CN107430264B - 用于试样的光片显微镜检测的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光片显微镜，包括：照明装置，其产生用于多个照明波长的相干照明光线；光束成形模块(8)，其用于利用所述照明光线产生光片；照明物镜(10)，其利用所述光片对试样(1)进行照明；以及检测物镜(12)，其用于将由试样发射的光成像到扇形检测器上，其中所述检测物镜(12)的光轴与所述照明物镜(10)的光轴形成不同于0°和180°的角度。在该光片显微镜中，光束成形模块(8)包括相位选择元件(19)，在该相位选择元件(19)上设置有空间上彼此分离的多个选择区域(20)，其中每个选择区域(20)分别被分配给一个特定的照明波长，并且其中在每个选择区域(20)上施加预设为用于相应照明波长的相位分布。另外，所述光束成形模块(8)包括用于根据所述相应照明波长对所述选择区域(20)进行依序选择或同时选择的装置。
Description
技术领域
本发明涉及一种借助于光片显微镜对试样进行检测的方法和装置，以及主要涉及对利用多种染料标记的试样进行分析的问题。
背景技术
对生物试样的研究在近年来越来越重要，其中，试样的照明被利用光片实现，光片的平面(光片平面)与检测的光轴(检测方向)以不为零的角度相交。通常，光片平面在此与检测方向(一般相对于检测物镜的光轴)夹成不为零的、但通常也不一定是直角的角度。这种研究方法主要用在荧光显微成像中并且被归纳为术语LSFM(光片荧光显微术)。示例是在DE10257423A1中描述的以及以上述文献为基础构成的WO2004/0535558A1中描述的而且称为SPIM(选择性平面照明显微术)的方法，利用这种方法，在相对短的时间内也能够产生较厚的试样的三维图像：基于光学剖面，在与沿垂直于剖切平面的方向的相对运动组合下，能够对试样进行可视的/三维拉伸的显示。
相对于其他设计的方法，诸如共焦激光扫描显微术或者双光子显微术，LSFM方法具有多种优点。因为能够实现在宽视场内的检测，所以能够在短时间内获得更大的试样区域。虽然分辨率略低于共焦激光扫描显微术的情况，但是，能够利用LSFM技术分析较厚的试样，因为透入深度较大。此外，在这种方法中，对试样的曝光是最低的，这降低了试样褪色的风险，因为试样仅受到薄的光片的照射，该薄的光片与检测方向的夹角不为零。
替代纯静置的光片，通过利用光束快速扫描试样也可以产生准静置的光片。光片类型的照明以如下方式产生，光束相对于需要观察的试样经历非常快速的相对运动并且在此，在时间上依次多重地并排排列。在此，照相机的在其传感器上成像出试样的积分时间以如下方式选择，使得扫描在积分时间内结束。
光片显微术的主要应用之一在于对几百微米直至几毫米的中等大小的生物体进行成像。一般，生物体嵌入凝胶中，例如琼脂中，凝胶又处在玻璃毛细管中。玻璃毛细管从上方或从下方被嵌入填入水的试样腔室中，并且试样作为一块被从毛细管中压出。琼脂中的试样被光片照明，并且利用检测物镜(该检测物镜优选地、但是没有必要一定，垂直于光片、进而也垂直于用于产生光片的光学系统的照明物镜)将荧光成像到照相机上。
但是，光片显微成像术的方法具有一定局限。一方面，需要研究的试样相对较大，该试样来自发展生物学。第二方面，由于试样制备和试样腔室的尺寸，光片相对较厚并且进而能够实现的轴向解析度受到限制。第三，试样的制备很复杂并且不与通常针对单个细胞的荧光显微术的标准试样制备和标准试验保持件相兼容。
为了部分地规避上述限制，在近年来，实现了新型的结构，其中，照明物镜和检测物镜优选彼此垂直而置并且以45°的角度从上方指向试样。操作方式例如在WO2012/110488A1以及在WO2012/122027A1中介绍。
为了照明试样，一般使用激光的相干的光。光的波长在荧光显微术中根据标记选定，所述标记应当被激励以发射荧光。在最简单的情况下，例如能够将具有符合高斯函数分布的强度分布的光束静态地借助于圆柱透镜形成光片，或者一定程度静态地借助于扫描和与之相协调的照相机积分时间来形成光片。在此，有利的是对试样结构化的照明，由此，能够提高分辨率。于是，例如在V.Kettunen等人的文章“不变传播的点阵列(Propagation-invariant spot arrays)”(出现在光学通信杂志1998年第1247页23(16)(Optics Letters23(16)，Seite 1247，1998))中，介绍了贝塞尔光束的相干叠加。这种叠加通过借助于算法计算能够引入光瞳的相分量的方式来实现。当贝塞尔光束的光谱成像到光瞳中时，相分量产生多束在试样中叠加的贝塞尔光束。相分量类似于相位值为0至π的星形光栅。作为条件给出的是，各个贝塞尔光束的间距必须很大，因为否则可能发生不希望的干涉效应。
在US2013/0286181A1中，有针对性地利用各个贝塞尔光束之间的干涉效应来产生拉伸的而且结构化的光片。在此，贝塞尔光束彼此如此近地挨着设置，使得各个贝塞尔光束的次极大值(side lobes)在传播平面、光片平面的上方和下方解构地(destructively)叠加。根据各个贝塞尔光束彼此间的间距，获得不同的干涉图案。
在WO2014/005682A1中介绍了所谓的sinc3光束的产生。在试样中，由此能够产生仅具有较小的次极大值的近乎方形的光片。sinc3光束可以在频率范围内表达为三个sinc3函数的乘积：
f＝fvrfvxfvy与
系数cr、cx和cy给出sinc3光束在光瞳平面中的位置，系数wx、wy和wz给出sinc3光束沿相应方向的宽度。
函数f的傅里叶变换获得了光片的混合电场EF。焦点上的强度分布通过I＝abs(EF)2获得，相位
获得
sinc3光束也可以相干地叠加，从而产生结构化的、光栅状的光片。
为了产生上面介绍的光束类型，例如可以使用空间光调制器(SLM，spatial lightmodulator)。对于贝塞尔光束，这例如在Rohrbach等的文章“利用自重构光束类型的相的线扫描光片显微镜”(Aline scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams)中有所介绍，见于2010年的光学快讯，第24229页(Optics Express18，Seite24229im Jahr 2010)，参考液晶SLM。在此，给出两种类型的液晶空间光调制器，其通过所用的液晶来区别。
向列SLM实现了从0至6π的最大连续可调的相位偏差。但是，SLM相对缓慢：一般SLM具有约60Hz、最大直至500Hz的帧速率。相反，向列SLM的衍射效率高于90％。
另一方面，给出铁电SLM，铁电SLM仅能够在无相位偏差的状态和相位偏差为π的状态之间来回切换。为此，SLM能够非常快速地切换，使得帧速率可以达到最高4000Hz。但是，向列SLM的衍射效率非常低，约为14％。
两种SLM类型具有相同之处是，能够实现相位偏差与照明激光的波长相关。理想情况下，向列SLM应当被校准，使得向列SLM具有从0至整个波长、也就是2π的连续的相位偏差。但是，相位偏差可以在唯一的波长下调制，于是，相位偏差针对所述波长来设计。一旦SLM被其他波长的激光照射时，相位偏差发生改变并且不等于2π。在波长较短的情况下，相位偏差较大，在波长较大的情况下，相位偏差减小。
对于铁电SLM而言，有类似的表现。同样在这里，π的相位偏差仅在如下的波长下达到：在该波长下，设计在SLM上显示的图案。在波长发生偏差时，相位偏差不为π。这对于上面提到的贝塞尔光束或sinc3光束的产生具有直接影响，于是，光束仅当相位偏差连续在0与2π之间改变时，才能最佳地产生，正如其针对贝塞尔光束和马丢光束所需那样，或者当相位偏差恰好为π时，才最佳地产生，正如针对相干叠加的贝塞尔光束或sinc3光束的情况那样。
为了进行荧光显微分析，试样通常利用不同的标记来制备，其分别能够使试样的不同结构可见。因此，所希望的是，在光片显微术中，利用不同波长的光片对试样加以激励。在用于空间调制器来进行光束成形时，如果各个不同色彩的光片被依次照射并且在变换波长时将相位图案与SLM相适配，那么能够实现最佳的彩色激励。例如，在第一次通过时，SLM被调制到第一激光波长，并且沿z方向、检测方向在该波长上拍摄图像栈。接下来，SLM被调制到第二波长，并且再在该波长下记录图像栈。但是，这种方法具有不利之处，图像栈的记录可能花费相对长的时间，直至数十秒。当试样在此期间运动或改变时，不同色彩的图像栈不再重叠，并且不能组合成整体图像。
可替换地，图像栈的每幅单图在图像栈的下一幅图被记录之前在不同的波长下被记录。但是，这具有不利之处，在约10ms的曝光时间下，对空间光调制器的优化必须根据新的激光波长每秒钟进行100次。凭借常规的向列SLM，这是不能实现的，从而必须使用具有其很低的光效率和受限的相位偏差的铁电SLM。
在以前未公开的DE 10 2014 119 255中，描述了一种方法，只通过通常是SLM的单相掩模可以生成多色光片，其中公共相位分布是针对所有的用于照明的波长预设的。这使得能够使用几种颜色的照明光线快速依序地或甚至同时进行照明。不利的是，相位分布对于每个波长不是最佳的，而是针对优选的波长而确定的。照明光线的波长彼此相差越大，相应光片的质量损失就越大。例如，它们的厚度可能不同，或在次极大值的出现方面不同，在某些情况下，该次极大值的出现将导致不可能直接比较不同染料的测量结果或将它们相互关联。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种方法，这种方法实现了：利用不同波长的彩色光片同时或依序地在非常短的时间内以静态相位调制来对试样进行中照明，使得同时能够检测多个色彩，并且记录时长相比于依次激励减少，其中，因为向列SLM的高衍射效率，应当优选也对向列SLM加以应用，并且其中对于每个波长而言，光片的质量尽可能高并且尽可能的相同。
所述目的针对一种借助于光片显微镜对试样进行检测的方法来实现，方式为：选择多个照明波长，用于试样的照明光线由所述多个照明波长组成。
通常，基于要进行的实验来选择照明波长，例如根据试样被标记的染料以及待被激发的荧光。对于照明光线的结构化，对于每个照明波长在相位选择元件上施加预设的相位分布，并且预设的孔板结构优选地也被施加在孔板平面中的孔板上。这可以例如如下实现：在第一步骤中，在照明物镜的焦平面中，对于预定形状的光片，利用相应照明波长的光确定该光片的电场。利用该电场分别计算出待预设的相位分布，由此，计算出要预设的相位分布，要预设的相位分布是复合电场的幅度，在相位为
时，
在此，为了确定或计算光片的电场，出发点在于，针对优先波长，在孔板平面中基于光片的位置的中间或中心区域被消隐，以便同样在计算时排除零阶，该零阶在实际中为了产生结构化的光片而必须被消隐。这里，基于光片位置的中间区域因此被消隐，结果孔板结构对相应照明波长的结构化的光的零阶进行了消隐。
例如可以通过所谓的光瞳函数的傅里叶变换、也就是频率范围内的电场(在这里为其在光瞳中的分布)来实现照明物镜的的焦点上的电场的计算。然后在相位选择元件上，将预设的相位分布中的每一个施加在其被分配给相应照明波长的且不与其他选择区域重叠的各自的选择区域中。相位选择元件优选处在中间像中。涉及的是一种静态的相位选择元件，例如相应制造的相位板。不同的相位板被保持就位以用于不同数量的波长，并且然后根据所选择的照明波长被引入到光束路径中。可控的相位选择元件例如空间光调制器相应得到操控和调制。
可选地，可以执行其他调校措施。例如，相位分布能够乘以垂直于光片平面的包络函数。按照这种方式能够调制光片的厚度，此外，能够抑制垂直于光片平面的次极大值。相位分布也可以通过尺寸设定来适配以被施加在相位选择元件上，使得光瞳中的光谱对应于初始计算的数值，或者光片具有试样中预设的规格。
然后用照明光束路径中的位于中间像平面内或附近的照明光线照亮相位选择元件。只有相应照明波长的光被引导到每个选择区域。这可以通过如下的方式实现：或者每个照明波长都具有其自己的光束路径，该光束路径与用于另一个照明波长的光束路径分离地延伸到相位选择元件，或者通过将所有照明波长共用的波束或波束路径拆分成各个单独的光束路径，这些单独的光束路径分别被分配给一个照明波长。根据不同照明波长的数量，分束可以例如由一个或多个分束器实现，这些分束然后例如被依序地布置以适配于照明波长，或者分束也可以通过色散或衍射元件实现，该色散或衍射元件偏转光谱上不同的照明光线或者依照光谱对光线进行拆分。
照明光线由相位选择元件结构化，其中该结构化对于每个照明波长而言实现在所分配的选择区域中而不是实现在另一选择区域中。预设的照明波长的光仅被引导到所分配的选择区域。在结构化之后，将不同的照明波长的光组合在一起，以形成共同的光束，此共同的光束在之后耦合到照明物镜中。在此之前，结构化的照明光线可以被成像在布置在相位选择元件的下游的孔板平面中，在该孔板平面中生成相应波长的照明光线的频谱。该成像可以在组合以形成公共光束之后进行。然后执行孔径结构的适配，使得相应照明波长的结构化照明光线的零阶在孔板平面中基本上被消隐，由此，结构化的彩色光片或者相应照明波长的结构化光片被成形在布置在下游的照明物镜的焦平面中，该光片具有垂直于照明物镜的焦平面的光片平面。随后在光片平面中用相应照明波长的结构光片照射试样，并在检测装置中检测由试样发出的光。检测装置与光片平面形成不同于零的角度。这个角度优选地选择在90°，因为这使得能够最佳地实现照明和检测的区分。然而，较小的角度也是可能的，例如30°或70°，特别是当结构情况不允许直角时。根据设计，不同照明波长的光可以依序地或同时地被引导到相位选择元件上，这意味着利用不同颜色的光片依序地或准同时地或同时地对试样进行照明。
孔板平面中的孔板能够按照不同的方式进一步适配。当例如执行尺寸设定时，则孔板调校可以使得所叠加的光线的零阶恰好被消隐。调校孔板的另一可行方案在于使光瞳函数的不希望的次极大值被消隐。
以这种方式，调整用于光片显微镜的照明装置，使得当使用照明波长的光时，对于这些照明波长中的每一个，该照明装置以可能最好的方式产生结构化的光片，结果是能够实现利用多个波长同时或准同时地激发试样。
在此，入射光束，例如高斯激光光束，优选椭圆准直化，以便一方面使得零阶的光线输出保持得尽可能低，并且另一方面仅尽可能小地影响到光片。
例如可以将衍射光学元件用作相位选择元件。衍射光学元件可以静态地形成为相位板，其中，用于所选择的照明波长的相应的选择区域被施加在相位板上。这里，对于特定的波长，只执行一次单独的适配。针对照明波长的不同组合，可以将不同的相位板引入光束路径中。另一可行方案在于，将空间光调制器(SLM)用作衍射光学元件。这提供如下优点，经由控制能够将空间调制器设置到不同的照明波长，而不一定进行变换；此外，利用SLM能够实现针对相应光片的不同的光束形状。然而，在分析试样期间，空间光调制器(SLM)不发生改变，SLM表现为静态。
然而，相位选择元件作为组件也可以由几个单独的元件组成，例如仅覆盖光束路径的一部分的小相位板，其中每个单独的元件包括分别分配给特定照明波长的一个选择区域。这些单独的元件然后可以在光束路径中彼此相邻地布置，或者一个在另一个之后。如果相位选择元件-例如相位板-被静态地构造，那么通常提供多个相位板，利用多个相位板，根据检测构造可以使用照明波长的不同组合。然后可以在机械方式或通过电机在光束路径中交换，例如可以在滤光轮上布置多个相位板。
此外，有利地，对于每个选择区域，根据照明波长将调制深度固定为π。因此，每个选择区域的相位偏差可以设置为π；通常在SLM的情况下使用控制电压来实现。因此，对于每个选择区域，该相位偏差是最佳的：在π的相位偏差的情况下，衍射效率处于其最高处，并且整个入射的激光辐射被调制，即重新分布成期望的波束形状。在调制深度不同于π的情况下，衍射效率将降低，并且激光输出的一部分将重新分布成零阶。如果没有相位偏差或仅有2π的倍数的相位偏差，则整个激光输出被衍射为零阶，结果是不产生期望的波束形状。
如果应用空间光调制器(SLM)时，能够在光路本身中进行容易的适配，例如不同的包络函数能够乘以沿垂直于光片平面的方向施加在选择区域上的相位分布，并且执行其他调制方案。尺寸设定也可以根据SLM更简便地执行。
虽然通常使用具有高斯强度分布的光束作为被准直并被引导到相位选择元件上的输入光束，但是为了计算光片的电场，优选地应用比高斯光束更适合于试样的均匀照明或结构化的照明的形状，该高斯光束当然也可以用来计算光片的电场。
在优选实施例中，光片的电场以如下方式确定，为了成形光片，使用两个sinc3光束，这两个sinc3光束在照明物镜的焦平面中相干叠加。这里，从起始说明的光瞳函数出发，对试样中、也就是焦平面中的光片的电场通过傅里叶变换来计算。基于在焦平面中获得的电场、叠加场，确定出相位，并且，针对每个照明波长，该相位在相位选择元件上唯一地被施加在分配的选择区域中。sinc3函数的主要优点在于，利用其能够形成在试样中具有均匀照明度的近乎方形的光片，仅具有很小的次极大值。在相干叠加的情况下，能够产生结构化的、光栅状的光片，其中，由于对于每个照明波长使用其各自的选择区域的事实，光片的特征对于每种颜色而言具有相同的质量。
在另一个优选设计中，光片的电场通过使用预设形状的贝塞尔光束来确定光片的形状。对于这样的贝塞尔光束，确定焦平面中的电场，以及算术地确定该电场和在焦平面中的分别以预定量Δ彼此间隔开的多个相同的电场之间的叠加。在此，间距Δ以如下时长改变，直至调制出最佳光片，也就是各贝塞尔光束的次极大值优选解构地叠加，从而形成如下的光片，该光片在横截面中长而且薄且仪具有很小的次极大值。
关于光束成形的进一步细节以及也可以转移到单一照明波长的使用的相应光束成形模块的基本设置的进一步细节在DE 10 2014 119 255中描述，该申请在开头已经提到而不是以前公开的，其内容完全纳入本文，并作了明确的提及。
本发明还涉及一种光片显微镜，该光片显微镜能够利用多色光片对试样进行照明，且适于特别是执行前述的方法。此种光片显微镜包括照明装置，其产生用于多个照明波长的相干照明光线。该光片显微镜还包括光束成形模块，其用于利用所述照明光线产生光片；照明物镜，其利用所述光片对试样进行照明；检测物镜，其用于将由试样发射的光成像到扇形检测器上，其中所述检测物镜的光轴与所述照明物镜的光轴形成不同于0°和180°的角度。
为了实现上述的目的，所述光片显微镜的光束成形模块包括相位选择元件，在该相位选择元件上设置有空间上彼此分离的多个选择区域，其中每个选择区域分别被分配给一个特定的照明波长。另外，所述光束成形模块包括用于根据所述相应照明波长对所述选择区域进行依序选择或同时选择的装置。选择区域被设计为如先前已经结合该方法描述的那样。选择区域彼此不重叠，并且预设为用于相应照明波长的相位分布施加在每个选择区域上。
然后将相位选择元件布置在照明光束路径中的中间图像平面中或附近。优选地相位选择元件形成为衍射光学元件，特别优选形成为空间光调制器(SLM)，优选为向列型SLM。然而，它也可以形成为相位板，或者形成为由几个单独的元件(例如几个较小的相位板)组成的组件，其一个照明波长分别分配给每个单独的元件。
根据相应照明波长对选择区域进行依序地或同时的选择和照明的装置可以以不同的方式实现，其中在下文中假定所有照明波长的波束路径是公共光束路径，该公共光束路径在光束成形模块中至少在相位选择元件之前的区域中，即在照明光线到达相位选择元件之前，必须根据选择区域的选择，将照明光线光谱分离为多个照明波长。在耦合到照明物镜之前，单独的照明波长的光的单独的光路被聚合在一起，为此，光束成形模块还包括用于组合照明波长的光束的装置。
在光片显微镜的一个设计中，用于选择区域的依序选择的装置包括：光路选择元件，其设置在光源和相位选择元件之间，所述光路选择元件用于根据照明波长将光偏转到相应的选择区域。另外，用于选择区域的依序选择的装置包括分段反射镜，其由设置在相位选择元件的下游的多个段组成，并且其将入射光反射到相位选择元件的分配给所述照明波长的区域。一个段分别被分配给一个照明波长。另外类似地属于用于依序选择的装置的一个λ/4板设置在分段反射镜和相位选择元件之间，其中相位选择元件被设计为在第一偏振方向的情况下不改变光的相位，并且被设计为在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下改变所述相位。
在本实施例的情况下，依次选择选择区域，即，将不同照明波长的光一个接一个耦合到照明光束路径中，而不是同时耦合几个照明波长。该变化可以如此迅速地进行，结果可以实现具有多色光片的准同时照明。根据相应照明波长，光路选择元件将光偏转到分配的选择区域。光路选择元件例如可以是可切换的镜，该可切换的镜与入射光束的光轴的角度可以根据所使用的照明波长而改变。该设置可以例如通过直接连接到发射源(例如激光模块中的激光器)的控制单元来实现，结果是根据耦合的光源自动设置对应的角度。也可以想到牢固布置的静态光路选择元件，例如可以使用棱镜或棱镜、玻璃板或其它色散元件的组合，或者也可以使用衍射元件，其中当使用色散和衍射元件也可以进行同时选择。重要的是，布置在光束路径中的光路选择元件的下游的相位选择元件被布置为使得只有所分配的照明波长的光分别到达相应的选择区域，并且其他照明波长的光不会到达所选择的选择区域，但是到达分配给这些波长的选择区域。
将光从相位选择元件引导到分段反射镜上，在该分段反射镜上，在相反选择元件的方向上将光反射。分段反射镜被构造成一个段分别被分配给一个选择区域，并且来自该选择区域的光被精确地反射回到该选择区域。各个段例如是平面镜面。由于λ/4板布置在相选择元件和分段反射镜之间，所以光束通过该λ/4板两次，结果是返回光束当它到达相位选择元件其偏振相对于原始偏振旋转了90°。因此λ/4板在单次通过期间像λ/2板一样起作用。
相位选择元件对应于偏振方向对齐，结果是在光的两个偏振方向中的第一个中，选择区域中的光不被修改，并且在两个偏振的第二个中方向，光线被修改。如果光不被修改，相位选择元件只能反射性地作为镜子。偏振优选地被设置为使得相位选择元件首先对来自光路选择元件(如反射镜)的光起作用，并且在返回路径上，当偏振旋转90°时，该相位选择元件以相位调制方式起作用。原则上，也可以想到逆向顺序，然而优选的变型具有以下优点：具有较短焦距的透镜系统可以用于相位图案的后续成像，该成像通常在中间图像中或附近。来自选择区域的相位修正光可以经由光路选择元件被耦合回光束路径，并且例如通过偏振分束器与直接来自光源的非结构化照明光线分离。
在光片显微镜的另一设计中，用于选择区域的同时选择的装置包括：一个或多个偏光元件，这些偏光元件相对于光的颜色是选择性的并且设置在光源和相位选择元件之间。每个偏光元件分别被分配给一个照明波长并且被设置成将光引导到相应的选择区域上。平面反射镜设置在相位选择元件的下游；和1/4λ板设置在平面反射镜和相位选择元件之间。这里，相位选择元件在第一偏振方向的情况下不改变光的相位，并且被设计为在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下改变所述相位，如已经结合先前所述的实施例所描述的那样。在这两种情况下，当然必须确保光的相应输入的偏振。虽然根据本实施例示例的布置优选地适于选择区域的同时选择，即同时照明，但是它也可以用于选择区域的依序序选择。例如可以使用反射镜和二向色分束器作为偏光元件，其中该反射镜仅可能在分束器链中的最后一个链接中，光可以依序地通过该反射镜。例如，如果仅使用两个照明波长，则一个二向色分束器就足够了。分配给分束器的照明波长的光通过分束器被引导到相应的选择区域中，第二照明波长的光通过分束器并到达反射镜，因为入射光仅具有该照明波长，该反射镜只将该照明波长的光指向选择区域。当然，替代在链中的最后一个链接中的镜子，也可以使用另一个分束器。假设分束器不是串联地布置，但是光先前已经被拆分到不同的光束路径上，例如没有光谱拆分，通常，除非用特殊的分色层覆盖镜子，否则不可能使用反射镜。
在该光片显微镜的优选实施例中，施加在每个选择区域上的是闪耀光栅，其设计成在第二偏振方向的情况下改变光的反射角。以这种方式，可以实现例如光的返回路径上的额外的角度偏转，结果可以通过反射镜实现更简单的耦合输出，并且可以省略偏振分束器。
在另一个实施例中，用于选择区域的同时选择的装置包括：一个或多个输入偏光元件，其设置在光源(其可以由多个激光器组成，并且发出照明波长的光)和相位选择元件之间，并且相对于颜色是选择性的。每个输入偏光元件分别被分配给一个照明波长，并且被设置成将该照明波长的光引导到相应的选择区域上。输入偏光元件用于根据照明波长对光束进行光谱拆分，它们被设置在相位选择元件的上游。一个或多个输出偏光元件类似地被设置在相位选择元件的下游，其中每个输出偏光元件再次分别被分配给一个照明波长，并将偏转来自相应的选择区域的光。在这两种情况下，输入和输出偏光元件可以是例如二向色分束器，其也可以被构造成相同的。输入和输出偏光元件也可以相同，即光利用相应的反射镜构造到达相应的输入和输出偏光元件两次。此外，输入和输出偏光元件可以被配置为使得它们偏转多个波长，例如使用相应的涂层。关于使用反射镜，参考关于前述实施例的说明。在该实施例中，通过相位选择元件可以避免具有不同偏振的双通道，因此可以避免由于不完全90°的偏振旋转而导致可能的残余调制。
为了补偿各个照明波长的光的路径之间的路径长度的差异，可以在相位选择元件和输出偏光元件之间布置例如产生附加玻璃路径的补偿元件，结果是试样中的多个光片同时在空间上叠加，同样的试样区域也被激动。然而，或者，这样的路径长度补偿也可以通过将预设的相位分布与相应的散焦物体叠加来实现。
在这种结构的发展中，分别使用与输出偏光元件相同的一个输入偏光元件，用于选择区域的选择的装置包括至少一个二向色分束元件，其光源和相位选择元件之前，并且将入射光分为至少一个反射的部分光束和一个透射的部分光束，并表示组合的输入和输出偏光元件。
例如，当两个部分光束被反射时，可以使用三个照明波长，这可以通过二向色分束元件的相应设计来实现。然后优选地形成为具有入射光所到达的两个平行的大面积的平面型平行板。第一分色层形成在第一大面积上或应用于第一大面积，第二分色层形成在第二大面积上或应用于第二大面积。两个分色层对于不同的照明波长或不同的照明波长的范围选择性地即反射地起作用-后者在这种分束元件的顺序排列的情况下是有利的。
该实施例优选地还包括第一偏光镜和第二偏光镜，其中相位选择元件位于两个偏光镜之间。第一偏光镜将所述至少一个反射的部分光束偏转到相位选择元件上。第二偏光镜将透射的部分光束偏转到相位选择元件上。多个二向色分束元件也可以串联连接，结果是越来越多的照明波长从连续地被透射和/或反射的光束中耦合出来。实现偏光镜相对于相位选择元件和至少一个二向色分束元件的布置，使得第一偏光镜引导来自相选择元件的透射的部分光束，并且第二偏光镜将来自相位选择元件的反射的部分光束分别都引导回至少一个二向色分束元件上，并且以这种方式，部分光束在光束成形模块中覆盖相同的光路。这可以通过反射镜相对于相位选择元件和分束元件的相应布置来实现。
在光片显微镜的另一实施例中，用于选择区域的选择的装置最终包括一个色散或衍射光学元件，它被布置在一个光源和相位选择元件之间，该色散或衍射光学元件以彼此不同的角度偏折一个照明波长中的每一个的光。可选地，在色散或衍射光学元件和相位选择光学元件之间还设置成像元件，其中衍射或色散光学元件和相位选择元件分别布置在可选光学成像元件的焦平面中或附近，并且其中相位选择元件被设计成通过相位调制将光反射到成像元件中。代替可选的光学成像元件，也可以使用第二衍射或分散光学元件；两者之间可以实现入射光和射出光束之间的光束位移。
例如，色散光学元件可以是棱镜，衍射光学元件可以是光栅。平面型平行玻璃板的使用也是可能的，如果平面型平行玻璃板相对于入射光束的方向倾斜地布置。从空气向介质过渡中的角分散而从分散介质返回空气的过渡中的角分散导致光束的颜色依赖的平行位移。或者，可移动反射镜也可以实现快速的依序拆分。通过色散或衍射光学元件，照明波长的光根据其颜色以不同的角度撞击。
如果使用光学成像元件，则色散光学元件或衍射光学元件分别被布置为尽可能靠近成像元件(例如凹面镜)的焦平面。因此，在通过色散或衍射光学元件之后，角拆分导致不同颜色的位置拆分。相位选择元件同样位于尽可能靠近光学成像元件的焦平面处或者在光学成像元件的焦平面中，结果是每个颜色聚焦在相应的选择区域上。在这种情况下，相位选择元件也起反射作用，并且在相位调制之后，光束在返回上再次组合。为了将每个照明波长的入射光束与出射光束分开，优选地相对于入射光的光路倾斜布置相位选择元件，结果在色散或衍射光学元件中，在每个照明波长的入射光束和出射光束之间产生光束位移。或者-当使用在相位选择元件和光学成像元件之间配置的λ/4板-也可以使用布置在光路中的偏振方向的变化和偏振分束器，该偏振分束器布置在光源和光学色散或衍射元件之间。
应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，上述特征和下面将要说明的特征不仅可以在所述组合中使用，而且可以以其它组合或单独使用。选择输入偏光元件
附图说明
下面通过参考附图的实施例来解释本发明，附图也公开了本发明所必需的特征，其中：
图1是倒置光片显微镜的示意图，
图2是具有多个选择区域的相位选择元件，
图3是具有光束成形模块的光片显微镜示意图，
图4是光束成形模块的第一设计，
图5a，b是光束成形模块的其他设计，
图6a，b是光束成形模块的进一步设计
图7a，b是光束成形模块的再次其他设计。
具体实施方式
图1首先示出光片显微镜的基本结构，可以借助于光片显微镜对试样进行检测。在这里，光片显微镜以倒置的构造示出，这仅示例性地可以理解为，在其中可对试样从上方或从侧面进行观察的光学显微镜也是可行的构造方案。试样1处在试样腔室2中并且由液体3、例如水或营养液包围。试样腔室2具有由玻璃制成的、预设厚度的侧壁和底部，在此，厚度例如等于常见的显微镜载玻片的厚度，例如为0.17mm。试样腔室2支承在显微镜载物台4上，显微镜载物台能够手动或以马达驱动地沿三个空间方向移动。光片显微镜的各个元件设置在试样腔室2的下方，试样腔室具有透明的底部5。在光片显微镜的物镜与试样腔室2的底部5之间存在所谓的虚拟中继器6，具有内透镜和外透镜。在虚拟中继器6的内透镜与试样腔室的底部5之间同样存在液体3。在虚拟中继器6的内透镜与外透镜之间存在包围的大气，通常为空气，同样在虚拟中继器6的外透镜与光片显微镜的物镜之间也存在包围的大气。
虚拟中继器6用于平衡由于照明物镜的光轴和检测物镜的光轴不垂直于试样腔室2的底部5地设置而产生的像差。取代虚拟中继器6地，在进行这种修正时，也可以使用其他修正机构，诸如前置透镜或自由形状透镜，其集成在物镜中。
在左侧示出照明光束路径。经由光束成形模块8和扫描模块9将出自照明模块(例如，激光模块7)的光引导到照明物镜10上，对于该激光模块，例如这里可以容纳不同波长的几个激光器，并且能够在不同波长之间进行选取，其中，也可以同时选择多个波长；光束成形模块8和扫描模块9例如可以用于产生准静态的光片和/或用于角度扫描；照明物镜10使进入在这里包括了照明物镜的光轴的光片平面的光片成像到试样中。照明物镜10的焦点、也就是光片具有最薄的伸展的部位能够借助于驱动装置、例如压电驱动装置11来调制。可替换地，也可以移动显微镜载物台4。
在右侧呈现出检测光束路径的示例。检测光束路径包括检测物镜12，检测物镜能够类似于照明物镜10地借助于驱动装置、在这里为压电驱动装置13得到调制。检测物镜12的光轴与照明物镜10的光轴所处于的光片平面围成不为零的角，这里为直角。但是，这不是使得过程起作用所必需的，在光片平面与检测物镜12的光轴之间不为零的角度就足够了。通过检测物镜12将从试样1发射的荧光通过分束器14转向到不同的检测模块15和16上。在同时或近乎同时地利用包括多个波长的光片照明试样时，例如可以有区别地根据波长来执行检测。在检测模块15、16中，一般存在扇形的检测器，这种检测器记录强度并且转换呈相应的电信号，所述电信号参与到图像处理中。光片显微系统通过能够借助于压电驱动装置18移动的概览物镜17来加以完善。概览物镜17用于首先检测试样的概观，并且选定要关注的区域(ROI)，然后能够将照明和检测聚焦到所述区域上。
图2示出了相位选择元件19。在该相位选择元件19上，施加预设为用于不同照明波长(该照明波长用于照明)的相位分布。这些照明波长是根据分析的具体要求选择的，用于试样1的照明光线由照明波长组成。相位分布预设为：在照明物镜10的焦平面中，对于预定形状的光片，利用相应照明波长的光确定该光片的电场，并且由此分别计算出待预设的相位分布，其中，在孔板平面中，基于光片的位置对中间区域进行消隐，使得孔板结构将相应照明波长的结构化的光的零阶消隐。
这种相位分布是针对每个照明波长确定的。预设的相位分布中的每一个都在其各自的选择区域20中被施加在相位选择元件19上，该选择区域20被分配给不与其他选择区域20重叠的相应照明波长。在图2的相位选择元件19上表现为具有五个这样的选择区域20，这五个选择区域20对应于五个可能的照明波长。每个相位分布针对相应照明波长进行了优化，即，对于该波长而言，相位偏差分别被设置为π，在相位分布的确定中仅考虑该波长。相位选择元件19被在照明光束路径中的位于中间像平面内或附近的照明光线照射，其中只有相应照明波长的光被引导到每个选择区域20上并且在不同的照明波长的光组合以形成共同的波束之前被相位选择元件结构化。以这种方式被结构化的照明光线被成像到孔板平面中，该孔板平面被设置在相位选择元件的下游，并且在该孔板平面中产生相应照明波长的照明光线的频谱。孔板结构然后被优选地适配，使得相应照明波长的结构化的照明光线的零阶在孔板平面中基本上被消隐，由此，在下游的照明物镜10的焦平面中，形成有相应照明波长的结构化的光片，其中光片平面垂直于曝光物镜10的焦平面。然后，光片平面中的相应照明波长的结构化的光片来照明试样1，一般来说几个单色光片的叠加来照明试样1；对于不同的颜色，照明可以同时或几乎同时(即，非常快速地改变)地实现。由试样1发射的光线沿检测方向得到检测，其中检测方向与光片平面形成不为零的角度。
可以使用空间光调制器(SLM)作为相位选择元件19。使用具有稳定施加的相位分布的一个或多个相位板也是可能的，因为针对相应波长，相位图案一旦已经被优化并且然后不需要被再次改变，结果是针对各个波长被优化的固定的相位分布也可以用来代替SLM，该固定的相位分布已经施加在一个相位板或几个相位板上。预设的光束形状可以是例如sinc3光束，但是也可以使用贝塞尔光束(Bessel beams)和马蒂厄光束(Mathieu beams)。小相位板也可以用作单独的元件，在每个单独的元件上仅施加一个选择区域被，然后这些单独的元件彼此叠加地(可选地也可以空间上稍微偏移以例如补偿路径差)设置在光束路径中。
然后可以通过在光路中选择相应图案来实现多个照明波长之间的快速变化或利用若干照明波长进行的同时照明。然后，对于每个选择区域，可以建立其自己的光路，例如通过使用快速光学切换经由可移动反射镜来选择用于快速顺序照明的光路。或者，还可以使用色分光学元件，通过该色分光学元件可以将光束路径分割成用于不同颜色的不同路径。在后一种情况下，仅通过选择用于激励的照明波长来选择对应的光路。这里也可以同时地或依序地进行选择。色分元件可以包括例如色散或衍射元件或二向色分束器。
图3以概略图的形式再次示出了具有元件的光片显微镜，其中一些元件对于光束成形是重要的。在这里，与图1相比，光片显微镜以直立构型示出。利用光束成形模块8，光束根据需要成形并成像到界面21中，该界面21被定位成使得在那里产生所需的光束的傅里叶变换。然后，其可以例如借助于4f成像将光束成像到扫描模块9中的扫描镜22上。扫描镜22继而被成像到照明物镜10的光瞳中；以这种方式，光片可以通过快速扫描运动在试样1中展开。检测物镜12通常进行检测，检测物镜12的定向基本上垂直于光片。此后，现有技术中本身已知的颜色和多通道检测的分离可以通过分色器和例如各自装备有扇形检测器的几个照相机来实现。
光片显微镜还包括照明装置，其包括激光模块7，并且通常产生用于几个照明波长的相干照明光线。在光束成形模块8中利用照明光线生成光片。光束成形模块8包括相位选择元件，例如图2中的相位选择元件19，在该相位选择元件19上设置有空间上彼此分开的几个选择区域20，其中一个选择区域20分别被分配给特定的照明波长。在每个选择区域20上施加预设为用于相应照明波长的相位分布。借助于照明物镜10，利用光片来照明试样，检测物镜12将由试样发射的光成像到扇形检测器上，其中根据照明波长的数量，能够实现被分束到多种颜色的待被探测的光束，其中此种扇形检测器被分配给各个颜色通道。参考图3，检测物镜12的光轴与所述照明物镜10的光轴形成直角，因为该直角对于观察条件而言是最适宜的，但是角度更大或更小的其他构造也是可能的，只要该角度不是0°和180°。
所述光束成形模块特别地还包括根据所述相应照明波长用于所述选择区域20的依序选择或同时选择的装置，即，在相位调制之前进行照明光线的空间拆分的装置和用于后续的组合的装置。将参照下面的附图4-7更详细地说明这些。
在光片显微镜的主要设计用于选择区域20的依序选择的一个实施例中，用于这种选择区域20的依序选择和照明的装置包括设置在光源(例如激光模块7)和相位选择元件19之间的光路选择元件，该光路选择元件用于根据照明波长将光偏转到相应的选择区域20上。这样的设计如图4所示。为了在相位选择元件19(例如SLM)的选择区域20中进行预设相位分布的快速依序选择，这里使用照明扫描镜23；这代表光路选择元件。该光路选择元件耦合到控制单元，该控制单元例如借助于声光元件来切换激光器的输出。由多个段25构成的分段反射镜24设置在相位选择元件19的下游。多个段25形成为平面反射镜表面，这些平面反射镜表面以预定角度彼此排列以形成分段反射镜24，在该分段反射镜24中，一个段25分别被分配给一个照明波长，结果是入射到分段反射镜24上的光被反射回相位选择元件19的被分配给相应照明波长的选择区域20，其中只有先前来自相应选择区域20的光通过反射被引导到所分配的段25上。
λ/4板26被设置在相位选择元件19和分段反射镜24之间。相位选择元件19形成为使得在第一偏振方向的情况下不修改光的相位，在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下，修改所述相位。这预先假定照明光线被相应地偏振，此外，相位选择元件19必须对应于偏振方向对准。
来自各个激光光源27的光通过准直仪28被准直成具有高斯强度分布的光束。通过反射镜29或二向色分束器30，各个照明波长的光借助于包括两个柱面透镜31和32的望远镜在一个轴上被合并和减少，结果是选择区域20被最佳地照亮以具有相位分布。选择区域20的较长边定位成垂直于纸面，即光片平面同样垂直于纸面。照明波长的光然后通过λ/2板33对准，使得其无阻碍地通过随后的偏振分束器34。对于光片平面中的偏振，这里示出为但不限定一般性，利用在λ/2板33和偏振分束器34之间的双箭头以及在相位选择元件19和λ/4板26之间的双箭头来标记该偏振。这种情况下，相位选择元件19将被对准，使得其被动地起作用，即对来自照明扫描镜23的光反射性地做出反应而不影响光的相位。每个照明波长的光通过λ/4板26，被分段反射镜24的相应的段25反射，并且再次通过λ/4板26，该λ/4板26以这种方式确保：当光线第二次到达相位选择元件时，照明光线的偏振被旋转90°，该光线标记有圆圈，这意味着垂直于光片平面的偏振和位于该位置的选择区域20中的相位分布现在作用在该光线上。在纯粹的反射性动作的返回期间，逆序-即首先是相位的调制并且然后是偏转的旋转-也是可以想到的。然而，这里所示的过程的优点在于，对于随后的成像-每个照明波长的照明光线再次通过照明扫描镜23，到达偏振分束器34，在此偏光分束器34处由于改变的偏振方向该光束现在被偏转-可以使用具有较短焦距的透镜35，以便将相位图案成像在中间像平面之外。透镜35在可选孔板37的平面中产生期望光束的傅里叶变换。可以使用可选的孔板37，以便滤除不期望的空间频率，该不期望的空间频率可以例如通过在SLM的像素处的衍射形成。通过连接到其上的4f系统，这里总体通过透镜38来表示，频谱可以被成像到扫描仪上，然后成像到照明物镜10的光瞳中。
例如，可以通过不同的准直状态来补偿照明(即在准直器28和相位选择元件19之间的光路上)中的色彩效果。例如，通过光学校正元件，或通过将光束成形相位图案与相应的散焦物体重叠可以补偿不同的光路长度。根据照明扫描镜23的位置，可以通过控制装置例如通过激光模块7中的声光元件来切换激光波长。
在结合图5a)和5b)描述的另一实施例中，用于选择区域20的同时选择和随后照明的装置包括设置在光源和相位选择元件19之间的一个或多个选择性偏光元件。每个偏光元件分别被分配给一个照明波长并将光引导到相应的选择区域20。在该示例中，使用三个照明波长，但是也可以更多或更少。这些偏光元件在图5a)和5b)所示的示例中被设计为二向色分束器38。反射镜39确保了以前未被选择的波长同样地被提供给相位选择元件19。这里，光将通过一个接一个的方式通过这些偏光元件，结果是在通过第二偏光元件之后，只有一个照明波长的光依然存在，反射镜39同样作为分配给单一照明波长的偏光元件。也可以分别使用分束器38代替反射镜39，特别是当偏光元件在光束路径中不会一个接一个地设置时。平面反射镜40设置在相位选择元件19的下游，并且λ/4板26设置在平面反射镜40和相位选择元件19之间。类似于图4所示的实施例，相位选择元件19在第一偏振方向的情况下不修改光的相位，并且在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下修改相位。图5a)所示的实施例中的操作和光束行进方式与已经结合图4描述的实施例类似，不同之处在于使用一个或多个二向色分束器38和一个反光镜39，从而针对各个预设的相位分布，即针对每个照明波长，产生其自己的光路。通过λ/2板33设置偏振，使得相位选择元件19(例如SLM)在前进路径上被动地表现，即不影响相位，并且仅用作简单的反射镜。由于空间光束的拆分，代替分段反射镜24，在图5a)和图5b)所示的实施例中，可以使用简单的平面反射镜40。λ/4板26确保在前进路径和返回路径之间的偏振旋转，即，在第二次撞击相位选择元件19之前使偏振旋转90°，其中位于该位置处的相位图案位置然后作用于照明。
在图5a)所示的变型中，要被引导到照明物镜10中的光的耦合输出再次由偏振分束器34实现。在图5b)所示的实施例中，除了波束成形相位图案之外，在相位分布上还施加闪耀光栅，该闪耀光栅仅作用于两个偏振方向中的一个，优选地与相位图案相同的偏振方向，因此，例如在返回路径上被通过。这种闪耀光栅导致额外的角度偏转，从而导致激发光束路径(相位选择元件19与照明物镜10或试样1之间的光束路径，以及照明光束路径，该照明光束路径即光束路径的位于激光模块7和相位选择元件19之间的一部分)的空间分离。由于分离，光束可以通过另一反射镜41而不是由偏振分束器34耦合输出。由于施加在相位分布上的额外的闪耀物体形成的角度偏转可以然后由色散元件再次合并和叠加。在相同的额外角度偏转的情况下，如图5b)所示，在反射镜41的反射之后产生照明波长的光束的平行位移；例如，可以通过相对于光束方向倾斜(即设置成不同于90°的角度)的平面型平行玻璃板42来再次合并光束。另一方面，如果在用于每个照明波长的相位图案上施加相同的闪耀物体，则由于相同的光栅常数，在不同的波长处实现偏转，结果是用于照明的结构化光束在离开相位选择元件19后具有稍微不同的角度。然后优选将色散元件设计为棱镜。
叠加不同照明波长的有用辐射是有利的，即产生公共光路，因为光片因此也被叠加在试样中，因此在空间和时间上同时激发相同的试样区域。然而，这种叠加并不是绝对必要的，特别是只表现在光片平面上的偏差是可以容忍的。
在结合图6(a)和b)描述的另一实施例中，用于选择区域20的同时选择的装置包括设置在光源(例如激光模块7)和相位选择元件19之间的一个或多个选择性输入偏光元件，其中每个输入偏光元件分别被分配给一个照明波长，并且被设置成将光引导到相应的选择区域20。对于光束组合，光束成形模块8又包括一个或多个串联设置的并且设置在相位选择元件19的下游的输出偏光元件，输出偏光元件中的每一个也分别分配给照明波长中的一个，并将被反射的并且相位被修改的光偏转到相应选择区域20之外。
与先前描述的设置相反，在图6a)和6b)中描述的设置中，省略了偏振分束器的使用，结果仅需要达到相位选择元件19接近一次。然而，光需要明确的偏振方向，通过λ/2板33产生该明确的偏振方向。这里，如在结合图4和5所描述的其它设置中，相位选择元件19分别相对于此偏振方向对齐。原则上，当然，用于选择区域20的同时选择所有设置也可以用于依次选择选择区域20，如果需要的话。在图6a)和6b)所示的实施例中，也使用一个或多个二向色分束器38，以便为不同的照明波长或选择区域建立不同的光路。因此，输入偏光元件由二向色分束器38实现。反射镜39确保以前未选择的波长同样提供给相位选择元件19。类似于图5a)和图5b)，反射镜39在这里同样作为输入偏光元件，因为以示例的方式示出了顺序的设置，然而，二向色分束器38也可以用在该反射镜39的位置。然而，与图5a)和b)所示的设置相反，这里使用了一组输出偏光元件，这里是在光束路径中分布在相位选择元件19的下游的二向色分束器43和反射镜44。在输出偏光元件、二向色分束器43和反射镜44的帮助下，组合光束示例性地再次由这里使用的三个照明波长的光束产生。以这种方式，可以省略相位选择元件19的双重通过，并且以这种方式避免了如果偏振旋转不是正好90°可能发生的可能的残余调制。选择性输入偏光元件可以被构造成与输出偏光元件相同，或者在相应的光束引导的情况下也与输出偏光元件相同。特别地，通过具有两个偏光镜和一个二向色分束元件(这两个偏光镜和一个二向色分束元件作为组合的输入和输出偏光元件)的相应设置，该二向色分束元件具有彼此平行但设置有不同分色层的两个表面，当相位选择元件(19)位于两个偏光镜之间时，可以实现三个照明波长的分裂，这三个照明波长全部覆盖相同的光路。
在图6(b)所示的例子中，在相位选择元件19和输出偏光元件之间，附加地设置补偿元件45，以用于补偿各个照明波长的光的路径之间的路径长度之差。这些补偿元件35例如形成为简单的玻璃体。然而，还可以通过将光束成形相位图案与相应的散焦物体叠加来实现补偿。以这种方式，图6b)所示的变型使得光束成形模块的紧凑的轴上设置成为可能。
在光片显微镜的光束成形模块8的另一实施例中，用于选择区域20的装置包括设置在光源和相位选择元件19之间的色散或衍射光学元件，该色散或衍射光学元件以不同的角度使每个照明波长的光偏转；以及可选的设置在色散或衍射光学元件和相位选择元件19之间的光学成像元件，其中色散或衍射光学元件和相位选择元件19分别设置在成像元件的焦平面内或附近。相位选择元件19通过相位调制将光反射回成像元件。成像元件的使用只是可选的。
下面将结合图7a)和图7b(b)来更详细地说明本实施例。这里，对于每种颜色，借助于设计为棱镜46的两个色散元件来建立它们自己的光束路径，结果是相应照明波长的光仅在所分配的选择区域20上到达相位选择元件19。另外利用不同照明波长的光束通过不同光程长度的事实。通过相对于入射光的光路倾斜光束路径中的相位选择元件19，当光在返回路径上从棱镜46出射时产生光束位移。另一个简单的可能性是使用平面型平行的玻璃板，其中从空气向介质的过渡中的角分散和当从分散介质中出射时的角分散导致光束的基于颜色的平行位移。代替棱镜的衍射光学元件(例如光栅)的使用也是可想到的并且具有相同的效果；在这两种情况下都是静态设置。
在图7b)所示的设置中，仅使用一个色散元件，棱镜46，另外还有一个成像元件，这里是设置在棱镜46和相位选择元件19之间的凹面镜48。这是一个所谓的4f设置，即角拆分的位置(棱镜的入射表面背离凹面镜)位于凹面镜48的焦平面或其附近。类似地，相位选择元件19是也位于凹面镜48的焦平面中或靠近凹面镜48的焦平面。由于棱镜46的放置(或者还可以使用光栅，或者也可以，例如借助于可移动反射镜依次实现拆分)，基本上不同的照明波长的光的位置拆分来自于在凹面镜48的反射之后的角度拆分。由于相位选择元件的位置，通过凹面镜48，每个照明波长的光再次分别聚焦在一个方向上，即分别仅仅聚焦到相位选择区域20。在相位选择元件19的相位调制之后，光被反射和被修改，光束再次在返回路径上组合到棱镜46的出射表面，该出射表面远离凹面镜48并对应于前述的入射面。
为了将入射的光束与出射光束分离，例如可以选择位置位移，该位置位移通过相位选择元件19在纸面中的角位移来实现。然而，位置位移也可以垂直于纸面生成；或者，如已经结合图4和图5所描述的，也可以执行根据偏振状态的分离。
可以用上述方法产生多色光片，其中，对于每种颜色，相对于厚度和人工制品以及结构的限制，光片以最佳可能的方式成形。利用照明物镜10的给定波长和数值孔径，利用所使用的相位选择元件19的最大衍射效率，为每种颜色生成具有尽可能小的厚度的光片。
附图标记列表
1 试样
2 试样腔室
3 液体
4 显微镜载物台
5 透明底部
6 虚拟中继器
7 激光模块
8 光束成形模块
9 扫描模块
10 照明物镜
11 压电驱动装置
12 检测物镜
13 压电驱动装置
14 分束器
15，16 检测模块
17 概览物镜
18 压电驱动装置
19 相位选择元件
20 选择区域
21 界面
22 扫描镜
23 照明扫描镜
24 分段反射镜
25 段
26 λ/4板
27 激光光源
28 准直器
29 反射镜
30 二向色分束器
31，32 圆柱形透镜
33 λ/2板
34 偏振分束器
35，36 透镜
37 孔板
38 二向色分束器
39 反射镜
40 平面反射镜
41 反射镜
42 玻璃板
43 二向色分束器
44 反射镜
45 补偿元件
46，47 棱镜
48 凹面镜
Claims (25)
1.一种光片显微镜，包括：
照明装置，其产生用于多个照明波长的相干照明光线，
光束成形模块(8)，其用于利用所述相干照明光线产生光片，
照明物镜(10)，其利用所述光片对试样(1)进行照明，
检测物镜(12)，其用于将由试样发射的光成像到扇形检测器上，其中所述检测物镜(12)的光轴与所述照明物镜(10)的光轴形成不同于0°和180°的角度，其特征在于，
光束成形模块(8)，其包括相位选择元件(19)，该相位选择元件(19)设置在中间像平面内或中间像平面的附近且设置有空间上彼此分离的多个选择区域(20)，其中一个选择区域(20)分别被分配给一个特定的照明波长，并且其中在每个选择区域(20)上施加预设为用于相应照明波长的相位分布，并且
所述光束成形模块(8)包括用于根据所述相应照明波长对所述选择区域(20)进行依序选择或同时选择的装置，其中用于所述选择区域(20)的选择的装置形成为将相应照明波长的光引导至所分配的选择区域(20)。
2.根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于，作为组件的相位选择元件(19)由几个单独的元件组成，其中每个单独元件分别被分配给一个照明波长。
3.根据权利要求1或2所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域(20)的依序选择的装置包括：光路选择元件，其设置在照明装置和相位选择元件(19)之间，所述光路选择元件用于根据照明波长将光偏转到相应的选择区域(20)；分段反射镜(24)，其由设置在相位选择元件(19)的下游的多个段(25)组成，并且其将入射光反射到相位选择元件(19)的分配给所述照明波长的选择区域(20)，其中一个段(25)分别被分配给一个照明波长；以及一个λ/4板(26)，其设置在分段反射镜(24)和相位选择元件(19)之间，其中相位选择元件(19)被设计为在第一偏振方向的情况下不改变光的相位，并且被设计为在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下改变所述相位。
4.根据权利要求1或2所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域(20)的同时选择的装置包括：至少一个选择性偏光元件，其设置在照明装置和相位选择元件(19)之间，其中每个选择性偏光元件分别被分配给一个照明波长并且被设置成将光引导到相应的选择区域(20)上；平面反射镜(40)，其设置在相位选择元件(19)的下游；和1/4λ板(26)，其设置在平面反射镜(40)和相位选择元件(19)之间，其中，相位选择元件(19)被设计成在第一偏振方向的情况下不改变光的相位，并且被设计为在垂直于第一偏振方向的第二偏振方向的情况下改变所述相位。
5.根据权利要求4所述的光片显微镜，其特征在于，施加在每个选择区域(20)上的是闪耀光栅，所述闪耀光栅被设计成在第二偏振方向的情况下改变光的反射角。
6.根据权利要求1或2所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域(20)的同时选择的装置包括：至少一个选择性输入偏光元件，其设置在照明装置和相位选择元件(19)之间，其中每个选择性输入偏光元件分别被分配给一个照明波长并且被设置成将光引导到相应的选择区域(20)上；对于光束组合，所述用于选择区域(20)的同时选择的装置包括至少一个输出偏光元件，其设置在相位选择元件(19)的下游，其中每个输出偏光元件分别被分配给一个照明波长，并偏转来自相应的选择区域(20)的光。
7.根据权利要求6所述的光片显微镜，其特征在于，在相位选择元件(19)和输出偏光元件之间，设置补偿元件(45)以用于补偿各个照明波长的光路之间的路径长度之差。
8.根据权利要求1所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域(20)的选择的装置包括至少一个二向色分束元件，其设置在照明装置和相位选择元件(19)之间以用于将入射光分成至少一个反射的部分光束和一个透射的部分光束。
9.根据权利要求8所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域(20)的选择的装置包括：第一偏光镜，其将所述至少一个反射的部分光束偏转到相位选择元件(19)上；以及第二偏光镜，其将透射的部分光束偏转到相位选择元件上，其中相位选择元件(19)形成为反射性的并且位于所述第一偏光镜和所述第二偏光镜之间的光束路径中。
10.根据权利要求8或9所述的光片显微镜，其特征在于，所述二向色分束元件形成为具有两个平行的大面积的平面型平行板，其中第一分色层被施加到第一大面积，第二分色层被施加到第二大面积，其中两个分色层对于不同的照明波长或不同范围的照明波长做出反射性反应。
11.根据权利要求1或2所述的光片显微镜，其特征在于，用于选择区域的选择的装置包括设置在照明装置和相位选择元件之间的色散或衍射光学元件。
12.根据权利要求11所述的光片显微镜，其特征在于，所述色散或衍射光学元件是以彼此不同的角度偏转每个照明波长的光的玻璃板，棱镜(46)或光栅。
13.根据权利要求11所述的光片显微镜，包括设置在所述色散或衍射光学元件和所述相位选择元件(19)之间的光学成像元件，其中所述色散或衍射光学元件和所述相位选择元件(19)各自设置在光学成像元件的焦平面中或附近，其中相位选择元件(19)被设计为利用相位调制将光反射到光学成像元件中。
14.根据权利要求13所述的光片显微镜，其特征在于，所述光学成像元件是凹面镜(48)。
15.根据权利要求13所述的光片显微镜，其特征在于，所述相位选择元件(19)设置在相对于入射光的光路倾斜的光束路径中，结果是在色散或衍射光学元件中，对于每个照明波长，在入射光束和出射光束之间产生光束位移。
16.一种通过光片显微镜检测试样(1)的方法，包括：
选择多个照明波长，其中用于试样(1)的照明光线由所述多个照明波长组成，
其中对于每个照明波长，在相位选择元件(19)上施加预设的相位分布，其中，在相位选择元件(19)上，将预设的相位分布中的每一个施加在其被分配给相应照明波长的且不与其他选择区域(20)重叠的各自的选择区域(20)中，
相位选择元件(19)被在照明光束路径中的位于中间像平面内或中间像平面的附近的照明光线照射，其中只有相应照明波长的照明光线被引导到每个选择区域(20)上并且在不同的照明波长的照明光线组合以形成共同的波束之前被相位选择元件(19)结构化，
由此，在下游照明物镜(10)的焦平面中，相应照明波长的结构化的光片成形为具有垂直于照明物镜(10)的焦平面的光片平面，
试样(1)被光片平面中的相应照明波长的结构化的光片照射，并且由试样(1)发射的光被定向在与光片平面之间的夹角不为零的检测方向上被检测到。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，通过在照明物镜(10)的焦平面中相干地叠加至少两个sinc3光束以使得光片成形并且通过计算焦平面中形成的电场，从而来确定所述光片的电场。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，通过如下的方式来确定光片的电场：使用预设形状的贝塞尔束来使得光片成形，确定焦平面中的这种贝塞尔光束的电场，以及算术地确定该电场和在焦平面中的分别以预定量Δ彼此间隔开的多个相同的电场之间的叠加。
19.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，衍射光学元件用作相位选择元件(19)。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述衍射光学元件是空间光调制器。
21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，作为组件的相位选择元件(19)由几个单独的元件组成，其中每个单独元件分别包括被分配给一个照明波长的一个选择区域。
22.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，对于每个选择区域(20)，根据照明波长将调制深度固定为π。
23.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在光片平面中利用相应照明波长的结构化的光片同时或依序地照射试样(1)。
24.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，被结构化的照明光线被成像到布置在相位选择元件(19)的下游的孔板平面中，并且在孔板平面中产生相应的照明波长的照明光线的频谱，并且预设的孔板结构被适配成使得相应照明波长的结构化的照明光线的零阶在孔板平面中基本上被消隐，其中预设的孔板结构被施加在孔板平面中的孔板上。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，对于每个照明波长，在相位选择元件(19)上施加预设的相位分布，其中在照明物镜(10)的焦平面中，对于预定形状的光片，利用相应照明波长的照明光线确定该光片的电场，并且由此分别计算出待预设的相位分布，其中，在孔板平面中，基于光片的位置对中间区域进行消隐，使得预设的孔板结构将相应照明波长的结构化的照明光线的零阶消隐。
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