CN107446877B - 一种适用于pcr扩增线粒体基因片断的dna提取的甜菜外植体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于PCR扩增线粒体基因片断的DNA提取的甜菜外植体制备方法，属于线粒体DNA提取材料制备技术领域。本发明外植体是先用水冲净甜菜种子表面灰尘，吸干表面水分，用95％酒精浸种后用灭菌水冲洗去除残留酒精，然后在灭菌水中室温浸泡4h‑10h；将预处理后的种子于室温避光萌发培养，培养期间每天用水冲洗一次，获得萌发胚苗；取萌发胚苗，切掉胚根以上部分，保留白色的胚根，切碎胚根组织后于‑20℃保存，作为外植体备用。本发明试验方法快速省时，成本低，易于操作，后续实验效果良好。制得的外植体材料通过简单的提取缓冲液可以直接进行DNA提取，用于PCR扩增细胞质中线粒体DNA上的基因片段。

Description

一种适用于PCR扩增线粒体基因片断的DNA提取的甜菜外植体 制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于线粒体DNA提取的植物外植体材料的制备方法，具体涉及一种适用于PCR扩增线粒体基因片断的DNA提取的甜菜外植体制备方法，属于线粒体DNA提取材料制备技术领域。

背景技术

高等植物的细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是普遍存在的。雄性不育在杂种优势利用中有极为重要的地位。CMS与其线粒体遗传系统关系密切，植物线粒体基因组的编码序列保守性很强，因此可利用某些植物的已知线粒体基因研究其他植物线粒体基因的多态性变化。在进行PCR扩增线粒体基因组DNA目的基因片断时，首先要分离提取线粒体DNA。

植物绿叶中的多糖类物质含量较高，加上叶绿素的大量存在，使用经典的DNA提取方法不能获得理想的线粒体DNA。为了去除细胞质中叶绿体DNA及叶绿素等非线粒体DNA成分的干扰，一般都使用植株黄化幼嫩叶片组织或愈伤组织作为外植体材料进行线粒体DNA提取，在进行PCR扩增线粒体基因片段的实验。在这些方法中，首先培育植株长成后再进一步培养获得黄化苗或经过繁杂的组织培养技术获得愈伤组织，才能进行线粒体细胞器分离及DNA的提取试验，无论获得植株黄化苗或培养愈伤组织，都要受到时间、空间、培养技术等条件的限制，时间较长。针对甜菜作物，由于叶中的糖类、酚类、叶绿体成分含量较高，使用以上方法并不能获得理想的mtDNA。一般从栽培甜菜母根中进行线粒体DNA的分离，效果较好，但甜菜母根从种子种植田间到收获母根至少3-5个月的时间。

发明内容

PCR扩增细胞质中线粒体DNA片断时，首先要进行甜菜线粒体基因组DNA提取，以甜菜根部母根为材料，经差速离心和蔗糖衬垫法得到纯净的线粒体，再进行DNA的提取。为解决现有技术中用于提取线粒体DNA的甜菜根部母根的栽培时间较长，工作量较大，田间试验条件限制较多，并且由于甜菜母根中含有多糖、多酚类物质使得后续试验的步骤复杂。本发明提供了一种甜菜外植体的制备方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供适用于PCR扩增细胞质中线粒体DNA片断试验的DNA模板提取的一种甜菜外植体制备方法，该外植体是通过如下步骤制备的：

1)种子预处理：用水冲净甜菜种子表面灰尘，吸干表面水分，用95％酒精浸种后用灭菌水冲洗去除残留酒精，然后在灭菌水中室温浸泡4h-10h；

2)培养：将预处理后的种子于室温避光萌发培养，培养期间每天用水冲洗一次，获得萌发胚苗；

3)器官分离：取萌发胚苗，切掉胚根以上部分，保留白色的胚根，切碎胚根组织放入离心管于-20℃保存，作为外植体备用。

进一步地，步骤1)所述的用95％酒精浸种是指搅拌浸种3s-5s后倒出酒精溶液并加入灭菌水冲洗。

进一步地，步骤2)所述室温避光萌发培养的培养温度为20℃-30℃。

进一步地，步骤3)所述的萌发幼苗是指胚根长至0.5cm-2cm时的胚苗。

进一步地，所述甜菜为叶用甜糖、饲料甜菜、食用甜菜或糖用甜菜。

本发明还提供了上述方法制备的外植体用于提取甜菜线粒体DNA。

进一步地，所述的应用，包括如下步骤：

1)按照权利要求1所述方法制备的外植体，取出-20℃保存装有外植体的离心管于管内迅速研磨，然后加入4倍-6倍外植体体积提取缓冲液，60℃水浴20分钟；所述的提取缓冲液中各组分的浓度为：2％(质量)CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L Na₂EDTA·2H2O，1.6mol/L NaCl；

2)加入与缓冲液等体积的氯仿异戊醇，13000r/min离心10min；所述氯仿异戊醇的体积比为24：1；

3)吸取上清液，重复步骤2)一次；

4)取上清液至装有冷的沉淀液的离心管中，离心沉淀DNA后弃掉液体，将离心管倒置于滤纸或面巾纸上，吸干管壁内水分，加入60μL灭菌水保存于-20℃；所述的沉淀液为异戊醇。

进一步地，所述PCR扩增线粒体基因片段为指上述方法制备的外植体提取的DNA直接作为PCR模板，根据目的基因设计上下游引物，进行扩增增线粒体DNA的序列片断的反应

本发明所述甜菜指所有的栽培甜菜，如叶用甜糖、饲料甜菜、食用甜菜以及糖用甜菜等。

本发明有益效果：

1、本发明通过采用甜菜胚根，甜菜胚根培养的时间短，解决了现有技术中以甜菜母根作为提取线粒体DNA的材料培养时间长，工作量较大，田间试验条件限制较多，甜菜母根中根所含多糖、多酚类物质后续试验的步骤复杂；以甜菜叶片作为材料，由于叶中的糖类、酚类、叶绿体成分含量较高，还需要去除叶绿体DNA及叶绿素等步骤，使用有机化学试剂种类较多对人体伤害较大等问题，相比于以甜菜母根及叶片作为提取线粒体DNA的材料,利用本发明制备的外植体材料提取DNA，不仅时间短(24h-48h)，简单，还因为不含有叶绿体及叶绿素，减少了后续DNA提取实验中叶绿体DNA及色素的去除步骤，成本低，易于操作，后续PCR实验效果良好。

2、本发明方法获得的外植体材料进行DNA提取，提取DNA无需纯化可直接作为PCR模板，采用与线粒体DNA互补的引物，进行PCR扩增试验，扩增出线粒体上的DNA片断，应用于基因克隆，分子标记、指纹图谱等分子生物学试验，为农业分子育种及分子生物学研究领域，也可利用本专利方法获得的外植体作为试验材料分离获得细胞质中的线粒体细胞器，用于甜菜的质体相关研究。

附图说明

图1为甜菜种子培养萌发的白色胚根器官示意图。

图2为本发明制备的外植体提取的DNA琼脂糖电泳结果图，其中M，DL15000Marker；泳道1-3分别为三种不同的栽培甜菜。

图3为本发明制备的外植体提取的DNA为模板，PCR扩增的线粒体atp6基因片断琼脂糖电泳结果图，其中M：DL2000Marker；泳道1、2、3分别表示三种不同的栽培甜菜扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：

一、本实施按照如下步骤制备外植体：

步骤1：自来水冲净甜菜种子表面灰尘，滤纸吸干表面水分；

步骤2：95％酒精浸种快速搅拌3秒-5秒，倒掉酒精，灭菌水冲洗去除残留酒精5遍，灭菌水室温浸泡4h-10h；

步骤3：预处理后的种子于室温(20℃-30℃)避光萌发培养(放在湿纱布上，包被种子的纱布放入烧杯，用牛皮纸包好烧杯，室温进行培养)，培养期间每天用水冲洗一次，获得萌发胚苗；

步骤4：待胚根长至0.5cm-2cm左右时(附图1)，切下胚根，解剖刀纵向横切碎胚根组织5mg-20mg放入1.5ml离心管中，保存于-20℃冰箱作为外植体备用。

二、以按照上述方法制备的外植体为原料，提取DNA，具体方法如下：①将装有制备好的外植体的离心管放入-40℃冰箱冷冻5-10分钟，取出后，用研磨杵快速研磨加入600ul提取缓冲液(2％(质量)CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L Na₂EDTA·2H2O，1.6mol/LNaCl)，60℃水浴锅中水浴20分钟；②加入600ul的氯仿异戊醇(24：1)，13000r/min离心10分钟；③吸取上清液重复②步骤一次；④取上清液加入另一离心管(400ul冷的异戊醇)中离心沉淀DNA，弃掉液体将离心管倒置于滤纸或面巾纸上，吸干管壁内水分，加入60μl灭菌水保存于-20冰箱。

脂糖凝胶电泳检测：取10μl DNA提取液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见附图2。DNA条带与DL15000Marker亮度基本一致，质量好。点样孔及其附近没有亮带，表明提取的DNA中没有蛋白质等杂质污染。

三、PCR反应验证提取的DNA模板PCR扩增线粒体基因片段

PCR扩增试验的Taq酶是大连宝生物TAKARA公司生产的Premix Taq混合反应液，以上述步骤提取的DNA直接作为模版，引物为线粒体atp6基因片断的上下游对应的序列，建立20μl PCR反应体系：DNA模板1μl,灭菌双蒸水8μl,上下游引物各0.5μl，Premix Taq混合酶10μl。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。反应结束后，取PCR产物8μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增效果。结果见附图3，电泳图显示PCR扩增出线粒体DNA上的atp6基因片断。

通过以上实验可知，利用本方法制备的外植体提取的DNA条带与Marker亮度基本一致，质量好，无蛋白质等杂质污染；以其为PCR模板,能够扩增出线粒体基因组上的DNA片段。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例2：采用本发明上述实施例1的方法进行操作

①外植体制备：自来水冲净甜菜种子表面灰尘，滤纸吸干表面水分。95％酒精浸种快速搅拌3秒-5秒，倒掉酒精，灭菌水冲洗去除残留酒精5遍，灭菌水室温浸泡6h.预处理后的种子于室温(20℃-30℃)避光萌发培养(放在湿纱布上，包被种子的纱布放入烧杯，用牛皮纸包好烧杯，室温进行培养)，培养期间每天用水冲洗一次.待胚根长至0.5cm-2cm左右时(附图1)，切下胚根，解剖刀纵向横切碎胚根组织5mg-20mg放入1.5ml离心管中，保存于-20℃冰箱作为外植体备用；

②制备的外植体为原料，提取DNA，具体方法如下：①将装有制备好的外植体的离心管放入-40℃冰箱冷冻5-10分钟，取出后，用研磨杵快速研磨加入600ul提取缓冲液(2％(质量)CTAB，100mmol/L Tris·Cl，20mmol/L Na₂EDTA·2H₂O，1.6mol/L NaCl)，60℃水浴锅中水浴20分钟；②加入600的氯仿异戊醇(24：1)，13000r/min离心10分钟；③吸取上清液重复②步骤一次；④取上清液加入另一离心管(装有400ul冷的异戊醇)离心沉淀DNA，弃掉液体将离心管倒置于滤纸或面巾纸上，吸干管壁内水分，加入60μl灭菌水保存于-20冰箱；

③取10μl DNA提取液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

④PCR反应验证提取的DNA模板PCR扩增线粒体基因片段效果

PCR扩增试验的Taq酶是大连宝生物TAKARA公司生产的Premix Taq混合反应液，以上述步骤提取的DNA直接作为模版，引物为线粒体atp6基因片断的上下游对应的序列，建立20μl PCR反应体系：DNA模板1μl,灭菌双蒸水8μl,上下游引物各0.5μl，Premix Taq混合酶10μl。PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。反应结束后，取PCR产物8μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增效果。结果见附图3，电泳图显示PCR扩增出线粒体DNA上的atp6基因片断。

实施例3：甜菜母根作为外植体材料利用经差速离心和蔗糖衬垫法提取mtDNA及PCR扩增

①母根组织制备:取种植3至5个月田间种植的母根洗净暗处理36h,去皮取100g母根组织，

②以制备的母根外植体为原料，提取线粒体DNA，具体方法采用朱彦涛等(农业生物技术学报，2010年，第18卷，第1期,185页)油菜细胞质雄性不育系根和叶mtDNA的提取的方法进行，具体操作如下：

将100g甜菜母根组织放入预冷的匀浆杯中，然后加入5mL/g FW预冷的提取缓冲液A，匀浆至叶或根细碎；匀浆液先用4层灭菌纱布过滤，再用3层200目滤网过滤；滤液分装于50mL离心管，1 000×g离心10min；取上清，17 000×g离心10min；弃上清，沉淀中加入0.1mL/g FW的缓冲液A，轻轻悬浮后，悬浮液再以1 000×g离心10min；取上清，加入DNaseⅠ(5mg/mL)及MgCl2(1mol/L)，在4℃下反应2h；加入EDTA至100mmol/L，以终止DNaseⅠ反应；利用蔗糖衬垫法纯化线粒体，即先在备用离心管中加入2mL/g FW的提取缓冲液B，再吸取上述溶液小心缓慢地铺于缓冲液B上，然后17 000×g离心10min；弃上清，所得沉淀用0.1mL/gFW的缓冲液A轻轻悬浮，在另一备用离心管中先加入0.2mL/g FW的缓冲液B，再将悬浮液小心缓慢地铺于缓冲液B上，然后17 000×g离心15min，获得纯化的线粒体

在纯化的线粒体沉淀中加入0.1mL/g FW裂解液，轻轻悬浮并混匀沉淀，再加入蛋白酶K(10mg/mL)和10％的SDS(用裂解液配制)，使二者的最终浓度分别为10μg/g FW和2％；线粒体在37℃下裂解4h；向裂解液中加入等体积的酚-氯仿/异戊醇(V/V＝24∶1)，轻轻混匀，静置5min；在4℃下11 000×g离心10min；吸出上清，再用酚-氯仿/异戊醇抽提2次；吸取上清，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，在-20℃下，在-20℃下放置2h；在4℃下11 000×g离心15min，回收DNA沉淀；用70％乙醇洗沉淀2次，在净化工作台上吹干，-20℃存放备用

上述步骤中的提取缓冲液A(pH 7.5)：Tris-HCl 10mmol/L，蔗糖500mmol/L，EDTA2mmol/L，BSA 0.2％，β-巯基乙醇0.1％；提取缓冲液B(pH 7.5)：Tris-HCl 10mmol/L，蔗糖600mmol/L；裂解液(pH8.0)：Tris-HCl 50mmol/L，EDTA 20mmol/L

③取10μl DNA提取液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

④母根mtDNA为模板,PCR反应验证提取的DNA模板PCR扩增线粒体基因片段效果，PCR扩增试验的具体操作方法与实施例一完全相同。

实施例4：甜菜母根为材料简化方法提取DNA及PCR扩增线粒体基因

①母根组织制备:取种植3至5个月田间种植的母根洗净暗处理36h,去皮取母根组织，

②以制备的母根外植体为原料，提取DNA，提取方法与实施例一中的步骤相同

③取10μl DNA提取液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；

④母根DNA为模板,PCR反应验证提取的DNA模板PCR扩增线粒体基因片段效果

PCR扩增试验的具体操作方法与实施例一完全相同

4实施例一及实施例三的三种方法的对比结果

结果显示利用实施例2方法制备的外植体提取的DNA条带与Marker亮度基本一致，质量好，无蛋白质等杂质污染，见图2，以其为PCR模板,能够扩增出线粒体基因组上的DNA片段，见图3，实施例2中胚根外植体的制备最短仅需24小时，以其为材料DNA提取实验只需要1h，所需试剂药品数量很少操作简单。

实施例3中利用母根为实验材料，该方法提取的DNA质量好，无蛋杂质污染，以其为PCR模板,能够扩增出线粒体基因组上的DNA片段，但甜菜母根的获得需要3-5月，时间长，且后续的DNA提取实验操作步骤繁杂，至少11h以上，配制药品试剂多，成本高。

实施案例4中琼脂糖电泳未检测到DNA条带，PCR未扩增出线粒体上的基因片段。因此，实施例2方法明显优于其它2种方法。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一种适用于PCR扩增的甜菜线粒体基因片断的DNA提取的方法，其特征在于，通过甜菜外植体提取线粒体基因组DNA，所述外植体是通过如下步骤制备的：

1)种子预处理：用水冲净甜菜种子表面灰尘，吸干表面水分，用95％酒精浸种后用灭菌水冲洗去除残留酒精，然后在灭菌水中室温浸泡4h-10h；

2)培养：将预处理后的种子于室温避光萌发培养，培养期间每天用水冲洗一次，获得萌发胚苗；

3)器官分离：取萌发胚苗，切掉胚根以上部分，保留白色的胚根，切碎胚根组织放入离心管于-20℃保存，作为外植体备用；

所述步骤1)中用95％酒精浸种是指搅拌浸种3s-5s后倒出酒精溶液并加入灭菌水冲洗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述室温避光萌发培养的培养温度为20℃-30℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的萌发幼苗是指胚根长至0.5cm-2cm时的胚苗。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菜为饲料甜菜、食用甜菜或糖用甜菜。

5.根据权利要1所述的一种适用于PCR扩增的甜菜线粒体基因片断的DNA提取的方法，其特征在于，提取线粒体基因组DNA步骤如下：

1)按照权利要求1所述方法制备的外植体，将获得的外植体-20℃以下冷冻5min-10min，取出装有外植体的离心管于管内迅速研磨，然后加入4倍-6倍外植体体积提取缓冲液，60℃水浴20分钟；所述的提取缓冲液中各组分的浓度为：2％(质量)CTAB，100mmol/LTris·Cl，20mmol/LNa2EDTA·2H2O，1.6mol/LNaCl；

2)加入与缓冲液等体积的氯仿异戊醇，13000r/min离心10min；所述氯仿异戊醇的体积比为24：1；

3)吸取上清液，重复步骤2)一次；

4)取上清液至装有冷的沉淀液的离心管中，离心沉淀DNA后弃掉液体，将离心管倒置于滤纸或面巾纸上，吸干管壁内水分，加入60μL灭菌水保存于-20℃；所述的沉淀液为异戊醇。

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