CN107427523B

CN107427523B - 平滑肌肉瘤的靶向疗法

Info

Publication number: CN107427523B
Application number: CN201680021715.2A
Authority: CN
Inventors: K.A.本哈吉; C.马萨德; J-C.索里亚
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2016-04-06
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2036-04-06
Also published as: CN107427523A; US10555951B2; TW201709913A; HK1251166A1; ES2760462T3; EP3283079A1; JP6412278B2; EP3283079B1; US20180104254A1; TWI609687B; WO2016168014A1; JP2018511629A

Abstract

提供用于治疗平滑肌肉瘤的方法和包含4,4,4‑三氟‑N‑[(1S)‑2‑[[(7S)‑5‑(2‑羟乙基)‑6‑氧代‑7H‑吡啶并[2,3‑d][3]苯并氮杂䓬‑7‑基]氨基]‑1‑甲基‑2‑氧代‑乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物的药物。

Description

平滑肌肉瘤的靶向疗法

平滑肌肉瘤（LMS）是源自通常为子宫、胃肠道或软组织来源的平滑肌细胞的侵袭性软组织肉瘤。LMS肿瘤通常难治。预后不良，存活率属于所有软组织肉瘤中最低的。

治疗方案通常包括手术切除或宽切缘（margins）切除。可在手术前为实现宽手术切缘或在手术后为减慢全身性疾病的进展而使用放射疗法和化学疗法（或靶向疗法），如阿霉素、异环磷酰胺、吉西他滨和多西他赛、达卡巴嗪、海鞘素（ecteinascidin）和帕唑帕尼。

Notch信号传导是在哺乳动物的发育和组织稳态中起到不可或缺的作用的进化保留通路。Notch受体和配体含有单程跨膜区，在细胞表面上表达，因此Notch信号传导在介导表达受体和配体的相邻细胞之间的通信方面特别重要。在啮齿动物和人类中发现四种已知的Notch受体，被称作Notch 1至Notch 4。Notch受体是由最初作为单一多肽合成的细胞外和细胞内结构域构成的异二聚体（heterodimeric）蛋白质。受体-配体相互作用引发Notch受体多肽的一系列蛋白水解裂解，其中涉及γ-分泌酶活性。γ-分泌酶活性从细胞表面裂解Notch细胞内结构域，其易位到细胞核上以形成转录因子复合物。Notch细胞内结构域（NICD）是蛋白质的活性形式。各种Notch信号传导功能包括增殖、分化、凋亡、血管生成、迁移和自我更新。Notch信号传导在正常组织的发育和维持过程中的这些多样化的作用在不同形式的癌症中异常活化。Notch信号传导的致癌功能包括抑制凋亡和促进细胞增殖。

最近，在WO 2013/016081中公开了对各种肿瘤类型具有活性的特异性Notch通路信号传导抑制化合物。

需要在LMS的治疗中表现出活性（效力）的治疗剂。还需要对目前用于治疗LMS的治疗剂的替代性治疗剂。Notch抑制剂4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬(benzazepin)-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物是替代性治疗剂并且表现出令人惊讶和出乎意料的抗LMS的临床治疗活性。

图1是实施例2的化合物的代表性X-射线粉末衍射图。

本发明的一个方面提供治疗LMS患者的方法，其包括给予需要治疗的LMS患者有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

本发明的另一方面提供治疗LMS患者的方法，其包括给予需要治疗的LMS患者2.5至100毫克/剂的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

本发明的另一方面提供治疗LMS患者的方法，其包括给予需要治疗的LMS患者10至75毫克/剂的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

本发明的另一方面提供治疗LMS患者的方法，其包括给予需要治疗的LMS患者25至75毫克/剂的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

本发明的另一方面提供治疗LMS患者的方法，其包括给予需要治疗的LMS患者有效量的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物T.I.W.。

本发明的另一方面提供用于治疗平滑肌肉瘤的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺。

本发明的另一方面提供用于治疗平滑肌肉瘤的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，其中给药剂量为2.5至100毫克。

本发明的另一方面提供用于治疗平滑肌肉瘤的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，其中给药剂量为10至75毫克。

本发明的另一方面提供用于治疗平滑肌肉瘤的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，其中给药剂量为25至75毫克。

本发明的另一方面提供用于治疗平滑肌肉瘤的化合物或其可药用盐，其中所述化合物是4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，其中剂量给药为T.I.W.。

本发明的另一方面提供4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物用于制备用于治疗LMS的药物的用途。

本发明的另一方面提供与可药用载体和任选用于治疗LMS的其它治疗成分一起的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

化合物4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺在WO 2013/016081中被教导为Notch抑制剂。该名称指定具有下列结构的化合物：

.

化合物1。

“治疗有效量”或“有效量”是指抑制LMS患者中的Notch信号传导和破坏靶向癌细胞或减慢或阻止患者的癌症进展所必需的化合物1或其可药用盐或水合物或含有该化合物或其可药用盐或水合物的药物组合物的剂量。化合物1或其可药用盐或水合物在成年人中的预期剂量为2.5至100毫克/剂。优选剂量预期为10至75毫克/剂。最优选的剂量预期为25至75毫克/剂。在儿科患者中，剂量可能更低并预期基于表面积。医师将根据年龄、疾病的阶段和严重程度以及个体患者的特定需要和响应确定治疗患者所需的确切剂量和治疗时长。尽管设想了在每日基础上在上述范围内的给药，但可以调节给药方案以向患者提供更优治疗益处并管理和改善观察到的副作用，例如粘液性肠病（胃肠道中的粘液分泌过多和积聚）或与肿瘤坏死相关的症状。除每日给药外，每隔一日给药（Q2D）；在五日内每隔一日给药接着停药两日（T.I.W.）；或每3日一次（Q3D）也可能适当。在28天周期期间的T.I.W.给药方案是优选的，连同视需要给药（在化合物1之前、同时或之后给药）甾族化合物，优选皮质甾类，最优选地塞米松以管理或改善粘液性肠病。由于肿瘤坏死或其它因素可随医师的意见修改剂量和/或给药方案或周期。

术语“治疗”意在包括对患者所患的癌症的全方位干预，如给药活性化合物以减轻至减慢或逆转一种或多种症状和延迟癌症的进展，即使没有实际消除癌症。待治疗的患者是哺乳动物，特别是人类。

本发明的化合物优选使用可药用载体配制成药物组合物并通过各种途径给药。这样的组合物优选用于口服给药。这样的药物组合物及其制备方法是本领域中公知的。参见例如REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY（A. Gennaro等人, eds., 第19版, Mack Publishing Co., 1995）。在一个特定实施方案中，该药物组合物包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物和可药用载体。本发明还提供包含4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物以及可药用载体和一种或多种其它治疗剂的药物组合物。

本发明的化合物能与许多无机酸和有机酸反应以形成可药用酸加成盐。这样的可药用盐和它们的常用制备方法是本领域中公知的。参见例如P. Stahl等人, HANDBOOK OFPHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)；S.M. Berge等人, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷, 第1期, 1977年1月。

本文所用的术语“患者”是指哺乳动物；“哺乳动物”是指高等脊椎动物的哺乳纲；术语“哺乳动物”包括但不限于人类。

化合物1或其可药用盐或水合物可通过本领域中已知的各种程序以及下述那些制备。具体合成步骤可以以不同方式组合以制备化合物1或其可药用盐或水合物。

化合物1命名为：4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺；也可命名为：N-[(1S)-2-[[(7S)-6,7-二氢-5-(2-羟乙基)-6-氧代-5H-吡啶并[3,2-a][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代乙基]-4,4,4-三氟丁酰胺；并且可以使用其它名称明确指定化合物1。

要理解的是，化合物1被描绘为单一立体异构体。存在两个手性中心，产生四种立体异构体。如本文所用，提到化合物1还意在包括包含化合物1的外消旋混合物。在此，(R)-和(S)-的Cahn-Ingold-Prelog名称用于指示特定异构体。可通过立体有择合成使用对映异构体纯或富集的起始材料制备特定立体异构体。可通过本领域中公知的技术，如Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel和S. H. Wilen (Wiley 1994)和Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet和S. H. Wilen(Wiley 1991)中的那些，包括基于手性固定相的色谱法、酶法拆分或分级结晶或为该目的形成的非对映异构体，如非对映异构体盐的色谱法拆分起始材料、中间体或包含化合物1的外消旋混合物的特定立体异构体。尽管在本发明内设想含有本发明的化合物的所有混合物，优选实施方案是化合物1。

还已经发现，化合物1作为阻转异构体或特定构象异构体存在。在水溶液中，在环境温度下在24小时后通过¹H NMR和LC-MS检测到与阻转异构体1（主要阻转异构体）平衡的8-9%的阻转异构体2（次要阻转异构体）。在有机溶剂中，在环境温度下在24小时后，通过¹HNMR和LC-MS检测到与阻转异构体1平衡的大约1-2%的阻转异构体2。尽管可通过¹H NMR和LC-MS分析检测，但阻转异构体2不可分离。

用作本发明的化合物的合成中的初始材料的化合物是公知的并在不可购得的情况下，容易使用所提供的特定参考文献通过本领域普通技术人员常用的标准程序合成或可见于普通参考文本中。

已知程序和方法的实例包括普通参考文本，如Comprehensive OrganicTransformations, VCH Publishers Inc, 1989；Compendium of Organic SyntheticMethods, 第1-10卷, 1974-2002, Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry,Reactions Mechanisms, and Structure, 第5版, Michael B. Smith和Jerry March,Wiley Interscience, 2001；Advanced Organic Chemistry, 第4版, Part B, Reactionsand Synthesis, Francis A. Carey和Richard J. Sundberg, Kluwer Academic /Plenum Publishers, 2000等和其中引用的参考文献中描述的那些。

中间体和化合物1使用SymaxDraw版本3.2 Drawing Program由结构命名，因为始终适用IUPAC名。

制备1

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯

在环境温度下在氮气下将L-丙氨酸苄酯盐酸盐（7.00克，32.5毫摩尔）、二异丙基乙胺（28.30毫升，162.3毫摩尔）、水合1-羟基苯并三唑（7.46克，48.7毫摩尔）和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（9.33克，48.7毫摩尔）相继添加到4,4,4-三氟丁酸（7.131克，48.7毫摩尔）在二氯甲烷（162毫升）中的溶液中并搅拌20小时。加入20%柠檬酸水溶液（150毫升，162毫摩尔），将混合物搅拌5分钟并分离层。用二氯甲烷（100毫升）从水层中萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液（150毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸镁干燥并浓缩。通过快速色谱法，用己烷:乙酸乙酯（4:1至2:1）洗脱提纯残留物以产生白色固体形式的标题化合物（9.22克，30.4毫摩尔，94%）。MS (m/z): 304(M+1)；[α]_Na ²⁵= -44.6° (c=5.0, 甲醇)。

制备2

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸

在环境温度下将钯/碳（5%，1.76克，0.8毫摩尔）一次性添加到(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸苄酯（8.80克，29毫摩尔）在甲醇（88毫升）中的溶液中。将该混合物脱气（真空/氮气），填充氢气（1大气压）并在氢气（29毫摩尔）下搅拌5小时。经Celite®过滤，用甲醇冲洗滤饼并将滤液浓缩以获得白色固体形式的标题化合物（6.11克，28.7毫摩尔，99%）。MS (m/z): 214 (M+1)；[α]_Na ²⁵= -24.7° (c=5.0, 甲醇)。

制备3

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

将二甲基甲酰胺（2.1毫升，27.3毫摩尔）接着是亚硫酰氯（52.3毫升，717.8毫摩尔）经7分钟添加到用环境温度水浴冷却的2-溴苯基乙酸（150.0克，683.6毫摩尔）在二氯甲烷（1.50升）中的溶液中。将混合物搅拌5小时，经5分钟加入甲醇（41.5毫升，1.0摩尔）。使氮气鼓泡通过溶液过夜。浓缩以获得定量收率的无色油形式的标题化合物（166.0克，724.7毫摩尔）。1H NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.57 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 7.30-7.26 (m, 2H),7.19-7.12 (m, 1H), 3.80 (s, 2H), 3.72 (s, 3H)。

制备4

2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯

用三个真空/氮气循环将2-(2-溴苯基)乙酸甲酯（156.6克，684毫摩尔）、双(频哪醇合)二硼（194.9克，752毫摩尔）和乙酸钾（135.6克，1.4摩尔）在N-甲基吡咯烷酮（940毫升）中的悬浮液脱气。加入(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)（11.4克，13.7毫摩尔）并在80℃下加热。在15小时后加入(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)（11.4克，13.7毫摩尔）并在90℃下搅拌24小时。冷却至环境温度并倒在冰水混合物（3升）上，并加入甲基叔丁基醚（1升）。搅拌混合物，经Celite®垫过滤并分离层。用甲基叔丁基醚（2x500毫升）从水层中萃取。用水（2x500毫升）、盐水（500毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱法，用己烷: 乙酸乙酯(9:1)洗脱提纯残留物以产生白色固体形式的标题化合物（160.6克，581.6毫摩尔，85%）。MS (m/z): 277(M+1)。

制备5

5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

将碳酸钾（235.7克，1.71摩尔）添加到2-氨基-3-溴吡啶（88.5克，511.7毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（550毫升）和水（550毫升）中的溶液中。用三个真空/氮气循环将该混合物脱气，加入乙酸钯(II)（6.4 g, 28.4毫摩尔）和四氟硼酸三-叔丁基鏻（16.5克，56.9毫摩尔）并在氮气下在88℃下搅拌。经3分钟逐滴加入2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯（157.0克，568.5毫摩尔）在1,4-二氧杂环己烷（550毫升）中的溶液并将该混合物在88℃下搅拌20分钟。将混合物冷却至50℃，加入水（100毫升）并分离层。用乙酸乙酯（2x100毫升）从水层中萃取，经硫酸钠干燥合并的有机物并浓缩。将该浓缩材料溶解在N-甲基吡咯烷酮（314毫升）中，在冰浴中冷却并逐滴加入硫酸（314毫升，5.9摩尔）以保持大约45℃的温度。将混合物在140℃下搅拌90分钟。冷却至环境温度，加入冰（4千克）并用逐份添加的50% NaOH水溶液碱化直至溶液为pH 7-8。将悬浮液冷却至10-15℃，滤出固体并用水（2升）、己烷（1升）和甲基叔丁基醚（1升）洗涤。在真空下在40℃下干燥。用10%甲醇/二氯甲烷溶液的回流混合物处理材料并热过滤（x4）。浓缩合并的滤液以提供浅棕色固体形式的标题化合物（85克，404.3毫摩尔，71%）。MS (m/z): 211(M+1)。

制备6

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

将碳酸铯（186.6克，572.7毫摩尔）、(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基硅烷（88.0毫升，409.1毫摩尔）和碘化钠（6.1克，40.9毫摩尔）添加到5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（86.0克，409.1毫摩尔）在二甲基甲酰胺（860毫升）中的悬浮液中并在70℃下搅拌20小时。将混合物冷却至环境温度，倒在冰水（100毫升）上，加入乙酸乙酯（200毫升）。经Celite®过滤混合物，然后用乙酸乙酯（100毫升）洗涤。分离滤液的层，用乙酸乙酯（2x50毫升）从水层中萃取。用水（2x100毫升）、盐水（100毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥并浓缩。将材料溶解在四氢呋喃（1.28升）中，加入Silia® 结合（bond）钯清除剂（16.7 g）并在环境温度下搅拌20小时。经二氧化硅垫过滤，用四氢呋喃（200毫升）洗涤并浓缩以获得浅棕色油形式的标题化合物（155克，420.6毫摩尔），其以定量收率结晶。MS (m/z): 369(M+1)。

方法2:

将5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（22.5克，106.9毫摩尔）和二甲基甲酰胺（500毫升）的混合物加热至100℃持续5分钟。冷却至40℃，加入碳酸铯（104.3克，320.1毫摩尔）和(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基硅烷（29.9毫升，138.9毫摩尔）并在环境温度下搅拌过夜。加热至60℃持续大约2小时，然后冷却至环境温度。将该残留物在乙酸乙酯（1升）和水（3升）之间分配，用乙酸乙酯（2x500毫升）从水层中反萃取，用盐水（2x500毫升）洗涤合并的有机物。经硫酸钠干燥合并的有机物并浓缩。通过快速色谱法，用乙酸乙酯: 己烷（0:100至100:0）洗脱提纯残留物以产生油形式的标题化合物（39.4克，106.9毫摩尔，89%）。MS (m/z): 369(M+1)。

制备7

5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

在-5℃下将2-甲基丙-2-醇钾（66.1克，588.8毫摩尔）添加到5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（155.0克，420.6毫摩尔）在四氢呋喃（1.6升）中的溶液中并搅拌10分钟。在-5℃下逐滴加入亚硝酯异戊酯（61.9毫升，462.6毫摩尔）并将混合物搅拌10分钟。倒在冰/水（2升）上并用乙酸乙酯（3x200毫升）萃取。用盐水（200毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥。加入甲苯（1升）并浓缩（x3）以获得稠棕色油形式的标题化合物（160.0克，402.5毫摩尔，96%）。MS (m/z): 398(M+1)。

制备8

(7S)-7-氨基-5-(2-羟乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

在环境温度水浴中将三氟乙酸（124.0毫升，1.64摩尔）分几份添加到5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（155.0克，389.9毫摩尔）在二氯甲烷（620毫升）和甲醇（310毫升）的混合物中的溶液中。分几份加入锌（76.5克，1.2摩尔）以使内部温度保持在33-38℃。在环境温度下搅拌15小时。经Celite®过滤混合物，用10%甲醇/二氯甲烷（100毫升）洗涤并浓缩滤液。加入二氯甲烷（0.5升）和冰（500克），搅拌并用50% NaOH水溶液碱化。滤出固体，分离滤液层。用二氯甲烷（2x100毫升）从水层中萃取，并浓缩合并的有机物。将固体在己烷中制浆（slurry），然后过滤和在高真空下干燥以获得浅黄色固体形式的标题化合物的外消旋物（74.0克，274.8毫摩尔，71%）。在用乙醇（0.2%二甲基乙胺）: 乙腈（0:100至100:0）洗脱的Chiralpak® AD柱上提纯该材料以获得白色固体形式的标题化合物（35.0克，130毫摩尔，33.3%）。MS (m/z):270(M+1)；[α]_Na ²⁵= +187.83° (c=6.9, 甲醇)。

制备9

7-叠氮基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

用己烷洗涤氢化钾（大约2勺，35重量%，在矿物油中）并倾析以除去油，加入四氢呋喃（60毫升）并冷却至-78℃。将2,4,6-三(1-甲基乙基)-苯磺酰基叠氮（37.6克，121.6毫摩尔）在四氢呋喃（60毫升）中的溶液经硫酸钠干燥45分钟。将叠氮化物溶液经15分钟倾析到该氢化钾悬浮液中。移除冷浴并将其温热至环境温度持续45分钟；留出无水溶液。将二异丙胺（17.0毫升，121.0毫摩尔）和四氢呋喃（50毫升）的溶液冷却至-78℃，经5分钟逐滴加入正丁基锂（52.1毫升，130.3毫摩尔）。移除冷浴并将其温热15分钟，然后冷却回-78℃。经5-10分钟经导管引入（cannulate into）5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（34.3克，93.1毫摩尔）在四氢呋喃（400毫升）中的-78℃溶液中。在-78℃下搅拌1小时，然后移除冷浴并将其温热15分钟（至大约-45℃）。冷却至-78℃并经导管经5-10分钟加入经干燥的2,4,6-三(1-甲基乙基)-苯磺酰基叠氮溶液。移除浴并将其经1小时温热至-5至0℃。在冰/水浴中冷却并经13分钟逐滴加入乙酸（26.7毫升，465.3毫摩尔）。经65分钟温热至环境温度并用饱和碳酸氢钠溶液（1升）淬灭。用乙酸乙酯（600毫升）和水（2升）稀释反应物，分离层，用乙酸乙酯（2 X 400毫升）从水层中反萃取。用饱和碳酸氢钠水溶液（500毫升）和盐水（500毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱法，用乙酸乙酯: 己烷（0:100至100:0）洗脱提纯残留物以产生油形式的标题化合物（39.8克，92.3毫摩尔，99%）。MS (m/z): 410(M+1)。

制备10

7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

将钯/碳（2.2克，1.0毫摩尔，5%，在碳上）添加到7-叠氮基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（39.8克，92.3毫摩尔）在乙醇（923毫升）中的经氮气吹扫的溶液中。抽空/填充氢气三次并在环境温度下在氢气（1大气压）下搅拌过夜。经Celite®过滤，用乙醇和乙酸乙酯冲洗并浓缩以获得透明油形式的标题化合物（36.6克，89.9毫摩尔，97%）。MS (m/z): 384(M+1)。

制备11

N-[(1S)-2-[[5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

将7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（36.3克，89.9毫摩尔）、二氯甲烷（360毫升）、三乙胺（16.3毫升，116.9毫摩尔）、3-羟基三唑并[4,5-b]吡啶（15.9克，116.9毫摩尔）和(2S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸（22.5克，116.9毫摩尔）的混合物冷却至0℃。加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（22.4克，116.9毫摩尔）并在5分钟后将其温热至环境温度过夜。用水（500毫升x2）、饱和碳酸氢钠水溶液（2 x 300毫升）、盐水（300毫升）洗涤，然后经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱法，用异丙醇 : 己烷（5:95至10:90）洗脱提纯残留物以产生白色泡沫形式的标题化合物（43.14克，77.77毫摩尔，86.50%）。MS (m/z): 555(M+1)。

制备12

(2S)-2-氨基-N-[5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]丙酰胺

将三氟乙酸（30毫升，396.76毫摩尔）经5分钟添加到N-[(1S)-2-[[5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（5.56克，10.0毫摩尔）和二氯甲烷（30毫升）的0℃溶液中并将其温热并在环境温度下搅拌5小时。通过快速色谱法经SCX®柱（Isolute SCX-2x6），用甲醇，接着用乙酸乙酯: 甲醇（2N氨）（1:1）洗脱提纯残留物以获得定量收率的白色固体形式的标题化合物（3.48克，10.2毫摩尔）。MS (m/z): 341(M+1)。

实施例1

4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺

在0℃下将(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸（28.9克，135.7毫摩尔；基本如上文在制备2中所述制备）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（29.7克，155.1毫摩尔）相继添加到(7S)-7-氨基-5-(2-羟乙基)-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（34.8克，129.2毫摩尔）在二氯甲烷（696毫升）中的悬浮液中，搅拌5分钟。加入一水合1-羟基苯并三唑（24.7克，155.1毫摩尔），将其搅拌1小时，然后温热至环境温度。加入(2S)-2-(4,4,4-三氟丁酰基氨基)丙酸（0.6克，2.6毫摩尔）并在环境温度下搅拌15分钟。加入水（600毫升），滤出白色固体并分离滤液的层。用水（3x200毫升）洗涤有机层，经硫酸钠干燥并浓缩以提供浅棕色泡沫。将材料在50%甲基叔丁基醚己烷（500毫升）中制浆，滤出固体，在高真空下干燥以获得65克固体。

将水（195毫升）和碳酸氢钾（14.0克，140.0毫摩尔）添加到之前获得的固体（65.0克，140.0毫摩尔）在甲醇（195毫升）中的10℃溶液中并在环境温度下搅拌29小时。浓缩并用二氯甲烷（3x50毫升）萃取。用水（3x20毫升）洗涤合并的有机物，经硫酸钠干燥并浓缩。通过快速色谱法，用甲醇: 二氯甲烷（98:2，7N，在氨中）洗脱提纯残留物。从50%甲基叔丁基醚/己烷中研磨材料，然后从甲基叔丁基醚（500毫升）中研磨。用甲基叔丁基醚（200毫升）和己烷（200毫升）洗涤固体并在高真空下干燥固体以获得灰白色固体形式的标题化合物（42.0克，90.4毫摩尔，65%）。MS (m/z): 270(M+1)；[α]_Na ²⁵= -153.40° (c=5.0, 甲醇)。

方法2:

将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（2.50克，13.0毫摩尔）添加到(2S)-2-氨基-N-[5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]丙酰胺（3.4克，10.0毫摩尔）、二氯甲烷（40毫升）、3-羟基三唑并[4,5-b]吡啶（1.8克，13.0毫摩尔）、4,4,4-三氟丁酸（1.9克，13.0毫摩尔）和三乙胺 (1.8毫升，13.0毫摩尔)的0℃混合物中。将其搅拌并温热至环境温度过夜。加入水（40毫升）并在二氯甲烷（100毫升）和水（50毫升）之间分配。分离层，用二氯甲烷从水层中反萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液（2 X 100毫升）洗涤合并的有机层。用二氯甲烷（25毫升）从碳酸氢盐层中反萃取，经硫酸钠干燥合并的有机层并浓缩。通过快速色谱法，用甲醇（2N氨）:二氯甲烷（0:100至5:95）洗脱提纯残留物以产生3.77克非对映异构体混合物。将材料在用乙醇（0.2%二甲基乙胺）:乙腈（0:100至100:0）洗脱的Chiralpak® AD柱上提纯以获得白色固体形式的标题化合物（1.7克，3.7毫摩尔，37%）。MS (m/z): 465(M+1)。

制备13

2-(2-溴苯基)乙酸甲酯

在氮气气氛下合并2-溴苯基乙酸（500.0克，2.33摩尔）与甲醇（5.0升）。在20-35℃下逐滴加入浓硫酸（185.8毫升），然后在搅拌3-4小时下温热至60-65℃。将反应混合物冷却至45℃并在低于45℃下在减压下浓缩至大约750毫升的体积。将反应混合物冷却至10-30℃并加入二氯甲烷（2.5升）。用氢氧化钠（7%，380.0毫升）将pH调节至7-8并分离层。在低于45℃下在减压下将有机相浓缩至干燥以获得黄色油形式的标题化合物（516.5克，97.0%）。

制备14

5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮

在室温下在搅拌下合并2-(2-溴苯基)乙酸甲酯（1.0千克，4.36摩尔）、二氧杂环己烷（11.0升）和N-甲基-2-吡咯烷酮（7.0升）。将双(频哪醇合)二硼（1.2千克，4.58摩尔）和乙酸钾（855.9克，8.72摩尔）添加到该混合物中，然后通过将氮气通过该溶液2-3小时，将该溶液脱气。在氮气气氛下装入[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷加合物（71.2克，97.2毫摩尔），然后将反应混合物加热至80-90℃持续18-20小时以获得溶液形式的2-[2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基]乙酸甲酯，其不经分离即使用。将反应混合物冷却至15-25℃并加入2-氨基-3-溴吡啶（675.0克，3.90摩尔）和磷酸三钾（2.41千克，11.3摩尔）在水（3.0升）中的溶液。通过将氮气通过该溶液2-3小时，将该溶液脱气，并加入[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷加合物（106.8克，130.8毫摩尔），然后将反应混合物加热至80-90℃持续18-40小时。将反应混合物冷却至50-60℃，缓慢加入由饱和碳酸氢钠（13.0升）、饱和氯化钠（13.0升）和水（13.0升）构成的溶液。将该混合物在50-60℃下搅拌2-3小时，冷却至15-25℃并搅拌另外18-20小时。过滤所得固体并用水（2 x 2.0升）洗涤滤饼。将该固体转移到干净反应容器中，加入乙酸乙酯（5.0升）并将该混合物加热至60-70℃持续2-3小时。将该溶液冷却至15 -25℃并将其搅拌1-2小时并过滤所得固体。用乙酸乙酯（2 x 750毫升）洗涤滤饼并在真空下干燥所得固体以提供灰白色固体形式的标题化合物（644.0克，68.1%）。

制备15

在乙腈（340.0毫升）中加入 5,7-二氢吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（33.8克，0.16摩尔）并在20-30℃下搅拌0.5-1小时。加入碳酸铯（104.6克，0.32摩尔）和(2-溴乙氧基)-叔丁基二甲基硅烷（42.2克，0.18摩尔）并将反应混合物加热至70-80℃持续18-20小时。将反应混合物冷却至20-25℃并经硅藻土（50.6 g）过滤。用乙腈（2 x 50.6毫升）洗涤滤饼并在减压下浓缩滤液以达到大约67.5毫升的总体积。加入甲苯（152毫升）、活性炭（2.53克）并将该混合物加热至60-70℃持续1-2小时。将该混合物冷却至25-35℃并经硅藻土（50.6克）过滤该反应混合物。用甲苯（17.0毫升）冲洗滤饼并在减压下浓缩以获得浅棕色油形式的标题化合物，其在静置时结晶（56.8克，92.2%）。

制备16

合并5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（30.0克，0.08摩尔）和甲苯（300.0毫升），将反应混合物冷却至-10-0℃。加入叔丁醇钾（18.2克，0.16摩尔）、亚硝酯异戊酯（13.34克，0.11摩尔），然后搅拌3-5小时。将该反应混合物转移到乙酸乙酯（210毫升）和水（510毫升）的冷（0-5℃）双相溶液中并搅拌15-30分钟。将反应混合物温热至15-25℃并分离层。用额外的乙酸乙酯（120毫升）和甲基叔丁基醚（120毫升）萃取水层并合并有机层。在减压下浓缩有机物至大约60-90毫升的溶液体积，然后加入甲苯（240毫升）和乙酸乙酯（75毫升）。经硅胶（45.0 g）过滤该溶液，用甲苯（210毫升）和乙酸乙酯（60毫升）的混合物冲洗硅胶，并在减压下浓缩滤液至大约75毫升的体积。加入庚烷（120毫升）并将该混合物浓缩至大约60毫升的体积并过滤所得固体。用庚烷（25毫升）洗涤滤饼并在真空下干燥以提供黄色固体形式的标题化合物（28.3克，72.5%）。

制备17

在氮气气氛下将5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7-羟基亚氨基-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（206.0克，0.52摩尔）和四氢呋喃（2.3升）合并到高压釜中。将雷尼镍（232.0克，1.13 wt/wt当量）添加到该反应混合物中并引入氢气气氛（87psi）。该反应混合物在60-65℃下搅拌24小时。经硅藻土过滤该混合物并用四氢呋喃（500毫升）洗涤该助滤剂。浓缩滤液以获得棕色油形式的标题化合物（196.0克，93.2%）。MS (m/z):384 (M+1)。

制备18

N-[(1S)-2-[[5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯

在氮气气氛下合并7-氨基-5-[2-(叔丁基(二甲基)甲硅烷基)氧基乙基]-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-6-酮（166.0克，0.43摩尔）、二氯甲烷（2.2升）和L-Boc-丙氨酸（106.4克，0.56摩尔）。加入羟基苯并三唑（1.46克，10.8毫摩尔）和三乙胺（102.5毫升，0.74摩尔），保持内部温度低于30℃。逐份加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（128.2克，0.67摩尔）并在20-30℃下搅拌16-18小时。通过硅胶色谱法（300克硅胶），用二氯甲烷（498毫升x2）洗脱提纯该反应混合物。合并该二氯甲烷溶液并用水（2 x 3.3升）洗涤。在减压下浓缩有机相至300毫升至400毫升的体积并加入乙酸乙酯（664.0毫升）。在减压下浓缩该混合物至300-400毫升的体积并加入乙酸乙酯（664毫升）。在减压下浓缩该混合物至300-400毫升的体积并加入乙酸乙酯（1.3升）。加入三水合四正丁基氟化铵（149.4克，0.47摩尔）并在20-30℃下搅拌16-18小时。加入氯化钠水溶液（20%，1.6升），分离层并再用氯化钠水溶液（20%，1.6升）洗涤有机相。将有机物浓缩至800-900毫升的近似体积并将该混合物在20-30℃下搅拌12-16小时。过滤所得固体，用乙酸乙酯（91.3毫升）洗涤滤饼。用硅胶色谱法（300克硅胶），用乙酸乙酯（2 x 500毫升）洗脱提纯滤液以提供黄色油形式的标题化合物（82.6克，85.2% de，100%ee，51.2%收率）。MS (m/z): 441 (M+1)。

制备19

(2S)-2-氨基-N-[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]丙酰胺

在氮气气氛下合并N-[(1S)-2-[[5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]氨基甲酸叔丁酯（54.0克，0.12摩尔）和乙腈（212.7毫升）。逐滴加入盐酸（317.5毫升，4N，1.27摩尔）以保持内部温度低于30℃，并将反应混合物在20-30℃下搅拌16-18小时。加入水（324.0毫升）和二氯甲烷（430毫升）并分离层。丢弃有机层并向水相中加入二氯甲烷（645毫升），并使用氢氧化钠水溶液（20%，252毫升）将pH调节至大约10。分离层，用额外的二氯甲烷（2 x 430毫升）萃取有机层并合并有机相。将有机物在减压下在低于45℃下浓缩至130-150毫升的近似体积，并加入四氢呋喃（322毫升）。将该溶液在减压下在低于45℃下浓缩至200-220毫升的近似体积，并加入额外的四氢呋喃（213毫升）。将该反应混合物在减压下浓缩至250-270毫升的近似体积，并加热至60-65℃持续2-3小时。将反应混合物缓慢冷却至5-15℃并搅拌5-8小时。过滤所得固体，用乙酸乙酯（56毫升）洗涤滤饼。将该固体转移到干净的反应容器中，加入乙酸乙酯（150 毫升）并加热至60-65℃持续2-3小时，然后将该溶液缓慢冷却至5-15℃。在该温度下搅拌2-3小时并通过过滤收集所得固体。用乙酸乙酯（45毫升）洗涤滤饼并在烘箱中在减压下在低于60℃下干燥该固体以提供灰白色固体形式的标题化合物（21.0克，99.2%de，100%ee，51.0%收率）。MS (m/z): 341 (M+1)。

实施例2

水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺

在氮气气氛下合并(2S)-2-氨基-N-[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]丙酰胺（45.0克，132.2毫摩尔）和二甲基甲酰胺（452.9毫升）。冷却至0-5℃并加入N-乙基二异丙胺（77.4毫升，444.0毫摩尔）、4,4,4-三氟丁酸（19.9克，139.3毫摩尔）和一水合羟基苯并三唑（22.3克，153.1毫摩尔）。将该溶液搅拌5-10分钟并一次性加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（30.6克，159.6毫摩尔）。将该反应混合物温热至20-25℃并搅拌1-2小时。加入乙酸乙酯（1.4升）和水（1.8升）并搅拌0.5-1小时。分离相并用碳酸氢钠水溶液（5%，1.0升）洗涤有机层并在减压下浓缩该溶液以获得200-300毫升的体积。加入乙醇（522毫升）并在减压下浓缩该溶液以获得200-300毫升的体积。重复三次。加入乙醇（180毫升）和5%碳酸钾溶液（34.6毫升）并在20~25℃下搅拌0.5-1小时。加入水（667毫升）和水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的晶种（0.4克，0.86毫摩尔）（晶种可由获自之前的产品批次的固体生成，或可以使用本领域技术人员公知和使用的其它方法，如小等分试样的重结晶获得）并在20-25℃下搅拌2-3小时。过滤并用乙醇（63毫升）和水（42毫升）的混合物洗涤滤饼两次。在烘箱中在减压下在低于40℃下干燥所得固体以提供白色至灰白色固体形式的标题化合物（41.9克，99.6%de，100%ee，65.3%收率）。MS (m/z): 465(M-H₂O+1)。

实施例2的XRPD

在配备CuKa源（λ = 1.54060 Å）和Vantec检测器、在35 kV和50 mA下运行的Bruker D4 Endeavor X-射线粉末衍射仪上获得结晶固体的XRPD图。在4和40° 2θ之间以0.0087° 2θ的步长和0.5秒/步的扫描速率和以0.6 mm发散度(divergence)、5.28mm固定反散射（anti-scatter）和9.5 mm检测器狭缝扫描样品。将干燥粉末填充在石英样品支架上并使用载玻片获得光滑表面。晶体学领域中公知的是，对于任何给定晶形，衍射峰的相对强度可由于由例如晶体形态和习性之类的因素造成的优选取向而变。如果存在优选取向效应，峰强度改变，但多晶型物的特征峰位置不变。（例如，参见：U. S. Pharmacopia 33 -National Formulary 28章节< 941> Characterization of Crystalline Solids by X-ray Powder Diffraction (XRPD) Official 2010年10月1日-2011年2月1日）。此外，结晶学领域中还公知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能轻微改变。例如，峰位置可由于分析样品时的温度或湿度变化、样品位移或内标的存在与否而移动。在本发明的情况下，2θ的± 0.2的峰位置变化性考虑到这些潜在变化，而不阻碍所示晶型的明确识别。可基于特征峰（以° 2θ为单位），通常更突出峰的任何独特组合确认晶形。在环境温度（19-25℃）和相对湿度（20-60%）下收集晶形衍射图。

因此，实施例2的化合物的制备样品通过使用CuKα辐射的XRPD图表征为具有如下表1中所述的衍射峰（2θ值）。该形式是结晶的并含有在22.97°的峰以及选自11.96°、18.81°、20.78°和21.07°2θ的一个或多个峰，衍射角公差为0.2°。

表1: 实施例2的X-射线粉末衍射峰

峰	角度(2-θ°)	强度%
			1	7.573	0.8
2	9.177	2.3
			3	11.96	50.4
4	13.063	24.6
			5	14.036	21.5
6	14.352	2.9
			7	15.223	32.4
8	16.845	15.8
			9	17.12	11.8
10	17.828	23.4
			11	18.481	10.6
12	18.809	25.3
			13	19.396	11.7
14	20.102	28
			15	20.778	44.2
16	21.068	63.8
			17	22.713	36.8
18	22.967	100
			19	23.407	7.4
20	23.625	2.4
			21	24.11	5.3
22	24.772	49
			23	25.028	6.5
24	25.311	11.5
			25	25.868	1.8
26	26.586	14.6
			27	27.979	25.6
28	28.27	6.6
			29	29.033	3.6
30	29.54	14.3
			31	29.9	12.2
32	30.556	9.9
			33	30.766	11.5
34	31.703	1.3
			35	32.186	10.1
36	33.015	1.4
			37	33.822	3.4
38	34.007	2
			39	34.451	1.1
40	34.728	0.5
			41	35.381	2.7
42	35.601	5.8
			43	36.052	3.2
44	36.272	3.5
			45	36.866	7.2
46	37.73	0.8
			47	38.232	0.2
48	38.608	1.2
			49	39.139	1.5

实施例2的固态NMR

使用在100.622 MHz的碳频率下运行并配备Bruker 4mm三共振探头（K299551）的Bruker Avance II 400 MHz NMR能谱仪（Lilly tag K299547）获得¹³C交叉极化/魔角旋转（CP/MAS）NMR（固态NMR或 SSNMR）谱。使用SPINAL64去耦（70.8 Watts）和RAMP100成型H-核CP脉冲，与交叉极化一起使用TOSS边带抑制。采集参数如下：2.5 µs的90°质子r.f.脉冲宽度，接触时间为3.5 ms，5 s的脉冲重复时间，10 kHz的MAS频率，30 kHz的谱宽，采集时间为34 ms且扫描数为10,587。化学位移参考在单独实验中的金刚烷（δ = 29.5 ppm）。¹³C NMR（固态）: δ (ppm) 18.65, 27.52, 28.76, 47.66, 49.96, 55.02, 58.88, 122.87,126.49, 129.73, 131.37, 132.31, 137.28, 145.01, 149.17, 168.53, 170.30,175.55。

实施例2的Karl Fischer滴定

使用Brinkmann Methrohm 756 KF Coulometer获得Karl Fischer滴定。使用Hydranol®作为水标准一式两份测定对照标准。一式三份运行样品并记录水的平均百分比以测定样品中的水量。实施例2的Karl Fischer滴定平均结果为3.9%水。实施例2中的1摩尔当量水的理论百分比为3.7%。

癌症越来越被识别为多样的一系列疾病，其发作和进展由一种或多种在细胞和组织微环境中调节DNA修复、基因组稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、浸润和转移的基因的异常功能引发。“癌症”基因的变异或异常功能可能起因于天然发生的DNA多态性、基因组拷贝数变化（通过扩增、删除、染色体丢失或复制）、基因和染色体结构的变化（通过染色体易位、倒位或造成基因表达失控的其它重排）和点突变。癌性肿瘤可能由一种异常基因功能引发并由同一异常基因功能维持，或通过另外的异常基因功能加重维持和进展。

除上文提到的基因染色体畸变外，各癌症还可能包括基因组的表观遗传修饰，包括DNA甲基化、基因组印记和通过乙酰化、甲基化或磷酸化的组蛋白修饰。表观遗传修饰可能在恶性肿瘤的诱发和/或维持中起作用。

通过活组织检查、免疫表型分型和其它试验诊断癌性肿瘤是已知的和常规使用的。除高分辨率染色体显带和先进的染色体成像技术外，可以通过细胞遗传学分析，如荧光原位杂交（FISH）、核型分析、光谱核型分析（SKY）、多重FISH（M-FISH）、比较基因组杂交（CGH）、单核苷酸多态性阵列（SNP Chips）和本领域技术人员已知和使用的其它诊断和分析试验测定癌症疑似病例中的染色体畸变。

使用联合正电子发射断层成像（PET）和X-射线计算机断层成像（CT）扫描仪的癌症PET/CT成像已成为肿瘤学中的诊断和分期的标准组成部分。放射性标记的示踪剂2-脱氧-2-[¹⁸F]氟-D-葡萄糖（FDG）用于所有PET/CT成像程序中的大部分。PET/CT成像的优点之一是其在治疗过程中的极早期检测葡萄糖代谢的显著变化或甚至肿瘤细胞代谢的完全停止的能力以替代肿瘤化学敏感性评估。除癌症检测和分期外，PET/CT成像作为个体对治疗的响应的定量监测和新药疗法的评估工具变得越来越重要。FDG积聚的变化已表明可用作评估治疗响应的成像标记物。RECIST标准（其中传统上通过测量CT图像中的肿瘤尺寸/维度的变化评估肿瘤对治疗的响应）可能无法证明对该治疗的早期响应。归因于治疗的肿瘤尺寸变化可能需要长时间显现出来。最广泛使用的参数是标准化摄取值（SUV），其被定义为在相关区域中的最大SUV值（SUV_MAX）并且SUV_MAX的降低通常被视为代谢活性停止的最可靠指标。

最早在涉及Notch1细胞内结构域易位到T-细胞受体-β启动子区（其导致Notch1细胞内结构域的过度表达）的人类T-细胞白血病中报道了Notch的致癌作用，（Grabher等人Nature Review Cancer, 2006(6):347-359；Weng等人Science, 2004(306):269-271）。Notch1细胞内结构域在小鼠的造血干细胞中的过度表达导致小鼠表现出与人类类似的T-细胞急性淋巴细胞性白血病。除T-细胞急性淋巴细胞性白血病外，越来越多的证据表明Notch信号在其它癌症中通过多种机制致癌，包括急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病和红白血病。异常的组成性Notch信号传导也牵涉到许多恶性实体瘤，包括乳腺癌、卵巢癌（Park等人Cancer Research, 2006(66):6312-6318）、黑素瘤（Gast等人Genes, Chromosomes & Cancer, 2010(49):733-745）、肺癌、非小细胞肺癌（Westhoff等人PNAS, 2009(106):22293-22298）、胰腺癌、胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、头颈癌、宫颈癌、前列腺癌、肝癌、鳞状细胞癌（口腔）、皮肤癌和髓母细胞瘤（Ranganathan等人, Nature Review Cancer, 2011(11):338-351和Supplementary Information S1（表））。异常Notch信号传导可以在特定软组织肉瘤中活化Guijarro等人Am J Pathol, 2013(182(6)):2015-2027。最近有报道在平滑肌肉瘤患者参加的1期临床研究中单独评估Notch抑制剂，Pant等人J Clin Oncol, 2012 (30(15)): 5月20日增刊, 摘要3008；Messersmith等人Clin Cancer Res (21(1)):60-67；和与维莫德吉（vismodegib）（一种Hedgehog 拮抗剂）一起评估, www.clinicaltrials.gov, Identifier: NCT01154452, 2014年12月20日下载。在Pant等人或Messersmith等人中对LMS患者没有报道完全响应或部分响应数据，并且尚未发现对联合临床研究报道的数据。Notch信号传导的抑制提出为其疾病由组成性Notch信号传导通路的异常活化诱发、维持和推进或加重的癌症患者提供治疗益处的有吸引力的目标。Shih等人Cancer Research, 2007(67)1879-1882。

临床评估

水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺在晚期或转移癌患者中的研究

研究设计

此研究是口服给药的水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺在晚期或转移癌的门诊患者中的多中心、非随机化、开放标签、剂量递增的研究，此后群组扩展（cohort expansion）。

研究目的

此研究的主要目的是测定可安全给药至晚期或转移癌患者的水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的推荐2期剂量。

该研究的次要目的是表征通过国家癌症研究所 (NCI) 的Common TerminologyCriteria for Adverse Events (CTCAE) v4.0评估的水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的安全性和毒性概况；预估水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的药代动力学（PK）参数；和记录用水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺观察到的任何抗肿瘤活性。

探索性目的是探索水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺在血浆和尿中的肾清除率和PK代谢物；探索与水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺相关的预测性生物标记；探索水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺对指示Notch活性的生物标记（Notch细胞内结构域，通过免疫组织化学或替代性的经验证的方法），包括细胞角蛋白18或Rules Based Medicine的药效学（PD）作用；和探索利用正电子发射断层成像（PET）扫描或PET/CT评估使用水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的治疗效果。

试验药

水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，剂量范围2.5至100 mg，在28日周期期间作为胶囊每周3次口服给药。

水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺作为用于口服的在瓶中的胶囊供应。这些胶囊应储存在标签上注明的温度范围内的室温下。

计划治疗持续时间

患者接受2个周期（各28天）的水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺，除非满足一个或多个停药标准。患者只有在1) 尚未满足任一停药标准，和2) 研究人员确定患者正临床获益于该治疗时才可接受多于2个治疗周期。

计划30天的短期随访期（停药后）。

给药

在剂量递增期（部分A）和剂量确定期（部分B）期间都口服给药水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺TIW。

评估标准

安全性: NCI CTCAE，版本4.0，剂量限制性毒性（DLT）.

生物分析（包括PK和PD）: 水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的血浆浓度

效力: 根据组织学，使用用于实体瘤的Response Evaluation Criteria inSolid Tumors（RECIST）v1.1、用于恶性淋巴瘤的Revised Criteria、来自National CancerInstitute Working Group for CLL的指南或用于胶质母细胞瘤的Response Assessmentin Neuro-Oncology（RANO）标准评估效力。通过用于肿瘤测量的1个或多个下列放射学试验评估各患者：X-射线计算机断层成像（CT）扫描；磁共振成像（MRI）；胸部X-射线；PET扫描；PET/CT成像标准化摄取值（SUV_MAX）。

统计方法

安全性: 使用3+3方法通过安全性驱动剂量递增。在各群组结束时将包含关于剂量-毒性曲线的之前的预期的基于模型的分析拟合至数据，其将被研究人员和Lilly临床研究医师用于测定下一剂量水平。最大耐受剂量被定义为具有小于33%的在周期1过程中造成DLT的概率的最高受试剂量。

效力: 将肿瘤响应数据制表并通过研究部分概括。

药代动力学: 通过标准非房室（non-compartmental）分析方法分析水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的PK参数。

药效学: 评估所有PD数据。可以进行探索性PK/PD分析以确定暴露-生物标记响应关系。

在正在进行的临床试验的周期1中被给药水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的3名平滑肌肉瘤患者的数据列在表2中。患者1之前用手术、放射疗法和5个在先的全身治疗或靶向治疗方案治疗平滑肌肉瘤。患者2之前用手术、放射疗法、近距离放射疗法和3个在先的全身治疗或靶向治疗方案治疗平滑肌肉瘤。患者3之前用手术和3个在先的全身治疗或靶向治疗方案治疗平滑肌肉瘤

DCE-US是动态对比增强超声检查（Dynamic Contrast-EnhancedUltrasonagraphy）。

fn: 患者1仅接受100毫克的两剂并且进一步给药为50毫克，然后25毫克。患者1随后在仍参加临床评估和接受另外的试验药周期的同时死于肝并发症。

在患者1和2中，在治疗第一周进行的肝的CT扫描显示肿瘤中部变得低密度，表明坏死。该暗示的坏死通过DCE-US证实。对平滑肌肉瘤患者的上述初步数据揭示，这两个患者都表现出其平滑肌肉瘤肿瘤的令人惊讶和出乎意料的显著坏死。在患者3中，从初始扫描没有观察到显著变化。

在1个周期（28天）后，另外的CT扫描成像证实在所有三个患者中的坏死。

在正在进行的临床试验的部分B中被给药水合4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂䓬-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺的另外19名平滑肌肉瘤患者的数据列在表3中。对有限数量的患者记录ChoiResponse Criteria并且没有报道在表3中，Choi等人, J Clin Oncol. 2007；25:1753–1759。

平滑肌肉瘤患者的上述数据，特别是PET/CT SUV_MAX数据显示在平滑肌肉瘤患者中的有益临床效果。

Claims

1.4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂

-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物用于制备用于治疗平滑肌肉瘤的药物的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述药物包含2.5至100毫克的4,4,4-三氟-N-[(1S)-2-[[(7S)-5-(2-羟乙基)-6-氧代-7H-吡啶并[2,3-d][3]苯并氮杂

-7-基]氨基]-1-甲基-2-氧代-乙基]丁酰胺或其可药用盐或水合物。

3.权利要求1或2的用途，其中所述药物适合于在五日内每隔一日给药接着停药两日(T.I.W.)给药。