CN107441047B - 一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法 - Google Patents

一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法，通过乙醇加热回流提取石斛碱，经减压蒸馏浓缩，冷冻干燥、重结晶得到石斛碱；然后通过乙醇注入‑超声分散法制备空白脂质体，最后采用pH梯度法主动载药方式包封所得的石斛碱。所得的石斛碱脂质体质粒均一，包封率较高，稳定性较好，为石斛碱制备脂质体剂型提供了参考依据；经检测，所得的石斛碱脂质柱分离度为0.747，包封率为96.7％，在透射电镜下观察其形态粒径，为分布均匀的圆球形，平均粒径约为20‑50nm。

Description

一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法
技术领域
本发明涉及氨态氮检测领域，具体涉及一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法。
背景技术
金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl），又称金钗石，扁金钗、扁黄草、扁草、黄草，为兰科石斛属多年生附生草本植物。石斛属植物主要含石斛碱、多糖、微量元素和氨基酸等，石斛的药理作用主要表现在免疫、降血糖及强壮机体等方面；其中的主要活性成分石斛碱的药理作用主要表现在抗肿瘤，对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热等作用。目前，国内外主要集中在研究金钗石斛的提取分离和含量测定，尚未见石斛碱的剂型研究。由于金叉石斛中石斛碱难溶于水、生物利用度低，限制了其在临床方面的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法，采用脂质体的制备技术对金钗石斛新剂型的制备进行研究并作出相应的质量表征，为金钗石斛新剂型的开发提供了参考依据。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法，包括如下步骤：
S1、石斛碱的提取纯化
S11、将金钗石斛药材置于温度为40℃、压力为0.9mPA真空干燥箱内干燥6h后，将其粉碎，过12目筛；
S12、将所得的金钗石斛粉置于圆底烧瓶内，加入体积分数为95％的乙醇，加热回流1h，将回流液体通过减压旋蒸浓缩后，将所得的浓缩液用质量分数为36％的盐酸调节pH至1-2，浓缩液过阳离子交换柱，用pH＝14的体积分数为 85％的乙醇溶液洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩，即得石斛总碱；
S13、将所得的石斛总碱溶解入乙醚中，进行重结晶，即得石斛碱；
S2、空白脂质体的制备
S21、精密称取磷脂0.3174g、胆固醇0.0302g置于圆底烧瓶内，加入4mL 的无水乙醇，60℃水浴，待其溶解，得混合液；
S22、取20mL的柠檬酸钠缓冲液于玻璃杯中，置于磁力搅拌器上加热至 60℃；用1mL注射器吸取步骤S21所得的混合液，缓慢滴入上述60℃的柠檬酸缓冲液中，快速搅拌5min，混合均匀后，置于旋转蒸发仪除去乙醇，再搅拌一小时，收集于圆底烧瓶于KQ-500DV数控超声波清洗器中，超声10min 后，即得空白脂质体；
S3、载药脂质体的制备
S31、取所得的空白脂质体1.0mL于D331氯型阴离子交换柱的顶端，收集过柱液体，若有沉淀则离心后收集离心液，得梯度空白脂质体；
S32、取梯度空白脂质体混悬液1.0mL、0.2mL 3.0mg/mL的石斛碱药液、 NaHCO3溶液50μL于西林瓶中，混匀，盖塞，50℃水浴孵化5min，随后立即用冷水降至常温，终止载药即得。
本发明具有以下有益效果：
通过pH梯度法主动载药方式用空白脂质体包封石斛碱，所得的石斛碱脂质体质粒均一，包封率较高，稳定性较好；经检测，所得的石斛碱脂质柱分离度为0.747，包封率为96.7％，在透射电镜下观察其形态粒径，为分布均匀的圆球形，平均粒径约为20-50nm。
附图说明
图1为本发明实施例中石斛碱的制备流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
试剂的配制：
pH 3.8柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸2.10g，柠檬酸钠1.40g，加水200mL，配制即得。
pH 5.8磷酸缓冲溶：分别称取磷酸二氢钠、磷酸氢二钠0.07g、0.41g，加200mL水配制即得。
pH7.8碳酸氢钠溶液：称取碳酸氢钠2.50g加50mL水，摇匀，即得。
氢氧化钠水溶液：称取0.03gNaOH，溶于20mL水中，振摇混匀。
氢氧化钠无水乙醇溶液：称取0.04gNaOH，溶于10mL无水乙醇，振摇混匀。
pH4.5邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液：取0.82g邻苯二甲酸氢钾，于20mL水中混匀后，用氢氧化钠水溶液调节其pH到4.5，即得。
S1、石斛碱的提取纯化
将金钗石斛药材置于温度为40℃、压力为0.9mPA真空干燥箱内干燥6 h后，将其粉碎，过12目筛；将所得的金钗石斛粉置于圆底烧瓶内，加入体积分数为95％的乙醇，加热回流1h，将回流液体通过减压旋蒸浓缩后，将所得的浓缩液用质量分数为36％的盐酸调节pH至1-2，浓缩液过阳离子交换柱，用pH＝14的体积分数为85％的乙醇溶液洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩，即得石斛总碱；将所得的石斛总碱溶解入乙醚中，进行重结晶，即得石斛碱；具体流程图如图1所示。
S2、空白脂质体的制备
精密称取磷脂0.3174g、胆固醇0.0302g置于圆底烧瓶内，加入4mL的无水乙醇，60℃水浴，待其溶解，得混合液；取20mL的柠檬酸钠缓冲液于玻璃杯中，置于磁力搅拌器上加热至60℃；用1mL注射器吸取所得的混合液，缓慢滴入上述60℃的柠檬酸缓冲液中，快速搅拌5min，混合均匀后，置于旋转蒸发仪除去乙醇，再搅拌一小时，收集于圆底烧瓶于KQ-500DV数控超声波清洗器中，超声10min后，即得空白脂质体；
S3、载药脂质体的制备
取所得的空白脂质体1.0mL于D331氯型阴离子交换柱的顶端，收集过柱液体，若有沉淀则离心后收集离心液，得梯度空白脂质体；取梯度空白脂质体混悬液1.0mL、0.2mL3.0mg/mL的石斛碱药液、NaHCO3溶液50μL于西林瓶中，混匀，盖塞，50℃水浴孵化5min，随后立即用冷水降至常温，终止载药即得。
S4、柱分离度考察
取步骤S2制备的空白脂质体0.4mL和50μL碳酸氢钠溶液，60℃水浴孵化，再加0.2mL药液(3.0mg/mL)混匀，取此混合液0.1mL置于10mL的容量瓶中，加95％无水乙醇6.0mL，振摇混匀，加磷酸缓冲溶液至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液4mL于10mL容量瓶中，加空白溶剂(95％乙醇6.0mL 置于10mL量瓶中，加磷酸缓冲液至刻度，摇匀即得)至刻度，摇匀，即得样品。另取一份0.1mL脂质体混合液于阳离子交换树脂柱顶端吸附，用磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液于10mL量瓶中，加95％乙醇6.0mL，磷酸盐缓冲定容，摇匀，即得对照品。分别取对照品、样品脂质体混悬液1.0mL于10mL中，加入氯仿使其稀释至10倍，再加pH4.5邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液5.0mL和0.04％溴甲酚绿溶液1.0mL剧烈振摇3min，静置30min，取氯仿层5.0mL，加0.01mol/L 氢氧化钠无水乙醇溶液1.0mL摇匀，在620nm波长下，测定吸光度，代入下式计算结果。
柱分离度公式＝1-(A样/A对×2.5)
其中，A样为样品溶液吸光度，A对为对照品溶液吸光度。
S5、包封率的测定
按照步骤S4的柱分离度考察项下对照品与样品的方法操作，使用酸性染料比色法，在620nm波长下，测定吸光度，代入下式计算包封率。
包封率公式＝A1/A2×100％
其中，A1为通过分离柱后收集脂质体中石斛碱的吸光度，A2为未过柱石斛碱脂质体的吸光度。
S6、脂质体的形态观察
采用透射电镜(TEM)观察载药石斛碱脂质体的表面形态。取石斛碱脂质体混悬液用蒸馏水稀释100倍后，滴至敷有支撑膜的铜网上，以1％磷钼酸负染，自然晾干后，于TEM下观察其形态，并拍照。
结果
制备方法对空白脂质体的影响结果
本实施例前期分别称取磷脂与胆固醇3∶1、6∶1的量采用以上两种方法制备空白脂质体。结果如表1所示。
表1不同方法制备空白脂质体的结果
Figure BSA0000150555170000051
+++：大量沉淀生成 ++：较多沉淀生成 +：有沉淀生成 -：无沉淀生成
脂质用量对脂质体的影响
制备脂质体时，脂质成分及用量的选择都是非常重要的。本实验选择了便宜易得的中性磷脂和胆固醇，且考察了磷脂和胆固醇用量比例对脂质体性状的影响。结果见表2.
表2磷脂、胆固醇用量对脂质体的性状影响
Figure BSA0000150555170000052
甘油量对脂质体的影响
向脂质体中加入一定量的短链烃--甘油，可提高脂质体的稳定性，故本实验考察了不同体积甘油对脂质体的影响。结果见表3
表3不同体积甘油对脂质体稳定性影响
Figure BSA0000150555170000061
+：有沉淀生成 -：未生成沉淀 *：底部有少许红色沉淀
柱分离度考察
分离度考察检验阳离子交换柱的分离效能，保证测定的数据的准确性，经多次测定柱分离度在0.74左右，详见表4。
表4柱分离度考察
Figure BSA0000150555170000062
包封率结果
载药时，药物与脂质体的量会影响包封率。当药脂比为1∶2时，包封率最高在53.9％，当药脂比为1∶5时，药物的包封率为96.7％。因此在载药时，应注意药物与脂质体的量，才能得到好的包封率。结果见表5。
表5药物与脂质体质量比包封率的影响
Figure BSA0000150555170000063
形态及粒径
取少量石斛碱脂质体混悬液，滴至载玻片上，用透射电子显微镜(60×10) 观察并拍摄照片由透射电镜照片可见，制备的脂质体为球状或椭圆状的小囊泡。
从表1结果可知，采用薄膜分散法制备，所得脂质体底部有白色沉淀物质，在显微镜观察粒径均在2-3μm左右，粒径较大，其稳定性也较差。乙醇注入法采用同样比例制备空白脂质体，此法所得脂质体无白色沉淀，其粒径＜1μm，显著小于薄膜法制备的脂质体粒径。因此本实验选用了乙醇注入法制备空白脂质体。由表2可知采用乙醇注入法制备空白脂质体时，随着磷脂的用量越来越大，脂质体的外观越来越好，产生沉淀的时间点越来越长。当磷脂与胆固醇质量比为10∶1时能得到粒径均一、外观形态好、较稳定的脂质体。由表3结果可知，在加入甘油后，2d各组均未有沉淀产生，3d-9d仅0.11mL甘油组出现了沉淀，14d时各组均在底部出现少许红色沉淀。可能原因系脂质体长时间暴露于空气中且包装并未密封，磷脂被氧化导致破裂，进而发生反应，产生沉淀。因此制备脂质体时，应加入一些稳定剂外，制备完毕应密封保存、制备过程中使用的缓冲溶液应抽气，避免液体中含有的氧气，氧化了磷脂，降低了脂质体的稳定性。制备金钗石斛脂质体过程中，首先，磷脂、胆固醇溶于无水乙醇时，水浴温度一定要在55℃-65℃之间。常温情况下，磷脂、胆固醇也能溶于乙醇，但是在显微镜下观察只有少许或没有脂质体。其原因可能是磷脂未达到水化温度所以导致不能够成膜形成脂质体；其次，磷酸盐缓冲液的pH值对空白脂质体的稳定性也有一定影响，当pH值分别为3.8、6.5，在同量、同法操作下，放置6小时后pH值为3.8的脂质体，会产生更多的白色沉淀。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于主动载药方式的石斛碱脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、石斛碱的提取纯化
S11、将金钗石斛药材置于温度为40℃、压力为0.9mPA真空干燥箱内干燥6h后，将其粉碎，过12目筛；
S12、将所得的金钗石斛粉置于圆底烧瓶内，加入体积分数为95％的乙醇，加热回流1h，将回流液体通过减压旋蒸浓缩后，将所得的浓缩液用质量分数为36％的盐酸调节pH至1-2，浓缩液过阳离子交换柱，用pH＝14的体积分数为85％的乙醇溶液洗脱至无色，收集洗脱液，浓缩，即得石斛总碱；
S13、将所得的石斛总碱溶解入乙醚中，进行重结晶，即得石斛碱；
S2、空白脂质体的制备
S21、精密称取磷脂0.3174g、胆固醇0.0302g置于圆底烧瓶内，加入4mL的无水乙醇，60℃水浴，待其溶解，得混合液；
S22、取20mL的柠檬酸钠缓冲液于玻璃杯中，置于磁力搅拌器上加热至60℃；用1mL注射器吸取步骤S21所得的混合液，缓慢滴入上述60℃的柠檬酸缓冲液中，快速搅拌5min，混合均匀后，置于旋转蒸发仪除去乙醇，再搅拌一小时，收集于圆底烧瓶于KQ-500DV数控超声波清洗器中，超声10min后，即得空白脂质体；
S3、载药脂质体的制备
S31、取所得的空白脂质体1.0mL于D331氯型阴离子交换柱的顶端，收集过柱液体，若有沉淀则离心后收集离心液，得梯度空白脂质体；
S32、取梯度空白脂质体混悬液1.0mL、0.2mL 3.0mg/mL的石斛碱药液、NaHCO3溶液50μL于西林瓶中，混匀，盖塞，50℃水浴孵化5min，随后立即用冷水降至常温，终止载药即得。
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