CN107427487A

CN107427487A - 组合治疗方案

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Publication number: CN107427487A
Application number: CN201680021765.0A
Authority: CN
Inventors: 艾伦·R·伊士曼; 达西·贝茨; 加布里埃尔·克雷米迪奥蒂斯
Original assignee: Bionomics Ltd
Current assignee: Bionomics Ltd
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2016-03-02
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2036-03-02
Also published as: AU2016228116A1; CA2978640A1; CN107427487B; NZ734946A; WO2016138559A1; EP3265080A1; US20180042887A1; CA2978640C; EP3265080A4; HK1249037A1; US10137105B2

Abstract

本公开内容提供了用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的组合和方法。

Description

组合治疗方案

背景

领域

本公开内容教导了用于慢性淋巴细胞白血病(CLL)的组合疗法。

相关技术描述

在本说明书中被作者提及的出版物的书目细节按字母顺序收集在说明书的最后。

在本说明书中提及任何现有技术不是并且不应该被视为确认或以任何形式暗示该现有技术形成任何国家中的公知常识的一部分。

在本说明书中对任何在先出版物(或来源于其的信息)或对任何已知的事物的引用不是并且不应当被视为确认或承认或以任何形式暗示该在先出版物(或来源于其的信息)或已知的事物形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。

癌症通常用手术、化学和/或辐射消融疗法来治疗。虽然化学和辐射消融疗法通常有效地破坏显著量的肿瘤细胞，但此类疗法通常留下许多对该治疗耐受的肿瘤细胞。这些耐受细胞可以增殖和/或转移以形成处于或具有变得难以治疗的潜力的新肿瘤。此外，连续使用化学治疗药物已经产生药物耐受肿瘤细胞。甚至当采用药物组合时，也可能出现多药耐受(MDR)肿瘤细胞。

美国癌症学会(American Cancer Society)估计，在单独的2013年因慢性淋巴细胞白血病(CLL)存在多于15,000例新病例和多于4,500例死亡。成功使用含嘌呤类似物的化学免疫疗法方案延长了患有CLL的较年轻患者的生存期(survival)。然而，最终进展为氟达拉滨(fludarabine)耐受性疾病和缺乏低风险治疗策略使得有必要探索新颖的治疗策略。

CLL的特征在于成熟的CD5⁺CD19⁺CD23⁺B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏中的积累，这被认为是由调控细胞死亡的途径的缺陷引起的，而不是由不受控制的细胞增殖机制引起的。此类缺陷可以导致化学耐受性，并且因此需要一些策略来产生更有效的治疗剂。B细胞淋巴瘤/白血病2(BCL-2)蛋白在CLL中过表达，并且因此，代表克服肿瘤对抗癌治疗的耐受性的尝试中的靶。CLL为一种衰弱性白血病(debilitating leukemia)，并且因此对于这种疾病的选择性治疗存在迫切需求。

BCR相关激酶的抑制剂的引入在CLL的靶向疗法中提供了广阔的前景。依鲁替尼(ibrutinib)，一种BTK抑制剂，在患有复发性/难治性CLL的患者的Ib/II期多中心研究中产生～71％总体响应率的显著单个药物活性。然而，完全缓解是罕见的(2.4％)，并且通常需要每日施用药物以维持治疗功效。BCR靶向剂(包括依鲁替尼)的单一疗法导致发生外周CLL细胞淋巴细胞增多，其中在20％的患者中持续存在＞12个月。这可能是BCR抑制介导的赘生性细胞从其小生境(niche)迁出的直接后果。有趣的是，在间歇地接受依鲁替尼的患者中，CLL细胞能够在停药时间(off-time)期间重新占据淋巴结。此外，最近出现了由于BTK中结合药物的半胱氨酸残基的突变导致的依鲁替尼耐受性的报道。其他耐受性机制可以解释BCR靶向剂的降低的功效。例如，体外数据表明，PI3K同种型的上调可能从PI3K特异性抑制剂idelalisib中救援淋巴瘤细胞。因此，观察到对BCR靶向剂的耐受性的增加、剩余疾病的持续性和CLL细胞重新占据其小生境的能力。

因此，存在对CLL的更有效和选择性治疗的需求。

概述

本发明是基于鉴定包括式(I)的化合物和驱动CLL细胞离开淋巴结或骨髓的化合物的CLL有效组合治疗。

在一个实施方案中，CLL的有效治疗包括以任一顺序或同时使用诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的组合。在一个实施方案中，CLL的有效治疗包括以任一顺序或同时使用依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的组合。在另一个实施方案中，CLL的有效治疗包括以任一顺序或同时使用idelalisib或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的组合。在一个实施方案中，该组合可用于治疗患有复发性或难治性CLL，或对治疗耐受或具有变得对治疗耐受的潜力CLL的患者。

如本文使用的“依鲁替尼”指以下结构的化合物：

该化合物也被称为PCI-32765(Pharmacyclics)，并且以名称Imbruvica市售。它的系统(或IUPAC)名称为1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮，并包括它的药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体和前药形式。

如本文使用的“idelalisib”指以下结构的化合物：

该化合物也被称为Zydelig、GS-1101或CAL-101。它的系统(或IUPAC)名称为5-氟-3-苯基-2[(1S)-1-7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮；并包括它的药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体和前药形式。

式(I)的化合物被如下呈现：

式(I)的化合物[2-甲基-7-羟基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃]可以通过在PCT/AU2007/000101(WO 07/087684)中描述的合成方法来制备，其内容通过引用并入，并且提及式(I)的化合物包括它的药学上可接受的盐、溶剂合物和前药形式。

依鲁替尼和idelalisib抑制基质小生境中CLL细胞的促存活BCR信号传导，导致其迁出至外周。重要的是，如果停止施用依鲁替尼或idelalisib，则CLL细胞快速返回至淋巴结。在一些患者中，已经持续超过一年观察到循环CLL细胞的药物诱导的增加，这反映了细胞在它们离开淋巴结后不容易死亡的事实。已经观察到因依鲁替尼的靶BTK中结合药物的半胱氨酸突变而对依鲁替尼的耐受性。不希望囿于理论，随着患者保持使用依鲁替尼持续数月或数年，这种耐受性可能会变得越来越普遍。本发明部分地基于以下的确定：当某些诱导从淋巴结或骨髓迁出的被批准用于CLL的药物与杀死外周循环中的CLL细胞的式(I)的化合物组合时将会具有更大功效，从而防止CLL细胞返回至保护性淋巴结小生境。式(I)的化合物通过完全不同的机制起作用，也就是使促存活和促凋亡BCL2家族成员蛋白的平衡倾向于后者，导致细胞死亡。该凋亡途径发生在细胞周期的所有阶段，考虑到大多数外周CLL细胞为非周期的(处于G0)，这是重要的。在依鲁替尼疗法后离开基质小生境的细胞将由于缺乏从基质支持物产生的另外的促存活信号而对式(I)的化合物易感。

诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的其他化合物或药物包括：BTK抑制剂诸如Acalabrutinib、ONO-4059和spebrutinib(AVL-292、CC-292)，或者磷酸肌醇3-激酶抑制剂诸如哌立福辛(Perifosine)、BKM120、Duvelisib(IPI-145)、PX-866、BAY 80-6946、BEZ235、RP6530、TGR 1202,SF1126、INK1117、GDC-0941、XL147(也被称为SAR245408)、XL765(也被称为SAR245409)、Palomid 529、GSK1059615,ZSTK474、PWT33597、IC87114、TG100-115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477、CUDC-907和AEZS-136，或者BCL-2抑制剂诸如venetoclax(ABT-199)、ABT-737或ABT-263，或者CDK抑制剂诸如dinaciclib(SH-727965)。

本文提出了，以任一顺序或同时地，式(I)的化合物经由JNK凋亡途径与活化的NOXA组合诱导CLL细胞的选择性和优先凋亡。正是由于这个提议的原因，仅一些微管药物有效治疗某些白血病。根据本公开内容，发现式(I)的化合物针对CLL细胞有效，促进它们的凋亡。

因此，本文提供了一种治疗患者中的慢性淋巴细胞白血病(CLL)的方法，所述方法包括步骤：以任一顺序或同时施用有效量的至少两种化合物—诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药，和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：

在一个实施方案中，诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物为依鲁替尼或idelalisib。在一个实施方案中，受试者或患者为人类。在另一个实施方案中，CLL为复发性或难治性CLL。这也可以被称为慢性、持续性或药物耐受性CLL或难以治疗的CLL。

在一个方面，本发明基于采用用于有效治疗患有CLL的患者的以下策略。患者被施用诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出、驱使细胞离开淋巴结小生境的化合物。然后施用式(I)的化合物以在细胞能够返回至淋巴结之前杀死细胞。在另一个方面，患者首先被给予式(I)的化合物，随后被给予诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物诸如依鲁替尼。又在另一个方面，两种化合物被同时施用。

本文还教导了依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备用于治疗患有包括复发性或难治性CLL的慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的药物中的用途：

该药物被意图用于管理患者中的CLL疗法的方案中，所述方案包括依鲁替尼和式(I)的化合物的任一顺序或同时的组合。在另外的实施方案中，药物为药物组合物，所述药物组合物包含依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药和式(I)的化合物或其盐、溶剂合物或前药。

“药物组合物”可以是包含在治疗试剂盒中或作为治疗方案的一部分施用的单独的、不同的治疗剂的单一组合物或组合组合物。

在相关的实施方案中，本说明书对以下有指导：诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药与式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药组合：

用于在治疗患者中的CLL中使用。

本发明还提供了一种用于治疗CLL的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药；

(b)式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：

以及

(c)以组合使用(a)和(b)的说明。

说明包括在治疗方案中使用诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物和式(I)的化合物以治疗或管理人类受试者中的CLL。任一种化合物可以被首先施用或两者可以被同时施用。在一个实施方案中，首先施用诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物。

关于以上实施方案，在另外的实施方案中，诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物为依鲁替尼。

在一个实施方案中，说明是专门针对用于治疗人类受试者中的复发性或难治性CLL。

不意图囿于任何特定的理论或作用模式，与在引起PARP裂解和染色质凝聚的浓度的式(I)的化合物的孵育活化CLL细胞中的JNK凋亡途径并上调功能性Noxa。式(I)的化合物的活性导致CLL细胞的急性凋亡。式(I)的化合物的效果以比其他微管靶向药物出乎意料地低的浓度来达到(即，增加的效力)。当与CLL细胞孵育时，长春花碱(vinblastine)和考布他汀A4(combretastatin A4)显示相似的效果，但式(I)的化合物为CLL活化的pJNK和Noxa的更有效的诱导剂，能够实现更高水平的CLL细胞的选择性凋亡。此外，仅孵育1h足以活化JNK，并且在去除式(I)的化合物之后5h仍然观察到凋亡。

本说明书教导凋亡依赖于JNK的活化。在不将本发明限制于任何一种理论或作用模式的情况下，本文提出了对于在CLL细胞中发生该急性凋亡需要Noxa和JNK两者。JNK在正常淋巴细胞中也被活化，但在Noxa的不存在下，JNK对式(I)的化合物耐受。

因此，在另一个实施方案中，该方法包括首先用有效量的式(I)的化合物治疗有相应需要的受试者，以诱导CLL细胞中的JNK依赖性凋亡。

在一个可选择的实施方案中，该方法包括首先用有效量的诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物诸如依鲁替尼，随后是式(I)的化合物来诱导CLL细胞中的JNK依赖性凋亡，以治疗有相应需要的受试者。

当与模拟淋巴结环境的基质细胞孵育时，CLL细胞对药物的耐受大得多。因此，测试合理的药物组合以试图规避这种耐受性。然而，此类组合导致协同功效的程度是有限的。本发明的化合物能够通过主要涉及BCL-2和MCL-1抑制的机制，作为单一剂诱导凋亡(图10)。在基质上生长的CLL细胞对ABT-199(一种BCL-2抑制剂)耐受，但被本发明的化合物致敏。这种致敏可能是由于诱导Noxa。然而，本文确定了与基质细胞孵育也上调BCL-X，BCL-X引起对Noxa诱导的耐受。由于当以超过MCL-1的结合能力过量存在时，Noxa也可以结合BCL-X，这允许该组合克服了CLL细胞的基质介导的化学耐受性。

更高的效力为期望的新药特征，因为明显需要较低量的药物以使作用生效，但如果它伴随着较高的毒性或脱靶效应，则它可能是有害的。本发明的式(I)的化合物作为单一剂在外周正常淋巴细胞中不具有任何毒性作用，即使在与血浆中可达到的那些浓度相当的高浓度下使用时。观察到JNK的活化，但没有观察到PARP裂解或Noxa诱导。以与依鲁替尼协同作用的能力能够实现在治疗患者中的CLL中的大得多的功效。

提及“CLL”包括它的亚型及它的相关形式，包括复发性或难治性形式的CLL和难以治疗的其他形式。

提及复发性或难治性CLL指对单一剂疗法无响应并被包含在慢性和药物耐受性CLL中的CLL。这有时也被称为“复发”，意味着疾病在被分类为完全或部分缓解的患者中在一段时间之后的返回。

附图说明

图1：式(I)的化合物诱导外周CLL细胞中的凋亡。A)与0-1μM式(I)的化合物孵育6h的来自患者的CLL细胞的蛋白印迹。B)用Hoechst染色通过染色质凝聚测量的相同CLL细胞的存活曲线。

图2：式(I)的化合物为CLL细胞中更有效的凋亡诱导剂。A)与0-1μM式(I)的化合物、长春花碱或考布他汀A4孵育6h的来自患者49的CLL细胞的蛋白印迹。"C"＝与2μM长春花碱孵育的对照细胞系作为蛋白表达的阳性对照。B)用Hoechst染色通过染色质凝聚测量的相同CLL细胞的存活曲线。C)与式(I)的化合物、长春花碱或考布他汀A4孵育6h的来自3-6名患者的CLL细胞的存活曲线的比较(平均值+/-SEM)。

图3：CLL细胞中式(I)的化合物诱导的凋亡为JNK依赖性的。A)与0-1μM式(I)的化合物(10-1000nM)孵育6h的来自患者15的CLL细胞的蛋白印迹。"C"＝与2μM长春花碱孵育的对照细胞系作为蛋白表达的阳性对照。B)进行并行孵育，但存在JNK抑制剂VIII。C)通过染色质凝聚测量的相同CLL细胞的存活曲线。

图4：式(I)的化合物在CLL细胞中在1h脉冲孵育之后诱导凋亡。A)左侧：与0-1μM式(I)的化合物(1-1000nM)孵育6h的来自患者66的CLL细胞的蛋白印迹。右侧：将相同的细胞与式(I)的化合物孵育1h，然后在培养基的不存在下持续另外5h。B)用Hoechst染色通过染色质凝聚测定测量的相同CLL细胞的存活曲线。

图5：式(I)的化合物诱导的CLL细胞中的凋亡的动力学。与20nM式(I)的化合物孵育的来自患者114的CLL细胞的蛋白印迹。

图6：式(I)的化合物诱导的Jeko-1细胞中的凋亡的动力学。与20nM式(I)的化合物孵育的Jeko-1细胞的蛋白印迹。"C"＝与2μM长春花碱孵育的对照细胞系作为蛋白表达的阳性对照。

图7：式(I)的化合物使外周CLL细胞对在基质上孵育的ABT-199敏感。A)与单独的式(I)的化合物或与ABT-199组合的式(I)的化合物孵育的来自患者66的CLL细胞的存活曲线。B)在L4.5基质细胞上孵育CLL细胞24h，然后与单独的式(I)的化合物或与ABT-199组合的式(I)的化合物孵育6h。C)类似于A，不同之处为对来自患者125的细胞进行。

图8：式(I)的化合物对正常的外周淋巴细胞未显示出毒性，并且不使细胞对ABT-199敏感。A)与0-1μM单独的0-1μM式(I)的化合物或与1-10nM ABT-199或与100nMdinaciclib孵育6h的来自健康志愿者的细胞的蛋白印迹。"C"＝与2μM长春花碱孵育的对照细胞系作为蛋白表达的阳性对照。B)用Hoechst染色通过染色质凝聚测定测量的相同细胞的存活曲线。

图9：式(I)的化合物导致凋亡的可能作用机制。式(I)的化合物结合微管中的秋水仙碱(colchicine)位点，破坏动态稳定性并导致微管蛋白解聚。结果是，JNK被磷酸化并且Noxa被诱导。pJNK可以活化磷酸化级联，引起BCL-2的抑制。Noxa结合MCL-1，将其靶向降解。通过CDK抑制剂dinaciclib的转录抑制导致MCL-1水平的快速降低。促凋亡活化剂(例如，BIM、BID)和效应物(例如，BAX、BAK)相互作用导致凋亡。与基质细胞共培养通过上调BCL-XL和MCL-1(以及可能地BFL1，未示出)引起保护。BH3模拟物ABT-199仅抑制BCL-2，并且将杀死外周CLL细胞，但不杀死在基质上的那些CLL细胞。诱导Noxa的剂(例如式(I)的化合物)或抑制MCL1/BCL-X表达的剂(dinaciclib)可以使细胞对ABT-199敏感。

图10：式(I)的化合物在离体CLL细胞中诱导JNK依赖性凋亡。将新鲜分离的CLL细胞与单独的EX2或在JNK抑制剂VIII的存在下离体孵育6h。(A)代表每一个单独的患者样品对单独的EX2的敏感性。(B)归纳了当相同样品在有或没有JNK抑制剂VIIII的情况下与EX2孵育的结果(n＝15)。

图11：式(I)的化合物增强由ABT-199或dinaciclib诱导的凋亡。将白血病细胞系或CLL细胞与EX2±dinaciclib(A)或ABT-199(B)孵育6h。与先前的长春花碱结果一致，dinaciclib介导的凋亡需要JNK，但ABT-199介导的凋亡不需要。(C)将新鲜分离的CLL细胞单独孵育并立即处理，或者将其铺在表达CD40L的L4.5基质细胞的单层上24h，然后用EX2±ABT-199处理6h(n＝16)。

详细描述

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、以及变型例如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”，将被理解为暗示包含所声明的整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他的整数或步骤或整数或步骤的组。

除非上下文另有清楚地规定，如本说明书中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包含复数方面。因此，例如，提及“一个(a)CLL细胞”包括单个细胞以及两个或更多个细胞；提及“一种(an)剂”包括单种剂以及两种或更多种剂；提及“该(the)公开内容”包括被该公开内容教导的单个和多个方面等等。本文教导和实现的方面由术语“发明”包括。所有此类方面都在本发明的范围内实现。

本公开内容教导了某些化合物诸如依鲁替尼与式(I)的化合物协同作用以有效抑制、控制或以其他方式临床管理患者中的CLL。式(I)的化合物的一个重要方面为特定C-6和C-7取代基与C-2Q-基团(特别是C-2甲基)的组合，所述组合当与其他结构上相关的TPI化合物相比时显示赋予更高的效力和选择性。相比于正常内皮细胞(静止(quiescent))，式(I)的化合物显示针对肿瘤内皮细胞(活化)的选择性。

将理解，依鲁替尼可以以其本身或以其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药的形式被施用。类似地，式(I)的化合物可以作为其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药被施用至受试者。合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸的盐或药学上可接受的有机酸的盐，所述无机酸为诸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸，所述有机酸为诸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹宁酸、抗坏血酸和戊酸。

碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子形成的那些，所述阳离子诸如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵。在一个实施方案中，本文描述的方法在其范围内包括磷酸基团的阳离子盐，例如钠盐或钾盐，或者烷基酯(例如甲基、乙基)。

还将理解，为例如依鲁替尼或式(I)的化合物的前药的任何化合物也在本文描述的治疗方案的范围和精神内。术语“前药”以其最广泛的意义使用并且包括在体内被转化为本发明的化合物(例如，依鲁替尼或式(I)的化合物)的那些衍生物。此类衍生物将由本领域技术人员容易想到，并且包括例如关于式(I)，在其中游离羟基基团(例如在C-7位置或R^1D)被转化为酯，诸如乙酸酯或磷酸酯的化合物，或者在其中游离氨基基团(例如在C-7位置或R^1D)被转化为酰胺(例如，α-氨基酸酰胺)的化合物。用于酯化，例如酰化化合物的程序为本领域熟知的，并且可以包括在合适的催化剂或碱的存在下用适当的羧酸、酸酐或氯化物处理化合物。一种前药为磷酸酯二钠(disodium phosphate ester)。本发明的化合物的磷酸酯二钠(例如，式I的化合物的C-7磷酸酯二钠)可以用于增加化合物的溶解度。例如，这将可以允许化合物在良性媒介物如盐水中递送。磷酸酯二钠可以根据在Pettit等，(1995)Anticancer Drug Des.,10:299.中描述的方法来制备。一般性地描述前药(及其制备)的其他文本包括：Bundgaard(1985)Design of Prodrugs,(Elsevier)；Wermuth等(1996)ThePractice of Medicinal Chemistry,第31章(Academic Press)；以及Bundgaard等(1991)ATextbook of Drug Design and Development，第5章,(Harwood Academic Publishers)。

因此，在一个实施方案中，式(I)的化合物为如下呈现的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：

式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药可以呈游离化合物或溶剂合物(例如水合物)的结晶形式，并且意图两种形式均在本发明的范围内。溶剂化的方法为本领域通常已知的。类似的考虑适用于依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药。

“有效量”意图意指诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物诸如依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药以及式(I)的化合物或其盐、溶剂合物或前药的量，并且当被施用至有此类治疗需要的受试者时，该量足以实现CLL的治疗。这包括在患者中缓解CLL的症状以及诱导CLL的缓解、延缓CLL的发展和对CLL的总体有效管理。因此，例如，治疗有效量为足以降低或缓解CLL生长和发育的量。“有效剂量”可能需要在特定的时间间隔内分开给药或周期给药。因此，例如，如果需要在治疗周期内的24至48小时的时间内施用特定量，则该总量可以在6至12个小时间隔内(over 6 to 12 hourly intervals)递送以达到每个周期所期望的剂量。分开或周期给药的任何变化都被包括在本文中。分开或间歇给药可以包括例如以下的周期：在第一个周期中使用依鲁替尼或式(I)的化合物，然后在随后的周期中使用依鲁替尼或式(I)的化合物中的另一个的组合的周期。一个周期可以持续7天至30天，诸如21天，并且可以需要3个至20个周期，诸如约6个周期。然而，所需的周期数将取决于CLL的严重程度、患者的年龄、患者的总体健康状况等。医师将能够进行评价。提及受试者包括任何年龄的人类。有此类治疗需要的人类包括疑似在即将来临的时间框内具有发展CLL的高遗传或家族风险的患者或患有复发性或难治性CLL或其他难治CLL的患者。

治疗包括至少部分达到期望的效果，或延迟CLL的发作或抑制CLL的进展或者完全停止或逆转CLL的发作或进展。

在一个实施方案中，治疗通过CLL的症状的改善来评价。

本文考虑临床研究，诸如在患有CLL增殖性疾病的患者中的非盲(open-label)、剂量递增研究，以鉴定依鲁替尼和式(I)的化合物的协同作用。有益和/或协同效果可以通过本领域技术人员已知的这些研究的结果直接确定。这些研究还能够比较使用单独的依鲁替尼或式(I)的化合物的单一疗法的效果。在一个实施方案中，组合伴侣(a)的剂量可以被递增直至达到最大耐受剂量(MTD)，并且剂(b)以固定剂量被施用。可选地，组合伴侣(a)被以固定剂量施用，并且剂(b)的剂量被递增。每一个患者可以每天、间歇地或周期地接受剂(a)的剂量。治疗的功效可以在此类研究中确定，例如，在6周、12周、18周或24周之后，通过每9周评价症状评分来确定。在该实施方案中，伴侣(a)或剂(b)中的一个被认为是依鲁替尼或式(I)的化合物中的一个，且伴侣(a)或剂(b)中的另一个为依鲁替尼或式(I)的化合物中的另一个。

本发明的药物组合的施用不仅可以产生有益的作用，例如附加的或协同治疗效果，例如关于缓解CLL或难治性CLL、延缓CLL或难治性CLL的进展或者抑制或改善CLL或难治性CLL的症状，而且还产生另外的出乎意料的有益效果。与仅应用本发明的组合中使用的药物活性成分之一的单一疗法相比，此类其他效果可以包括较少的不利副作用、改进的生活质量或降低的发病率。

本治疗方案的另一个益处为可以使用较低剂量的诸如依鲁替尼和/或式(I)的化合物的活性成分。不仅需要每一个组分(依鲁替尼或式(I)的化合物)的较小剂量，还可以不太频繁地应用，这可以减少副作用的发生率或严重程度。

本文描述的治疗方案还可以包括基于某些临床参数诸如年龄、疾病的进展水平和/或其他因素选择患者进行治疗。另外，通常在开始治疗之后监测患者的CLL的进展。因此，在停止治疗之后，根据状态或缓解水平，随后可能需要另外的治疗。

术语“施用(administration)”涉及将依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药与式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药一起施用至单个患者。组合疗法包括在其中剂不必被以相同的施用途径或同时施用的治疗方案。因此，组合伴侣可以被一起、一个接一个地、或以一个组合的单位剂型单独地或以两个单独的单位剂型施用。单位剂型还可以是固定的组合，诸如包含两种伴侣的药物组合物，或者可以呈以间歇或周期方式的单独剂量。

在一个实施方案中，治疗有效量的例如依鲁替尼可以被单独地施用，或者与式(I)的化合物同时或以任何顺序依次施用，并且组分可以被单独施用或作为固定组合施用。例如，根据本发明的治疗CLL或复发性或难治性CLL的方法可以包括：(i)施用游离形式的或药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药形式的第一组合伴侣；以及(ii)以联合治疗有效量，通常以协同有效量(例如，每日或间歇剂量或者以相应于本文描述的量的周期方案)同时或以任何顺序依次施用游离形式的或药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药形式的第二组合伴侣。在组合伴侣为依鲁替尼的情况下，则依鲁替尼的形式包括其立体异构体。本发明的组合的单独组合伴侣可以在疗法过程期间在不同时间被单独施用，也可以以分开或单一形式被同时施用。术语施用还包括使用在体内转化为组合伴侣本身的组合伴侣的前药。因此，本发明被理解为包括所有此类同时或交替治疗的方案，并且术语“施用(administering)”被相应地解释。

在一个实施方案中，用于施用的一个组合伴侣为依鲁替尼，且另一个组合伴侣为式(I)的化合物。在另一个实施方案中，一个组合伴侣为式(I)的化合物，且另一个组合伴侣为依鲁替尼。

因此，将理解，伴侣的组合可以被呈现为用于在治疗CLL中使用的“部件试剂盒(kit of parts)”或“药物试剂盒(pharmaceutical kit)”。试剂盒可以包括包装和在特定治疗方案中使用的说明，在包装中组合伴侣被单独地供应以用于共施用。

有效剂量可以根据所采用的具体化合物或药物组合物、施用模式和所治疗的CLL状况的严重程度而变化。因此，剂量方案根据多种因素选择，包括施用途径及患者的肾脏和肝脏功能。普通技术医师可以容易地确定并处方缓解、抵消或阻止CLL进展所需的组合中的每一个组分的有效量。

当然，每日剂量将根据多种因素变化，例如所选择的化合物、待治疗的CLL的特定类型和期望的结果。然而，通常，在以单一剂量或分开的剂量，以每天约0.05mg/kg至20mg/kg，特别地每天1mg/kg至20mg/kg，例如每天0.4mg/kg至16mg/kg的每日剂量率(dailydosage rate)施用式(I)的化合物后，达到满意的结果。如以上指示的，每个特定间隔(例如24至48小时)的剂量方案可以被分开以在该时间内达到总剂量，而不是通过快速推注(bolus)。化合物可以通过任何常规途径施用，特别地肠内施用，例如口服，例如以片剂、胶囊、饮用溶液的形式，或者肠胃外施用，例如以可注射溶液或悬浮液的形式。用于口服施用的合适的单位剂型包括从约0.02mg至50mg活性成分，通常0.1mg至30mg和2mg至25mg、4mg至20mg，以及因此的一种或更多种药学上可接受的稀释剂或载体。换言之，式(I)的化合物可以被以每周期从1mg/m²至280mg/m²的量提供。依鲁替尼可以类似地以每周期约200mg至800mg的量施用。

施用方案可以包括在(至少20天的周期的)第1天和第8天通过静脉内以制定的剂量水平添加式(I)的化合物。在该实施方案中，式(I)的化合物可以以1mg/m²至20mg/m²之间的水平给药。

依鲁替尼的施用可以包括口服施用，例如口服，例如以片剂、胶囊、饮用溶液的形式，或者肠胃外施用，例如以可注射溶液或悬浮液的形式。用于口服施用的合适的单位剂型包括每天从约200mg至800mg，例如每天480mg。

在一个实施方案中，式(I)的化合物以第一剂量(约1mg/m²至8mg/m²(例如8mg/m²)；周期1)在第1天和第8天静脉内给予，随后是以相同剂量与每日200mg至800mg(例如480mg)依鲁替尼在第8天和第15天的周期2静脉内给予。周期长度约为20天，且需要6个周期。根据患者的响应，可以采用任何周期数。此外，依鲁替尼可以作为第一周期给予，随后是式(I)的化合物。

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含依鲁替尼和式(I)的化合物或其盐、溶剂合物、立体异构体或前药的组合物，该组合物例如包含例如从约0.1％至约99.9％w/w或w/v，包括从约1％至约50％w/w或w/v的依鲁替尼和式(I)的化合物两者。

组合物可以包含任何合适的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有常规的溶剂、分散介质、填充物、固体载体、包衣、抗真菌剂和抗细菌剂、皮肤渗透剂、表面活性剂、等渗剂和吸附剂等。将理解，本发明的组合物还可以包含其他补充的生理学活性剂。

载体必须是药学上“可接受的”，其意义在于与组合物的其他成分相容并且对受试者不是有害的。组合物包括适用于口服、直肠、经鼻、局部(topical)(包括含服和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)施用的那些。组合物可以便利地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。此类方法包括使活性成分与构成一种或更多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，通过如下制备组合物：使活性成分与液体载体或细碎地分开的固体载体或两者均一地和紧密地缔合，且然后如必要的话，使产品成形。

适用于口服施用的本发明的组合物可以作为每份包含预定量的活性成分的离散单位呈现，诸如胶囊、小袋或片剂；诸如粉末或颗粒；诸如在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或诸如水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分也可以作为快速推注剂(bolus)、舐剂(electuary)或糊剂呈现。

片剂可通过任选地与一种或更多种辅助成分一起压制或模制来制造。压制的片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式的活性成分来制造，诸如任选地与粘合剂(例如惰性稀释剂)、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合的粉末或颗粒。模制的片剂可通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化的化合物的混合物来制造。片剂可以任选地被包衣或刻痕(scored)，并且可以被配制以提供其中的活性成分的缓慢或受控制的释放，使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放谱。片剂可以任选地设有肠溶包衣，以提供在除了胃以外的肠的部分释放。

适用于在口中局部施用的组合物包括锭剂(lozenge)，所述锭剂在调味基底(通常为蔗糖和金合欢胶(acacia)或黄蓍胶)中包含活性成分；含片(pastille)，所述含片在惰性基底诸如明胶和甘油、或蔗糖和金合欢胶中包含活性成分；以及漱口剂，所述漱口剂在适当液体载体中包含活性成分。

适用于局部施用(topical administration)至皮肤的组合物可以包含溶解或者悬浮于任何合适载体或基底的化合物，并且可以呈洗液、凝胶、霜剂、糊剂、软膏及类似物的形式。合适的载体包括矿物油、丙二醇、聚环氧乙烷、聚氧丙烯、乳化蜡、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。经皮贴片也可以用于施用本发明的化合物。

用于直肠施用的组合物可以作为栓剂呈现，所述栓剂具有包含例如可可油、甘油、明胶或聚乙二醇的合适的基底。

适用于阴道施用的组合物可以作为阴道栓剂、卫生棉条、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂呈现，包含除了活性成分以外的如本领域中已知的适当的此类载体。

适于肠胃外施用的组合物包括可以包含抗氧化剂、缓冲剂、杀细菌剂(bactericide)以及使得组合物与预期的接受者的血液等渗的溶质的水性和非水性的等渗无菌注射溶液；以及可以包含悬浮剂和增稠剂的水性或非水性的无菌悬浮液。组合物可以呈现于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件中，仅需要在临使用之前添加无菌液体载体例如注射用水。即时注射溶液和悬浮液可以由先前描述的无菌粉、颗粒和片剂的种类制备。

在一个实施方案中，单位剂量组合物为包含活性成分的如本文以上描述的每日剂量或者单位、每日亚剂量或者其适当的部分的那些。

应该理解，除了以上具体提及的活性成分以外，本发明的组合物可以包括本领域关于所讨论的组合物的类型的常规的其他剂，例如适用于口服施用的那些可以包括诸如以下的另外的剂：粘合剂、甜味剂、增稠剂、调味剂、崩解剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或覆盆子调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

本领域技术人员将理解，本文描述的主题发明除了具体描述的那些以外还易于变化和修改。应当理解，本发明包括落在精神和范围内的所有此类变化和修改。本发明还包括在本说明书中单独或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。

现在将参考以下实施例来描述本发明的某些实施方案，所述实施例意图仅出于说明的目的，并且不意图限制本文之前描述的普遍性的范围。

实施例

合成方案

2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制备。

步骤1：2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基亚甲基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(Larock偶联)。

在100℃，将2-异丙氧基-3-甲氧基-5-碘苯酚(4.41mmol)、1-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)丙炔(1.5g，5.28mmol)、氯化锂(189mg，4.45mmol)和碳酸钠(2.34g，22.08mmol)在干燥二甲基甲酰胺(5mL)中的悬浮液通过排空和用氮气回填脱氧4次。添加乙酸钯(135mg，0.60mmol)，并将反应容器用氮气脱气2次。然后将反应混合物在该温度搅拌4小时(tlc)，并通过在真空下蒸馏去除溶剂。将剩余物溶解于乙酸乙酯(75mL)中，充分搅拌，过滤并用三乙胺(5mL)处理。将溶液浓缩到硅胶(10g)上，并且通过快速色谱法纯化(硅胶，洗脱液＝己烷/乙醚/三乙胺；95:5:1％)，以提供作为黄色油的标题化合物(1.45g，96％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.24(d,1H,J＝8.45Hz),6.88(d,1H,J＝8.47Hz),4.80(s,2H,CH₂),4.73(m,1H),3.88(s,3H,OMe),1.36(d,6H,J＝6.17Hz),0.94(s,9H),0.92(s,9H),0.35(s,6H),0.12(s,6H)。

步骤2：2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-甲酰基-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃

向2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基亚甲基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(2.69mmol)在甲醇(100mL)中的溶液添加浓盐酸(200μL)，并将反应搅拌30分钟(通过tlc监测)，用三乙胺(2mL)猝灭并通过在真空下蒸馏去除溶剂。将剩余物溶解于二氯甲烷(20mL)中，用水(10mL)洗涤，经硫酸镁干燥，在真空下浓缩并与甲苯(20mL)共蒸馏。将粗制产物溶解于干燥二氯甲烷(4mL)中，并将其添加至Collin试剂(于干燥二氯甲烷(30mL)中的三氧化铬(1.01g)、吡啶(1.65mL))的搅拌溶液中。将悬浮液搅拌10分钟，过滤，并用乙醚(20mL)洗涤剩余物。将滤液浓缩到硅胶(10g)上，并且通过快速色谱法纯化(硅胶，洗脱液＝己烷/乙醚/三乙胺；(90:9:1))，以提供作为浅黄色油的标题化合物(503mg，48％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ10.25(s,1H,CHO),7.79(d,1H,J＝8.45Hz),6.98(d,1H,J＝8.46Hz),4.65(m,1H),3.89(s,3H,OMe),1.35(d,6H,J＝6.17Hz),0.97(s,9H),0.45(s,6H)。

步骤3：2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃

在氮气下，在-78℃，向3,4,5-三甲氧基碘苯(377mg，1.27mmol)在干燥四氢呋喃(1mL)中的搅拌溶液中添加正丁基锂(795μL，1.59mmol，在环己烷中的2M溶液)，并将反应混合物在该温度搅拌40分钟。在此时间之后，经由注射器移液管逐滴地将2-叔丁基二甲基甲硅烷基-3-甲酰基-6-甲氧基-7-异丙氧基苯并呋喃(1.07mmol)于干燥四氢呋喃(1mL)中的溶液添加至反应。将反应混合物在-60℃搅拌20分钟，并且然后允许温热至0℃，搅拌10分钟，用饱和的氯化铵溶液(2mL)猝灭并用乙酸乙酯(20mL)稀释。将有机层用水(10mL)洗涤，经硫酸镁干燥，并在真空下去除溶剂，以给出与甲苯共蒸馏的剩余物。将粗制产物(908mg)溶解于干燥四氢呋喃(10mL)中，并添加2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(900mg，1.59mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时(通过tlc监测)，然后将其装载到硅胶(10g)上，并且通过快速色谱法纯化(硅胶，洗脱液＝己烷/乙醚/三乙胺；90:9:1)，以提供作为浅黄色油的标题化合物(498mg，69％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.14(s,2H,苯甲酰基H),6.81(d,1H,J＝8.64Hz),6.77(d,1H,J＝8.64Hz)4.74(m,1H),3.93(s,3H,OMe),3.86(s,3H,OMe),3.78(s,6H,2x OMe),1.39(d,6H,J＝6.14Hz),1.01(s,9H),0.26(s,6H)。

步骤4：2-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃

在氮气下，在室温向2-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)-7-异丙氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-苯并呋喃(160mg,0.31mmol)于干燥DCM(2mL)中的搅拌溶液添加固体三氯化铝(83mg，0.62mmol)，并将反应混合物搅拌15分钟(通过tlc监测)。用氯化铵的饱和溶液猝灭反应，用二氯甲烷萃取并用硫酸镁干燥。通过蒸馏去除溶剂，并通过与甲苯共沸去除水来干燥剩余物。将粗制产物溶解于吡啶(2mL)，添加乙酸酐(1mL)并将反应混合物在室温搅拌2小时。在真空下蒸馏溶剂，并将剩余物装载到硅胶(1g)上，并且通过柱色谱法纯化(硅胶，洗脱液，己烷:乙醚；80:20)(134mg，84％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.14(s,2H,苯甲酰基H),6.98(d,1H,J＝8.72Hz),6.85(d,1H,J＝8.72Hz),3.93(s,3H,OMe),3.86(s,3H,OMe),3.80(s,6H,2x OMe),2.41(s,3H),0.99(s,9H),0.25(s,6H)。

步骤5：2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃

在氮气下，在室温，向2-叔丁基二甲基甲硅烷基-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃(120mg,0.44mmol)于1,2-二氯乙烷(1mL)中的搅拌溶液中逐滴添加溴(12μl，0.44mmol)，并将反应混合物在该温度搅拌10分钟。在此时间之后，用饱和的硫代硫酸钠溶液猝灭反应，用乙酸乙酯(20mL)萃取，经硫酸镁干燥并通过在真空下蒸馏去除溶剂。粗制产物通过硅胶柱色谱法纯化(洗脱液＝己烷:乙醚；8:2-7:3)，以提供作为无色结晶固体的标题化合物(91mg,81％)；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.40(d,1H,J＝8.70Hz),7.14(s,2H,苯甲酰基-H),6.98(d,1H,J＝8.75Hz),3.94(s,3H,OMe),3.89(s,3H,OMe),3.86(s,6H,2x OMe),2.43(s,3H)；¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ187.95(CO),167.71,152.75,149.54,147.49,142.59,131.92,131.80,123.91,121.84,119.89,117.72,109.89,106.92,60.69,56.61,56.00,20.09。

实施例1

2-甲基-7-羟基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃的制备

制备A

在90℃，向2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基苯并呋喃(20mg,0.042mmol)、甲基-硼酸(40mg,0.67mmol)在1,4-二氧六环(dioxane)(2mL)中的搅拌溶液中添加四-三苯基膦钯(11mg,0.01mmol)，随后添加碳酸氢钠(40mg,0.48mmol)在蒸馏水(0.5mL)中的溶液。5分钟后，反应混合物变成红色。2小时(tlc)后，将反应混合物降至室温，并添加饱和的氯化铵(2mL)，并用二氯甲烷(20mL)稀释。将有机层分离并用水洗涤，经硫酸镁干燥，并通过在真空下蒸馏去除溶剂。将剩余物通过PTLC纯化(洗脱剂＝二氯甲烷/甲醇，1:1)，以给出作为蓬松的白色固体的标题化合物(乙酸酯在反应期间裂解)；(3mg,19％)。

制备B(Negishi偶联)

在0℃，向溴化锌(592mg,2.63mmol)在干燥THF(1.5mL)中的搅拌溶液中添加甲基锂溶液(在乙醚中的1.6M溶液，2.6mL,4.15mmol)，并将反应混合物搅拌2小时。添加固体2-溴-7-乙酰氧基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-6-甲氧基-苯并呋喃(300mg，0.63mmol)，并在真空下去除乙醚，并向剩余的悬浮液添加双(三苯基膦)二氯化钯催化剂(21mg)和催化量的碘化亚铜(I)。将反应混合物在室温搅拌36小时(通过tlc监测)，用饱和的氯化铵溶液猝灭，并用二氯甲烷(10mL)萃取，经硫酸镁干燥，并在真空下蒸馏蒸馏，并通过硅胶柱色谱法(洗脱液＝己烷:乙醚；8:2)纯化产物。将产物在甲醇(106mg,46％)中结晶；¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.09(s,2H,苯甲酰基H),6.93(d,1H,J＝8.54Hz),6.83(d,1H,J＝8.56Hz),5.70(bs,1H,OH),3.93(s,3H,OMe),3.92(s,3H,OMe),3.83(s,6H,2x OMe),2.54(s,3H,2-Me)。

实施例2

6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸二钠的制备

步骤1：6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸二苄酯：

在氮气气氛下，在0℃，向0.081g(0.22mmol)的(7-羟基-6-甲氧基-2-甲基苯并呋喃-3-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮、0.086g(0.261mmol)的四溴化碳和0.063ml(0.283mmol)的亚磷酸二苄酯在2.5ml无水乙腈中的混合物中逐滴添加0.046ml无水三乙胺。将所得混合物在室温搅拌2h，然后用乙酸乙酯稀释至20ml，用水盐水洗涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并在减压下蒸发至干。将剩余物通过快速柱色谱法(二氯甲烷/乙酸乙酯，9:1)纯化，以给出作为无色泡沫的标题化合物(0.13g,94％)；¹H NMR(CDCl₃)δ2.42(s,3H,Me-2)；3.83(s,1H,OMe)；3.93(s,3H,OMe)；5.33(m,4H,CH₂Ph)；6.89(d,芳族CH,J＝8.7Hz)；7.21(dd,1H,芳族CH,J＝8.72Hz；J＝1.2Hz)；7.08(s,2H,芳族CH)；7.29-7.43(m,10H,芳族CH)。

步骤2：6-甲氧基-2-甲基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)苯并呋喃-7-基磷酸二钠：

在氮气气氛下，在-5℃，向0.122g(0.193mmol)的来自步骤1的产物在1ml无水乙腈中的搅拌溶液中添加0.075ml(0.58mmol)的溴代三甲基甲硅烷。将所得混合物在0℃搅拌1h，然后真空蒸发至干。将剩余物用无水甲醇稀释至5ml，并且通过添加甲醇钠将溶液的pH升至约10。在减压下蒸发所得混合物后，将固体剩余物用无水异丙醇(4x1.5ml)和无水乙醇(3x1.5ml)洗涤，并且在真空下干燥以给出0.062g(65％收率)作为无色固体的标题化合物；¹H NMR(D₂O)δ2.37(s,3H,Me-2)；3.76(s,6H,OMe)；3.79(s,3H,OMe)；3.82(s,3H,OMe)；4.66(s,H₂O)；6,93(d,1H,芳族CH,J＝8.6Hz)；7.04(d,1H,芳族CH,J＝8.6Hz)；7.10(s,2H,芳族CH)。

生物数据

材料和方法

试剂

这些研究中使用的实施例2(EX2)从Bionomics Ltd.获得。ABT-199从ActiveBiochem购买。Dinaciclib从国家癌症研究所癌症疗法评价计划(Cancer TherapyEvaluation Program,National Cancer Institute)获得。c-Jun-NH2-末端激酶(JNK)抑制剂VIII从Calbiochem购买。Hoechst 33342从Molecular Probes购买。长春花碱、考布他汀A及其他试剂从Sigma购买。

使用以下抗体：磷酸化-c-Jun(Ser-63；9261)、磷酸化-JNK1/2(9255)、JNK1/2(9252)和聚ADP核糖聚合酶(PARP；9542；细胞信号传导)；Noxa(OP180)和肌动蛋白(EMDBiosciences；JLA20)。二级抗体从BioRad购买。

细胞培养

CLL细胞从Norris Cotton癌症中心(Norris Cotton Cancer Center)的同意的患者获得。通过在Ficoll-Paque PLUS中离心从10mL血液纯化细胞。将淋巴细胞在PBS+2mmol/L EDTA中洗涤3次后，以1×10⁶个细胞/mL铺于RPMI 1640加10％血清中。将细胞立即与试剂孵育，或者在以5:1的比与CD154+基质细胞(L 4.5)的汇合层孵育24h之后与试剂孵育。

染色质染色

在37℃，将细胞用2μg/mL Hoechst 33342孵育10分钟，并用荧光显微镜可视化。对于每一个样品，对至少200个细胞进行评分。记录具有凝聚染色质的细胞百分比。

免疫印迹分析

在尿素样品缓冲液[4mol/L尿素、10％β-巯基乙醇、6％w/v SDS、125mmol/L Tris(pH 6.8)、0.01％w/v溴酚蓝和蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(cocktail)]中裂解细胞并煮沸5分钟。随后将蛋白通过SDS-PAGE(10％或15％w/v)分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)。用TBS和0.05％w/v吐温20中的5％w/v脱脂奶粉封闭膜，并用适当的一级抗体探测过夜。随后，将膜在TBS和0.05％w/v吐温20中洗涤，并然后与缀合至辣根过氧化物酶的二级抗体孵育。将蛋白通过增强的化学发光(Amersham)可视化。肌动蛋白用作蛋白印迹中的上样量对照。

结果

EX2在CLL细胞中的单剂功效

为了确定EX2是否诱导凋亡，将新鲜分离的CLL细胞孵育在包含0-1μM EX2的培养基中。将染色质凝聚作为凋亡的典型标志进行评分。在细胞与10-100nM EX2孵育之后观察到凋亡，并且这也与PARP的裂解相关(图1)。还用pJNK和NOXA两者评价蛋白裂解物，二者都被相同浓度的EX2升高。

然后将三种微管破坏剂EX2、长春花碱和考布他汀A4的功效进行非常详细地比较。图2A和B反映了一名单独的患者，而图2C反映了3-6名患者的平均值。如通过染色质凝聚和PARP裂解评价的，EX2为CLL细胞中的凋亡的更有效的诱导剂。在每一种情况下，pINK和Noxa表达与凋亡的出现相关，凋亡在EX2的情况下在低至5nM的浓度开始出现(图2A)。

在CLL细胞中诱导的凋亡为JNK依赖性的

在存在或不存在JNK抑制剂VIII的情况下孵育CLL细胞和0-1μM EX2。在不存在抑制剂的情况下观察到PARP裂解，但PARP裂解被JNK抑制剂完全阻止(图3A、B和10A、B)，并且这与通过凝聚染色质染色测量观察到的细胞存活率相关(图3C)。在具有和不具有抑制剂的所有条件下观察到磷酸化的JNK。这些结果表明，导致EX2诱导的CLL细胞中的凋亡的机制取决于pJNK活性。

JNK的活化快速发生(在少于一小时内)。然后确定用EX2脉冲处理1小时是否与用EX2连续孵育一样有效。去除EX2后5小时，仍然观察到JNK活化和PARP裂解，尽管略少于当EX2与细胞连续孵育时(图4)。

注意到，在这些实验中的许多实验中，PARP裂解在6h时是不完全的。为了确定在较晚的时间点是否发生更大的凋亡，我们将细胞与EX2孵育多达至24小时(图5)。尽管凋亡在此时间段内增加，到24小时观察到PARP几乎全部裂解，但是所示的实例显示出甚至在6小时时对EX2特别敏感。然而，在使用Jeko-1细胞的平行实验中，发现大多数凋亡发生在6小时与12小时之间，并且到24小时时完成(图6)。因此，显示凋亡不限于任何亚群，而是可以发生在整个细胞群体中。

基质介导对EX2的耐受性，这可以通过新颖的药物组合来规避

以上实验表明，CLL细胞通常对EX2非常敏感。然而，这些细胞分离自外周血，并且治愈CLL的真正问题为能够杀死存在于淋巴结或骨髓小生境中的细胞。为了模拟该小生境，我们使用了表达CD154的L4.5细胞。将CLL细胞在该基质上共孵育24小时，引起对许多药物包括BCL-2抑制剂ABT-199的显著耐受性(图7)。这些共培养的CLL细胞也对EX2显著耐受，在1μM未观察到凋亡(图7)。然而，当组合ABT-199和EX2时，再次观察到明显的凋亡。例如，单独的100nM ABT-199诱导约10％的凋亡，而当与1μM Ex2组合时，在6h内观察到>60％的凋亡。1μM EX2和1μM ABT-199的组合诱导约80％的凋亡。该患者的细胞似乎比图2中归纳的那些细胞更耐受，因此这可能低估了该组合的影响。在来自另一个对单独的EX2更敏感的患者的细胞中，观察到对ABT-199的更大致敏。

正常外周淋巴细胞耐受EX2

为了测试EX2的潜在毒性，从健康志愿者分离正常的外周淋巴细胞，并将其与单独的EX2或与ABT-199组合的EX2孵育。尽管pJNK被活化，但不存在显著的由EX2诱导的PARP裂解或染色质凝聚；然而，Noxa未被诱导(图8)。ABT-199似乎诱导轻微的PARP裂解，但PARP裂解不被EX2升高，并且未观察到染色质凝聚。该图还显示了将EX2与CDK9抑制剂dinacilib组合的影响，dinacilib主要通过组织MCL-1表达而在该模型中起作用。单独的Dinaciclib诱导正常白细胞中的一些的凋亡，但这未被EX2增加。

图11示出了将白血病细胞系或CLL细胞与EX2±dinaciclib(A)或ABT-199(B)孵育6小时。与先前的长春花碱结果一致，dinaciclib介导的凋亡需要JNK，但ABT-199介导的凋亡不需要。(C)将新鲜分离的CLL细胞单独孵育并立即处理，或者将其铺在表达CD40L的L4.5基质细胞的单层上24h，然后用EX2±ABT-199处理6小时(n＝16)。

实施例3

依鲁替尼和实施例2在患有复发性或难治性CLL的患者中的1b期。

进行1b期试验。表1提供了实验条件的归纳。在此实施例的末尾提供了此实施例中使用的缩写列表。实施例2为式(I)的化合物的实例。该研究还能够进行变化，首先向患者提供依鲁替尼，随后使患者暴露于实施例2。在此非限制性实施方案的以下讨论中，将考虑此类变化。

表1：试验归纳

表2提供了研究方案。

表2：研究方案

基于周期1-2中DLT的决策树

研究设计和目的

研究设计

这是实施例2与依鲁替尼组合在患复发性/难治性CLL的患者中的非随机非盲Ib期剂量递增/发现研究。

研究遵循标准的3+3I期设计。在确定了最大耐受剂量(MTD)后，招募扩充队列。在治疗周期1和2期间评价剂量限制性毒性(DLT)以确定MTD。

本研究中增加了先前未接受依鲁替尼或替代性布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂的患复发性/难治性CLL的患者。先前接受了抑制B细胞受体(BCR)信号传导级联中除BTK以外的激酶的药物(例如，idelalisib、PI3K抑制剂)的患者有资格。在剂量水平1，患者接受8mg/m²实施例2与依鲁替尼(420mg，从周期2开始)组合。如果安全，将实施例2的剂量递增至12mg/m²和16mg/m²(剂量水平2和3)。相反，如果遇到DLT，则会发生实施例2的剂量递减至4mg/m²和2mg/m²(剂量水平-1和-2)。在确定MTD后，则在该组合的剂量水平增加扩充队列，以允许在随后的周期期间评价DLT。

增加(Accrual)同时发生(参见表2)，并在医学监督期间在门诊诊所(ambulatoryclinic)进行。

研究目的

主要：

-建立与BTK抑制剂依鲁替尼组合的实施例2在患CLL的患者中的MTD。

次要：

-确定与依鲁替尼组合的实施例2在患有CLL的患者中的功效

第三/探索性目的：

-探索实施例2在CLL B细胞中的药效学作用

-评价确认的生物标志(染色体异常、免疫球蛋白重链[IGHV]突变状态、ZAP-70和CD38表达；p53突变状态)是否预测与依鲁替尼组合的实施例2在患复发性/难治性CLL的患者中的响应。

研究终点

主要

主要研究终点基于毒性。

次要

1)功效。完成至少三个21天的研究疗法周期(单独的实施例2的一个周期和与依鲁替尼组合的两个周期)的患者是可评价反应的。

a)根据IWCLL 2008年标准(Hallek等(2008)BLOOD:111:5446-5456)，基于在完成治疗后两个月评价时达到CR、CRi、PR或nPR的研究参与者的比例确定总体响应率。

b)无事件生存期(Event-free survival)(EFS)被定义为首次研究治疗日期与疾病复发的客观体征(objective signs)、随后的抗白血病疗法或死亡的日期(以首先报告的为准)之间的间隔。

2)观察患者数和完成的治疗周期数。

3)生物标志-通过评价生物标志分析来确定有更大或更小可能性响应于研究方案的患者群体。

用于剂量选择的原理

在具有晚期实体瘤的受试者中评价实施例2的推荐的2期剂量(RP2D)。剂量为在2.1mg/m²的水平。16mg/m²的剂量被认为是MTD。在此研究中，在所有剂量组都观察到不良事件。两个最常见的AE类别为胃肠紊乱(恶心、呕吐、便秘)和一般紊乱(主要是疲劳)。与骨髓抑制相关的紊乱很少见。在8.4mg/m²的剂量水平的一名患者中和在18.9mg/m²的剂量水平的两名患者中报告了贫血。两个4级事件(心肌梗死和周围神经病变)发生在剂量水平为18.9mg/m²的同一受试者中。类似地，在实施例2的II期研究中，在患恶性胸膜间皮瘤的患者中，1-2级胃肠紊乱和一般紊乱为主要的AE：分别在87％和50％的患者中。在8％的患者中观察到3级疲劳。最后，在33％的研究参与者中报告了1-2级贫血。

当在CLL中研究组合疗法时，考虑以下注意事项。

首先，患者被诊断为患CLL时的中值年龄为72岁。患CLL的患者在诊断时呈现中值为2种共病(comorbidity)，并且46％携带至少一种主要共病Thurmes等(2008)LeukLymphoma 49:49-56。

第二，骨髓参与和血细胞减少在CLL中普遍存在。因此，与具有完整骨髓的患实体瘤的患者相比，患CLL的患者可以经历增加频率的3-4级血液毒性治疗。

第三，由于肿瘤细胞积累在它们可能对细胞毒性剂特别易感的外周血中，所以肿瘤裂解综合征(TLS)为CLL中的担忧。由于实施例2在体外诱导CLL细胞的快速凋亡，测试低于当前提出的MTD的剂量的药物是明智的，特别是在其中依鲁替尼可能引起淋巴细胞增多的情况下。如果在低于先前建立的MTD的剂量的实施例2发生快速响应，针对患有CLL的患者的RP2D被向下修正，最终降低AE的风险。

第四，对于本研究重要的是，实施例2显示以12.6mg/m²和16mg/m²的剂量短暂地破坏PBMC中的微管，这表明可以达到诱导预期的促凋亡生物标志(P-JNK和NOXA)的足够的血浆浓度。

因此，本研究在21天周期的第1天和第8天(周期1)或在第8天和第15天(周期2-6)中采用静脉内8mg/m²作为实施例2的起始剂量。该剂量相应于比足以诱导微管破坏的剂量低一个等级，且还低于在患实体瘤的患者中实施例2的I期研究中当前建立的MTD的剂量。患者接受实施例2持续一个21天周期，并从周期2开始，以FDA批准的剂量(每天po 420mg)接受依鲁替尼。该研究遵循标准的3+3I期设计(在每一个剂量等级招募3和6名之间的患者)。将药物的剂量递增至毒性允许的16mg/m²。如果在剂量水平1出现毒性，将实施例2的剂量递减至4mg/m²。依鲁替尼起始剂量在每个剂量等级保持相同(420mg)，但根据毒性进行调整。在几个剂量水平评价用实施例2的治疗的响应和药效学终点的初步评价，允许在CLL中更仔细地选择RP2D。

参与者的选择

资格标准

1.根据NCI-WG 1996指南Cheson等(1996)Blood,87:4990-4997，患者患有组织学或流式细胞术证实的B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(B-CLL/SLL)的诊断。恶性B细胞必须共表达CD5与CD19或CD20。检查在他们的白血病细胞上缺乏CD23表达的患者(并发现不具有)t(11；14)或细胞周期蛋白D1过表达，以排除套细胞淋巴瘤。

2.满足需要治疗的IWCLL 2008标准的至少1项的活动性疾病(Hallek等(2008)同上)：

(1)至少以下全身症状的任一种：

(a)在筛选之前的前6个月内非意愿性体重减轻>10％。

(b)极度疲劳(无法工作或进行常规活动)。

(c)发热大于100.5F，持续≥2周，没有感染的迹象。

(d)夜间盗汗，没有感染的证据。

(2)进行性骨髓衰竭的迹象，表现为贫血或血小板减少的发展或恶化。

(3)块状(massive)(即左肋缘下＞6cm)、进行性或症状性脾肿大。

(4)实心节或簇(即，最长直径＞10cm)或进行性淋巴结病(lymphadenopathy)。

(5)进行性淋巴细胞增多，其中在2个月内增加＞50％，或预期倍增时间少于6个月。

(6)对皮质类固醇响应不佳的自身免疫性贫血或血小板减少。

3.患者必须已经接受过至少一次以前的用于CLL的疗法。

4.患者必须具有ECOG体能状态≤2。

5.患者必须具有如下文定义的器官功能：

-直接胆红素≤2X机构ULN(institutional ULN)(除非由于已知的吉尔伯特氏综合征(Gilbert’s syndrome)或可直接归因于CLL的补偿性溶血)

-AST或ALT少于2.5X机构ULN

-使用Cockroft-Gault等式估计的CrCL≥50mL/min。

-血小板≥50,000/mm³，不受输血支持影响，不存在活动性出血。

6.备孕女性在筛选时必须具有阴性血清β-人类绒毛膜促性腺激素或尿妊娠测试。

7.具有生殖能力的所有患者(异性性活跃的男性和女性)都必须同意使用阻隔性避孕方法和第二种避孕方法，并且男性必须同意在研究期间和持续在接受研究治疗的最后剂量之后4周不捐献精子。

排除标准

1.现有的治疗性干预使用以下的任一种：

a)在任何时间的依鲁替尼或另一种布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂；

b)在6周内的亚硝基脲或丝裂霉素C；

c)在4周内的治疗性抗癌抗体(包括利妥昔单抗)；

d)在10周内的辐射性免疫缀合物或毒素免疫缀合物；

e)在疗法开始之前3周内的所有其他化学疗法、放射疗法。

2.尚未从与现有疗法相关的不良事件恢复至≤1级(不包括2级脱发和神经病变)。

3.长期使用超过泼尼松20mg/天或其等效的皮质类固醇。干细胞移植接受者必须没有活动性移植物抗宿主病的迹象。

4.使用全剂量，用华法林(warfarin)、未分级或低分子量肝素或其他抗凝剂(anticoagulant)(例如，直接凝血酶抑制剂—达比加群(dabigatran)或抗Xa剂—利伐沙班(rivaroxaban)/阿哌沙班(apixaban))的治疗性抗凝固。用于导管预防的低剂量华法林或阿司匹林≤325mg/天是可以接受的

5.伴随使用强力CYP诱导剂或抑制剂，包括营养制剂，例如贯叶连翘(St John’sWort)

6.除以下以外的先前的恶性肿瘤病史：

a)在本研究的疗法开始之前，恶性肿瘤用治愈性目的进行治疗并且不存在已知的活动性疾病≥2年；

b)充分治疗的非黑素瘤皮肤癌或恶性雀斑样痣(lentigo maligna)，无疾病症状；

c)充分治疗的原位癌(例如宫颈癌、食管癌等)，无疾病症状；

d)无症状的用“观察和等待”策略管理的前列腺癌；

e)被临床良好控制的骨髓增生异常综合征，并且在筛选时骨髓上的骨髓增生没有细胞遗传学异常特征的迹象。

7.不受控制的免疫溶血或血小板减少(不存在溶血的阳性直接抗球蛋白测试不是排除要素)。

8.在疗法开始之前6个月内的血栓形成事件(肺栓塞；深静脉血栓形成)。

9.人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体阳性或活动性乙型肝炎或活动性丙型肝炎。静脉内注射免疫球蛋白(IVIG)可能引起假阳性的乙型肝炎血清学。如果接受常规IVIG的患者具有核心抗体或表面抗原阳性，没有活动性病毒血症的迹象(阴性乙型肝炎病毒DNA)，他们仍可以参与研究，但应该由治疗医师定期监测肝炎血清学和乙型肝炎病毒DNA。

10.在C1D1之前8周内，III级或IV级纽约心脏病协会充血性心力衰竭(New YorkHeart Association Congestive Heart Failure)或急性冠状动脉综合征。

11.在疗法开始之前30天内进行大手术(需要全身麻醉)。

12.无力吞咽并保留口服药物。患有吸收不良、炎性肠病、表现为腹泻的慢性状况、难治性恶心、呕吐或显著干扰研究药物吸收的任何其他状况的临床显著医学状况的患者。

13.被研究者判断为参与此项试验对患有间歇性疾患(inter-current illness)的患者有害的任何状况，包括但不限于不受控制的活动性感染；不稳定性心绞痛；不受控制的心律失常或将危及依从研究要求的精神/社会情况。

治疗计划

治疗基于住院或门诊来施用。对于实施例2和依鲁替尼的预期的毒性和潜在风险以及剂量修改在下文描述(预期的毒性和给药延迟/修改)。除了下文描述的那些以外，未施用研究或商业剂或疗法以意图治疗参与者的CLL/SLL。

研究程序

该研究由以下组成：在实施例2施用之前具有基线肿瘤评价的治疗前期、具有多达6个21天周期的治疗期和治疗后期(治疗结束的访问和治疗后随访访问)。患者接受总计6个周期的疗法，除非由于预先指定的原因之一而终止治疗。

研究评价和程序的计时由研究周期和天呈现，并缩写为以下参考符号(references)：周期(C)数和天(D)数，如在C1D1(第1周期第1天)。C1D1为实施例2的第一剂量的日期。将在每一周内的周期和天数此后依次编号。

治疗前期

在治疗前期期间，患者被筛选并同意研究。如果在限定的时间段内完成，在知情同意之前以常规护理的一部分进行的评价被用作筛选评价。

患者经历筛选评价以确定研究资格，包括医学史、身体检查、血液学和生物化学/代谢实验室概况、尿液分析、凝血、妊娠测试和所有有资格的疾病评价(qualifyingdisease assessments)。所有资格筛选(qualifying screening)和资格评价(eligibilityassessment)在第一研究治疗剂量之前30天内进行。用于基线疾病评价的测试在初始研究治疗剂量的指定时间框内进行(CT扫描-30天，遗传标志[细胞遗传学和FISH]、CD38和骨髓活检-6个月、HIV和肝炎测试-12个月、ZAP-70-自诊断的任何时间以及IGHV突变状态-自诊断的任何时间，如果有的话)。

治疗期

周期被定义为每21天。实施例2以下文详述的剂量被施用多达6个周期，并且在周期2至6与依鲁替尼组合施用。每个周期在第1天进行诊所访问。在某些情况下，在周期2-6期间，第1天可以被延迟不多于3天，或者比安排的早不多于1天发生。

不良事件的评价发生在周期1的第1天、第2天、第8天和第15天；周期2的第1天、第8天、第9天和第15天；以及随后周期的第1天、第8天和第15天。

临床实验室评价在每一次周期访问的D1或在那些访问之前≤48小时收集，并且测试结果在实施例2(C1D1)或依鲁替尼(C2-6)的第一剂量之前是可获得的并且被审核。如果筛选评价在研究治疗的第一剂量之前≤72小时进行，则筛选评价测试被认为是C1D1测试；否则，在此时间段内重复所需的评价。在C1D1、C1D2以及C1D8、C1D15、C2D8、C2D9和C2D15收集另外的临床实验室评价。

在C1D1和C2D8，所有有资格的患者都提供样品用于生物标志分析。

患者还在C4D1(或在C4D1访问之前≤72小时)经历CT分期，以评价疾病进展。如果怀疑在C4开始之前已经发生疾病进展，可以在C1-3期间进行CT扫描。

研究治疗期结束于最后一个研究治疗周期的第21天。患者在研究治疗的最后一个21天周期后2个月(±7天)回到研究地点进行结束治疗访问。进行实验室和身体检查以及ECG。辐射学评价在最后一个21天周期后的2个月(±7天)进行。如果怀疑有完全响应，在研究治疗的最后一个21天周期后不晚于3个月进行骨髓活检。跟随与研究治疗相关并在此访问时持续存在的不良事件直至消除或直至被首席研究员(Lead PI)认为不可逆。

治疗后期

疾病评价按照原始时间表在治疗后期或更早(如果临床指示)被获得。具体地，评价在治疗结束访问后3个月、6个月、9个月和12个月进行，此后每4-6个月进行，并且在每次访问时包括实验室评价和身体检查。在治疗结束访问后6个月和12个月(±7天)时以及此后根据临床指示获得CT扫描。无论患者是否选择继续依鲁替尼治疗都进行此类评价。继续依鲁替尼疗法的患者参与EFS分析。

治疗

实施例2的配制、储存和操作

实施例2从Bionomics Ltd,Australia获得。本研究产品为"实施例2注射溶液"，其为根据当前的良好生产规范(cGMP)制造的实施例2的无菌溶液，并且该无菌溶液包含溶解于盐水中的10mg/mL磷酸盐前药等效物(phosphate prodrug equivalent)(未离子化)。本研究产品为透明的、无色至黄色的液体，被呈现于透明玻璃小瓶中，并且意图在静脉内施用之前用可商购的无菌0.9％盐水稀释。使用无菌技术进行用于在临床试验中使用的本研究产品的稀释。10mg/mL实施例2注射溶液药物产品意图冷冻储存和运输，以使药物的货架期和质量最大化。稀释的研究药物被储存在受控制的室温或更低温度(冷藏)，并且在使用之前可以被保存多达28小时。不需要避光。实施例2注射溶液已经显示与商购可得盐水静脉内施用袋及一系列输注装置组分(infusion set components)相容。储存在-20℃的实施例2药物产品的稳定性试验已经在多达48个月显示可接受的产品回收率和纯度。

当需要时，使用无菌技术将本研究产品用商购可得的无菌0.9％w/v盐水稀释。在用盐水进行任何稀释之前，分配时间以使本研究产品解冻至环境温度。建议在给药的前一天进行用0.9％w/v盐水对本研究产品的稀释。

依鲁替尼的配制、储存和操作

依鲁替尼从商业供应获得，并根据制造商的说明使用。

治疗说明

将治疗归纳于表3中。

表3.治疗说明

总体研究设计

这是具有剂量递增阶段随后是MTD剂量扩大阶段的非盲Ib期试验。剂量递增阶段的主要目的为评价实施例2与依鲁替尼组合在患复发性/难治性CLL的患者中的MTD。MTD剂量扩大阶段还在MTD水平在多达15名患者中评价组合的安全性和功效。

剂量递增阶段

在“剂量递增”阶段评价多达三个剂量水平。

实施例2的剂量水平为在周期1的第1天和第8天以及周期2-6的第8天和第15天的8mg/m²(剂量水平1)、12mg/m²(剂量水平2)和16mg/m²(剂量水平3)静脉内(表4)。

如果在剂量水平1观察到DLT(如下文中描述的)，则将实施例2的剂量降低至4mg/m²(剂量水平-1)。如果在剂量水平-1观察到DLT(如下文中描述的)，则将实施例2的剂量降低至2mg/m²(剂量水平-2)。

当BCN105P在依鲁替尼开始之前作为单一剂被施用时，实施例2的开始剂量为在周期1的第1天和第8天的8mg/m²静脉内。从周期2开始，依鲁替尼以每日420mg PO的开始剂量与实施例2同时施用。为了允许依鲁替尼介导CLL细胞从淋巴结小生境的迁出，在周期2-6期间的第8天和第15天施用实施例2。依鲁替尼的开始剂量在每一个剂量水平保持不变。

每一个周期持续21天。如果没有毒性发生，每一个患者被治疗6个周期。

该研究的“剂量递增”阶段遵循标准的3+3I期设计。在给定剂量水平，招募3名患者。如果所有3名患者完成第一个疗法周期而没有任何剂量限制性毒性(DLT)，则在下一个较高剂量水平下招募下一个3名患者的队列。如果1/3的患者发生DLT，则将该队列扩充至6名患者。然而，如果在任何剂量等级中的≥2/3或≥2/6的患者具有DLT，则先前的剂量等级被定义为组合的最大耐受剂量(MTD)。确定MTD后，扩充队列在该剂量水平被增加至总计15名患者，即增加12名或9名另外的患者。

表4：对于本研究的剂量递增阶段计划的剂量水平

^*仅当多于1名患者在剂量水平1发生DLT时，才研究剂量水平-1

对于在剂量递增阶段的所有剂量水平，如果多于一名患者在相应的剂量水平发生DLT；则将根据表4示出的计划降低实施例2的剂量。

如果未观察到显著的毒性，研究的剂量递增部分预期将招募9名至18名之间的患者。治疗继续持续a)6个周期；或b)直至疾病进展或不可接受的毒性，如果它们在完成6个治疗周期之前发生。

剂量延长阶段

在“剂量延长”阶段，以在剂量递增阶段确定的实施例2与依鲁替尼组合的MTD治疗患者。治疗继续持续a)6个周期；或b)直至疾病进展或不可接受的毒性，如果它们在完成6个治疗周期之前发生。在该阶段，对患者评价安全性(CTCAE v.4.03)和功效参数(总体响应率[ORR]和无进展存活期(progression free survival)[PFS])。

不考虑对以下患者进行功效评价，除非疾病进展在第一次安排的功效评价之前已经发生：

a)由于任何原因未能完成第一次功效评价(安排在C4开始时)，或者

b)在前3个周期的每一个周期期间接受＜2次剂量的实施例2或在周期2和3的每一个周期期间接受21个剂量中＜14个剂量的依鲁替尼。

治疗前标准

C1D1

血液学参数：血小板必须＞50,000/mm³(不存在输血支持)；血红蛋白＞8g/dL(允许输血支持)；

非血液学参数：直接胆红素≤2X机构ULN(除非由于已知的吉尔伯特氏综合征或可直接归因于CLL的溶血)；AST或ALT＜2.5X机构ULN。

生命体征、所有实验室数据(包括妊娠测试)在施用第一剂量的研究剂之前由治疗医师审查。

随后周期

血液学参数：血小板必须＞50,000/mm³或＞基线的75％，以较低者为准(无输血支持)；血红蛋白＞8g/dL(允许输血支持)；ANC＞1000/mm³或＞75％的基线，以较低者为准(在ANC＜1000的情况下由研究者酌情决定，允许G-CSF支持)。

实施例2的施用。

对于所有患者，实施例2的起始剂量为在周期1的21天周期的第1天和第8天；从最大6个周期的周期2开始在21天周期的第8天和第15天在10分钟内静脉内输注8mg/m²。实施例2的剂量使用用于BSA的Mosteller或DuBois公式基于实际体重来计算。

公式的选择基于机构指南。

Mosteller公式：BSA＝SQRT([身高(cm)x体重(kg)]/3600)，

DuBois公式：BSA(m²)＝0.20247x身高(m)^0.725x体重(kg)^0.425。

根据与前一个周期使用的相同公式，对每一个周期重新计算剂量。

推荐的输注持续时间：10分钟；输注之后观察期：15分钟。

依鲁替尼的施用

依鲁替尼从C2D1开始自行施用。用8盎司(约240mL)的水口服服用依鲁替尼。胶囊在餐前不少于30分钟或在餐后不少于2小时被完整吞咽。每天在约同一时间在早晨服用剂量。如果患者错过了剂量，可以在同一天尽快服用以在次日返回至正常时间表。患者记日记，在日记中他/她记录服用依鲁替尼的日期和时间。

在当依鲁替尼与实施例2一起的时候(周期2至6的第8天和第15天)，依鲁替尼在施用实施例2之前至少30分钟在诊所给予。

个体患者的疗法持续时间及随访

假定未发生限制毒性，则研究参与者接受多达6个周期的实施例2和依鲁替尼。

预期的毒性和剂量延迟/剂量修改

预期毒性：实施例2

基于实施例2的可获得的数据，以下为在经由静脉内途径施用实施例2的患者中可能遇到的影响的列表。

·胃肠影响(恶心、呕吐、腹泻或便秘)。

·血液学变化(骨髓抑制、血小板计数、网织红细胞数、凝固轻微延迟)

·嗜睡、疲劳

·胳膊和腿部无力

·全身不适

·肋骨疼痛

·感染/侵袭(infestation)症状增加(单纯性疱疹；口腔念珠菌病)

·增加的皮肤敏感度

·对精子计数的影响

·心血管影响、心肌梗死和瞬时血压变化。

·外周感觉神经病变

·肝功能测试升高(Elevation in the liver function tests)

·非ST段抬高性心肌梗死

·血栓栓塞事件(包括肺栓塞、深静脉血栓形成)

·中风

尽管在犬中测试时实施例2对心血管系统没有影响，但不能排除对心血管系统的潜在影响。基于实施例2的2周期大鼠研究的结果，在大鼠中观察到剂量依赖性的可逆的心肌病。至2周期治疗后14天，心肌病的迹象在严重程度和发病率方面降低，表明影响的恢复或可逆性。这些发现对人类的意义并不清楚，因为在犬毒性研究中未观察到这些心血管影响。此外，在遥测犬的心血管安全性药理学研究中，在剂量高达0.8mg/kg(评价的最高剂量)后，对心血管或呼吸功能不存在影响。此外，基于体外测试，实施例1和实施例2的hERG通道抑制的IC50值分别比2.5μg/mL和486.0μg/mL大得多，其中第一剂量代表在测试系统中最大可行的，并且后一剂量代表在以临床上理论起始剂量的100倍使施用实施例2后，预期存在的最高游离血浆浓度的30倍的水平。因此，预期在实施例2的有效剂量，对hERG通道有轻微的影响(如果有的话)。

在以上列出的影响中，对精子计数的影响、血液学变化和潜在的心血管影响(心肌梗塞；瞬时血压变化)可能被认为是潜在的严重程度和严重性的风险。值得注意的是，血液学影响和对精子计数的影响不是抑制微管蛋白聚合和随后细胞增殖的药物的出乎意料的效果。

功效

完成两个周期的研究治疗的所有受试者都可以评价功效。

疾病评价

作为完全疾病评价的一部分在治疗期间以及在研究结束访问后的第3个、第6个、第9个和第12个月及此后直到疾病进展或死亡的每4-6个月，进行聚焦于记录淋巴结肿大、肝肿大和脾肿大的位点数和尺寸的变化的身体检查。

在C1的第1天、第2天、第8天和第15天；在C2的第1天、8天、9天和第15天；在剩余的四个周期的第1天、首个12个月的每3个月以及此后直至疾病进展或死亡的每4-6个月获得具有包括ALC的参数测量的完全血细胞计数(CBC)。

在每一个周期的D1；在C1D1和C2D8施用实施例2之后3和6小时；以及在C1D2和C2D9获得血清生化/代谢组(Serum biochemistry/metabolic panel)。

在筛选时、在C4D1(或≤72小时之前)、在治疗结束访问时(在完成治疗的最后21天周期之后2个月±7天)、在治疗访问结束之后的第6个月和第12个月(±7天)以及此后根据临床指示，进行颈部、胸部、腹部和骨盆的可能的静脉对比度的计算机断层扫描(CT)。位置测量根据IWCLL 2008标准进行。

在筛选期间或在研究药物第一剂量之前多达6个月获得单侧骨髓抽吸和活检。自从完成其最后的CLL疗法具有骨髓抽吸和活检结果的受试者可以使用这些结果，如果这些结果在研究药物第一剂量之前的6个月内获得。如果受试者的身体检查结果、实验室和辐射学评价表明已经获得CR，则在治疗结束访问之后30天内进行骨髓抽吸/活检以确认CR。

响应标准

修改的IWCLL指导Hallek等(2008)Blood,111:5446-5456用于测量CLL/SLL患者中的响应。

CLL/SLL患者的客观响应被定义为CR、Cri、nPR和PR。在治疗结束时评价患者的响应。如果存在进展的临床怀疑，随时进行疾病评价。

完全缓解(CR)要求以下所有内容：

1.外周血淋巴细胞(通过血液和差异计数评价)低于4×10⁹/L

2.如果基线扫描异常，通过身体检查和成像不存在显著的淋巴结肿大(淋巴结直径＞1.5cm)

3.如果基线扫描异常，通过身体检查和成像无肝肿大或脾肿大

4.不存在全身症状(B症状)

5.血液计数：

-中性粒细胞＞1.5×10⁹/L，无需外源生长因子

-血小板＞100×10⁹/L，无需外源生长因子

-血红蛋白＞11.0g/dL，无红细胞输血或无需外源红细胞生成素

6.骨髓抽吸和活检必须具有以下结果

-对于年龄，细胞正常(normocellular for age)

-少于30％的有核细胞是淋巴细胞

-无B淋巴结节(由IHC证实)

具有不完全骨髓恢复的完全响应(CRi)：满足CR的所有标准、但具有与CLL无关但继发于药物毒性的低细胞骨髓和持续性贫血或血小板减少症或中性粒细胞减少症(neutropenia)的患者。如果骨髓是低细胞的，4周后或当外周血计数已经恢复时进行重复确定。

结节性部分响应(nPR)：满足CR的所有标准、但通过IHC具有B淋巴结节的骨髓证据的患者。

部分缓解(PR)要求：

1.血液计数应该显示以下结果之一：

-中性粒细胞多于1.5×10⁹/L，无需外源生长因子

-血小板计数＞100×10⁹/L或相比于基线改善50％，无需外源生长因子

-血红蛋白＞11.0g/dL或相比于基线改善50％，无需红细胞输血或外源红细胞生成素

以及以下三个标准中的两个：

2.血液淋巴细胞的数目比治疗之前的值减少了50％或更多

3.通过身体检查或成像淋巴结肿大的降低被定义如下：

-在多达6个淋巴结的和积(sum products)中，或在治疗之前检测到的扩大的淋巴结的最大直径中，淋巴结尺寸减少了50％或更多

-在任何淋巴结中无增加，并且无新的扩大的淋巴结

-在小淋巴结(＜2cm)中，少于25％的增加不被认为是显著的

4.通过体检或成像，脾肿大和肝肿大降低50％或更多。

具有淋巴细胞增多的PR：

由于依鲁替尼可能引起持续性淋巴细胞增多，因此其在指定PR时应不会干扰。具有淋巴细胞增多的PR应该基于ALC以外的其他可测量的疾病方面Cheson等(2012)J ClinOncol,30:2820-2822。

Claims

1.一种用于治疗患者中的慢性淋巴细胞白血病(CLL)的方法，所述方法包括以任一顺序或同时施用有效量的(i)诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药；和(ii)式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药的步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者为人类受试者。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的所述化合物为依鲁替尼。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述有效量被以周期施用，包括，在第一周期中施用依鲁替尼或式(I)的化合物中的一种；以及在第二周期中施用依鲁替尼和/或式(I)的化合物与依鲁替尼中的另一种，以及根据需要此类各自的周期，用于改善所述受试者中的CLL的症状。

5.如权利要求4所述的方法，其中依鲁替尼的量为每日从200mg至800mg。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中式(I)的化合物的有效量为从1mg/m²至20mg/m²。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物通过口服或肠胃外施用来施用。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物与另一种抗癌剂同时或顺序共施用。

9.如权利要求1所述的方法，其中基于临床参数选择患者进行治疗，所述临床参数包括年龄、所述疾病的进展水平、和/或其他复杂的不适。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述患者表现出复发性或难治性CLL。

11.如权利要求1所述的方法，其中式(I)的化合物为实施例2。

12.诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药；和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药在制备用于治疗患者中的CLL的药物中的用途：

13.一种组合物，所述组合物包含诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药；和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：

所述组合物用于在治疗患者中的CLL中使用。

14.如权利要求12所述的用途或如权利要求13所述的组合物，其中所述患者为人类。

15.如权利要求14所述的用途或组合物，其中诱导CLL细胞从淋巴结或骨髓迁出的所述化合物为依鲁替尼。

16.如权利要求12所述的用途或如权利要求13所述的组合物，其中所述人类具有复发性或难治性CLL。

17.如权利要求12所述的用途，其中所述化合物与另一种抗癌剂组合使用。

18.如权利要求12所述的用途或如权利要求13所述的组合物，其中所述式(I)的化合物为：

19.一种用于治疗CLL的药物试剂盒，所述药物试剂盒包含依鲁替尼或其药学上可接受的盐、溶剂合物、立体异构体或前药；和式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或前药：

以及使用说明。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法、用途或试剂盒，其中所述式(I)的化合物为：