CN107418933A - 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法 - Google Patents

一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107418933A
CN107418933A CN201710739714.8A CN201710739714A CN107418933A CN 107418933 A CN107418933 A CN 107418933A CN 201710739714 A CN201710739714 A CN 201710739714A CN 107418933 A CN107418933 A CN 107418933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cik
immunocytes
amplification method
external evoked
culture plate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710739714.8A
Other languages
English (en)
Inventor
朱学义
徐峰波
陈乐�
王豪东
陈艳普
王秋文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yinfeng Biological Group Ltd
Original Assignee
Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd filed Critical Henan Yinfeng Bioengineering Co Ltd
Priority to CN201710739714.8A priority Critical patent/CN107418933A/zh
Publication of CN107418933A publication Critical patent/CN107418933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤：(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基培养，接种于细胞培养板中，通过γ‑干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔2‑3d换培养液，并每隔5‑10天悬浮刺激细胞，培养至20‑25d时，结束培养。本发明的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，减少了cik免疫细胞的培养时间及培养成本，能够提高cik免疫细胞的扩增速度。

Description

一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法。
背景技术
CIK免疫细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKiller，CIK)，细胞毒作用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性，和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，因此，CIK细胞被认为是新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CIK免疫细胞扩增能力限制了其在临床上进一步的推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，以提高cik免疫细胞的扩增速度。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤：
(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；
(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基培养，接种于细胞培养板中，通过γ-干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔2-3d换培养液，并每隔5-10天悬浮刺激细胞，培养至20-25d时，结束培养。
所述步骤(1)中，包被的细胞培养板在使用之前，需吸出孔内的CD3单克隆抗体溶液，并用D-Hanks缓冲液冲洗细胞培养板。
所述步骤(2)中，基础培养基为PRMI-1640培养基。
所述步骤(2)中，培养液中含有白细胞介素-1、白细胞介素-2。
所述步骤(2)中，白细胞介素-1、白细胞介素-2的浓度分别为50-200U/mL，100-200U/mL。
所述步骤(2)中，保持细胞密度为0.8-1.2*106个/mL。
所述步骤(2)中，γ-干扰素溶液的浓度为500-1000U/mL。
有益效果：本发明的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，减少了cik免疫细胞的培养时间及培养成本，能够提高cik免疫细胞的扩增速度。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤：
(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；包被的细胞培养板在使用之前，需吸出孔内的CD3单克隆抗体溶液，并用D-Hanks缓冲液冲洗细胞培养板；
(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基PRMI-1640培养，接种于细胞培养板中，通过浓度为1000U/mL的γ-干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔2d换培养液，培养液中白细胞介素-1、白细胞介素-2的浓度分别为50U/mL，200U/mL。并每隔5天悬浮刺激细胞，培养至20d时，培养过程中保持细胞密度为1.2*106个/mL，结束培养。
实施例2
一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤：
(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；包被的细胞培养板在使用之前，需吸出孔内的CD3单克隆抗体溶液，并用D-Hanks缓冲液冲洗细胞培养板；
(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基PRMI-1640培养，接种于细胞培养板中，通过浓度为500U/mL的γ-干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔3d换培养液，培养液中白细胞介素-1、白细胞介素-2的浓度分别为100U/mL，150U/mL。并每隔10天悬浮刺激细胞，培养至25d时，培养过程中保持细胞密度为0.8*106个/mL，结束培养。
实施例3
一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，包括以下步骤：
(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；包被的细胞培养板在使用之前，需吸出孔内的CD3单克隆抗体溶液，并用D-Hanks缓冲液冲洗细胞培养板；
(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基PRMI-1640培养，接种于细胞培养板中，通过浓度为600U/mL的γ-干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔2d换培养液，培养液中白细胞介素-1、白细胞介素-2的浓度分别为200U/mL，100U/mL。并每隔8天悬浮刺激细胞，培养至20d时，培养过程中保持细胞密度为1.0*106个/mL，结束培养。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将纯化的CD3单克隆抗体溶液室温下包被细胞培养板，并于4℃存储备用；
(2)将分离得到的单个核细胞以基础培养基培养，接种于细胞培养板中，通过γ-干扰素溶液刺激细胞24h，之后经离心、换液，转移至步骤(1)得到的CD3单克隆抗体包被的细胞培养板中培养，每隔2-3d换培养液，并每隔5-10天悬浮刺激细胞，培养至20-25d时，结束培养。
2.根据权利要求1所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(1)中，包被的细胞培养板在使用之前，需吸出孔内的CD3单克隆抗体溶液，并用D-Hanks缓冲液冲洗细胞培养板。
3.根据权利要求1所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)中，基础培养基为PRMI-1640培养基。
4.根据权利要求1所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)中，培养液中含有白细胞介素-1、白细胞介素-2。
5.根据权利要求4所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)中，白细胞介素-1、白细胞介素-2的浓度分别为50-200U/mL，100-200U/mL。
6.根据权利要求1所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)中，保持细胞密度为0.8-1.2*106个/mL。
7.根据权利要求1所述的cik免疫细胞的体外诱导扩增方法，其特征在于：所述步骤(2)中，γ-干扰素溶液的浓度为500-1000U/mL。
CN201710739714.8A 2017-08-25 2017-08-25 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法 Pending CN107418933A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710739714.8A CN107418933A (zh) 2017-08-25 2017-08-25 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710739714.8A CN107418933A (zh) 2017-08-25 2017-08-25 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107418933A true CN107418933A (zh) 2017-12-01

Family

ID=60434616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710739714.8A Pending CN107418933A (zh) 2017-08-25 2017-08-25 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107418933A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019892A (zh) * 2019-12-16 2020-04-17 杭州恩格生物医疗科技有限公司 一种免疫细胞体外诱导扩增方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418283A (zh) * 2007-10-23 2009-04-29 范云峰 一种简单高效地制备cik细胞的方法
CN103468640A (zh) * 2013-09-27 2013-12-25 合肥凤凰肿瘤医院 提高cik细胞对癌细胞的杀伤作用的方法
CN105087487A (zh) * 2015-09-23 2015-11-25 协和干细胞基因工程有限公司 一种高效扩增cik的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101418283A (zh) * 2007-10-23 2009-04-29 范云峰 一种简单高效地制备cik细胞的方法
CN103468640A (zh) * 2013-09-27 2013-12-25 合肥凤凰肿瘤医院 提高cik细胞对癌细胞的杀伤作用的方法
CN105087487A (zh) * 2015-09-23 2015-11-25 协和干细胞基因工程有限公司 一种高效扩增cik的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHI HUA WANG ET AL.: "effect of il-12 on the proliferation and cytotoxicity of CIK cells to gastric adenocarcinoma cell BGC-823", 《SEMANTIC SCHOLAR》 *
段彦龙等: "一种高倍扩增细胞因子诱导杀伤细胞方法", 《大连理工大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111019892A (zh) * 2019-12-16 2020-04-17 杭州恩格生物医疗科技有限公司 一种免疫细胞体外诱导扩增方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109294985B (zh) 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法
CN103849599B (zh) 一种高效扩增自体nk细胞的培养基及培养方法
CN105238754B (zh) 一种高增殖力和高杀伤力nk细胞的体外培养方法
CN107475196A (zh) 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN104371974B (zh) 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法
CN103756963A (zh) 一种体外扩增nk细胞的方法
CN107460168A (zh) 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN107488631A (zh) 自然杀伤细胞培养基质及自然杀伤细胞的扩增培养方法
CN104894065A (zh) 一种nk细胞培养基及nk细胞的培养方法
CN103525763A (zh) 一种高效cik细胞的培养方法
CN106701827A (zh) 表达cd19和cd20抗体基因嵌合抗原受体t细胞的转化及扩增培养与保存方法
CN106591232A (zh) 一种高效的pd‑1‑cd8+t细胞的培养方法
CN103468641A (zh) 一种癌性胸腹水来源的til细胞的高效扩增方法
CN103936862A (zh) 猪白细胞介素4/6、2基因共表达及其在制备生物制剂中的应用
CN102732481A (zh) 一种人细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法
CN105505871A (zh) 一种有效扩增cik且提高其特异性杀瘤能力的方法
CN104818249B (zh) 一种增强型cik细胞制剂及其制备方法
CN107418933A (zh) 一种cik免疫细胞的体外诱导扩增方法
CN112662625B (zh) 一种t细胞培养基及其用于t细胞的扩增培养方法
CN103981144A (zh) 自体血清抗原致敏dc-cik细胞的制备方法
CN104762261A (zh) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法
CN104017770B (zh) 一种利用糖脂制备cik细胞的方法
CN106047809A (zh) 一种联合tlr7配体同时扩增人cik/nk细胞的方法
CN106244540A (zh) 一种提高cik细胞增殖率和杀伤力的细胞培养方法
CN106085960A (zh) 一种培养dc细胞的培养基及培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180115

Address after: No. 11 Changchun Road, Henan high tech Industrial Development Zone, Zhengzhou, Henan

Applicant after: HENAN YINFENG BIOENGINEERING CO., LTD.

Applicant after: YINFENG BIOLOGICAL GROUP CO., LTD.

Address before: No. 11 Changchun Road, Henan high tech Industrial Development Zone, Zhengzhou, Henan

Applicant before: HENAN YINFENG BIOENGINEERING CO., LTD.

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171201

RJ01 Rejection of invention patent application after publication