CN107406837A - 修饰的dna酶及其用途 - Google Patents

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尤利娅·乌郭尔瑟夫
哈奇特·内塔
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艾尔拉德·拉维拉维亚德
尤瑟夫·雪提尔
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Abstract

本发明提供一种修饰的DNA酶I蛋白，其中一DNA酶I蛋白的一或多个氨基酸被非细胞地修饰。所述修饰的DNA酶I蛋白在肌动蛋白存在下展现一DNA水解活性，以及相较于一同源的未修饰的DNA酶I蛋白亦展现一改良的DNA水解活性。本发明还提供多种制备修饰的DNA酶I蛋白的方法以及例如其在减少痰液中DNA含量和/或治疗与一对象的流体、分泌物或组织中过量的细胞外DNA相关的一疾病或病症的多种用途。

Description

修饰的DNA酶及其用途
技术领域
本发明在其一些实施例中涉及治疗方法，更具体地但非唯一地涉及非细胞修饰的DNA酶I蛋白、其制备方法及其治疗用途。
背景技术
根据其生物化学性质和酶活性，去氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase，DNA酶)蛋白被分类为DNA酶I和DNA酶II两种。DNA酶I蛋白质具有最接近中性的pH值，并在DNA水解后产生5'-磷酸核苷酸(5'-phosphate nucleotides)。
人类DNA酶I是哺乳动物DNA酶I家族的成员(EC 3.1.21.1)。DNA酶I属于Mg2+和Ca2+依赖性内切核酸酶，其水解活性取决于二价阳离子的存在。Mg2+离子参与磷酸二酯键切割的亲电子催化，而Ca2+保持最佳的酵素构型。DNA酶I优先在与嘧啶核苷酸(pyrimidinenucleotide)相邻的磷酸二酯连接(phosphodiester linkages)处切割DNA，产生5'端磷酸端的多核苷酸(5'-phosphate-terminated polynucleotides)，在3'位置上具有游离羟基(hydroxyl group)，平均产生四核苷酸(tetranucleotides)。它作用于单链DNA、双链DNA和染色质。
人类DNA酶的主要治疗用途是通过水解分泌物中存在的高分子量DNA，以降低肺炎(pneumonia)和囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)等肺分泌物(包括粘液)的粘液弹性(viscoelasticity)，从而有助于清除的呼吸气道内部[Shak等人所著，PNAS 87：9188-9192(1990)]。粘液还导致慢性支气管炎(chronic bronchitis)、哮喘性支气管炎(asthmaticbronchitis)、支气管扩张(bronchiectasis)、肺气肿(emphysema)、急性和慢性鼻窦炎(acute and chronic sinusitis)、甚至感冒(common cold)的发病。具有这种疾病的人的肺分泌物包括粘液糖蛋白(mucus glycoproteins)、粘多醣(mucopolysaccharides)、蛋白酶(proteases)、肌动蛋白(actin)和DNA的复杂物质。DNA酶还被提出用于治疗非肺部疾病、例如治疗男性不育症和子宫疾病(参见美国专利申请公开号2007/0259367)、抑制肿瘤转移性生长(参见美国专利号7,612,032)和局部应用于病毒病症。
链道酶α(Dornase alfa)是在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达的一重组人类DNA酶(rhDNase)，用于治疗囊性纤维化(cystic fibrosis)，并以商品名称上市。
国际专利申请公开号WO 2013/114374中描述了植物表达的重组人类DNA酶I蛋白及其通过吸入DNA酶I来治疗肺和/或呼吸病症的用途。
由于DNA酶I与肌动蛋白(actin)的相互作用，肺分泌物中DNA酶I的DNA水解活性可能会降低[Lazarides等人所著，PNAS 71:4742-4746(1974)；Mannherz等人所著,Eur JBiochem 104:367-379(1980)]。
国际专利申请公开号WO 96/26279描述了
人类DNA酶I的氨基酸序列变体(variant)对肌动蛋白具有降低的结合亲和力，及其被应用于降低粘液粘度的用途。已有报道指出肌动蛋白抗性(actin-resistant)的DNA酶变体A114R和A114F比野生型DNA酶在降低粘性和增加囊性纤维化的患者的气道分泌物的咳嗽运输更有效果[Zahm等人所著，Am J Respir Crit Care Med 163:1153–1157(2001)；Pan等人所著,J Biol Chem 273:18374-18381(1998)]。
将额外正电荷的氨基酸引入DNA酶I序列中导致更有活性的DNA酶I变体。导致最大活性增强的额外正电荷的氨基的数目取决于DNA和离子的浓度[Pan&Lazarus所著，J BiolChem 273：11701-11708(1998)；Pan等人所著，J Biol Chem 273：18374-18381(1998)]。
已有报道指出，包含用于增加活性的额外带正电荷的氨基酸，同时包含肌动蛋白抗性突变A114F的DNA酶I比以额外带正电荷的氨基酸或肌动蛋白抗性突变为单一特征的变体，能更有效地降解囊性纤维化的痰液中DNA[Pan等人所著，J Biol Chem 273:18374-18381(1998)]。
已有报道指出聚天冬氨酸(Polyaspartic acid)和肌动蛋白切断蛋白凝溶胶(gelsolin)增强了DNA酶I(dornase alfa)使囊性纤维化患者的痰液液流动化的能力[Bucki等人所著，J Cystic Fibrosis 2015,14:587-593]。
发明内容
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一种修饰的DNA酶I蛋白。
根据本发明的一些实施例，所述修饰的DNA酶I蛋白包括一DNA酶I蛋白的一氨基酸序列(例如一被肌动蛋白(actin)抑制的DNA酶I蛋白，如本文中所定义)，并且被修饰使得所述DNA酶I蛋白中至少一的氨基酸残基是一非细胞修饰的氨基酸残基。
根据本发明的一些实例，如周围参考文献中任一者所述的修饰的DNA酶I蛋白及其任何组合的特征在于或表现至少一特性选自于由以下所组成的一群组：
(1)在一修饰的DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％；
(2)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少20％；
(3)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(4)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性在不存的至少150％；
(5)在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少两倍。
根据本发明的一些实例的任何一者，在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在1微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的DNA水解活性的至少80％。
根据本发明的一些实例的任何一者，在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少70％。
根据本发明的一些实例的任何一者，在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％。
根据本发明的一些实例的任何一者，在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少200％。
根据本发明的一些实例的任何一者，在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少200％。
根据本发明的一些实例的任何一者，在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少三倍。
根据本发明的一些实例的任何一者，至少两个氨基酸残基，任选地至少5个氨基酸残基，是非细胞修饰的氨基酸残基。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(修饰的)DNA酶I蛋白质为所述(未修饰的)DNA酶I蛋白质的至少一羧酸基(carboxylic acid group)被以下通式的一酰胺基(amide group)所取代：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'和R”各自独立地选自于一氢元素和一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基(hydrocarbon moiety)所组成的一群组，任选地被一或多个杂原子(heteroatoms)插入。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'和R”中的至少一者是所述饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入。
根据本发明的一些实例的一方面，提供一种修饰的DNA酶I蛋白，包括一DNA酶I蛋白的一氨基酸序列，其中所述DNA酶I蛋白质的至少一羧酸基被以下通式的一酰胺基所取代：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'和R”各自独立地选自于一氢元素和一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基所组成的一群组，任选地被一或多个杂原子插入。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'和R”中的至少一者是所述饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入。
根据本发明的一些实例的任何一者，至少一特性选自于由以下所组成的一群组：
(1)在一修饰的DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％；
(2)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少20％；
(3)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(4)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(5)在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少两倍。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述酰胺基具有以下通式：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'选自于烷基、烯基和炔基所组成一群组，所述烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)和炔基(alkynyl)的各者未被取代或被一或多个选自于羟基(hydroxy)和氨基(amino)所组成的一群组的取代基所取代。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'包括1至10个碳原子。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'包括2至6个碳原子。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述烷基、所述烯基或所述炔基被一或多个羟基(hydroxy group)取代。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'是三(羟甲基)甲基(tris(hydroxymethyl)methyl)。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述烷基、所述烯基或所述炔基被一或多个氨基取代。
根据本发明的一些实例的任何一者，R'是2-氨基乙基(2-aminoethyl)。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述至少一羧酸基选自于一氨基酸残基的一侧链内的一羧酸基和一C-末端羧酸基(C-terminal carboxylic acid group)所组成的一群组。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述氨基酸残基的侧炼是选自于下述所组成的一群组的一氨基酸残基的一侧链：一谷氨酸残基(glutamic acid residue)、一天冬氨酸残基(aspartic acid residue)、一N-甲基-谷氨酸残基(N-methyl-glutamic acidresidue)、一N-甲基天冬氨酸残基(N-methylaspartic acid residue)、一α-甲基谷氨酸残基(α-methylglutamic acid residue)、一α-甲基天冬氨酸残基(α-methylaspartic acidresidue)、一γ-羧基谷氨酸残基(γ-carboxyglutamic acid residue)、一N-(羧甲基)甘氨酸残基(N-(carboxymethyl)glycine residue)、一N-(2-羧乙基)甘氨酸残基(N-(2-carboxyethyl)glycine residue)和一α-氨基己二酸残基(α-aminoadipic acidresidue)。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述DNA酶I蛋白质的至少两个所述羧酸基被所述酰胺基取代。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述DNA酶I蛋白质的至少五个所述羧酸基被所述酰胺基取代。
根据本发明的一些实例的任何一者，相对于DNA水解活性的一米氏常数低于一未修饰的DNA酶I蛋白相对于一DNA水解活性的一米氏常数。
根据本发明的一些实例的任何一者，相对于DNA水解活性的一米氏常数(Michaelis constant)不超过20微克/毫升的DNA。
根据本发明的一些实例的任何一者，相对于DNA水解活性的一比活性为一未修饰的DNA酶I蛋白相对于DNA水解活性的一比活性的至少70％。
根据本发明的一些实例的任何一者，相对于DNA水解活性的一催化效率大于一未修饰的DNA酶I蛋白质相对于DNA水解活性的一催化效率。
根据本发明的一些实例的任何一者，小于10重量百分比的所述修饰的DNA酶I为一多聚体形式(multimeric form)。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白是一重组蛋白。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白是一植物重组蛋白。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白对于一人类DNA酶I蛋白具有至少80％的同源性。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白包括一N-末端甘氨酸残基。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白包括或具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰的)DNA酶I蛋白包括或具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
根据本发明的一些实例的任何一者，所述(未修饰)DNA酶I蛋白具有至少一核心木糖(core xylose)和至少一核心α-(1,3)岩藻糖(coreα-(1,3)fucose)。
根据本发明的一些实例的一方面，提供一种制备本文中所述多个实施例的任一者所述的修饰的DNA酶I蛋白的方法，所述方法包括：
使所述(未修饰的)DNA酶I蛋白在一偶联剂存在下，与以下通式的一含胺化合物反应
HNR’R”
其中R'和R”的各者是一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入，所述杂原子独立地选自于一氢元素及一取代的或未取代的烷基(alkyl)、链烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、环烷基(cycloalkyl)、芳基(aryl)、杂脂环(heteroalicyclic)和杂芳基(heteroaryl)所组成的一群组。
根据本发明的一些实例，所述含胺化合物具有以下通式：
H2N-R’
其中R'是一饱和或不饱和的烷基，所述饱和或不饱和的烷基未被取代或被一或多个选自于羟基和氨基(hydroxy and amino)所组成的一群组的取代基所取代。
根据本发明的一些实例的任一者，所述偶联剂是一碳二亚胺(carbodiimide)。
根据本发明的一些实例的任一者，所述碳二亚胺是CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)。
根据本发明的一些实例的一方面，提供一种药物组合物，包括本文中所述多个实施例的任一者中所述的修饰的DNA酶I蛋白作为一活性成分以及一药学上可接受的载体。
根据本发明的一些实例的任一者，所述药物组合物还包括一钙盐。
根据本发明的一些实例的任一者，所述药物组合物中钙的浓度在5至15毫摩尔浓度的一范围内。
根据本发明的一些实例的任一者，所述药物组合物还包括一聚山梨醇酯80。
根据本发明的一些实例的任一者，所述药物组合物包括约10毫摩尔浓度的CaCl2、约0.01％的聚山梨酯80、约140毫摩尔浓度的NaCl和约5毫克/毫升的所述修饰的DNA酶I蛋白。
根据本发明的一些实例的任一者，所述药物组合物被配制成通过一雾化器递送。
根据本发明的一些实例的任一者，所述修饰的DNA酶I蛋白是一至少90％纯的DNA酶I蛋白。
根据本发明的一些实例的任一者，所述多个个别实施例的任一者以及其任何组合中所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白被应用于降低痰液液的粘度。
根据本发明的一些实例的任一者，所述多个个别实施例的任一者以及其任何组合中所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白被应用于降低痰液中的DNA含量。
根据本发明的一些实例的任一者，所述多个个别实施例的任一者以及其任何组合中所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一疾病或病症，所述疾病或病症与在一有需要的对象的一流体、分泌物或组织中过量的细胞外DNA相关。
根据本发明的一些实例的任一者，所述疾病或病症是一肺部疾病或病症。
根据本发明的一些实例的任一者，所述多个个别实施例的任一者以及其任何组合中所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一有需要的对象的囊性纤维化。
根据本发明的一些实例的任一者，所述多个个别实施例的任一者以及其任何组合中所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一疾病或病症，所述疾病或病症选自于由下述所组成的一群组：一支气管炎(bronchitis)、一非囊性纤维化支气管扩张症(non-cystic fibrosis bronchiectasis)、一慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease,COPD)、一红斑狼疮(lupus erythematosus)、一狼疮肾炎(lupus nephritis)、一柯凯因氏综合症(Cockayne syndrome)、一天使人综合症(Angelman syndrome)、一男性不育症(male infertility)、一转移性癌症(metastaticcancer)、一病毒、细菌、真菌或原生动物感染性败血症(viral,bacterial,fungal orprotozoan infection sepsis)、一心肌梗塞(myocardial infarction)、一动脉粥样硬化(atherosclerosis)、一糖尿病(diabetes)、一迟发型超敏反应(delayed typehypersensitivity)和一子宫紊乱(uterine disorder)。
除非另有定义，否则所有本文使用的技术和/或科学术语与本发明所属领域的通常技术人员所理解的具有相同含义。尽管与本文所描述的类似或相同的方法或材料可以用于实践或测试本发明的实施例，但是仍将示例性的方法和/或材料描述如下。在冲突的情况下，以专利说明书所包含的定义为主。此外材料、方法和实施例仅是用于说明，而非旨在必然性地限制各自实施例。
附图说明
本发明在本文中仅以示例性的方式描述，并参考附图。现在具体详细地参照附图，重要的是其所显示的细节是通过示例的方式，仅仅是用于说明及讨论本发明的实施例。在这点上，当将说明结合附图，如何可具体实践出本发明的实施例对于领域技术人员是显而易见的。
在图式中：
图1呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示DNA酶I标准品(第S行)，和通过以乙二胺(ethylene diamine)(第1-3行)或六亚甲基二胺(hexamethylene diamine)(第4-6行)与25(第1和4行)、50(第2和5行)或100(第4和6行)当量的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)进行酰胺化的修饰的DNA酶I；
图2是一柱状图，显示根据本发明的一些实施例中，通过光密度(右侧柱，opticaldensity，OD)所决定的DNA酶I浓度和根据DNA酶I活性通过一甲基绿分析(左侧柱)所决定的表观DNA酶I浓度，在通过以乙二胺(ethylene diamine,Y24(2)和Y24(3))或六亚甲基二胺(hexamethylene diamine,Y24(4)和Y24(5))进行酰胺化(midation)所制备的修饰的DNA酶I样品中，以及在一未修饰的DNA酶标准品中。
图3呈现一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(DNase)，以及使用EDC加入乙醇胺(ethanolamine)(第2行)和没有加入乙醇胺(ethanolamine)(第1行)修饰的DNA酶I(pH值标记在第M行)；
图4是一柱状图，显示根据本发明的一些实施例中，通过光密度(右侧柱，opticaldensity，OD)所决定的DNA酶I浓度和根据DNA酶I活性通过一甲基绿分析(左侧柱，MG long)所决定的表观DNA酶I浓度，在通过以乙醇胺(ethanolamine)进行酰胺化(amidation)所制备的修饰的DNA酶I样品中；
图5是一曲线图，显示通过用乙醇胺(L172)进行酰胺化修饰的DNA酶I以及未修饰的DNA酶I(PRX 110)的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数；
图6是一曲线图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即，G'＝G”，相角＝45°)，在一痰液样品中以每克痰液 0或0.2微克的修饰的DNA酶I处理或未修饰的植物重组人类DNA酶I(PRX-110)处理，所述修饰的DNA酶I是根据本发明的一些实施例(L172)中通过用乙醇胺(ethanolamine)酰胺化制备的(每个值代表至少多个测量值)；
图7是一曲线图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即，G'＝G”，相角＝45°)，在一痰液样品中以每克痰液 0或0.05微克的修饰的DNA酶I处理或未修饰的植物重组人类DNA酶I(PRX-110)或DNA酶I处理，所述修饰的DNA酶I是根据本发明的一些实施例(L172)中通过用乙醇胺(ethanolamine)酰胺化制备的(每个值代表至少两个测量值)；
图8呈现一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(DNase)，以及使用EDC与Tris(第3和5行)或氯化铵(ammonium chloride，第4和6行)或单独使用EDC(第1和2行)进行修饰的DNA酶I，所述修饰的DNA酶I在3小时后具有(第5和6行)或不具有(第3和4行)与Tris或氯化铵的反应终止(pH标记在第M行)；
图9是一柱状图，显示根据本发明的一些实施例中，通过光密度(右侧柱，opticaldensity，OD)所决定的DNA酶I浓度和根据DNA酶I活性通过一甲基绿分析(左侧柱)所决定的表观DNA酶I浓度，在通过以Tris(L171(1))或氯化铵(L171(2))进行酰胺化(amidation)所制备的修饰的DNA酶I样品中。
图10是一曲线图，显示通过以Tris(L171(1))或氯化铵(ammonium chloride,L171(2))进行酰胺化修饰的DNA酶I以及未修饰的重组人类DNA酶I(标准品)的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数。
图11呈现根据本发明的一些实施例中通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I(AIRDNA酶，在图9和10中称为L171(1))以及未修饰的植物重组人DNA酶I(PRX 110)的酶活性的初始速度的动力学图，其使用DNA超色度分析(DNA hyperchromicity assay)，其在DNA降解时，测定在260nm波长处的光密度(右侧柱，optical density，OD)的增加；
图12A和12B呈现一DNA电泳胶体(DNA electrophoresis gel)的影像(图12A)和一柱状图(图12B)，其显示痰液中的DNA含量(图12B中的单位为每克痰液中的DNA毫克)，以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，图12A中的第3和4行)、或每克痰液2微克(图12A中的第7和8行)或5微克(图12A中的第5和6行)的未修饰的DNA酶I、或不含DNA酶I(每克痰液0微克)进行处理；
图13是一柱状图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即，G'＝G”，相角＝45°)，在一痰液样品中以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶)、或每克痰液2微克或5微克的未修饰的 DNA酶I、或不含DNA酶I(每克痰液0微克)进行处理。(每个值代表至少2次测量)；
图14是一柱状图，显示19位患者每个人的痰液中的DNA含量(单位为每克痰液中的DNA毫克)，其痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，右侧柱)、或未修饰的重组人类DNA酶I(rhDNA酶I，中间柱)、或不含DNA酶I(控制组，左侧柱)进行处理；
图15呈现多个柱状图，显示3位患者每个人的痰液中的DNA含量(单位为每克痰液中的DNA毫克)，其痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，右侧柱)、或每克痰液2或5微克的未修饰的DNA酶I、或不含DNA酶I(每克痰液0微克)进行处理。；
图16A至图16D分别是多个柱状图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即，G'＝G”，相角＝45°)，在26位患者的痰液样品中以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克(图16A)、0.2微克(图16B)、20微克(图16C)或0.05微克(图16D)的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(右侧柱)、或未修饰的重组人类DNA酶I(中间柱)、或不含DNA酶I(左侧柱)进行处理(每个值代表至少2次测量)；
图17是一菱形图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即，G'＝G”，相角＝45°)，在6位患者的痰液样品中以根据本发明的一些实施例中肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶)、或未修饰的重组人类DNA酶I(PRX-110)、或链道酶α(Dornase alfa,)DNA酶I进行处理(对于每个处理组的平均值由菱形中间线表示，95％置信区间由菱形的顶部和底部表示，并且进一步显示每个样品的个别数据点)；
图18呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-7)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)和通过用乙二胺(ethylene diamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用25或50当量的DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide，分别在第3和4行)，使用25或50当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate，分别在第5和6行)或50或100当量的DTC(二叔丁基碳二亚胺，di-t-butylcarbodiimide，分别为第1和2行)；
图19呈现根据本发明的一些实施例中(分子量标记在第M行)，一聚丙烯酰胺(polyacrylamide，12％)电泳胶体(SDS-PAGE)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)和通过以乙二胺(ethylene diamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用25或50当量的DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide，分别在第3和4行)，使用25或50当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate，分别在第5和6行)或50或100当量的DTC(二叔丁基碳二亚胺，di-t-butylcarbodiimide，分别为第1和2行)；
图20呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-7)，其显示通过以乙二胺(ethylene diamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用35当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)于MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid)缓冲液中，具有4(第1行)、4.5(第2行)、5(第3行)、5.5(第4行)或6(第5行)的pH值；
图21呈现根据本发明的一些实施例中(分子量标记在第M行)，一聚丙烯酰胺(polyacrylamide，12％)电泳胶体(SDS-PAGE)的影像，其显示通过以乙二胺(ethylenediamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用35当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)于MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid)缓冲液中，具有4(第1行)、4.5(第2行)、5(第3行)、5.5(第4行)或6(第5行)的pH值；
图22呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)和通过用乙二胺(ethylene diamine)和CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)于12℃(第1行)，16℃(第2行)，20℃(第3行)或25℃(第4行)的温度进行酰胺化修饰的DNA酶I；
图23呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)和通过以乙二胺(ethylene diamine)和CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)进行2.5小时(第1行)、2小时(第2行)、1.75小时(第3行)、1.5小时(第4行)或1小时(第5行)酰胺化修饰的DNA酶I；
图24呈现根据本发明的一些实施例中(pH值标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)和通过以CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)和100(第1行)、500(第2行)、1000(第3行)2000(第4行)、4000(第5行)或6000(第5行)当量的乙二胺(ethylenediamine)酰胺化反应修饰的DNA酶I；
图25呈现一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(第1行)和通过以乙二胺(ethylene diamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用35(第2和6行)、45(第3和7行)、55(第4和8行)或65(第5和9行)当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)，在2毫摩尔浓度(第6至9行)的钙离子下进行(pH标记与所标示的pH值在第M行)；
图26是一曲线图，显示通过用乙二胺(ethylene diamine，AIR DNA酶)进行酰胺化修饰的DNA酶I以及未修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数(DNA酶I的浓度为45纳克，阴影区域表示肌动蛋白浓度(至少为0.93微克/毫升)，其中肌动蛋白对DNA酶浓度(45纳克/毫升)的比例与受治疗的囊性纤维化患者的肺粘液中发现的比例相关连)；
图27呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-7)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)，以及通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用25和50当量的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，分别在第1和2行)或25和50当量的DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide，分别在第3和4行)；
图28是一曲线图，显示未修饰的DNA酶I(PRX 110)以及通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数，所述修饰的DNA酶I使用25或50当量EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)或DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide)。
图29呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-7)，其显示未修饰的DNA酶I(第D行)，和通过以100毫摩尔浓度(第1行)或100当量(第2和3行)Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用25(第2行)和100当量(第1行)的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)或35当量的CMC((N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate，在第3行)；
图30是一曲线图，显示未修饰的DNA酶I(PRX 110)以及通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数,所述修饰的DNA酶使用25或100当量EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)或35当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)；
图31A至图31C分别是多个柱状图，显示应力(以Pa为单位)，其中弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)，在3位患者(在图31A至图31C的各图中)的痰液样品中以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克(图31A)、0.2微克(图31B)或0.05微克(图31C)的以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I、或未修饰的重组人类DNA酶I(PRX-110，图31A至图31C)、或DNA酶I(图31C)、或不含DNA酶I(控制组)进行处理，所述修饰的DNA酶I使用25或100当量EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)或35当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)；
图32呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-7)，其显示未修饰的DNA酶I(第1行)，以及通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I，其使用25当量(第2行)的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)；
图33是一曲线图，显示未修饰的DNA酶I以及通过使用25当量EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数；
图34呈现根据本发明的一些实施例中(pH标记及所标示的pH值在第M行)，一等电聚焦胶体(isoelectric focusing gel)的影像(pH 3-10)，其显示未修饰的DNA酶I(第1行)、植物重组人类DNA酶I(第3行)、和通过以乙二胺(ethylenediamine)和60当量的CMC((N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)进行酰胺化修饰的植物重组人类DNA酶I(第2行)；
图35呈现一未修饰植物重组人DNA酶I的MALDI-ToF光谱(下图以更高分辨率显示上图所示光谱的一部分)；
图36呈现根据本发明的一些实施例中通过以乙二胺(ethylene diamine)和60当量的CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)酰胺化修饰的植物重组人DNA酶I的MALDI-ToF光谱。(下图以更高分辨率显示上图所示光谱的一部分)；
图37是一曲线图，显示未修饰的DNA酶I、植物重组人类DNA酶I(PRX-110)以及根据本发明的一些实施例中通过以乙二胺(ethylene diamine)和60当量的CMC((N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)进行酰胺化修饰的植物重组人类DNA酶I(AIR DNA酶)；
图38A和图38B是曲线图，显示未修饰的DNA酶I、植物重组人类DNA酶I(PRX-110)以及根据本发明的一些实施例中通过以乙二胺(ethylene diamine)和60当量的CMC((N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)进行酰胺化修饰的植物重组人类DNA酶I(AIR DNA酶)的DNA酶I活性(通过波长260nm的吸收变化率测定)，为鲑鱼精子DNA浓度的一函数(图38A以更高的分辨率呈现图38B中呈现的数据的一部分)；
图39A至图39C呈现多个柱状图显示，弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)(图39A)、DNA含量(图39B)以及一显示DNA降解的DNA电泳胶体的影像(FIG.39C)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0.2微克(图39C中第3-4行)或2微克(图39C中第5-6行)的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I、或不含DNA酶I的AIR DNA酶I载体(图39A和图39B中0微克/克，图39C中第1-2行)进行处理；
图40A至图40C呈现多个柱状图显示，弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)(图40A)、DNA含量(图40B)以及一显示DNA降解的DNA电泳胶体的影像(FIG.40C)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0.2微克(图40C中第3-4行)或2微克(图40C中第5-6行)的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I、或不含DNA酶I的AIR DNA酶I载体(图40A和图40B中0微克/克，图40C中第1-2行)进行处理；
图41A至图41C呈现多个柱状图显示，弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)(图41A)、DNA含量(图41B)以及一显示DNA降解的DNA电泳胶体的影像(FIG.41C)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，图41C中第7-8行)、或DNA酶I(图41C中第3-4行)、或不含DNA酶I的AIR DNA酶I载体(图41A和图41B中0微克/克，图41C中第5-6行)、或载体(图41A和图41B中0微克/克，图41C中第1-2行)进行处理；
图42A和图42B分别是一柱状图，显示弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0或2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，深色柱)或DNA酶I(浅色柱)(图42A和图42B显示来自不同囊性纤维化患者的痰液样品的结果，其代表痰液液对AIR DNA酶I有强烈反应但本质上不受DNA酶I影响)；
图43A和图43B分别是一柱状图，显示弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0或2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，深色柱)或DNA酶I(浅色柱)(图43A和图43B显示来自不同囊性纤维化患者的痰液样品的结果，其代表痰液对AIR DNA酶I有强烈反应但对DNA酶I反应弱)；
图44A和图44B分别是一柱状图，显示弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0或2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，深色柱)或DNA酶I(浅色柱)(图44A和图44B显示来自不同囊性纤维化患者的痰液样品的结果，其代表痰液对AIR DNA酶I与DNA酶I均有强烈反应)；
图45A和图45B分别是一柱状图，显示弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscous modulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0或2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，深色柱)或DNA酶I(浅色柱)(图45A和图45B显示来自不同囊性纤维化患者的痰液样品的结果，其代表痰液对AIR DNA酶I与DNA酶I均无反应)；
图46是一柱状图，显示弹性模量(elastic modulus,G')和粘性模量(viscousmodulus,G“)交叉(即G'＝G”，相角＝45°)的应力(以Pa为单位)，其中痰液以根据本发明的一些实施例中每克痰液0或2微克的肌动蛋白抑制抗性DNA酶I(AIR DNA酶，深色柱)或DNA酶I(浅色柱)(痰液样品对于下述呈现非典型结果：痰液对DNA酶I的反应强于对AIR DNA酶I的反应)；
图47呈现存在于AIR DNA酶的示例性样品中的聚糖结构(glycan structure)及其相对量(M或白色圆圈表示甘露糖(mannose)；Fc(3)或具有点的菱形表示α(1-3)连接的核心岩藻糖(fucose)；X或白色三角形表示木糖(xylose)；A或黑色方块表示N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；实线表示β连接；虚线表示α连接；水平线表示1-4连接；向上角对角线(/)表示1-3连接；向下角对角线(\)表示1-6连接；垂直线表示1-2连接；波浪线表示1-3或1-6连接；少量表示约1-5％；多量表示约40-60％)；
图48呈现一等电聚焦胶体(pH 3-10)的影像，显示未修饰的DNA酶I(第2行)，以及以乙二胺(ethylene diamine)修饰的DNA酶I，其使用60(第3行)或80(第1行)摩尔当量的CMC(pH标记在最左侧行)；以及
图49是一曲线图，显示未修饰的DNA酶I(Pulmozyme)以及根据本发明的一些实施例中通过以乙二胺(ethylene diamine)以及60摩尔当量(60eq)或80摩尔当量(80eq)的CMC修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，为肌动蛋白浓度的一函数。
具体实施方式
本发明在其一些实施例中涉及治疗方法，更具体地但非唯一地涉及非细胞修饰的DNA酶I蛋白、其制备方法及其治疗用途。
在说细实明本发明的至少一种详施例之前，应当理解的是，本发明不只限于应用到下面的说明中所阐述的及/或图示中及/或示例中所的显示的多个构件及/或多个方法的建构及配置的细节。本发明能够实施成为其它的实施例或以各种方式被实践。
本发明人已发现DNA酶I可以在转译后被修饰(合成地、非细胞地、转译后修饰)，以显示DNA酶I的本质酵素活性(例如水解、DNA水解)，以及在肌动蛋白存在下对酵素活性的失活的抗性。修饰的DNA酶I特别适用于在存在肌动蛋白的环境中降解DNA，例如在分泌物、流体和组织中的DNA。
在将本发明实践的同时，本发明人已经显示，以酰胺基(amide groups)将DNA酶I中的羧酸基(carboxylic acid groups)化学取代，产生对抗肌动蛋白失活的一惊人的高度抗性，同时基本上维持DNA酶I对去氧核糖核酸(DNA)的水解能力。本发明人进一步显示修饰的DNA酶I在降低痰液粘度和破坏痰液弹性结构方面的功效，其可用于治疗包括囊性纤维化(cystic fibrosis)在内的多种医学病症。
现在参考附图，图1、图34和图48显示出通过以二胺(diamines)进行酰胺化修饰的不同来源的DNA酶I(植物重组人类DNA酶I和哺乳动物重组人类DNA酶I)，形成具有一游离胺基的一酰胺基。图18至图25显示在各种反应条件下，二胺修饰的DNA酶I显示出不同程度的酰胺化。图2显示用二胺酰胺化修饰的DNA酶基本保持DNA酶I酶活性。图26、图37和图49显示通过以二胺酰胺化修饰的不同来源的DNA酶(哺乳动物重组人类DNA酶I和植物重组人类DNA酶I)表现对抗肌动蛋白失活的抗性。使用丁胺(单胺)得到类似的结果(数据未显示)。图39A至图46显示通过以二胺(diamines)酰胺化修饰的DNA酶I在水解痰液中的DNA和破坏痰液的弹性结构方面比未修饰的DNA酶I更显著有效。
图38A至图38B显示通过以二胺进行酰胺化学修饰的DNA酶I即使在没有肌动蛋白的情况下也增强了DNA酶的酵素效力以及DNA酶对DNA的亲和力。
图3显示用乙醇胺(ethanolamine)进行酰胺化修饰的DNA酶I。图4显示通过以乙醇胺进行酰胺化修饰的DNA酶本质上保持了DNA酶I酶活性。图5显示通过以乙醇胺进行酰胺化修饰的DNA酶表现出对抗肌动蛋白失活的抗性。图6和图7显示通过以乙醇胺进行酰胺化修饰的DNA酶I在破坏痰液的弹性结构上比未修饰的DNA酶I更有效，为DNA降解的一指标。
图8和图32显示通过以Tris或氯化铵(ammonium chloride)进行酰胺化修饰的不同来源的DNA酶I(哺乳动物重组人类DNA酶I和植物重组人类DNA酶I)。图9显示通过以Tris或氯化铵进行酰胺化修饰的DNA酶本质上维持DNA酶I酶活性。图10和图33显示通过以Tris或氯化铵进行酰胺化修饰的DNA酶I表现出对抗肌动蛋白失活的抗性。图11显示通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I的动力学类似于未修饰的DNA酶I的动力学。图12A、图12B、图14和图15显示通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I在水解痰液中的DNA时比未修饰的DNA酶I更显著有效。图13、图16A至图16D和图17显示通过以Tris进行酰胺化修饰的DNA酶I在破坏痰液的弹性结构方面比未修饰的DNA酶I更显著有效。图27至图31C显示，对抗肌动蛋白失活的抗性和破坏痰液弹性的能力与通过酰胺化修饰的DNA酶I中的位点数相关。
图18和图19显示CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)是比DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide)和DTC(二叔丁基碳二亚胺，di-t-butylcarbodiimide)更有效的酰胺化偶联剂(coupling agent)，。
图35和图36显示一示例性的DNA酶I修饰过程，导致蛋白质分子量的增加，由此确认胺对蛋白质的酰胺化。
图47显示修饰的植物重组人DNA酶I的聚糖(glycan)结构。
这些结果表明，通过使DNA酶I蛋白与一种含胺化合物反应，使DNA酶I蛋白的一或多个羧酸的酰胺化，导致修饰的DNA酶I蛋白的酵素活性表现出对抗肌动蛋白失活的抗性，当在修饰的DNA酶I蛋白中形成酰胺基，酰胺基表现出各式各样的官能基，而得到这样的结果。通过形成表现出带正电荷(例如通过用二胺(diamine)进行酰胺化获得的酰胺基)或非带电荷(例如通过用单胺(monoamine)进行酰胺化获得的酰胺基)、疏水性(例如通过用丁胺(butylamine)进行酰胺化获得的酰胺基)或亲水性(例如通过用乙醇胺(ethanolamine)、三羟甲基胺(Tris)或二胺进行酰胺化得到的酰胺基)、具有相当大的烷基(例如通过与六亚甲基二胺或Tris进行酰胺化获得的酰胺基)、具有小的烷基(例如通过用乙醇胺或乙二胺(ethanolamine or ethylene diamine)进行酰胺化获得的酰胺基)或不存在烷基(例如通过用氨(ammonia)进行酰胺化获得的酰胺基)的官能基的酰胺基，而可以得到这样的结果。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供一修饰的DNA酶I蛋白，其包含与一DNA酶I蛋白(根据本文所述的各实施方案中的任一者)的一氨基酸序列本质上同源的一氨基酸序列，其中(所述修饰的DNA酶I的氨基酸序列)的至少一氨基酸残基是如本文所定义的一非细胞修饰的氨基酸残基。
本文中，短语“非细胞修饰的氨基酸残基”是指不包括转译作用内或并入作为转译作用的一部分的氨基酸残基(例如其不是20个标准氨基酸残基之一)，并且不形成于没有人为介入的DNA酶(人造活性)。术语“非细胞修饰的”在本文中也可互换地称为“化学修饰的”或“合成修饰的”或“非细胞合成修饰的”，并且描述了合成地将化学修饰(本文也称为“合成修饰”或“非细胞修饰”)引入DNA酶。
这个短语也可以互换地称为“非细胞转译后修饰的氨基酸残基(non-cellularpost-translationally modified amino acid residue)”或简称为“转译后修饰的氨基酸残基(post-translationally modified amino acid residue)”，并且不认为与自然发生在细胞中的转译后修饰相似或相同。因此通过细胞转译后修饰形成的氨基酸残基，例如糖基化(包括但不限于糖基化的天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸和/或C-末端氨基酸残基)，磷酸化(包括但不限于磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和/或酪氨酸残基)，二硫键形成(包括但不限于通过二硫键一半胱氨酸残基连接到另一半胱氨酸残基)或天冬酰胺残基去酰胺(deamidation)形成异天冬氨酸，例如SEQ ID NO：1的位置74或一与SEQ ID NO：1同源的序列的相应残基)被排除在短语“非细胞修饰的氨基酸残基(non-cellularlymodified amino acid residue)”的范围之外。
为了清楚和简单起见，被用于作为修饰的一基质以产生本文所述的修饰的DNA酶I蛋白的所述DNA酶I蛋白(例如修饰的基础，修饰的起始点)在本文中被称为“未修饰的DNA酶I”。应当理解“未修饰的DNA酶I”不能排除以某种方式被修饰，并且术语“未修饰”仅仅是指缺少非细胞修饰的氨基酸残基(如本文所述和本文实施例中所述)存在于所述修饰的DNA酶I蛋白中。
类似地，为了简洁起见，包含至少一非细胞修饰的氨基酸残基的所述修饰的DNA酶I蛋白在本文中仅描述为“修饰的DNA酶I”等。应当理解，根据本发明的实施例的修饰的DNA酶I至少修饰为包含如本文所定义的至少一非细胞修饰的氨基酸残基。任选地，所述修饰的DNA酶I包括额外的修饰(除了包括如本文所定义的至少一非细胞修饰的氨基酸残基)，例如细胞转译后修饰(例如如本文所述)和/或额外合成修饰。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于(或表现出)至少一特性选自于由以下所组成的一群组：：
(1)在一修饰的DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％；
(2)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少20％；
(3)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(4)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(5)在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少两倍。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于具有至少2个上述5个特性(标记为(1)至(5))。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于具有至少3个上述5个特性。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于具有至少4个上述5个特性。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于具有上述5个特性的各者。
本文中短语“在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50”是指抑制一DNA水解活性的人非肌肉肌动蛋白的浓度(例如在本文中描述的修饰或未修饰的DNA酶I)使得所述活性精确降低了50％。
本文中，术语“AIR DNA酶”和“肌动蛋白抑制抗性DNA酶”(可互换使用)是指以本文所述的一方式修饰的任何DNA酶，使得修饰的DNA酶比相应的未修饰的DNA酶更不易感受在肌动蛋白存在下对DNA水解活性的抑制。
在本文所述的修饰的和未修饰的DNA酶I的任何比较中，用于比较未修饰的DNA酶I优选地不同于修饰的DNA酶I之处，仅在于不存在所述修饰的DNA酶I的非细胞修饰的氨基酸残基。例如在多个实施例中，非细胞修饰的氨基酸残基位于一同源天然存在的DNA酶I蛋白的氨基酸残基所占据的位置(例如具有SEQ ID NO：1)；用于比较的未修饰的DNA酶I在所述位置上具有天然存在的蛋白质的氨基酸；而多个实施例中，非细胞修饰的氨基酸残基不具有一同源天然存在的DNA酶I蛋白的一相应氨基酸残基(例如具有SEQ ID NO：1)，例如所述非细胞修饰的氨基酸残基插入在天然存在的蛋白质中彼此相邻的两个氨基酸残基之间，非细胞修饰的氨基酸残基从用于比较的未修饰的DNA酶I中简单地删除。
根据本文所述的任何相应实施例，为了决定修饰或未修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，可以将DNA酶I在水溶液中与复合DNA(任选的鲑鱼精子DNA)和甲基绿(methyl green)温育(任选为在37℃下)一段时间(任选为4小时)，在约pH 7.5下(任选地为25毫摩尔浓度HEPES-NaOH、4毫摩尔浓度CaCl 2、4毫摩尔浓度MgCl2、0.1％牛血清白蛋白、0.05％聚山梨醇酯20(例如，TWEEN-20)，pH7.5)。在DNA酶I温育前后测定甲基绿(任选在620纳米波长处)的光吸收。在与DNA酶I一起温育时，以甲基绿的光吸收的降观察DNA酶I的DNA水解作用(例如如本文实施例部分所述)。
在本文所述任何一实施例中，在DNA酶I浓度为45纳克/毫升时测定DNA酶I活性(例如修饰的和/或未修饰的DNA酶I)。
根据本文所述的任何相应实施例，为了决定肌动蛋白存在下修饰或未修饰的DNA酶I的DNA酶I活性，以指定浓度的人类非肌肉肌动蛋白(任选地来自血小板)和ATP(任选地为0.1毫摩尔浓度)与在水溶液中的上述DNA酶I、DNA和甲基绿进一步温育。为了决定IC50，DNA酶I活性的测量在多种肌动蛋白浓度(任选地为2倍连续稀释度)下进行，并且根据一用于决定IC50的合适演算法，使用一非线性拟合来分析结果(例如本文实施例部分所述)。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于在1微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的DNA水解活性，在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％(例如在DNA酶I浓度为45纳克/毫升时测定)。在一些实施例中，存在1微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少70％。在一些实施例中，存在1微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少80％。在一些实施例中，存在1微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少90％。在一些实施例中，存在1微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少95％。在一些实施例中，存在1微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少97.5％。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少60％。存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少70％。存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少80％。存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少90％。存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少95％。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少30％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少40％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少50％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少60％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少70％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少80％。存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的活性是在人类非肌肉肌动蛋白不存在下的活性的至少90％。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于存在5微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的一DNA水解活性是在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下所述未修饰的DNA酶I蛋白的的一水解活性的至少200％(2倍)。在一些这样的实施例中，所述活性是所述未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少300％(3倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少500％(5倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少1000％(10倍)。在一些实施例中，所述活性为未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少2000％(20倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少5000％(50倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少1000％(100倍)。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于存在50微克/毫升的人类非肌肉肌动蛋白的一DNA水解活性是在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下所述未修饰的DNA酶I蛋白的的一水解活性的至少200％(2倍)。在一些这样的实施例中，所述活性是所述未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少300％(3倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少500％(5倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少1000％(10倍)。在一些实施例中，所述活性为未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少2000％(20倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少5000％(50倍)。在一些实施例中，所述活性是未修饰的DNA酶I蛋白的活性的至少1000％(100倍)。
不受任何特定理论约束，认为在至少约0.9微克/毫升的肌动蛋白浓度下，例如本文描述的约1、5或50微克/毫升(例如根据本文所述的任何实施例中涉及这种肌动蛋白浓度下的DNA酶活性)，约45纳克/毫升DNA酶I(如本文所例举)的水解活性与本文所述的一些实施例的临床应用特别相关，因为所述DNA酶I浓度(45纳克/毫升)对这种肌动蛋白浓度(例如0.9-100微克/毫升)的比例对应于2.9微克/毫升DNA酶I的浓度(据报道以推荐剂量在气雾化DNA酶I 15分钟后存在于呼吸道粘液中[Zahm等人所著，Eur Respir J 1995,8:381-386])对60-5,000微克/毫升的肌动蛋白浓度(据报道存在于呼吸道粘液中[Ulmer等人所著，PNAS 1996,93:8225-8229；Sanders等人所著,Thorax 2006,61:962-966])的临床相关比例。
在本文描述的任何实施列的一些实施列中，所述修饰的DNA酶I的特征在于在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少300％(3倍)。在一些实施例中，所述IC50为所述未修饰的DNA酶I蛋白的IC50的至少500％(5倍)。在一些实施例中，所述IC50为所述未修饰的DNA酶I蛋白的IC50的至少1000％(10倍)。在一些实施例中，所述IC50为所述未修饰的DNA酶I蛋白的IC50的至少2000％(20倍)。在一些实施例中，所述IC50为所述未修饰的DNA酶I蛋白的IC50的至少5000％(50倍)。在一些实施例中，所述IC50为所述未修饰的DNA酶I蛋白的IC50的至少10000％(100倍)。
在本文所述任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于在人非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的IC50为至少2微克/毫升(的肌动蛋白)。在一些实施例中，IC50为至少5微克/毫升。在一些实施例中，IC50为至少10微克/毫升。在一些实施例中，IC50为至少20微克/毫升。在一些实施例中，IC50为至少50微克/毫升。在一些实施例中，IC50为至少100微克/毫升。在一些实施例中，在45纳克/毫升的DNA酶I浓度下测定IC50。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于即使在不存在肌动蛋白的情况下也增强了酵素活性。在一些这样的实施例中，与未修饰的DNA酶I相比，增强的酵素活性(至少部分)的特征在于相对于DNA水解活性的一降低的米氏常数(Michaelis constant)。本领域技术人员将理解，降低的米氏常数(KM)与对基质(substrate)的增强的亲和力相关，并且在低浓度基质下增强活性。
酵素活性参数如米氏常数(Michaelis constant，KM)，比活性(specificactivity，kcat)，催化效率(catalytic efficiency，kcat/KM)和最大速度(maximumvelocity，Vmax)可以通过测量DNA酶的DNA水解速率决定(根据本文中描述的任何实施例)并且使用本领域已知的技术将获得的数据拟合到一方程式，诸如Michaelis-Menten方程式。本文描述的任何酵素活性参数的示例性条件包括在pH 7.5的25毫摩尔浓度HEPES(4-(2-羟乙基)-1-呱嗪乙磺酸，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、4毫摩尔浓度的CaCl2、4毫摩尔浓度的MgCl2、0.1％牛血清白蛋白和0.05％聚山梨醇酯20(polysorbate20，例如TWEEN-20))的水性缓冲液中温育，其中DNA是鲑鱼精子DNA。
优选地，测量多种DNA(例如鲑鱼精DNA)浓度的活性，所述多种浓度包括至少一浓度为所计算出的KM的至少约5倍的浓度(例如如果最初计算出的KM超过最高测试的DNA浓度的20％，以至少一种更高的DNA浓度进行额外的测量，然后重新计算KM)，并且至少一种浓度大约等于KM或更低(例如如果最初计算出的KM低于最低测试的DNA浓度的，以至少一种更低的DNA浓度进行额外的测量，然后重新计算KM)。任选地，使用浓度范围为2.5至14纳克/毫升的DNA酶I(任选2.5纳克/毫升)和/或浓度范围为约1.6倍至至少约5倍的所述被测试的DNA酶的KM值的鲑鱼精子DNA，测量DNA水解速率，如上所述(例如如本文所例举)。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于相对于DNA水解活性的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的90％(例如在相同的条件下)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的80％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的70％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的60％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的50％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的40％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的30％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的20％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数，其不超过一未修饰的DNA酶I的米氏常数的10％。在一些实施例中，所述米氏常数在DNA酶I浓度为2.5纳克/毫升被测定，并且DNA为鲑鱼精子DNA。
在本文描述的任何实施例的某些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于相对于不超过40微克/毫升DNA的DNA水解活性的米氏常数。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过30微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过20微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过15微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过10微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过5微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的米氏常数不超过2.5微克/毫升DNA。在一些实施例中，所述米氏常数在DNA酶I浓度为2.5纳克/毫升被测定，并且DNA为鲑鱼精子DNA。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于比活性为一未修饰的DNA酶I的比活性的至少70％(例如相同条件下)。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于比活性是未修饰的DNA酶I的比活性的至少80％。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于比活性是未修饰的DNA酶I的比活性的至少90％。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的特征在于比活性是未修饰的DNA酶I的比活性的至少100％。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的进一步特征在于与所述未修饰的DNA酶相比具有一降低的米氏常数。在一些实施例中，所述米氏常数在DNA酶I浓度为2.5纳克/毫升被测定，并且DNA为鲑鱼精子DNA。
在本文描述的任何实施例的某些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率(kcat/KM)大于未修饰的DNA酶I的催化效率(例如相同的条件下)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少150％(即大于50％)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少200％(即2倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少300％(即3倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少400％(即4倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少500％(即5倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少600％(即6倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少800％(即8倍)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的特征在于催化效率是未修饰的DNA酶I的催化效率的至少1000％(即10倍)。一些实施例中，所述催化效率在DNA酶I浓度为2.5纳克/毫升被测定(即通过所述比活性与所述米氏常数所决定)，并且DNA为鲑鱼精子DNA。
不受任何特定理论的束缚，认为根据本发明的一些实施例的修饰的DNA酶I以惊人的低的米氏常数和增加的催化效率的形式，兼备了增强的活性，与在低浓度的DNA(DNA酶I的基质)下增强的活性相关，并结合与未修饰的DNA酶I相似的比活性，这表明DNA酶活性在高DNA浓度下并没有显著降低。
在本文所述的任何实施例的某些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少2个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少3个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少4个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少5个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少7个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少10个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少15个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少20个非细胞修饰的氨基酸残基。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I包含至少30个非细胞修饰的氨基酸残基。
在本文描述的任何实施例的某些实施例中，修饰的DNA酶I是多个型式的混合物，其中不同的形式可任选地包括在蛋白质的不同位点的一非细胞修饰的氨基酸残基、不同数量的非细胞修饰的氨基酸残基，和/或不同类型的非细胞修饰的氨基酸残基和/或不同类型的组合的非细胞修饰的氨基酸残基(例如根据本文所述的各个实施例的任一者中的不同酰胺基(amide)类型)。多个类型的混合可任选地与未修饰的DNA酶I进一步混合，尽管这种未修饰的DNA酶I不被认为是修饰的DNA酶I的一部分。
在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I是多个修饰的DNA酶I类型的混合物，根据本文所述各实施例的任一者中非细胞修饰的氨基酸残的数目指的是非细胞修饰的氨基酸残基的平均数目的，如在修饰的DNA酶I的分子上平均数目。在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述DNA酶I蛋白的至少一羧酸基被酰胺基代替。在这种实施例中，与根据本文所述的实施例中任一者所述的羧酸基(例如在本文的相应部分中)相关联的羧酸基可任选地被与根据本文所述的实施例中任一者所述的酰胺基(例如在本文的相应部分中)相关联的酰胺基所取代。
通过酰胺基置换至少一羧酸基任选地代表所述修饰的DNA酶I中非细胞修饰的至少一部分。在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的非细胞修饰的氨基酸残基的各者是一氨基酸残基，其中至少一羧酸基被一酰胺基取代。
根据本发明的任何实施例的某些实施例中，所述修饰的DNA酶I蛋白使得所述修饰的DNA酶I少于10重量％为二聚体(dimeric)或多聚体形式(multimeric form)。
在本文中术语“多聚体(multimeric)”是指相互作用以共价和/或非共价结合的多个分子(例如DNA酶I蛋白)，并且包括有序结构和/或无序结构(如聚集体)。多个分子可以任选地为相同的或不同的。实例包括但不限于蛋白质二聚体(dimeric，2个蛋白质相互作用)，三聚体(trimeric，3个蛋白质相互作用)，四聚体(tetrameric，4个蛋白质相互作用)和更高分子量的多聚体，或者由分子间相互作用产生的任何其他结构。
酰胺基(amide group)：
如本文所用的术语“酰胺”是指一–C(＝O)-NR’R”基团，其中R'和R”各自独立地选自于一氢元素和一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基所组成的一群组。R'和R”通过其碳原子与酰胺的氮原子结合(除非R'或R”是氢)。当被取代时，与酰胺的氮原子结合的R'和/或R”的碳原子不被氧(oxo)代取代，使得R'和R”不是(例如)羰基(carbonyl)，C-羧基(carboxy)或酰胺(amide)，如这些基团在本文中定义。任选地R'和R”选自氢和烷基(alkyl)。
术语“烃(hydrocarbon)”描述了一种有机基团，包括多个碳原子所构成的一炭链，作为其基本骨架，并由氢原子取代。烃可以是饱和或不饱和的，由脂族(aliphatic)、脂环族(alicyclic)或芳族(aromatic)基团所组成，并且可以任选被一或多个取代基(除氢以外)取代。所述烃基团任选被一或多个杂原子插入，包括但不限于一或多个氧原子、氮原子和/或硫原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'和R”选自于烷基(alkyl，例如其中烃基是饱和的)，烯基(alkenyl，例如其中烃基是不饱和的)，炔基(alkynyl，例如其中烃基是不饱和的)、环烷基(cycloalkyl)、杂脂环基(heteroalicyclic，通过一环碳键合)、芳基(aryl)和杂芳基(heteroaryl，通过环碳键合)，如这些基团在本文中定义。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，烃是一取代或未取代的饱和烃，选自于取代的或未取代的烷基、环烷基和杂脂环基(如本文所定义)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，如上所定义的酰胺基中的C(＝O)衍生自未修饰的DNA酶I中存在的羧酸基(如本文所述根据各实施例中的任何一者)，而酰胺基中的NR'R“表示取代羧酸基的-OH的一取代基。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，与酰胺的氮原子结合的R'和/或R“的碳原子不与任何其它杂原子结合(即仅结合碳原子和/或氢原子)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R”是一氢原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'和R”各自为一氢原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'和R”中至少一者不是氢原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'和R”中至少一者是烃基，即酰胺基不是-C(＝O)NH2基团。在一些这样的实施例中，R'是一烃基，R”是一氢原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，取代氨基酸残基侧链上的羧酸基的一酰胺基不是-C(＝O)NH2基团，如谷氨酸(glutamic acid)或天冬氨酸(aspartic acid)残基，然而例如一C-末端羧酸可以任选地被C-末端的-C(＝O)NH2基团取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述酰胺基具有以下通式：
-C(＝O)-NH-R’
其中R'选自烷基、烯基和炔基，其各自为未被取代或被一或多个选自于羟基(hydroxy)和氨基(amino)的取代基所取代。
在本文中，术语“羟(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”是指-OH。
在本文中，术语“胺(amine)”和“氨基(amino)”分别指一-NR'R”基团或-N+R'R”R”’基团，其中R'和R”如本文中所定义，而R”’如本文中R'和R”所定义。任选地，R'、R”和R”’选自氢和包含1至4个碳原子的烷基。任选地，R'和R”是氢。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'是未取代的烷基、烯基或炔基。在一些实施例中，R'是未被取代的烷基，例如甲基、乙基、正丙基(n-propyl)、异丙基(isopropyl)、正丁基(n-butyl)、异丁基(isobutyl)和/或叔丁基(t-buty)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'(任选地仅仅)被一或多个为羟基(hydroxy)的取代基所取代。在一些实施例中，R'仅包含一羟基(例如其中R'是2-羟乙基，2-hydroxyethyl)。在一些实施例中，R'包含至少2个羟基。在一些实施例中，R'包含至少3个羟基。在一些实施例中，R'包含2至6个羟基。在一些实施例中，R'包含2至4个羟基。在一些实施例中，R'包含3个羟基。三(羟甲基)甲基(Tris(hydroxymethyl)methyl)是包含3个羟基的R'基团的一非限制性实例。在一些实施例中，R'是一被取代的烷基。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'(任选地仅仅)被一或多个为氨基(amino)的取代基所取代。在一些实施例中，R'包含1至4个氨基取代基。在一些实施例中，R'包含一氨基取代基。在一些实施例中，R'是一被取代的烷基。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'被或多个-NH2取代基取代。在一些实施例中，R'是一被取代的烷基，例如2-氨基乙基(2-aminoethyl)，3-氨基丙基(3-aminoethyl)、4-氨基丁基(4-aminoethyl)、5-氨基戊基(5-aminoethyl)和/或6-氨基己基(6-aminoethyl)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'是被一或多个取代基取代的烃基(hydrocarbon moiety)，所述取代基是烷基氨基(alkyamino)，例如具有通式-NHR'的伯烷基氨基(primary alkylamino)，其中R'是烷基(alkylamino)。在一些实施例中，烷基氨基中的烷基被氨基取代，使得烃基被一(氨基烷基)氨基((aminoalkyl)amino)取代基所取代。在一些实施例中，烃基是一被取代的烷基，例如被(氨基烷基)氨基(aminoalkyl)amino所取代的烷基(例如4-(3-氨基丙基)氨基-丁基或3-(4-氨基丁基)氨基-丙基，4-(3-aminopropyl)amino-butyl or3-(4-aminobutyl)amino-propyl，各自其中提供了一酰胺，所述酰胺为亚精胺(spermidine)的一衍生物)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，R'被一或多个氨基取代基所取代，根据本文中的各自实施例的任一者所描述的一降低的米氏常数、一提高的催化效率和/或比活性，所述修饰的DNA酶I展现了一降低的米氏常数、一提高的催化效率和/或比活性。在一些这样的实施例中，R'是2-氨基乙基。
不受任何特定理论的约束，认为氨基取代基的正电荷增强了对带负电荷的DNA的亲和力，从而降低米氏常数。
在本文中所述的任何实施例的一些实施例中，烃基(hydrocarbon moiety，例如R')包含1至100个碳原子。在一些实施例中，烃基包含1至50个碳原子。在一些实施例中，烃基包含1至20个碳原子。在一些实施例中，烃基包含1至10个碳原子。在一些实施例中，烃基包含1至6个碳原子。在一些实施例中，烃基包含1至4个碳原子。在一些实施例中，烃基包含2至4个碳原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，烃基(例如R')包含2至10个碳原子。在一些实施例中，烃基包含2至6个碳原子。在一些实施例中，烃基包含3至5个碳原子。在一些实施例中，烃基包含4个碳原子。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，烃基(例如R')包含超过100个碳原子。在一些这样的实施例中，烃基是聚合部分，例如聚亚烷基二醇基(polyalkylene glycolmoiety，任选地通过与酰胺基的氮原子结合的官能团修饰)。聚乙二醇(polyethyleneglycol)是聚亚烷基二醇基的一非限制性实例。
如本文所用，术语“烷基(alkyl)”是指包括直链和支链基团的饱和脂族烃(aliphatic hydrocarbon)。优选地，烷基具有1至20个碳原子。每当一个数值范围在本文中所述(例如1-20)，这意味着
所述基团(在这种情况下为烷基)可以含有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等且至多包括20个碳原子。更优选地，烷基是具有1至10个碳原子的中等大小的烷基。最优选地，除非另有说明，烷基是具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基可以是取代或未取代的。取代基可以是例如环烷基(cycloalkyl)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、杂脂环(heteroalicyclic)、卤素(halo)、羟基(hydroxy)、烷氧基(alkoxy)、芳氧基(aryloxy)、硫代羟基(thiohydroxy)、硫代烷氧基(thioalkoxy)、硫代芳氧基(thioaryloxy)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基(sulfonyl)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、叠氮化物(azide)、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(oxo)、羰基(carbonyl)、硫代羰基(thiocarbonyl)、尿素(urea)、硫脲(thiourea)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、C-酰胺基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、亚磺酰氨基(sulfonamido)和氨基(amino)，这些术语如本文中所定义。
“环烷基(cycloalkyl)”基团是指饱和的或不饱和的全碳单环或融合的环基(即共享一对相邻的碳原子的环)基，其中多个环中的一者或多者不具有完全共轭的π电子系统。环烷基的实例，但不限于环丙烷(cyclopropane)、环丁烷(cyclobutane)、环戊烷(cyclopentane)、环戊烯(cyclopentene)、环己烷(cyclohexane)、环己二烯(cyclohexadiene)、环庚烷(cycloheptane)、环庚三烯(cycloheptatriene)和金刚烷(adamantane)。环烷基可以是取代或未取代的。取代基例如可以是烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、杂脂环(heteroalicyclic)、卤素(halo)、羟基(hydroxy)、烷氧基(alkoxy)、芳氧基(aryloxy)、硫代羟基(thiohydroxy)、硫代烷氧基(thioalkoxy)、硫代芳氧基(thioaryloxy)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基(sulfonyl)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、叠氮化物(azide)、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、羰基(carbonyl)、硫代羰基(thiocarbonyl)、脲(urea)、硫脲(thiourea)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、C-酰氨基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、亚磺酰氨基(sulfonamido)和氨基(amino)，这些术语如本文中定义。当环烷基是不饱和的时，它可以包含至少一碳-碳双键和/或至少一碳-碳三键。
“芳基(aryl)”是指一全碳单环或融合的多环(即共享一对相邻的碳原子的环)基，具有完全共轭的π电子系统。芳基的实例，但不限于苯基，萘基(naphthalenyl)和蒽基(anthracenyl)。芳基可以是取代的或未取代的。取代基例如可以是烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、环烷基(cycloalkyl)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、杂脂环(heteroalicyclic)、卤素(halo)、羟基(hydroxy)、烷氧基(alkoxy)、芳氧基(aryloxy)、硫代羟基(thiohydroxy)、硫代烷氧基(thioalkoxy)、硫代芳氧基(thioaryloxy)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基(sulfonyl)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、叠氮化物(azide)、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、羰基(carbonyl)、硫代羰基(thiocarbonyl)、脲(urea)、硫脲(thiourea)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、C-酰氨基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、亚磺酰氨基(sulfonamido)和氨基(amino)，这些术语如本文中定义。
“杂芳基(heteroaryl)”基团是指一单环或融合的环(即共享一对相邻的碳原子的环)基，在环中具有一或多个原子，例如为氮、氧和硫，另外具有完全共轭的π电子系统。杂芳基的非限制实施例包括吡唑(pyrrole)、呋喃(furan)、噻吩(thiophene)、咪唑(imidazole)、恶唑(oxazole)、噻唑(thiazole)、吡唑(pyrazole)、吡啶(pyridine)、嘧啶(pyrimidine)、喹啉(quinoline)、异喹啉(isoquinoline)和嘌呤(purine)。杂芳基可以是取代或未取代的。取代基例如可以是烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、环烷基(cycloalkyl)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、杂脂环(heteroalicyclic)、卤素(halo)、羟基(hydroxy)、烷氧基(alkoxy)、芳氧基(aryloxy)、硫代羟基(thiohydroxy)、硫代烷氧基(thioalkoxy)、硫代芳氧基(thioaryloxy)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基(sulfonyl)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、叠氮化物(azide)、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、羰基(carbonyl)、硫代羰基(thiocarbonyl)、脲(urea)、硫脲(thiourea)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、C-酰氨基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、亚磺酰氨基(sulfonamido)和氨基(amino)，这些术语如本文中定义。
“杂脂族(heteroalicyclic)”基团是指一单环或融合的环基，在环中具有一或多个原子，例如为氮、氧和硫。所述环也可以具有一或多个双键。然而所述环不具有完全共轭的π电子系统。杂脂环可以被取代或未取代。取代基例如可以是烷基(alkyl)、烯基(alkenyl)、炔基(alkynyl)、环烷基(cycloalkyl)、芳基(aryl)、杂芳基(heteroaryl)、杂脂环(heteroalicyclic)、卤素(halo)、羟基(hydroxy)、烷氧基(alkoxy)、芳氧基(aryloxy)、硫代羟基(thiohydroxy)、硫代烷氧基(thioalkoxy)、硫代芳氧基(thioaryloxy)、亚磺酰基(sulfinyl)、磺酰基(sulfonyl)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、叠氮化物(azide)、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基(phosphinyl)、氧代(oxo)、羰基(carbonyl)、硫代羰基(thiocarbonyl)、脲(urea)、硫脲(thiourea)、O-氨基甲酰基(O-carbamyl)、N-氨基甲酰基(N-carbamyl)、O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)、N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)、C-酰氨基(C-amido)、N-酰氨基(N-amido)、C-羧基(C-carboxy)、O-羧基(O-carboxy)、亚磺酰氨基(sulfonamido)和氨基(amino)，这些术语如本文中定义。
“叠氮基(azide)”是指-N＝N+＝N-基团。
“烷氧基(alkoxy)”是指-O-烷基(-O-alkyl)和-O-环烷基(-O-cycloalkyl)，如本文所定义。
“芳氧基(aryloxy)”是指如本文所定义的-O-芳基(-O-aryl)和-O-杂芳基(-O-heteroaryl)。
“硫代羟基(thiohydroxy)”或“硫醇(thiol)”是指-SH基团。
“硫代烷氧基(thioalkoxy)”是指如本文所定义的-S-烷基(-S-alkyl group)和-S-环烷基(-S-cycloalkyl)，如本文所定义。
“硫代芳氧基(thioaryloxy)”是指-S-芳基(-S-aryl)和-S-杂芳基(-S-heteroaryl)，如本文所定义。
“羰基(carbonyl)”是指-C(＝O)-R’基团，其中R'如上所定义。
“硫代羰基(thiocarbonyl)”是指-C(＝S)-R’'基团，其中R'如本文所定义。
“羧基(carboxyl)”或“羧酸酯(carboxylate)”既指“C-羧基(C-carboxy)”和“O-羧基(O-carboxy)”。
“C-羧基(C-carboxy)”是指-C(＝O)-O-R'基团，其中R'如本文所定义。
“O-羧基(O-carboxy)”是指R'C(＝O)-O-基团，其中R'如本文所定义。
“羧酸基(carboxylic acid)”是指-C(＝O)OH基团，包括去质子化的离子形式及其盐。
“氧代(oxo)”基团是指＝O基团。
“硫代羧基(thiocarboxy)”或“硫代羧酸酯(thiocarboxylate)”基团是指-C(＝S)-O-R'和-O-C(＝S)R'基团。
“卤代(halo)”基团是指氟，氯，溴或碘。
“亚硫酰基(sulfinyl)”是指-S(＝O)-R'基团，其中R'如本文所定义。
“磺酰基(sulfonyl)”是指-S(＝O)2-R'基团，其中R'如本文所定义。
“磺酸根(sulfonate)”基团是指-S(＝O)2-O-R'基团，其中R'如本文所定义。
“硫酸根(sulfate)”基团是指-O-S(＝O)2-O-R'基团，其中R'如本文所定义。
“磺酰胺(sulfonamide)”或“亚磺酰氨基(sulfonamido)”组包括如本文所定义的S-亚磺酰氨基(S-sulfonamido)和N-亚磺酰氨基(N-sulfonamido)。
“S-亚磺酰氨基(S-sulfonamido)”是指-S(＝O)2-NR'R“基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“N-亚磺酰氨基(N-sulfonamido)”基团是指R'(＝O)2-NR“基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“O-氨基甲酰基(O-carbamyl)”是指-OC(＝O)-NR'R“基，其中R'和R”各自如本文所定义。
“N-氨基甲酰基(N-carbamyl)”是指R'OC(＝O)-NR“-基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“氨基甲酰基(carbamyl)”或“氨基甲酸酯(carbamate)”基团包括O-氨基甲酰基(O-carbamyl)和N-氨基甲酰基(N-carbamyl)。
“O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)”是指-OC(＝S)-NR'R“基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)”是指R'OC(＝S)NR“-，其中R'和R”各自如本文所定义。
“硫代氨基甲酰基(thiocarbamyl)”或“硫代氨基甲酸酯(thiocarbamate)”基团包括O-硫代氨基甲酰基(O-thiocarbamyl)和N-硫代氨基甲酰基(N-thiocarbamyl)。
“C-酰胺基(C-amido)”基团是指-C(＝O)-NR'R“基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“N-酰胺基(N-amido)”是指R'C(＝O)-NR“-基团，其中R'和R”各自如本文所定义。
“脲(urea)”是指-N(R')-C(＝O)-NR'R“'基团，其中R'，R”和R“各自如本文所定义。
“硝基(nitro)”是指-NO 2基团。
“氰基(cyano)”是指-C≡N基团。
术语“膦酰基(phosphonyl)”或“膦酸酯(phosphonate)”描述了如上定义的具有R'和R“的-P(＝O)(OR')(OR”)基团。
术语“磷酸酯(phosphate)”表示-O-P(＝O)(OR')(OR“)基团，其中R'和R”各自如上所定义。
术语“氧膦基(phosphinyl)”描述了-PR'R“基团，其中R'和R”各自如上所定义。
术语“硫脲(thiourea)”描述了-N(R')-C(＝S)-NR'R“'基团，其中R'，R”和R“各自如本文所定义。
羧酸基(Carboxylic acid group)：
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，被酰胺基取代的羧酸基选自于一氨基酸残基的一侧链内的一羧酸基和一C-末端羧酸基所组成的一群组。
氨基酸残基的侧链的实例包括但不限于谷氨酸残基(glutamic acid residue)、天冬氨酸残基(aspartic acid residue)、N-甲基谷氨酸残基(N-methyl-glutamic acidresidue)、N-甲基天冬氨酸残基(N-methylaspartic acid residue)、α-甲基谷氨酸残基(α-methylglutamic acid residue)、α-甲基天冬氨酸残基(α-methylaspartic acidresidue)、γ-羧基谷氨酸残基(γ-carboxyglutamic acid residue)、N-(羧甲基)甘氨酸残基(N-(carboxymethyl)glycine residue)、N-(2-羧乙基)甘氨酸残基(N-(2-carboxyethyl)glycine residue)和α-氨基己二酸残基(α-aminoadipic acid residue)，所述氨基酸残基的侧链包括一羧酸残基，所述羧酸残基根据本发明的一些实施例可任选地被酰胺基团所取代。在一些实施例中，所述侧链是谷氨酸和/或天冬氨酸侧链。
氨基酸残基可以任选地是L-氨基酸和/或D-氨基酸残基。在一些实施例中，氨基酸残基是L-氨基酸残基。
在一些实施例中，氨基酸残基是L-谷氨酸和/或L-天冬氨酸残基。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少两个羧酸基被如本文所述的酰胺基团代替。在一些实施例中，2至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基团取代。在一些实施例中，2至30个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，2至25个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，2至20个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，2至15个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，2至10个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，2至5个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I是多个修饰的DNA酶I类型的混合物，根据本文所述各实施例中任一者，酰胺基取代的羧酸基团的数目是指被取代的羧酸基的平均数目于所述修饰的DNA酶I分子的平均值(即其中至少一个羧酸基被酰胺基取代的DNA酶I分子)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少3个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基所取代。在一些实施例中，3至30个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至25个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至20个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至15个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至10个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，3至5个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少4个羧酸基被如本文所述的酰胺基代替。在一些实施例中，4至35个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至25个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至20个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至15个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至10个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，4至5个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少5个羧酸基被如本文所述的酰胺基代替。在一些实施例中，5至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，5至30个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，5至25个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，5至20个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，5至15个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，5至10个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少6个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，6至35个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，6至30个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，6至25个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，6至20个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，6至15个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，6至10个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少8个羧酸基被如本文所述的酰胺基所取代。在一些实施例中，8至35个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，8至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，8至25个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，8至20个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，8至15个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，8至10个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少10个羧酸基被如本文所述的酰胺基所取代。在一些实施例中，如本文所述，10至35个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，10至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，10至25个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，10-20个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，10至15个羧酸基被酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少12个羧酸基被如本文所述的酰胺基替代。在一些实施例中，12至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，12至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，12至25个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，12至20个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，12至15个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少15个羧酸基被如本文所述的酰胺基所取代。在一些实施例中，15至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，15至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，15至25个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，15至20个羧酸基被酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少20个羧酸基被如本文所述的酰胺基替代。在一些实施例中，如本文所述，20至35个羧酸基被酰胺基取代。在一些实施例中，20至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，如本文所述，20至25个羧酸基被酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少25个羧酸基被本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，25至35个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。在一些实施例中，25至30个羧酸基被如本文所述的酰胺基取代。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少30个羧酸基被如本文所述的酰胺基所取代。在一些实施例中，如本文所述，30至35个羧酸基被酰胺基取代。
谷氨酸残基侧链(glutamic acid residue side)和天冬氨酸残基侧链(asparicacid residue side)的非限制性代表性实例可以任选地被根据本文所述的各个实施例中任一项的酰胺基团替代，其包括但不限于在SEQ ID NO：1中的Glu13、Glu39、Glu69、Glu78、Glu122、Glu124、Glu127、Glu143、Glu156、Glu161、Glu256、Asp33、Asp42、Asp53、Asp58、Asp61、Asp87、Asp93、Asp98、Asp99、Asp107、Asp139、Asp145、Asp149、Asp153、Asp162、Asp168、Asp201、Asp212、Asp228、Asp243和Asp251以及与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基。例如SEQ ID NO：2含有谷氨酸和天冬氨酸残基，对应于上述谷氨酸残基或天冬氨酸残基的各者，各个残基的编号高于SEQ ID NO：1中相应的残基。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu13被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu39被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu69被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu78被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu102被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu112被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu124被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu127被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu143被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu156被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu161被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Glu256被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp33被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp42被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp58被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp61被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp87被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp93被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp98被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp99被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp107被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp139被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp145被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp149被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp153被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp162被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp168被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp198被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp201被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp212被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp228被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp243被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
文所述的任何实施例的一些实施例中，至少SEQ ID NO：1中的Asp251被根据本文所述的各实施例中的任何一者的酰胺基所取代(或与SEQ ID NO：1同源的氨基酸序列中的任何相应的谷氨酸或天冬氨酸残基)。
DNA酶I：
除了明确提及的修饰的DNA酶I之外，，除了根据本文实施例中的任一者本文所述的非细胞修饰的氨基酸残基之外，以下部分描述与本文所述的修饰的DNA酶I同源的DNA酶I。也就是说，本文所述的DNA酶I是指在没有任何非细胞修饰的氨基酸残基的情况下，根据本文所描述的各实施例中任一者所述的未修饰蛋白。
本领域技术人员将了解本发明根据本发明的实施例的修饰的DNA酶I蛋白的结构，通过思考根据本节中描述的实施例中任一者的未修饰的DNA酶I结合根据本文所述的各实施例中的任何一者的修饰。
如本文所用，术语“DNA酶I”和“DNA酶I蛋白”是指去氧核糖核酸酶I(EC3.1.21.1)多肽(deoxyribonuclease I polypeptide)。DNA酶I被分类为一内切核酸酶，切割DNA以产生5'-磷酸二磷酸核苷酸(5'-phosphodinucluotide)和5'-磷酸寡核苷酸末端(5'-phosphooligonucleotide end)产物，优选地以双链DNA为基质和碱性pH为最佳值。
DNA酶I作用于单链DNA、双链DNA和染色质。
根据本教示的一些实施例中(即未修饰)的DNA酶I被肌动蛋白抑制。
根据本教示的一些实施例中(即未修饰)的DNA酶I不被肌动蛋白抑制。
本文中，短语“被肌动蛋白抑制”是指在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下(例如DNA酶的)DNA水解活性降低至少20％(相对于在没有肌动蛋白的情况下的活性)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，涉及由肌动蛋白抑制的一未修饰的DNA酶I，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少30％。在一些实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少40％。在一些实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少50％。在一些实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少60％。在一些实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少70％。在一些实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少80％。在示例性实施例中，DNA酶I的DNA水解活性在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下降低至少30％(例如图37所示)。
本文中所考虑的是EC 3.1.21.1类的DNA酶I酶。
根据具体的实施例，DNA酶I是如SEQ ID NO：1所示的人类DNA酶I。
还考虑具有DNA酶I活性的人类DNA酶I的同源物(homologs，即功能等同物)和直向同源物(orthologs，例如小鼠NM_010061.5NO_034191.3)。
这样的同源物可以是例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％等同于或同源于SEQ ID NO：1(同一性identity+同源性homology)，使用威斯康星序列分析套件(Wisconsinsequence analysis package)的BestFit软件确定，利用史密斯和沃特曼演算法(Smithand Waterman algorithm)，其中间隙权重(gap weight)等于50、长度权重(lengthweight)等于3、平均匹配(average match)等于10，平均不匹配(average mismatch)等于-9。
本发明的实施例包括上文所述的核酸序列；其片段、可与其杂合的序列、与其同源的序列、与其直向同源(orthologous)的序列、编码相似多肽但具有不同密码子的序列、以改变序列为特征的突变，例如删除、插入或取代一或多个核苷酸，无论是天然存在或人类诱导的，无论是随机地还是以有目的的方式，这些都被统称为“本质同源物(substantialhomologs)”。
当“本质同源(substantial homologs)”用于描述DNA酶I蛋白的氨基酸序列，以修饰而提供所述修饰的DNA酶I时，短语“本质同源”在本文中也指一胺基酸序列，相对于本文详细描述的DNA酶I蛋白的另一个氨基酸序列具有至少80％同源性，任选地至少90％同源性、任选地至少95％同源性、任选地至少98％的同源性、任选地至少98％的同源性、以及任选地至少99％的同源性。
核酸内切酶的DNA酶I家族中的其他成员为在人类中DNA酶X、DNA酶λ、DNASIL2和泪脂蛋白(tear lipocalin)。DNA酶I还包括碱性DNA酶、牛胰蛋白(bp)DNA酶、DNA酶A、DNA磷酸酶(DNA phosphatase)和DNA内切核酸酶(DNA endonuclease)，例如在家牛(Bos taurus)中。
未修饰的DNA酶I可以是从其天然表达的细胞/组织中所提取的一纯化DNA酶I.
可替代地或额外的，DNA酶I是由重组产生。
对于重组表达，将编码DNA酶的核酸序列在顺式作用(cis-acting)调节元件(例如启动子)的转录调控下连接到一核酸表达载体中。
除了含有所述插入的编码序列的转录和转译所必需的元件外，本发明的一些实施例的表达构建体还可以包括多个序列，被工程改造以增强所述被表达肽的稳定性、产生、纯化、产量或毒性。各种原核或真核细胞可用作为一宿主表达系统，来表达本发明的一些实施例的DNA酶I。这些包括但不限于微生物(microorganisms)，例如用含有编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体(plasmid DNA or cosmid DNA.expression vector)进行转化(transformed)的细菌；用含有编码序列的重组酵母菌表达载体进行转化的酵母菌；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)进行转染的植物细胞系统，或用含有编码序列的重组质粒表达载体(recombinant plasmidvector)进行转化的植物细胞系统，例如含有编码序列的Ti质粒转化。哺乳动物表达系统也可用于表达本发明的一些实施例的多肽。
细菌构建体的实例包括pET系列大肠杆菌表达载体[Studier等人所著.(1990)酵素学中的方法期刊Methods in Enzymol.185:60-89]。
在酵母菌中，可以使用含有持续型(constitutive)或诱导型(inducible)的启动)的多种载体，如美国专利申请号5,932,447所揭露。或者可以使用促进外来DNA序列整合到酵母菌染色体中的载体。
在使用植物表达载体的情况下，编码序列的表达可以由许多启动子驱动。例如病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人所著。(1984)自然期刊Nature310：511-514]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人所著。(1987)EMBO J.6：307-311]。可替代地，植物启动子，例如加氧酶(RUBISCO)的小型子单元(small subunit)[Coruzzi等人所著。(1984)EMBO J.3：1671-1680和Brogli等人所著(1984)科学期刊Science 224：838-843]或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人所著。(1986)分子细胞生物学期刊Mol.Cell.Biol.6：559-565]。这些构建体可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和本领域技术人员熟知的其它技术引入植物细胞。参见例如Weissbach&Weissbach等人所著，1988，植物分子生物学的方法期刊Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463。
根据具体的实施例，如在国际专利申请公开号WO2013/114374中描述，DNA酶I在植物细胞悬浮培养液中产生，也称为PRX-110，其全部内容通过引用并入本文。
因此至少一部分的人类DNA酶I蛋白具有一N-末端甘氨酸(glysin residue)残基(SEQ ID NO：2)。在一些实施例中，人类DNA酶I蛋白质包含如SEQ ID NO：2所示的DNA酶I和SEQ ID NO：1所示的DNA酶I的混合物。
这样的蛋白质由核酸构建体表达，所述核酸构建体包含编码人类DNA酶I蛋白的一核酸序列，所述人类DNA酶I蛋白在其N末端转译地融合到由一拟南芥ABPI内质网靶向信号肽(Arabidopsis ABPI endoplasmic reticulum targeting signal peptide)，由SEQ IDNO：3所示的一核酸序列所编码。
如本文所用的术语“拟南芥ABPI内质网靶向信号肽(Arabidopsis ABPIendoplasmic reticulum targeting signal peptide)”是指拟南芥生长素结合蛋白(theArabidopsis thaliana auxin binding protein)的前导肽序列，其能够将表达的蛋白质引导到植物细胞中的内质网。在一实施例中，拟南芥ABPI内质网靶向信号肽是如SEQ IDNO：8所示的33个氨基酸多肽。
因此根据一些实施例，人类DNA酶I蛋白在N末端邻接地连接到拟南芥ABPI内质网靶向信号，以及人类DNA酶I蛋白具有如SEQ ID NO：9所示的一氨基酸序列。
人类DNA酶I蛋白可以任选地由如SEQ ID NO：6所示的一核酸序列所编码。拟南芥ABPI内质网靶向信号肽可以任选地由如SEQ ID NO：3所示的一核酸序列所编码。在N末端邻接地连接到拟南芥ABPI内质网靶向信号的一人类DNA酶I蛋白可以任选地由如SEQ ID NO：7所示的一核酸序列所编码。
本文还提供编码一天然人类DNA酶I蛋白(SEQ ID NO：5；GenBank：NM_005223，序列(a))的一天然核酸序列(SEQ ID NO：4)，其包括一天然信号前导肽。
下文进一步描述的其它表达系统是本领域所公知的，如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可以在本发明的一些实施例中使用。
根据本文所描述的任何实施例的一些实施例所涉及的人类DNA酶I，所述DNA酶I是成熟的人类DNA酶I。在一些实施例中，所述DNA酶I是多糖酶α酶I(例如)。
根据本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述人类DNA酶I包含SEQ ID NO：1所示的一氨基酸序列。
应当理解的是，DNA酶I蛋白具有与SEQ ID NO：1的人类DNA酶I氨基酸序列同源(例如如本文所述至少80％同源)的一氨基酸序列，所述DNA酶I蛋白可以任选地保持人类DNA酶I的特征结构和/或功能。与人类DNA酶I蛋白的氨基酸序列同源的一氨基酸序列的一非限制性实例是SEQ ID NO：2，其与SEQ ID NO：1非常相似。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述DNA酶I蛋白是一人类DNA酶I蛋白变体，任选地是一天然存在的(至少在一些人类中)人类DNA酶I变体。人类DNA酶I蛋白变体具有改变的催化特性和/或其它生物化学和结构特性，例如改变肌动蛋白亲和力、辅因子需求(cofactor requirement)、pH最佳值、在储存中增加的保质期等，增强的重组表达或融合蛋白已被公开。适合的修饰的DNA酶I多肽包括但不限于在美国专利号6,348,343、6,391,607、7,407,785和7,297,526以及国际专利申请公开号WO 96/26279、WO 2008/039989和WO2013/114374中所公开的DNA酶多肽，其全文各自通过引用并入本文中，特别是关于DNA酶多肽及其制备方法。
在一些实施例中，DNA酶I在可以在烟草(例如烟草属细胞)中表达，任选地为悬浮的，例如在Bright Yellow-2(BY2)细胞培养基中表达的DNA酶I(例如下文中所举例，和/或如国际专利申请公开号WO 2013/114374中所述)。
在一些实施例中，农杆菌(Agrobacterium)介导的转化用于将外来基因引入一植物细胞基因组。所述技术基于农杆菌转化植物细胞的天然能力，通过将质粒DNA片段(转移的DNA(T-DNA))转移到宿主细胞基因组中。使用这种方法，由外来基因及其调控元件组成的T-DNA分子被随机引入植物基因组。并入的位点以及插入基因复制数目(copy number)不受控制，因此所述转化过程导致一转基因细胞“库(pool)”，所述转基因细胞“库”由具有不同程度的转基因表达的细胞所组成。所述转基因“库”随后用于克隆分离。所述克隆分离导致建立许多单细胞系，然后选择具有最高外源基因表达程度的克隆。在一些实施例中，农杆菌介导的转化用于将外源基因引入烟草细胞的基因组中，例如但不限于烟草(Nicotianatabacum L.cv)Bright Yellow(BY-2)细胞。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)多肽的分子量与在哺乳动物细胞中表达的重组人DNA酶I(DNA酶I)的分子量相似，通过PAGE和/或质谱法测量。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)多肽通过SDS-PAGE测量具有约30kDa的分子量，通过质谱法测量具有约32kDa。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，未修饰的DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)被糖基化。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，修饰的DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)被糖基化。
在本文中描述的任何实施例的一些实施例中，糖基化DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)蛋白的等电点位于比在哺乳动物细胞(Pulmozyme)中表达的重组人类DNA酶I更高的pH值。
当多个等电点的范围发生时(例如在等电聚焦时观察到一宽带)，DNA酶I的“等电点”在本文中指一平均等电点。
不受任何特定理论的约束，认为与在哺乳动物细胞中表达的DNA酶I(如本文中用植物重组DNA酶I所示例)相比具有较高等电点(表明较少的负电荷)结合负电荷的减少可以增强DNA酶对带负电荷的DNA的亲和力，从而降低米氏常数，所述负电荷的减少与带负电的羧酸基的改性和/或引入带正电的胺基(根据本文与非细胞修饰相关的所述实施例中的任一项)相关。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述糖基化DNA酶I(例如植物重组人类DNA酶I)蛋白的电泳迁移率的异质性大于在哺乳动物细胞(Pulmozyme)中表达的重组人类DNA酶I的异质性。例如糖基化DNA酶I的电泳带可以比在哺乳动物细胞中表达的重组人DNA酶I的电泳带宽。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述DNA酶I(例如植物重组人DNA酶I)是糖基化蛋白质，其包含分子量为约29kDa的多肽基团。
在本文描述的任何实施例的某些实施例中，所述修饰和/或未修饰的DNA酶I是纯化的蛋白质，其任选地特征在于纯度为(例如本文所述的组合物中的DNA酶I)至少85％、至少87％、至少90％、至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.1％、至少93.2％、至少93.3％、至少93.4％、至少93.5％、至少93.6％、至少93.7％、至少93.8％、至少93.9％、至少94％、至少94.5％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、在至少95.0-99.8％或100％纯度的范围内。在一些实施例中，通过HPLC测量所述修饰和/或未修饰的DNA酶I蛋白的纯度。
上述纯度是指杂质含量低(或不存在)。故意添加到包含修饰和/或未修饰的DNA酶I的组合物的成分(例如本文所述组合物的任何成分)在本文中不被认为是影响DNA酶I蛋白纯度的杂质。
在一些实施例中，所述DNA酶I是一重组DNA酶I任选地是一植物重组人类DNA酶I，并且上文所述的纯度是指衍生自所述培养基的杂质含量低(或不存在)，DNA酶I蛋白分泌至所述培养基和/或从宿主细胞分泌(例如植物宿主细胞)，例如但不限于核酸和多核苷酸、氨基酸、寡肽和多肽、聚糖和其它碳水化合物、脂质等。在一些实施例中，所述宿主细胞衍生的杂质包括生物活性分子，例如酵素。
在本文所述的实施例中的任何一个实施例中，DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有至少为0.2个、任选至少为0.5个、任选至少为1个、任选至少为2个、任选至少为3个、或任选至少为4个或更多个暴露的甘露糖(mannose)残基的一平均值。
在本文中，“暴露”的残基是指仅通过一共价键连接到一聚糖(glycan)的一非还原性末端的单糖残基。
在本文所述的实施例中的任何一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有平均至少一个，以及任选的至少两个核心木糖(xylose)残基。
在本文所述的实施例中的任何一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有至少为0.2、任选地至少0.5、任选地至少1，并且任选地约2个核心α-(1,3)岩藻糖(fucose)残基的一平均值。
在本文所述的实施例中的任何一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有至少1个核糖木糖残基和至少1个α-(1,3)岩藻糖残基的一平均值。
在本文所述的实施例中的任何一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有至少1个暴露的甘露糖残基、至少1个核糖木糖残基和至少一个α-(1,3)岩藻糖残基的一平均值。
在本文所述的实施例中的任何一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)被糖基化，使得多个DNA酶多肽分子的每个多肽分子具有至少1个、任选地至少2个、任选地至少3个、并且任选地至少4个末端N-乙酰葡糖胺取代基的一平均值，于甘露糖(mannose)残基的外部(远离多肽)。
在本文所述的实施例中的任一实施例中，所述DNA酶I蛋白(例如植物重组DNA酶I)没有唾液酸(sialic acid)残基。
本文中“没有唾液酸残基”是指少于1％的聚糖含有唾液酸残基，任选地小于0.1％，任选地小于0.01％。
关于糖基化的一些或所有上述特征可以在植物重组DNA酶I(根据本文所述的各实施例中任一者)中获得，其可任选地显示高度甘露糖糖基化(例如多个暴露的甘露糖糖残基和/或每个聚糖多于3个甘露糖残基)和植物特异性聚糖残基(plant specific glycanresidues)。
制备：
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了根据本文所述的各实施例中任一者制备所述修饰的DNA酶I蛋白的方法。所述方法包括在偶联剂(coupling agent)存在下，使根据本文所述各实施例中任一者的所述DNA酶I蛋白与含胺化合物(amine-containingcompound)反应。
用于使羧酸和胺反应以形成酰胺的合适的偶联剂是本领域已知的，例如由F.Abicicio、SAKates所著的，固相合成：实用指南Solid-Phase Synthesis：A0PracticalGuide，S.A.Kates,F.Albericio Eds；Marcel Dekker所著的,New York,NY,2000,pp.273-328and F.Albericio等人所著的,Org.Prep.Proc.Int.,33,202(2001)]。偶联剂的实例包括但不限于
碳二亚胺(carbodiimides)和苯并三唑(benzotriazole)衍生物，例如羟基苯并三唑(hydroxybenzotriazole)衍生物的鏻和铵/铀盐，例如2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(2-(7-aza-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HATU)，苯并三唑-1-基-N-氧-三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐(benzotriazol-1-yl-N-oxy-tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorophosphate，PyBOP)，7-氮杂苯并三唑-1-基-N-氧-三(吡咯烷子基)鏻六氟磷酸盐(7-azabenzotriazol-1-yl-N-oxy-tris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorophosphate，PyAOP)。
在一些实施例中，所述偶联剂是碳二亚胺(carbodiimide)。
不受任何具体理论的约束，认为碳二亚胺首先与DNA酶I蛋白的羧酸基反应形成具有被活化羧酸基的一中间体，并且含胺化合物与所述中间体反应，从而形成修饰的DNA酶I，具有取代羧酸基的酰胺基。
本文中，所述术语“碳二亚胺(carbodiimide)”是指具有式R'N＝C＝NR”的化合物，其中R'和R”如本文所定义。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述碳化二亚胺选自于EDC(1-乙基-3-((3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-((3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)和DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide)所组成的一群组。在一些实施例中，所述碳二亚胺为EDC和/或CMC。在一些实施例中，所述碳二亚胺为EDC。在一些实施例中，所述碳二亚胺是CMC。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述碳二亚胺是水溶性的。EDC是一示例性的水溶性的碳二亚胺。
本文中，短语“含胺化合物(amine-containing compound)”是指包含一或多个胺基的任何化合物(如本文所定义)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，含胺化合物包括伯胺(primaryamine)或仲胺(secondary amine)基，使得所述化合物具有通式HNR'R”，其中R'和R”如本文所定义。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，含胺化合物具有通式H2NR'，其中R'选自烷基、烯基和炔基，各自为未取代的或取代的，具有一或多个选自羟基和氨基的取代基，根据本文所述的任何相应的实施例。
含胺化合物的实例包括非取代的单胺，如丁胺，和其它未取代的烷基胺；取代的单胺，如乙醇胺(ethanolamine)和Tris(即三(羟甲基)氨基甲烷，tris(hydroxymethyl)aminomethane)；二胺(diamines)如乙二胺(ethylene diamine)、六亚甲基二胺(hexamethylene diamine)和其它亚烷基二胺(alkylene diamines；和氨(或其盐，如氯化铵)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，含胺化合物不是氨(或其盐)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I、偶联剂(任选地为碳二亚胺)和含胺化合物在水性液体(aqueous liquid)中进行反应。在一些实施例中，水性液体的pH在6以下的范围内。在一些实施例中，pH在3.5至6的范围内。在一些实施例中，pH在3.5至5.5的范围内。在一些实施例中，pH在4.5至5.5的范围内。在某些实施例中，pH值为5。
在本文中描述的任何实施例的一些实施例中，所述水性液体(aqueous liquid)是一缓冲溶液，例如适于提供根据各实施例中任一项的pH的缓冲溶液。合适的缓冲剂包括磷酸盐、Tris和MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸、2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)溶液，任选浓度约为0.1M。在一些实施例中，水性液体是包含MES的溶液。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I、偶联剂(任选地为碳二亚胺)和含胺化合物进行反应至少1个小时，在一些实施例中，至少2小时，在一些实施例中，至少3个小时，在一些实施例中，反应进行约2.5小时。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，通过除去含胺化合物，从而分离含胺化合物和DNA酶I，来终止反应。在一些实施例中，终止反应还包括除去所述偶联剂(例如碳二亚胺，carbodiimide)。可以通过替换进行所述反应所在的一介质来除去含胺化合物和/或偶联剂。透析(Dialysis)是用于除去含胺化合物和/或偶联剂的一合适技术的示例(例如如本文示例中所述)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I的反应浓度为0.1至10毫克/毫升。在一些实施例中，所述浓度在0.3至3毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述浓度在0.5至2毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述浓度在0.75至1.5毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，浓度约为1毫克/毫升。
进行反应的温度，优选地选择用以避免DNA酶I沉淀。在一些实施例中，温度低于50℃，任选地小于40℃。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，使用至少10摩尔当量的碳二亚胺，进行DNA酶I和碳二亚胺的反应，即每个DNA酶I分子至少10分子的碳二亚胺。在一些实施例中，使用10至200摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用100至200摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用10至100摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用10至40摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用30至70摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用50至80摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用约60或约70摩尔当量的碳二亚胺。在一些这样的实施例中，根据本文所述的各个实施例中的任何一者，反应的DNA酶I的浓度在0.1至10毫克/毫升的范围内。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，使用至少15摩尔当量的碳二亚胺，进行DNA酶I和碳二亚胺的反应。在一些实施例中，使用15至100摩尔当量的碳二亚胺。在一些实施例中，使用15至40摩尔当量的碳二亚胺。在一些这样的实施例中，根据本文所述的各实施例中的任何一者，反应的DNA酶I的浓度在0.1至10毫克/毫升的范围内。
不受任何特定理论所限制，认为本文所述的碳二亚胺与DNA酶I的摩尔比是合适提供所需的酰胺化，如果碳二亚胺的量低，同时减少DNA酶的二聚化程度(其与碳二亚胺相对高的量相关)，可能会阻碍所述酰胺化。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，DNA酶I、含胺化合物和偶联剂(例如碳二亚胺)反应在钙离子浓度为0至100毫摩尔浓度的范围下进行。在一些实施例中，钙离子浓度为0至50毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为0至25毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为0至10毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为0至5毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为0至2毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为0至1毫摩尔浓度。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，在存在至少1毫摩尔浓度的钙离子浓度的下进行DNA酶I、含胺化合物和偶联剂(例如碳二亚胺)的反应。在一些实施例中，钙离子浓度为1至100毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为1至50毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为1至25毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为1至10毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为1至5毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为1至2毫摩尔浓度。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，在存在至少5毫摩尔浓度的钙离子浓度下进行DNA酶I、含胺化合物和偶联剂(例如碳二亚胺)的反应。在一些实施例中，钙离子浓度为5至100毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为5至50毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为5至25毫摩尔浓度。在一些实施例中，钙离子浓度为5至10毫摩尔浓度。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，在存在至少50毫摩尔浓度的钙离子浓度下进行DNA酶I、含胺化合物和偶联剂(例如碳二亚胺)的反应。在一些实施例中，钙离子浓度为50至100毫摩尔浓度。
不受任何特定理论的约束，认为相对较低的钙浓度可用于获得更高的反应转化率，而相对较高的钙浓度可用于减少DNA酶I的二聚化。
药物组合物(Pharmaceutical composition)：
根据本文所述的各实施例中任一项的修饰的DNA酶I蛋白质可用于制备伊药物组合物。
药物组合物可用于通过任何给药途径治疗或预防任何病症或疾病。
根据本发明的另一方面，提供一种药物组合物，包含一修饰的DNA酶I蛋白作为其活性成分(根据本文所述的各实施例中任一项)和药学上可接受的载体。
如本文所使用的“药物组合物”是指本文所述化合物的制备物，与其它化学组分例如药学上可接受的及适合的载体和赋形剂(carriers and excipients)。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。
本文中，术语“活性成分”是指所述修饰的DNA酶I蛋白质(根据本文所述的各实施例中的任一项)对于应于所述生物学效应。
本文中，术语“药学上可接受的载体”是指一载体或稀释剂对生物体不会引起显著刺激，且不会消除所施用化合物的生物学活性和特性。此术语包括一佐剂(adjuvant)。
此处的“赋形剂(excipient)”是指加入到药物组合物中以进一步促进施用一化合物的惰性物质。赋形剂的非限制性实施例包括碳酸钙(calcium carbonate)，磷酸钙(calcium phosphate)，各种糖和各种类型的淀粉(starch)，纤维素衍生物(cellulosederivatives)，明胶(gelatin)，植物油和聚乙二醇(polyethylene glycols)。
在本文中描述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为至少0.2毫克/毫升。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为至少0.5毫克/毫升。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为至少1毫克/毫升。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为至少2毫克/毫升。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为至少5毫克/毫升。
在本文中描述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度在0.2至20毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度在0.5至20毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度在1至20毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度在2至10毫克/毫升的范围内。在一些实施例中，所述组合物中修饰的DNA酶I的浓度为约5毫克/毫升。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述药物组合物还包含钙盐，其量有效地增加所述修饰的DNA酶I对抗热应激的稳定性(例如暴露于高于40℃2小时)。在一些实施例中，钙盐包括氯化钙(并且任选地本质上由氯化钙(CaCl2)组成)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度为至少2毫摩尔浓度。在一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度至少为5毫摩尔浓度。在一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度为至少约10毫摩尔浓度，任选地约10毫摩尔浓度。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度在2毫摩尔浓度至20毫摩尔浓度的范围内。在一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度在5毫摩尔浓度至15毫摩尔浓度的范围内。在一些实施例中，所述组合物中钙离子的浓度为约10毫摩尔浓度。在一些实施例中，所述氯化钙离子是以氯化钙的形式(例如约10毫摩尔浓度的氯化钙)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述药物组合物还包含一聚山梨醇酯(polysorbate)，其量有效地增加所述修饰的DNA酶I对抗剪切应力的稳定性。在一些实施例中，聚山梨醇酯包含聚山梨醇酯80(并且任选地基本上由聚山梨醇酯80(polysorbate 80)组成)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中的聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)的浓度为至少0.001重量％。在一些实施例中，所述组合物中的聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)为至少0.003重量％。在一些实施例中，所述组合物中的聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)为至少约0.01重量％，任选地约0.01重量％。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述组合物中的聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)的浓度在0.001至0.1重量％的范围内。在一些实施例中，所述组合物中聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯80)的浓度在0.003至0.03重量％的范围内。在一些实施例中，所述组合物中聚山梨醇酯的浓度为约0.01重量％。在一些实施例中，所述组合物中聚山梨醇酯80的浓度为约0.01重量％。
所述药学上可接受的载体(例如一水性载体)可任选地包含一溶质(任选NaCl)，其浓度导致一等渗溶液。
一示例性制剂包含约10毫摩尔浓度的CaCl2、约0.01重量％的聚山梨醇酯80、约140毫克/毫升的NaCl和约5毫克/毫升的修饰的DNA酶I蛋白。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述药物组合物还包含额外的活性成分，例如降低肌肉蛋白抑制DNA酶I活性的一药剂，例如一或多种无机盐，选自于钾，镁，钙，锌，锂，锰，镉，镍，钴，铵，多胺(polyamine)和大环多铵盐(macrocyclic polyammonium)所组成的一群组，和/或聚天冬氨酸(Polyaspartic acid)和/或肌动蛋白切断蛋白凝溶胶(gelsolin)[例如Bucki等人所著，J Cystic Fibrosis 2015,14:587-593]。
美国专利号7,432,308中详细描述了适合与修饰的DNA酶I结合的多种药剂，用于治疗上的应用，如肺部病症(例如囊性纤维化，cystic fibrosis)，其全部内容通过引用并入本文(特别是关于涉及适合与DNA酶I结合的多种药剂的教示，以及适用于DNA酶I的治疗应用的多种药剂的教示)。
在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I与额外的活性成分的组合导致降低痰液粘度的改进，并且任选地为协同(synergistic)改进，(例如由剪切损耗模量(shear lossmodulus)和/或剪切储能模量(shear storage modulus)的降低所表示)。
在一些实施例中，额外的活性成分是一镁盐，例如氯化镁或硫酸镁。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述药物组合物进一步包含一额外的药剂或者与一额外的药剂一起施用，额外的药剂包括但不限于一种或多种药剂，用于治疗本文列出的任何一或多种病症，例如抗生素，如包括抗假单胞菌(anti-pseudomonal)和/或抗葡萄球菌治疗(anti-staphylococcal therapy)(例如妥布霉素tobramycin、氟氯西林flucloxacillin)、支气管扩张剂(bronchodilators)、抗炎剂(anti-inflammatoryagents)、粘液溶解剂(mucolytics，例如N-乙酰半胱氨酸，n-acetyl-cysteine)、肌动蛋白结合蛋白或肌动蛋白切断蛋白(例如凝溶胶，gelsolin)、蛋白酶抑制剂或基因治疗产品，如包含囊性纤维化跨膜传导调节因子基因(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator gene，CFTR)[Riordan等人所住，科学期刊Science 245：1066-1073(1989)]。多种额外的药剂可以在本发明的实施例的所述药物组合物之前、同时、之后或与任何其它时间组合一起施用。
可以任选地包括在所述组合物中的额外的添加成分，例如包括以下任何成分或类似性质的化合物：一粘合剂(binder)，如微晶纤维素(microcrystalline cellulose)、黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶(gelatin)；赋形剂(excipient)，如淀粉或乳糖；崩解剂(disintegrating agent)，如藻酸(alginic acid)、Primogel TM或玉米淀粉(cornstarch)；润滑剂(lubricant)，如硬脂酸镁(magnesium stearate)或SterotesTM；助流剂(glidant)，如胶体二氧化硅(colloidal silicon dioxide)；甜味剂(sweetening agent)，如蔗糖(sucrose)或糖精(saccharin)；或调味剂(flavoring agent)，如薄荷(peppermint)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)或柳橙调味剂。当剂量单位形式是一胶囊时，除了上述类型的材料之外，还可以含有一液体载体。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其它材料，例如糖、虫胶(shellac)或其它肠溶剂(enteric)的包衣。
本发明的药物组合物与其他药剂的组合方案可以根据多个参数来配制，诸如特定病况或疾病、对象的健康状况、给药方法等等。这种组合方案可以例如由专业人员进行决定，如主治医师、医院工作人员，以及根据预定方案决定。
药物的配制和给药技术可参见“雷明顿的药物科学Remington's PharmaceuticalSciences”，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，其通过引用并入本文中。
适合的给药途径例如可以包括口服、直肠、经粘膜，特别是经鼻、肠或肠外递送，包括肌肉内、皮下和髓内(intramedullary)注射，以及鞘内(intrathecal)、直接心室内(direct intraventricular)、心内(intracardiac)，例如进入右心室或左心室，进入一般冠状动脉、静脉内、腹膜内(intraperitoneal)、鼻内(intranasal)或眼内(intraocular)注射。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，将所述药物组合物配制成用于对对象的肺部给药。
根据吸入应用和/或治疗应用的方式，用于本发明的方法和组合物的组合物可以是多种形式。
在描述的任何实施例的一些实施例中，所述药物组合物被配制成适合一对像吸入。适用于吸入的药物组合物的示例包括但不限于含有推进剂的气溶胶(propellant-containing aerosol)和不含推进剂的可吸入的(propellant-free inhalable)溶液或悬浮液。可以任选地使用本文所述的装置来配制这样的药物组合物，以用于给药。在一些实施例中，所述组合物是不含推进剂的可吸入溶液，包含所述修饰的DNA酶，适合于例如通过雾化器(nebulizer)施用于所述对象。其他合适的制剂包括但不限于雾状、蒸气或喷雾制剂，只要包含蛋白质组合物的颗粒以与所述递送装置所描述的尺寸范围一致的一尺寸范围被递送，例如一干粉药物组成。在一些实施例中，组合物经配制用于通过一雾化器递送。
当在递送装置中使用一液体溶液或一悬浮液、一雾化器、一计量剂量吸入器或其它合适的递送装置以单一或多次部分剂量通过肺部吸入，所述组合物的一药物有效量到达所述对象的肺，作为液滴，例如具有本文所述的相同的颗粒大小范围。
制备和使用适合用作为液体或悬浮液的制剂的方法是本领域已知的，例如国际专利申请公开WO 2011/004476中教示的基于油(oil-baaed)的基质。
当在使用本发明的递送方法之前，所述液体药物组合物被冷冻干燥(lyophilized)，可以将冷冻干燥的组合物研磨以获得由本文所述的所需尺寸范围内的颗粒所组成的细碎干燥粉末。当使用喷雾干燥来获得所述液体药物组合物的干粉形式时，所述过程是在多个条件下执行，所述条件导致由上述所需尺寸范围内的颗粒所组成的一本质上无定形的细碎干燥粉末。类似地，如果起始药物组合物已经是冷冻干燥的形式，则可以将组合物研磨以获得干燥粉末形式用于随后的制备，作为适于肺部吸入的气雾剂或其它制剂。当起始药物组合物为其喷雾干燥形式时，优选地制备所述组合物，使得所述组合物已经为一干粉形式，具有适当的颗粒尺寸，用于分配一水性或非水性溶液或悬浮液，根据本发明的肺部给药方法。关于制备药物组合物的干粉形式的方法，例如参见国际专利申请公开号WO 96/32149、WO 97/41833和WO 98/29096，以及美国专利号5,976,574、5,985,248和6,001,336，其并入本文参考。
然后将得到的干燥粉末形式的组合物任选地放置在合适的递送装置中，用于之后的制备，作为一气雾剂或其它合适的制剂，通过肺吸入递送至所述对象。
当所述干燥粉末形式的药物组合物被制备并以一水性或非水性溶液或悬浮液的形式分配时，任选地使用一计量吸入器(metered-dose inhaler)或其它合适的递送装置。
根据本发明的一些实施例的干粉形式的药物组合物可以任选地重新配制成水溶液，以便作为一水溶液气溶胶用于随后的递送，可使用雾化器(nebulizer)、计量剂量吸入器或其它合适的递送装置。在使用雾化器的情况下，保存在流体储存器内的水溶液被转化为水性喷雾，其中只有一小部分离开雾化器以在任何给定时间递送到所述对象。剩余的喷雾回流到雾化器内的流体储存器中，所述雾化器再次将其雾化成水性喷雾。重复所述过程直到流体储存器被完全分配或者直到雾化喷雾的施用终止。本文描述了雾化器的实例。
所述稳定的冷冻干燥或喷雾干燥的组合物可以使用缓冲剂来配制，其将药物组合物的pH值保持在可接受的范围内，例如在配制过程中或在干燥形式的组合物重构之后。在一些实施例中，pH值在约pH4.0至约pH 8.5、约pH 4.5至约pH 7.5、约pH 5.0至约pH 6.5、约pH 5.6至约pH 6.3和约pH 5.7至约pH 6.2。合适的pH包括约4.0、约4.5、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.2、约8.4、约8.6、约8.8、约9.0，在3.5至9.0、4.0至8.0、4.5.至7.5、5.0至6.0、5.0至7.5、5.5至7.0和6.0至7.0的范围内。
在一特定的实施例中，pH为约7.0至8.2。合适的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲液(citrate buffer)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer)、琥珀酸盐缓冲剂(succinatebuffer)、更特别是柠檬酸钠/柠檬酸(sodium citrate/citric acid)。或者可以使用维持pH在约4.0至约8.5范围内的咪唑(imidazole)或组氨酸(histidine)或其它碱/酸。选择缓冲剂使得它们与干燥过程相容，并且在处理和储存期间不影响蛋白质的质量、纯度、效力和稳定性。
本发明的药物组合物可任选地包括根据本文所述各实施例中任一项的“治疗有效量(therapeutically effective amount)”或“预防有效量(prophylactically effectiveamount)”的经修饰的DNA酶I蛋白。“治疗有效量”是指在剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。所述修饰的DNA酶I的治疗有效量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别和体重，以及所述修饰的DNA酶I在个体中引起所需反应的能力而也差异。治疗有效量也是所述修饰的DNA酶I的任何有毒或不利影响超过治疗有益效果的量。“预防有效量”是指在剂量和时间段内有效实现所需预防结果的量。通常由于在疾病之前或前期在所述对象中使用一预防剂量，所述预防有效量将小于所述治疗有效量。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，本发明的药物组合物包含约0.01毫克至10毫克的修饰的DNA酶I的一单位剂量。或者，本发明的药物组合物包含一单位剂量为约0.1毫克至5毫克、约1毫克至5毫克(例如约1.25毫克、约2.5毫克、约5毫克)、约2.5毫克至5毫克、约2.0毫克至4.5毫克、约2.2毫克至4.0毫克、约2.0毫克至3.0毫克、约2.2毫克至3.0毫克、约2.3毫克至3.0毫克、约2.4毫克至2.8毫克、约2.4至2.6毫克；或约2.5毫克的修饰的DNA酶I或其酵素活性部分。在另一实施例中，药物组合物包含超过10毫克的单位剂量。
应当注意，剂量值可以随着要缓解的病症的类型和严重程度而变化。应当进一步理解，对于任何特定受试者，应当断随时间根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的专业判而调整特定剂量方案，并且本文所述的剂量范围是示例性的并不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
通常药物组合物在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。所述组合物可以配制为一溶液(solution)、微乳液(microemulsion)、分散体(dispersion)、脂质体(liposome)或其它有序结构，适用于高药物浓度。无菌可吸入溶液可以通过将所需量的活性化合物(例如根据本文所述的相应的实施例中的任一种的修饰的DNA酶I)加入适当的溶剂中，所述溶剂根据需要具有上述列举的成分之一或组合，然后通过过滤灭菌。通常，通过将活性化合物加入含有碱性分散介质的无菌载体以及加入来自上面列举的所需的其它成分来制备分散体(dispersion)。
例如通过使用诸如卵磷脂(lecithin)的涂层，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂，来维持溶液的适当的流动性。延长可吸入组合物的作用可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶来实现。
本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒(granulating)、糖衣丸制造(dragee-making)、研磨(levigating)、乳化(emulsifying)、包封(encapsulating)，包埋(entrapping)或冷冻干燥(lyophilizing)方法。
根据本发明的一些实施例使用的药物组合物因此可以以常规方式配制，使用一或多种药学上可接受的载体，其包含赋形剂(excipients)和助剂(auxiliaries)，其有助于将活性成分加工成药学上可使用的制剂。适当的配方取决于所选择的给药途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选地为在生理学上相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐缓冲液(physiological salt buffer)中。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合渗透屏障的渗透剂(penetrants)。这种渗透剂(penetrants)在本领域中通常是已知的，例如上文所述的表面活性剂。
对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的载体组合来容易地配制药物组合物。这样的载体使得药物组合物可以配制成片剂(tablets)、丸剂(pills)、糖衣丸(dragees)、胶囊(capsules)、液体、凝胶(gels)、糖浆(syrups)、浆液(slurries)、悬浮液(suspensions)等，用于患者的口服摄取。口服使用的药学制剂可以使用一固体赋形剂，任选地研磨所得的混合物，并且如果需要，在加入合适的助剂之后，加工颗粒(granules)的混合物以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂，特别是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉(maize starch)、小麦淀粉(wheat starch)、稻米淀粉(rice starch)、马铃薯淀粉(potato starch)、明胶(gelatin)、黄蓍胶(gum tragacanth)、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl-cellulose)、羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethylcellulose)；和/或药学上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)。如果需要，可以加入崩解剂(disintegrating agents)，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮(cross-linked polyvinyl pyrrolidone)、琼脂(agar)或海藻酸(alginicacid)或其盐，如藻酸钠(sodium alginate)。
糖衣丸芯具有合适的涂层。可以使用浓缩糖溶液达到此目的，其可以任选地含有阿拉伯胶(gum arabic)、滑石(talc)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、二氧化钛(titanium dioxide)、漆溶液(lacquer solutions)和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料加入到片剂或糖衣丸包衣中用于鉴定或显示活性化合物剂量的不同组合的特征。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶(gelatin)制成的推入组合式(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入组合式胶囊可以含有与填料混合的活性成分，如乳糖、粘合剂(binder)、润滑剂(lubricant)以及任选的稳定剂(stabilizer)，所述粘合剂如淀粉，所述润滑剂如滑石(talc)或硬脂酸镁(magnesiumstearate)。在软胶囊中，所述活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡(liquid paraffin)或液体聚乙二醇(liquid polyethylene glycols)。此外可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂应该适合于所选给药途径的剂量。
对于口腔给药(buccal administration)，所述组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
本文所述的药物组合物可以配制用于肠胃外给药(parenteraladministration)，例如通过单剂推注(bolus injection)或连续输注(continuousinfusion)。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿瓶(ampoules)或多剂量容器中，任选地添加防腐剂。所述组合物可以是在油性或水性载体中的悬浮液(suspensions)、溶液(solutions)或乳液(emulsions)，并且可以含有配制剂(formulatoryagents)，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式(water-soluble form)的活性制剂的水性溶液(aqueous solutions)。此外，活性成分的悬浮液可以适当地制备为油基或水基注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油(sesame oil)或合成脂肪酸酯(synthetic fatty acids esters)，如油酸乙酯(ethyl oleate)、甘油三酯(triglycerides)或脂质体(liposomes)。
水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠(sodiumcarboxymethyl cellulose)、山梨糖醇(sorbitol)或葡聚糖(dextran)。任选地，所述悬浮液还可含有合适的稳定剂或药剂，增加所述活性成分的溶解度，以允许制备高度浓缩的溶液。
可替代地，如上所述，所述活性成分可以是粉末形式，用于在使用前以合适的载体(例如无菌、无热原(pyrogen)的水基溶液)构成。
本发明的一些实施例的药物组合物也可以配制为用于直肠的组合物，如栓剂(suppositories)或停留灌肠剂(retention enemas)中，例如使用常规栓剂基质(suppository bases)，如可可脂(cocoa butter)或其它甘油酯(glycerides)。
药物组合物可以任选地以局部而不是全身的方式施用，例如通过将药物组合物直接注射到患者或其他有需要的对象的组织区域中。
本文中，术语“组织(tissue)”是指生物体中由细胞组成的一部分，设计成执行一功能或多个功能。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织，肝组织、胰组织、骨胳、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
对于治疗和/或预防呼吸和/或肺部疾病，本发明的修饰的DNA酶I和/或药物组合物可以通过肺部直接给药至呼吸道(airways)，例如本文所详述的。
适用于本发明的一些实施例的上下文中的药物组合物包括多个组合物，其中包含多个活性成分于一有效量，以达到预期目的。更具体地，治疗有效量是指有效预防、缓解或改善病症症状(例如囊性纤维化)，或延长正在接受治疗的对象的生存的活性成分(根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I)的量。
治疗有效量的决定是在本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于本文提供的详细公开内容。
对于用于本发明方法的任何制剂，所述治疗有效量或剂量最初可以从体外及细胞培养分析以及动物模型中估计。例如可以在动物模型和/或痰液样品中配制一剂量(例如根据本文所述的程序)，以实现期望的浓度或滴度(titer)。这些信息可用于更精确地决定人体中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外及细胞培养分析或实验动物中的标准药物程序来决定。从这些体外和细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的一系列的剂量。
剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。鉴于患者状况，个个医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量。(例如参见Fingl等人所著，1975，“治疗药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，Ch.1p.1)。
剂量的量和间隔可以单独调整，例如提供细胞、血清、粘液和/或痰中的活性成分的浓度，足以诱导或抑制生物效应(最低有效浓度，minimal effective concentration，MEC)。MEC将因每种制剂而有差异，但可以从体外数据估算。实现MEC所需的剂量取决于个体特征和给药途径。检测分析可用于测定血浆浓度。
取决于要治疗的病症的严重性和反应性，给药可以是单次给药或多次给药，治疗过程持续数天至数周，或直到治愈，或达到疾病状态的减轻。
当然要施用的组合物的量将取决于被治疗对象的痛苦严重性、给药方式、处方医师的判断等。
如果需要，本发明的实施方案的组合物可以存在于一包装(pack)或分配器(dispenser)装置，例如美国FDA(美国食品和药物管理局)批准的试剂盒，其可以包含含有活性成分的一或多个单位剂型。举例而言，所述包装可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装(blister pack)。所述包装或分配装置可附有给药说明书。所述包装或分配器也可以伴随着与容器相关的通知，所述容器的形式是依照监管药品生产，使用或销售的政府机构所规定，所述通知反映所述组成物的用于人体或兽医的形式授所述机构批准。举例而言，这样的通知，可能是经过美国食品和药物管理局批准的处方药标签，或批准的产品插入物。组成物包括配制在药学相容的载体中的本发明的化合物，所述组合物可以被制备，置于合适的容器中，并标记，以用于治疗本文中所述的病症，如本文中详细说明。
修饰DNA酶I的使用：
在一些实施例中，本文所述的根据本实施例中任一项的修饰的DNA酶I和/或药物组合物用于降低含有DNA的生物流体和/或分泌物的粘度。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种降低含有DNA的生物流体和/或分泌物的粘度的方法，所述方法包括使流体和/或分泌物与根据本文所述各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物接触。在一些实施例中，所述方法是离体(ex vivo)进行的。在一些实施例中，所述方法在有需要的对象中在体内(in vivo)进行。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物在制备用于降低含有DNA的生物流体和/或分泌物的粘度的药物的一用途。
在一些实施例中，根据本文描述的各实施例中任一者的所述修饰的DNA酶I和/或药物组合物用于降低含有DNA的生物流体和/或分泌物中的DNA含量。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种降低含有DNA的生物流体和/或分泌物的DNA含量的方法，所述方法包括使流体和/或分泌物与根据本文所述各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物接触。在一些实施例中，所述方法是离体(ex vivo)进行的。在一些实施例中，所述方法在有需要的对象中在体内(in vivo)进行。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物在制备用于降低含有DNA的生物流体和/或分泌物的DNA含量的药物的一用途。
在本文所述的任何实施例，关于降低含有DNA的流体和/或分泌物的粘度的一些实施例中，所述流体和/或分泌物选自痰液、粘液和精液。在某些实施例中，分泌物是粘液(mocus)。在某些实施例中，分泌物是痰液(sputum)。
本文中，术语“痰液(sputum)”是指下呼吸道的粘液，并且包括咳出的粘液以及仍然在下呼吸道中的粘液(本领域中也称为“痰(phlegm)”)。
在本文所述的任何实施例中，关于降低含有DNA的流体和/或分泌物的粘度的一些实施例中，粘度降低的特征在于必须施加于流体/或分泌物(例如痰)的振荡应力(oscillatory stress)的降低，使得粘度模量(viscous modulus)超过弹性模量(elasticmodulus，例如表明液体状行为超过固体状行为)，例如使用本文所述的方法测定。
在本文所述的任何实施例中，关于降低含有DNA的流体和/或分泌物的粘度的一些实施例中，所述流体和/或分泌物与一疾病或病症相关，与来自健康个体的类似流体和/或分泌物的DNA含量相比，所述疾病或病症导致流体和/或分泌物中的DNA量增加。
积累在分泌物、流体或组织中的过多的DNA已与许多病理和疾病有关的病症相关联，不仅关于肺部病症，并且关于诸如败血症、不育症和癌症的转移性扩散的病症。本发明的修饰的DNA酶I施用达到过量细胞外DNA的位置，可以有效地裂解这种细胞外DNA，从而降低其严重程度，缓解症状，治疗、预防或治愈这种病症。因此根据本发明的一些实施例，所述疾病或病症与所述对象的流体、分泌物或组织中过量细胞外DNA相关，并且任选地施用所述修饰的DNA酶I，其作为本文中所述药物组合物的一部分，导致细胞外DNA的裂解。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，本文所述的修饰的DNA酶I和/或药物组合物用于在任何组合物中进行DNA的裂解，例如水性或半水性组合物。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种在包含DNA的一组合物中进行DNA裂解的方法，例如水性或半水性组合物，所述方法包括使所述组合物与根据本文所述各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物接触。在一些实施例中，所述方法是离体(ex vivo)进行的。在一些实施例中，所述方法在有需要的对象中在体内(in vivo)进行。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物在制备用于在含有DNA的生物流体和/或分泌物中裂解DNA的药物的一用途。
在本文所述的任何实施例，关于在一组合物中裂解DNA的一些实施例中，所述组合物唯一有DNA的生物流体和/或分泌物，任选的粘膜分泌物，例如但不限于粘液(mucus)、痰液(sputum)、精液(sperm)或其他分泌物，其中DNA的裂解、DNA含量的降低和/或随后的流变性质(rheological properties)的降低是可期望的。分泌物的这种流变学性质的增加任选地是宿主细胞免疫的细胞毒性反应和病毒或微生物生长的结果。
在本文描述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I(例如修饰的人类DNA酶I)是有生物活性的，具有与哺乳动物细胞表达的重组人DNA酶I相当或更优越的催化活性、酵素动力和比活性，并有效降低囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)痰液的流变学性质。
应当理解，修饰的DNA酶I可以用于实现DNA的裂解和/或降低除了分泌物之外的生物流体的DNA含量，例如血液、血浆、淋巴、脑脊液等之外，或在生物体的内部器官或组织的局部环境，例如动物和/或人类受试者。在一些实施例中，将修饰的DNA酶I给药至生物体，导致血液中的核酸内切酶活性增加，例如在循环血液中或在生物体的一组织中。
在一些实施例中，根据本文描述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物，用于治疗有需要的对象中可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了一种治疗有需要的对象中可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的方法，所述方法包括将根据本文所述各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物的一治疗有效量给药于所述对象。
根据本发明的一些实施例的一方面，提供了根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物在制备用于治疗有需要的对象中可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的药物的一用途。
如本文所用，短语“有需要的对象(subject in need thereof)”是指被诊断患有或表现出本文所述的一或多种相应病症中的对象、过去被诊断患有或表现出一或多种此类病症的对象、或由于遗传或环境因素而被认定有发展一或多种此类病症的风险的对象。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症可通过降低和/或稀释(thinning)含有DNA的生物流体和/或分泌物的粘度进行治疗(例根据本文所述的各实施例中的任何一者)。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症与一对象的流体、分泌物或组织中的过量细胞外DNA相关。
在一些实施例中，所述疾病或病症是与一粘液相关的疾病或病症。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症是一呼吸系统疾病或病症，例如一呼吸系统疾病或病症与一对象的呼吸道的液体、分泌物或组织中过量的细胞外DNA相关。在一些实施例中，所述呼吸系统疾病或病症与粘液相关。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症是一肺部疾病或病症，例如一肺部疾病或病症与一对象的肺脏的液体、分泌物或组织中过量的细胞外DNA相关。在一些实施例中，所述肺部疾病或病症与粘液相关。
在一些实施例中，一有需要的受试者具有以临床异常肺量计值(spirometryvalues)为特征的呼吸系统和/或肺部疾病。可指示所述对象需要的肺量参数的实例包括但不限于强制呼气量1(forced expiration volume1，FEV1)、强制肺活量(forced vitalcapacity，FVC)、强制呼气流量(forced expiratory flow，FEF25-75)等。在一些实施例中，将修饰的DNA酶I给药于所述对象导致一或多个肺活量参数的改善。
根据本文描述的各实施例中任一者，可以通过施用修饰的DNA酶I蛋白治疗的呼吸病症或疾病包括但不限于
急性或慢性支气管肺疾病(acute or chronic bronchopulmonary disease)、肺不张(atelectasis，例如由于气管或支气管阻塞和气管切开术(tracheostomy)的并发症)，支气管炎或气管支气管炎(bronchitis or tracheobronchitis，例如慢性支气管炎(chronic bronchitis)、哮喘性支气管炎(asthmatic bronchitis))、囊性纤维化(cysticfibrosis)、肺炎(pneumonia)、过敏性疾病(allergic diseases)(例如过敏性哮喘(allergic asthma))，非过敏性哮喘(non-allergic asthma)、结核病(tuberculosis)，支气管肺真菌感染(bronchopulmonary fungal infections)、系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、支气管扩张(bronchiectasis，例如非囊性纤维化支气管扩张(non-cystic fibrosisbronchiectasis))、肺气肿(emphysema)、急慢性鼻窦炎(acute and chronic sinusitis)和感冒(common cold)。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症是一化脓性(suppurative)疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病或病症是一化脓性肺部疾病。在一些实施例中，所述疾病或病症是一慢性化脓性肺部疾病(chronic suppurative lung disease，CSLD)，例如以慢性湿咳(chronic wet cough)和渐进性肺损伤(progressive lung damage)为特征的疾病或病症。
根据本发明的实施例可治疗的CSLD可任选为囊性纤维化或非囊性纤维化CSLD。非囊性纤维化CSLD的实例包括但不限于非囊性纤维化支气管扩张(non-cystic fibrosisbronchiectasis)和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disorder，COPD)(包括慢性支气管炎(bronchitis)和肺气肿(emphysema))。在某些实施例中，疾病或病症是囊性纤维化(cystic fibrosis)。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症是本文所述的疾病的恶化发作(exacerbation episode)，例如囊性恶化发作纤维化和/或COPD恶化发作。
在本文所述的任何实施例，关于治疗根据本文所述的各实施例中任一者所述的一肺部疾病或病症的一些实施例中，包括但不限于囊性纤维化，所述治疗通过修饰DNA酶I的肺部给药而实现，有效剂量在每剂量0.1至50毫克DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.1至50毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.5至25毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量1.0至20毫克(例如约1.25毫克、约2.5毫克、约5毫克)修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量1.5至15毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.0至10毫克修饰DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.5至7.5毫克修饰DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.75至5毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每剂量2.0至3.0毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量为每剂量2.0至3.0毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.1至2.9毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.2至2.8毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.3至2.7毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)或每剂量2.4至6.6毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)的范围内。在一些实施例中，每天一次、每2天一次、每2至5天一次，每2至10天或更多天一次给药修饰的DNA酶I的有效剂量。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量为每天2次、3次、2至4次、2至6次、2至8次或更多次。在本发明的一些实施例中，每天通过肺部给药2.5毫克修饰的DNA酶I一次，例如用于治疗囊性纤维化。
在本文所述的任何实施例，关于治疗根据本文所述的各实施例中任一者所述的一肺部疾病或病症的一些实施例中，包括但不限于囊性纤维化，所述治疗通过修饰DNA酶I的肺部给药而实现，有效剂量在每天0.1至50毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.1至50毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.5至25毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天1.0至20毫克(例如约1.25毫克、约2.5毫克、约5毫克)修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天1.5至15毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天2.0至10毫克修饰DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量2.5至7.5毫克修饰DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天2.75至5毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每天2.0至3.0毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。
在本文所述的任何实施例，关于可通过DNA酶I活性治疗的一疾病或病症的一些实施例中，所述疾病或病症选自红斑狼疮(包括一般的系统性红斑狼(systemic lupuserythematosus)以及特别是与DNA0酶I相关的系统性红斑狼疮易感性)、狼疮性肾炎(lupusnephritis)、柯凯因氏综合征(Cockayne syndrome)、天使人综合征(Angelman syndrome)、男性不育症(male infertility)、转移性癌症(metastatic cancer)、病毒、细菌、真菌或原生动物感染性败血症(protozoan infection sepsis)、心肌梗塞(myocardialinfarction)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、糖尿病、迟发型超敏反应(delayed typehypersensitivity)和子宫疾病。
在本文所述的任何实施例，关于治疗的一些实施例中，待治疗的对象受到假单胞菌(Pseudomonas，例如绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)肺部感染，任选地还患有本文所述的肺部疾病或病症，如囊性纤维化。
在本文所述的任何实施例，关于治疗的一些实施例中，待治疗的对象对于以未修饰的DNA酶I治疗是非反应性的(例如由治疗医师确定)，例如链道酶α(Dornase alfa)。在一些实施例中，将未修饰的DNA酶I(例如， 链道酶α(Dornase alfa))给药于所述对象至少四个月，并且在这种治疗后，所述对象未显示临床显著改善则被确定为无反应性的。
在本文所述的任何实施例，关于治疗的一些实施例中，所述待治疗的对像是小孩，即年龄在18岁以下，任选地年龄在12至17岁，任选地年龄在12岁以下。
根据本文所述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物可用于治疗或预防男性不育症(参见例如美国专利号20110033438和美国专利申请公开号2007/0259367)，和/或用于治疗或预防由细菌、病毒、真菌和原生动物引起的感染性疾病，治疗或预防败血症(例如细菌性败血症)，治疗或预防肿瘤(原发性和转移性)，预防或减少转移生长，治疗和预防动脉粥样硬化(atherosclerosis)、糖尿病、迟发型超敏反应(delayed typehypersensitivity)，治疗和预防由体细胞突变引起的疾病，以及增加生物体的寿命(例如参见美国专利申请公开号2008/0004561)。以修饰的DNA酶I治疗男性不育是通过减少精液样品中DNA的量，如例如美国专利申请公开号2007/0259367所教示的，通过离体(ex vivo)将修饰的DNA酶I提供至精液样品。在其他实施例中，男性不育症、肿瘤、转移和生长、动脉粥样硬化、子宫和子宫内膜异常(uterine and endometrial disorders)、败血症(sepsis)、病毒、细菌、真菌和原生动物感染、延迟型超敏反应和由体细胞突变引起的疾病的治疗是通过减少对象体内(in vivo)的DNA的量，并且DNA酶可以通过适合于将DNA酶递送到所述对象体内的期望目标的任何途径或方法而进行给药。
在体内实现这种治疗的技术包括但不限于根据本文所述各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物的口服给药、吸入、腹膜内、静脉内、皮下、肌内注射或任何其他形式的全身给药(例如参见美国专利申请公开号US20110033438或US20080004561)。
在本文所述的任何实施例，关于根据本文所述的各实施例中的任一者的疾病或病症的治疗的一些实施例中，所述有效剂量范围为每剂量0.01至200毫克DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.1至100毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至80毫克的修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至60毫克经修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至40毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每剂量0.5至20毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的有效剂量为每剂量0.1至1毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量1至10毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每剂量10至200毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在上述一些实施例中，通过全身施用所述修饰的DNA酶I，任选地为腹膜内、静脉内、皮下或肌内给药进行治疗。在一些实施例中，所述疾病或病症是狼疮(lupus)。
本文所述的任何有效剂量可以任选地是根据本文所述的实施例中任一项的治疗有效量。
在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量每天施用一次、每2天一次、每2至5天一次、每2至10天或更多天一次。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量为2次、3次、2至4次、2至6次、2至8次或更多次。
在本文所述的任何实施例，关于根据本文所述的各实施例中的任一者的疾病或病症的治疗的一些实施例中，所述有效剂量范围为每天0.01至200毫克DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.1至100毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.2至80毫克的修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.2至60毫克经修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天0.2至40毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每天0.5至20毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的有效剂量为每天0.1至1毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每天1至10毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每天10至200毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在上述一些实施例中，通过全身施用所述修饰的DNA酶I，任选地为腹膜内、静脉内、皮下或肌内给药进行治疗。在一些实施例中，所述疾病或病症是狼疮(lupus)。
本文所述的任何有效剂量可以任选地是根据本文所述的实施例中任一项的治疗有效量。
在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量每天施用一次、每2天一次、每2至5天一次、每2至10天或更多天一次。在一些实施例中，修饰的DNA酶I的有效剂量为2次、3次、2至4次、2至6次、2至8次或更多次。
在本文所述的任何实施例，关于根据本文所述的各实施例中的任一者的疾病或病症的治疗的一些实施例中，所述有效剂量范围为每剂量0.01至200毫克DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.1至100毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至80毫克的修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至60毫克经修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量0.2至40毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每剂量0.5至20毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在一些实施例中，所述修饰的DNA酶I的有效剂量为每剂量0.1至1毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，每剂量1至10毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)，或每剂量10至200毫克修饰的DNA酶I蛋白(作为活性成分)。在上述一些实施例中，通过全身施用所述修饰的DNA酶I，任选地为腹膜内、静脉内、皮下或肌内给药进行治疗。在一些实施例中，所述疾病或病症是狼疮(lupus)。
在本文所述的任何实施例，关于根据本文所述的各实施例中的任一者的疾病或病症的治疗的一些实施例中，有效剂量的范围
在每天约0.01毫克至10毫克的修饰的DNA酶I，任选地在每天约0.1毫克至5毫克，任选地在每天约1毫克至5毫克(例如约1.25毫克、约2.5毫克、约5毫克)，任选地在每天约2.5毫克至5毫克，任选地在每天约2.0至4.5毫克，任选地在每天约2.2至4.0毫克，任选地在每天约2.0至3.0毫克，任选地在每天约2.2至3.0毫克，任选地在每天约2.3至3.0毫克，任选地在每天约2.4至2.8毫克，任选地在每天约2.4至2.6毫克；或在每天约2.5毫克的修饰的DNA酶I或其酶活性部分。在另一实施例中，有效剂量每天超过10毫克。
在本文中描述的任何实施例的一些实施例中，根据本发明的多个实施例的修饰的DNA酶I的剂量(例如，每个给药剂量的DNA酶的量、给药次数、治疗持续时间和/或每个治疗期间给药的DNA酶的总量)低于使用未修饰的DNA酶I所接受治疗的剂量，例如DNA酶的剂量(例如，FDA认可的DNA酶的剂量)。
根据本文描述的各实施例中任一者的修饰的DNA酶I和/或药物组合物任选地在人类对象中进行安全性研究，及/或在患有本文所述病症的人类对象中进行临床研究，优选地为囊性纤维化的患者。可以根据在相关领域中被认可为适合的常用方案进行研究。例如，安全性研究和/或临床研究任选地使用与先前用于研究DNA酶I(例如，dornase alfa)类似或基本相同的方案进行。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，所述修饰的DNA酶I与额外的活性剂(例如根据本文所述的任何实施例的任何其它活性剂和/或成分)结合给药，例如降低DNA酶I活性的肌动蛋白抑制的一试剂(例如根据本文所述的各实施例中的任一者)、抗生素、支气管扩张剂(bronchodilator)、抗炎剂(anti-inflammatory agent)、粘液溶解剂(mucolytic，例如乙酰半胱氨酸n-acetyl-cysteine)、肌动蛋白结合蛋白或肌动蛋白切断蛋白(an actin binding or actin severing protein例如凝溶胶蛋白gelsolin)、蛋白酶抑制剂或基因治疗产品。额外的活性剂可以在之前、同时、之后或任何其他时间组合与本发明实施例的修饰DNA酶I一同给药。
在本文中描述的任何实施例，与治疗有关的一些实施例中，治疗任选地进行至少一周。在一些实施例中，治疗至少进行两周。在一些实施例中，治疗至少进行四周。在一些实施例中，治疗至少进行两个月。在一些实施例中，治疗至少进行六个月。在一些实施例中，治疗至少进行一年。在一些示例性实施例中，治疗进行约四周。在上述任何实施例中的一些中，治疗包括通过吸入(任选地每天一次)1.25、2.5和/或5.0毫克修饰的DNA酶进行给药。
肺部给药(Pulmonary administration)：
肺部给药可以通过本领域技术人员已知的合适方式来实现。修改DNA酶的肺部给药通常需要在吸入期间将生物活性物质从递送装置分配到一对象的口腔中。
在本文中描述的任何实施例，与肺部治疗有关的一些实施例中，包含修饰的DNA酶I(根据本文所述的各实施例中任一项)的药物组合物通过吸入气雾剂(aerosol)或其它合适的制剂，其由水性或非水性溶液或悬浮液形式或药物组合物的固体或干粉形式获得，这取决于所使用的递送装置。这种输送装置是本领域公知的，包括但不限于雾化器(nebulizers)、计量剂量吸入器(metered dose inhalers)和干粉吸入器(dry powderinhalers)，或任何其它合适的输送机构，其允许将药物组合物分配为水性或非水性溶液或悬浮液或固体或干粉形式。
通过肺部给药将修饰的DNA酶I递送给一对象的方法(包括定向递送至中央和/或外周肺部区域)，包括但不限于干粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)装置和雾化器(nebulizers)。
在本文所述的任何实施例的一些实施例中，使用雾化器或液体吸入器将修饰的DNA酶I递送至一对象。通常，雾化器(nebulizers)使用压缩空气以递送药物，作为用于吸入的湿气雾剂或雾气，因此需要药物溶于水。与MDI(计量吸入器)或DPI(干粉吸入器)装置相比，雾化器(nebulizers)装置可以提供相对较大的剂量，并且对于递送至肺部深层(外周肺部区域)特别有效。雾化器不需要推进剂，包括喷射式雾化器(喷气式雾化器和喷液式雾化器)和超声波雾化器。雾化器的实例包括AkitaTM(Activaero GmbH)(参见例如美国专利号7,766,012和欧洲专利号EP1258264)、一种基于Pari's LC Star的桌面雾化器吸入系统，其提供对患者呼吸模式的全面控制，以及便携式Go/Pro/Lab雾化器(AeroGen)。雾化器是基于OnQTM技术，即由振动元件包围的电子微型泵，适用于广泛患者的需求，包括儿童和老年人，可单次或多次使用。
便携式AerocurrentTM(AerovertRx公司)也可以用于本发明的方法和组合物中(参见国际专利申请公开号WO 2006/006963)。
StaccatoTM(Alexza Pharma)也可用于本发明的方法和组合物中(参见国际专利申请公开号WO03095012)。StaccatoTM技术的关键是蒸发药物，而没有产生热降解。一手持式电池操作装置(Aradigm)也可以使用于本发明的方法和组合物(参见国际专利申请公开号WO 98/48873，美国专利号5,469,750、5,509,404、5,522,385、5,694,919、5,735,263和5,855,564)。也可以用于本发明的方法和组合物中的雾化器装置的另一例子包括一多剂量储存系统(Boehringer)。DNA酶也可以使用CollegiumNebulizerTM(Collegium Pharma)递送。也可以用于本发明的方法和组合物中的雾化器装置的另一实例包括626(Respironics)，一种用于家庭护理的压缩机雾化器，其输送粒径在0.5至5微米之间(自适应气溶胶递送技术Adaptive Aerosoltechnology(Respironics))提供精确和可重复的吸入药物剂量。
自适应气溶胶递送系统(Adaptive Aerosol Delivery将电子装置和传感器集成在手持件中，通过检测吸气和呼气期间的压力变化来监测患者的呼吸模式，从而允许患者在没有药物浪费的情况下中断治疗。系统雾化器的实例包括以及 自适应气溶胶递送技术(Adaptive Aerosoltechnology(Respironics))是一种由便携式压缩机供电的气动雾化系统(pneumatic aerosolization system)(参见欧洲专利号EP0910421，通过引用并入本文)。
(Respironics)是一种由便携式压缩机供电的气动雾化系统(pneumatic aerosolization system)，并且由“ProDose DiscTM”系统控制(Respironics)(参见EP1245244)。可以通过进行递送，用于处理铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)的肺部感染，特别是囊性纤维化。作为雾化粉末提供，在使用前重新配制(reconstituted)。是基于电子网格雾化技术(electronic mesh-based aerosolization technology，Omron)和技术结合的一种手持式小型化系统，无需分离的压缩机(“I-Neb”)。已被用于递送(iloprost，伊洛前列素)(CoTherix/Schering AG)。
可用于本发明的方法和组合物的雾化器的另一实例是AriaTM(Chrysalis)。Aria是基于毛细管气溶胶生成系统，MMAD范围为0.5至2.0微米。
在另一个实施例中，可以使用TouchSprayTM雾化器(Odem)，其使用一穿孔膜(perforate membrane)，以一超声波频率振动，与储存流体接触以产生气溶胶云(aerosolcloud，参见美国专利号6,659,364)并可以用于递送根据本发明的DNA酶。可用于本发明的额外雾化器包括为便携式单元的多种雾化器，其当患者吸气时使雾化剂输出最大化，并且当患者使用两个单向阀进行呼气时使雾化剂输出最小化(参见PARI雾化器(PARI GmbH)，对设计用于特定的患者群体，如3岁以下的患者(PARI BABYTM)和老年患者(PARI和PARI )。
可用于本发明的额外的雾化器是一e-雾化器(PARI GmbH)，使用振动膜技术来雾化药物溶液以及悬浮液或胶体分散体(TouchSprayTM；ODEM(United Kingdom))，如美国专利号6,962,151所述。可用于本发明的额外雾化器包括Hudson T-Updraft I或II雾化器(Pulmo-Aide压缩机)、Marquest Acorn I或II雾化器(Pulmo-Aide压缩机)、DurableSidestream(Portaneb压缩机)，电子雾化器(Omron)(见美国专利号6,901,926)和MysticTM雾化器(Ventaira)(见美国专利号6,397,838)。MysticTM装置被呼吸激活的，并与Corus 1030TM(盐酸利多卡因，lidocaine HC1)、Resmycin(盐酸多柔比星doxorubicin hydrochloride)、Acuair(丙酸氟替卡松，fluticasone propionate)、ViroPharm的NCE以及辉瑞(Pfizer)的NCE一起使用。因此在一实施例中，本发明提供了一容器，用于一雾化器装置，将DNA酶给药于一对象的肺部。所述容器包含含有DNA酶而不含推进剂(propellant-free)的可吸入溶液或悬浮液。
根据设计用于实现治疗效果的给药方案，DNA酶可任选地通过吸入给药于受试者。在一些实施例中，一多剂量给药方案可用于治疗多种病症，使用本文所述的方法时，DNA酶I活性对所述病症是有益的。多种可变剂量的治疗方法也可用于治疗多种病症，DNA酶I活性对所述病症是有益的。
术语“治疗(treating)”是指抑制、预防或阻止病理的发展(疾病(disease)、病症(condition)或失调(disorder))和/或引起病理学的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和分析来评估病理学的发展，并且类似地，可以使用各种方法和分析来评估病理学的减少、缓解或消退。
如本文所用，术语“预防(preventing)”是指避免在患有疾病风险但尚未被诊断患有所述疾病的对象中发生疾病(disease)、病症(condition)或失调(disorder)。
如本文所用，术语“对象(subject)”包括患有病理的哺乳动物，优选地为任何年龄的人类。优选地，所述术语包括具有发展所述病理风险的一个体。
如本文所用，短语“治疗方案(treatment regimen)”是指一治疗计划，详细指出提供给有需要的对象(例如诊断为具有一病理的受试者)的治疗类型，剂量、时间表和/或持续时间。所选择的治疗方案可以是一积极性治疗方案，其预期导致最佳临床结果(例如完全治愈一病理)或更温和的治疗方案，其可以缓解病理症状，但不导致所述病理完全治愈。应当理解，在某些情况下，较积极的治疗方案可能与所述对象的一些不适或不良副作用(例如对健康细胞或组织的损伤)相关。治疗的类型可以包括外科手术(例如，去除病变(lesion)、病变的细胞，组织或器官)、细胞替代疗法、治疗药物(例如受体激动剂、拮抗剂、激素、化疗剂)的局部或全身型式给药、使用外源(例如外部光束，external beam)和/或内源(例如近接放射治疗，brachytherapy)放射治疗的照射和/或其任何组合。治疗的剂量、方案和持续时间可以根据病理学的严重程度和所选择的治疗类型而变化，并且本领域技术人员能够以治疗的剂量、时间表和治疗持续时间来调整治疗类型。
如本文所用的术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
术语“由...组成(consisting of)”意指“包括并且限于”。
术语“基本上由......组成(essentially consisting of)”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新颖特征。
本文所使用的单数形式“一”、“一个”及“至少一”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在。应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及所述范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。
每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。术语，第一指示数字及第二指示数字"之间的范围”及第一指示数字"到”第二指示数字"的范围"在本文中可互换，并指包括第一及第二指示数字，及其间的所有分数及整数。
如本文所用的术语“方法(method)”指的是用于完成一特定任务的方式(manner)，手段(means)，技术(technique)和程序(procedures)，包括但不限于，那些方式，手段，技术和程序，其是已知的，或是从已知的方式，手段，技术或程序很容易地被化学，药理，生物，生化及医学领域从业者所开发。
可以理解，本发明中的特定特征，为清楚起见，在分开的实施例的内文中描述，也可以在单一实施例的组合中提供。相反地，本发明中，为简洁起见，在单一实施例的内文中所描述的各种特征，也可以分开地、或者以任何合适的子组合、或者在适用于本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的内文中所描述的特定特征，并不被认为是那些实施方案的必要特征，除非所述实施例没有那些元素就不起作用。
上文所述的及以权利要求项部分所请求的本发明各种实施例和方面，可在以下的实施例中找到实验支持。
实施例：
现在参考以下实施例，其与上述描述以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
通常，本文使用的命名法和本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详细解释。参见例如"分子克隆：实验室手册MolecularCloning:A2laboratory Manual"Sambrook等人所著,(1989)；"当前分子生物学方法Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel等人所著,"当前分子生物学方法Current Protocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"分子克隆实用指南APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人所著,"重组DNA Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren等人所著(eds)"基因组分析：实验室手册系列Genome Analysis:A Laboratory ManualSeries",Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth in U.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；"Cell Biology:实验室手册A Laboratory Handbook",VolumesI-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"当前的免疫学方案Current Protocols in Immunology"Volumes I-III Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites等人所著(eds),"基础和临床免疫学Basic and Clinical Immunology"(8th Edition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"细胞免疫学中的选择方法Selected Methods in CellularImmunology",W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述,例如请见美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771and 5,281,521；"寡核苷酸合成OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,ed.(1984)；“核酸杂交Nucleic Acid Hybridization"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；"转录和翻译Transcription and Translation"Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；"动物细胞培养Animal Cell Culture"Freshney,R.I.,ed.(1986)；"固定化细胞和酶Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press,(1986)；"分子克隆实用指南A Practical Guide to Molecular Cloning"Perbal,B.,(1984)and"Methods in Enzymology酵素学方法"Vol.1-317,Academic Press；"PCR方案：方法与应用指南PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications",AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak等人所著,"蛋白质纯化和表征的策略-实验室课程手册Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual"CSHL Press(1996)；这些所有皆通过引证被纳入在本文中，如同在本文中完全阐明。其中的程序被认为是本领域熟知的，为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文中。
材料和方法
材料：
肌动蛋白(人类非肌肉肌动蛋白)，获自于Cytoskeleton公司
氯化铵，获自于Sigma公司
ATP，，获自于Sigma公司
丁胺(Butylamine)，获自于Sigma公司
CaCl2，获自于Sigma公司
CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)，获自于Sigma公司和Molekula公司
二异丙基碳二亚胺(Diisopropylcarbodiimide，DIC)，获自于Sigma公司
二异丁基碳二亚胺(Di-t-butylcarbodiimide，DTC)，获自于Sigma公司
DMSO，获自于Sigma公司
DNA，获自于Sigma公司(来自鲑鱼睾丸)。
EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)，获自于Sigma公司
乙醇，获自于Sigma公司
乙醇胺，获自于Sigma公司
乙二胺，获自于Sigma公司
己二胺，获自于Sigma公司
MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)，获自于Sigma公司
甲基绿(Methyl green)，获自于Sigma公司
三(三(羟甲基)氨基甲烷，Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane))，获自于Sigma公司
植物重组人类DNA酶I：
如国际专利申请公开WO 2013/114374中所述，制备植物重组人类DNA酶I，通过在Nicotiana tabacum Bright Yellow-2(BY2，烟草亮黄培养基)细胞培养基中表达并从细胞外培养基中收获。所述DNA酶I通常含有氨基酸序列的混合物，其中大多数具有SEQ ID NO：1，小部分具有SEQ ID NO：2。
BY2悬浮培养基与根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株共培养48小时，所述根癌土壤杆菌携带含有DNA酶I基因的载体和新霉素磷酸转移酶(NPTII)的选择基因。
随后，将细胞保持在补充有50毫克/升卡那霉素(kanamycin)和250毫克/升头孢噻肟(cefotaxime)的培养基中。NPTII基因赋予对卡那霉素的抗性，因此只有NPTII阳性BY2细胞在所述选择培养基中存活。头孢噻肟用于选择性杀死农杆菌，所述植物细胞对所述抗生素具有抗性。一旦建立了良好生长的转基因细胞悬浮液，其被用于筛选和分离单个细胞系。为了允许选择单个细胞系，将高度稀释的细胞悬浮液的等分试样(aliquiots)铺在固体BY2培养基上。然后细胞生长直到小的愈伤组织(calli)发育。随后将每个愈伤组织重新悬浮在液体培养基中。之后对培养基进行取样并评估DNA酶I浓度。然后进一步重新分析分泌DNA酶I浓度相对高的品系，并将DNA酶I浓度进行比较，以选择最终候选的DNA酶I表达品系。
收集表达人类DNA酶I蛋白的转化的BY2细胞的培养基样品，并且当需要时，通过离心过滤器(Amicon Ultra，10K，#UFC501096)浓缩5倍。DNA酶I在细胞培养基中的催化活性通过DNA甲基绿分析测定，并与总DNA酶I量进行比较，通过酶联免疫吸附分析(Enzyme-linkedimmunosorbent assay)测定总DNA酶I量。
从烟草悬浮植物细胞分泌的重组人类DNA酶-I蛋白通过以下步骤纯化：在发酵结束时，使用100目(mesh)过滤袋通过过滤将完整的烟草细胞与培养基分离。丢弃细胞，并使用压滤装置收集含有DNA酶I的培养基，用0.2微米过滤片进一步过滤。所述被过滤的培养基中的DNA酶通过以下两个步骤进一步纯化，先通过阴离子交换树脂(Poros 50HQ，AppliedBiosystems，USA)的层析柱，然后进行苯基650C树脂(Phenyl 650C resin，Toyopearl，Japan)的疏水相互作用层析。从最后一层析柱收集的纯化DNA酶经0.2微米过滤并在4℃下储存
囊性纤维化痰液收集、储存和样品处理：
从患有严重囊性纤维化(CF)肺部疾病的患者中收集痰液样品，所述患者在以色列Schneider儿童医学中心的肺和囊性纤维化单位或Carmel医疗中心(以色列)的囊性纤维化中心接受治疗。将痰液直接排放到无菌密封的容器中，并在冰上运输到用于流变学表征(rheological characterization)的设施。将唾液去除，并将每个痰样品轻轻地匀质化，并分成200至300毫克等分试样(aliquots)，并储存在-70℃直到分析。冷冻样品在室温下解冻，然后分析。痰液样品的冷冻，随后进行单次解冻步骤，其已被证明可以提供痰液流变学的准确和可重复的分析，类似于冷冻前的新鲜样品。
为了确保痰液不含外源DNA酶I活性(例如用于治疗的DNA酶)，优选地在最近使用DNA酶治疗后12至24小时收集痰液样品。据报道，吸入气溶胶DNA酶I在两个小时内从患者的痰液中清除。
等电聚焦(Isoelectric Focusing)
使用装有Powerpac电源(BIO-RAD)的XCell SureLock电泳池进行等电聚焦(IEF)分析。从Invitrogen公司购得预成型(pre-cast)的聚丙烯酰胺IEF胶体，pH范围为3至7或3至10、阳极缓冲液、阴极缓冲液和样品缓冲液的。从SERVA公司购得pI蛋白标准品。电泳条件如下：1小时100mV、1小时200mV、1.5小时500mV。可根据制造商的说明书以Bio-SafeTMCoomassie Stain(Bio-Rad)来显示条带。
SDS-PAGE：
在SDS-PAGE上分析DNA酶I和DNA酶变体。根据制造商的说明书，通过Coomassie亮蓝染色(Bio-Rad)实现蛋白质的检测。
DNA酶活性测定：
通过甲基绿酶活性分析评估DNA酶I和修饰的DNA酶I的活性，使用与甲基绿复合的鲑鱼睾丸DNA作为基质。染料甲基绿插入双链DNA的堆叠碱基之间。一旦长DNA分子由于DNA酶I活性而被水解成四核苷酸，就会发生甲基绿从DNA的解离，在第二次非酵素反应中，游离甲基绿进行脱色(可能由染料的互变异构体所引起)。通过对制剂缓冲液(150毫摩尔NaCl，1毫摩尔CaCl2，pH 6.1至6.5)进行透析，以纯化DNA酶I变体。
通过在活性缓冲液(25毫摩尔HEPES-NaOH、4毫摩尔CaCl2，4毫摩尔MgCl2、0.1％牛血清白蛋白、0.05％TWEEN-20、pH 7.5)中稀释经纯化的标准植物重组人类DNA酶I(未修饰)，来制备标准曲线，浓度范围为0.3至20纳克/毫升，在2倍系列稀释下。样品和对照品以类似方式制备。将100微升标准品、对照品和样品重复加入到含有100微升的DNA-甲基绿基质的96孔板(NUNC)中，并将内容物充分混合。然后将板在37℃温育过夜，之后在620nm的波长处测量吸光度。以吸光度相对于标准浓度进行绘图，数据通过Marquardt的非线性回归方法拟合为4参数对数模型。
DNA酶动力学测定：
使用DNA超色度分析(hyperchromicity assay)测定DNA酶I和修饰的DNA酶I的动力学，当DNA降解时，测量在260nm处的吸光度的增加。酵素反应在25毫摩尔HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)缓冲液(pH 7.5)中进行，其含有4毫摩尔CaCl2、4毫摩尔MgCl2、0.1％w/v牛血清白蛋白(BSA)和0.05％w/v TWEEN 20，在30℃下进行约40分钟。
在一些实验中，将90微升的鲑鱼精子DNA加入到UV-STAR 96孔微孔板(Greiner)中。在30℃下预温育5分钟后，将10微升稀释的酶迅速加入每个孔中，随后以1分钟间隔收集实时光密度(real-time optical density,OD)数据(260nm)在30℃下进行20分钟。鲑鱼精子DNA的浓度在23.2和289微克/毫升之间。每个反应混合物中酶的最终浓度为100纳克/毫升。
在其他实验中，将鲑鱼精子DNA在30℃下预孵育时间提高到15分钟，并在30℃下以40秒间隔收集实时OD数据(260nm)进行40分钟。使用浓度范围为10至240微克/毫升的鲑鱼精子DNA和14纳克/毫升的各反应混合物中酵素的最终浓度来分析未修饰的DNA酶I的动力学，而使用浓度范围为1.6至38.8微克/毫升的鲑精子DNA和2.5纳克/毫升各反应混合物中酵素的最终浓度来分析EDA修饰的DNA酶I的动力学。
测定以下常数：
最大速度(Vmax)-速度(V)表示由一酵素所催化的每单位(分钟)时间的吸光度(OD)增加率。
米氏常数(KM)-酵素的特征值，由达到最大速度的一半(Vmax/2)所需的基质浓度所定义。所述值表示酵素基质(enzyme substrate，ES)复合物的解离常数(对基质的亲和力)。
比活度(specific activity，kcat)-一效力的量度，定义为每纳克蛋白质的最大速度。
催化效率(kcat/KM)-比活度与米氏常数的比值。
初始速度与基质浓度的关系图可以使用Michaelis-Menten方程来撷取KM和Vmax值。
比活性是在分析中(Vmax/纳克DNA酶)每纳克蛋白质的Vmax([E])，并且催化效率是从所获得的米氏常数和比活性值所计算出。
通过肌动蛋白分析DNA酶抑制：
在对感染反应的期间将其引入呼吸道后，来自囊性纤维化(CF)患者的痰液含有大量DNA(3至14毫克/毫升)和由坏死的中性粒细胞(necrosing neutrophils)所释放的肌动蛋白(0.06至5毫克/毫升)。除了水解DNA之外，DNA酶I可将丝状肌动蛋白(filamentousactin，F-肌动蛋白，F-acin)解聚(depolymering)为单体肌动蛋白(monomeric actin，G-肌动蛋白，G-actin)。单体球状肌动蛋白(monomeric globular actin，G-actin)是DNA酶I酵素活性的有效抑制剂(Ki 1纳摩尔浓度)，可能影响吸入至囊性纤维化患者肺部的DNA酶I的有效性。
为了评估G-肌动蛋白对DNA酶I活性和修饰的DNA酶I活性的抑制作用，开发了IC50分析(一半的最大抑制浓度)，在高浓度人类非肌肉肌动蛋白存在下，使用上述甲基绿酶活性分析。
将10微升的人类非肌肉肌动蛋白和90微升的100纳克/毫升的DNA酶I置于含有100微升DNA-甲基绿基质的96孔板(NUNC)中，得到最终的DNA酶I浓度为45纳克/毫升。在上述甲基绿分析活性缓冲液中，通过2倍系列稀释来液稀释人类非肌肉肌动蛋白至浓度范围为50至0.05微克/毫升，其进一步含有0.1微摩尔浓度ATP(三磷酸腺苷)。然后将各个孔板的内容物充分混合，在620nm的波长读取孔板，密封并在37℃下温育4小时，然后再次在620nm的波长读取。以吸光度(OD620nm)相对于肌动蛋白浓度的变化进行作图，并通过使用GraFit软件(Erithacus Software，UK)的非线性拟合来计算IC50参数。
在一些实验中，对于含有上述浓度的肌动蛋白但不含DNA酶的对照样品，也测定了吸光度变化。然后以不含DNA酶的对照样品的吸光度(OD620nm)变化减去具有各肌动蛋白浓度的含DNA酶的样品的吸光度变化，以除去背景信号，从而获得反映DNA酶活性的一信号，并表达为％DNA酶活性，以不存在肌动蛋白下将DNA酶活性定义为100％DNA酶活性。
测定痰液中的DNA酶活性：
将痰液等分试样(aliquot)在37℃的温度下与制剂缓冲液(150毫摩尔NaCl，1毫摩尔CaCl2，pH 6.1至6.5)温育30分钟，所述制剂缓冲液以指定的最终浓度含有植物重组人类DNA酶I(PRX-110)、DNA酶或依照本文所述制备的修饰的DNA酶I。单独用DNA酶I制剂缓冲液处理对照样品。将DNA酶样品或对照的4％(体积/重量)加入到痰液样品中。温育后，立即测量痰液样品的流变性能(rheological properties)，如本文所述。
痰液流变学测量：
粘液和痰液的物理行为是复杂的(非牛顿型)，具有高度可变的性质，它们在粘性液体和弹性固体之间。粘液的物理性质的表征主要集中在两个性质：(i)粘度模量，也称为剪切损耗模量(G“)，其反映胶体抵抗流动趋势的程度，和(ii)弹性模量，也被称为剪切储能模量(G')，其反映了胶体在应力诱导变形后恢复其原始形状的趋势。损耗角正切(G“/G')和相位角(δ等于G/G'的反正切)反映了样品的总体弹性或粘性，其中损耗角正切或相位角接近于零表示强烈弹性(固体样)行为，而90°的相位角表示纯粘性(液体样)行为。
使用受应力流变仪(stress rheometer，Thermo Fisher Scientific GmbH)控制的HAAKETM RheoStressTM 1测定痰液样品的流变性能(rheological properties)。在20℃的温度下使用间隙宽度为0.5厘米的20厘米喷砂平行板几何形状(sandblasted parallelplate geometry)进行应力扫描测量。在测量之前，将痰液样品(200微升)加载到流变仪板(rheometer plate)上并进行平衡30秒，以允许原始胶体结构松弛。为了减缓痰液的脱水，使用溶剂阱(solvent trap)。以1Hz的恒定频率，从0.1至100Pa进行应力扫描，测定弹性模量(G')，粘度模量(G”)和相位角(δ)。使用HAAKE1RheoWin14软件((Thermo FisherScientific GmbH)测定流变参数。G’和G”交叉时所施加的应力，即相位角达到45°时，是样品开始变得较为液体样的应力，多于固体样。此时记录应力值并比较DNA酶I样品。一般来说，为了从主要是弹性的固体状态过渡到主要是粘稠的液体状态，所必须施加于痰液的应力程度代表为痰液最初的固体样程度。必要应力程度的减少代表为痰液的弹性结构受到破坏。对从各痰样品中取出的至少两个痰液分液进行实验，并将获得的数据平均。
痰液中总DNA含量测定：
使用Quant-iTTM高灵敏度DNA分析套件(Invitrogen)测定痰液中DNA含量。将鲑鱼精子DNA和痰液样品(约50毫克)在一溶解缓冲液(25毫摩尔浓度的HEPES-NaOH、0.05％聚山梨酯(TWEEN 20)、5毫摩尔浓度的EGTA，1％十二烷基硫酸钠，pH7.5)中稀释10倍，在60℃的温度下搅拌1小时。将样品重复剧烈摇晃(vortex)以使痰液分解。然后使用NanoDropTM 2000分光光度计(spectrophotometer，Thermo Fisher Scientific)测量稀释的鲑鱼精子样品的DNA浓度，并且通过2倍系列稀释以溶解缓冲液稀释鲑鱼精子样品至4.22至270纳克/毫升的浓度范围，来绘制标准曲线。类似地，通过3倍系列稀释将痰液样品进一步稀释至300倍至8100倍。然后将分析部件平衡至室温，并通过在Quant-iTTM dsDNA HS缓冲液中以1：200稀释Quant-iTTM dsDNA HS试剂，来制备一工作溶液。将5微升的标准品和样品一式两份加入到黑色96孔孔板(Greiner)中，并与100微升工作溶液一起温育。通过荧光计测量波长为502nm激发(excitation)和523nm发射(emission)的波长的荧光。以荧光单位与标准DNA浓度的关系进行作图，并通过Marquardt的非线性回归方法将数据拟合为4参数对数模型。然后通过插值法(interpolation)确定痰液中的DNA浓度。
痰液中DNA片段化的评估：
使用胶体电泳评估痰液中DNA酶介导的DNA片段。将痰液样品(约50毫克)在溶解缓冲液(25毫摩尔浓度的HEPES-NaOH、0.05％聚山梨酯(TWEEN20)、5毫摩尔浓度的EGTA，1％十二烷基硫酸钠，pH7.5)中稀释10倍，并在60℃下温育1小时。将样品重复剧烈摇晃(vertex)以使痰液分解。然后将各样品中的20微升
加入6微升的6倍DNA装载染料(Thermo Fisher Scientific)中，并使用溴化乙锭(ethidium bromide)在0.8％琼脂糖胶体(agarose gel)上分离，以标记DNA及其相对量。使用Lambda DNA/HindIII ladder(Thermo Fisher Scientific)作为大小标记。
粒径排阻色谱法(Size exclusion chromatography，SEC)：
在TSK GEL 2000管柱上执行HPLC持续50分钟，使用10毫摩尔浓度Tris、100毫摩尔浓度NaCl和1毫摩尔浓度EDTA的一缓冲液(pH7.4)，通过天然粒径排阻色谱法定量DNA酶I的高分子量物质(high molecular weight species，HMMS)的量。HMMS的典型滞留时间为约11分钟、二聚体为14分钟、单体为16分钟。
质谱法：
使用基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight，MALDI-ToF)质谱仪，以芥子酸(sinapinic acid)为基质，测定DNA酶I蛋白的平均分子量。使用标准校准设备，并将约2.5微克DNA酶I用于质量分析。MALDI是一种软电离技术(soft ionization technique)，允许分析生物聚合物，如蛋白质，当其通过更常规的电离方法进行离子化时，易于破碎及断裂。修饰和未修饰的DNA酶I进行相似的分析。将样品与基质混合，然后在可重复使用的MALDI板上点样。电离由激光束(通常为氮激光器)触发，并且使用线性模式法(inear mode)测定带有单正电荷单体的m/z值。
实施例1
DNA酶I与二胺改性的羧基
浓度为1毫克/毫升的DNA酶I与大量过量(50至5,000摩尔当量)的二胺(diamine)在pH为5至6的范围内反应。使用25至100摩尔当量的碳二亚胺-EDC(carbodiimide–EDC)(如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、二异丙基碳二亚胺，di-isopropylcarbodiimide或二叔丁基碳二亚胺di-t-butylcarbodiimide)来实现DNA酶羧基的活化。
使用上述一般方法，使用六亚甲基二胺(hexamethylene diamine，HMD)或乙二胺(ethylene diamine，EDA)作为二胺，来制备修饰的DNA酶(本文称为“Y24”)。将227微升的DNA酶(2.2毫克/毫升，0.5毫克)溶液在具有CaCl2(0.15毫克/毫升)和NaCl(8.77毫克/毫升)pH为6的一制剂缓冲液中与0.1摩尔浓度pH为5的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)缓冲液混和，然后在MES缓冲液(pH值为5)中加入7,680当量的EDA(75微升的1.7摩尔浓度的EDA)或9,400当量的HMD(230微升的0.7摩尔繷度)以及25、50或100当量的EDC(52毫摩尔浓度于DMSO)，以及2550或100当量的EDC(52毫摩尔，在DMSO中)，得到1毫克/毫升的最终DNA酶I浓度。由此制备以下样品：
Y24(1)：
将DNA酶溶液加入到193微升的MES缓冲液中，并且加入75微升EDA溶液和25当量的EDC(7微升EDC于DMSO溶液中)。
Y24(2)：
将DNA酶溶液加入到185微升的MES缓冲液中，并且加入75微升EDA溶液和25当量的EDC(15微升EDC于DMSO溶液中)。
Y24(3)：
将DNA酶溶液加入到170微升的MES缓冲液中，并且加入75微升EDA溶液和100当量的EDC(30微升EDC于DMSO溶液中)。
Y24(4)：
将DNA酶溶液加入到38微升的MES缓冲液中，并且加入230微升EDA溶液和25当量的EDC(7微升EDC于DMSO溶液中)。
Y24(5)：
将DNA酶溶液加入到30微升的MES缓冲液中，并且加入230微升EDA溶液和50当量的EDC(15微升EDC于DMSO溶液中)。
Y24(6)：
将DNA酶溶液加入到15微升的MES缓冲液中，并且加入230微升EDA溶液和100当量的EDC(15微升EDC于DMSO溶液中)。
将反应混合物在室温下振荡2小时。然后使用VivaspinTM离心浓缩器(10,000Da分子量截留)将反应混合物透析成制剂缓冲液。
使用二胺形成酰胺导致带正电荷的胺基取代带负电荷的羧基(通过酰胺键共轭)。使用等电聚焦(IEF)于3至10的pH范围内，检测电荷的此修饰。
如图1所示，当使用100当量的EDC(第3和6行)时，DNA酶I完全被二胺(EDA于第1至3行、HMD于第4至6行)酰胺化，但当使用25当量(第1和4行)或50当量(第2和5行)的EDC，却无法完全酰胺化，如通过IEF分析所测定。
为了评估EDA和HMD修饰DNA酶I对酵素活性的影响，使用如上文的“材料和方法”段落中所述的甲基绿测定评估样品Y24(2)、Y24(3)、Y24(5)和Y24(6)(如上文所述)中修饰DNA酶的DNA酶活性。通过甲基绿分析测定DNA酶的浓度，使用DNA酶修饰不影响活性的初步假设，并与测量光密度所决定的DNA酶浓度进行比较。
如图2所示，对于大多数二胺修饰的(diamine-modified)的DNA酶I样品，测量DNA酶活性所决定的DNA酶浓度和测量光密度所决定的DNA酶浓度相似，从而表明所述修饰基本上不影响DNA酶的活性。
然后使用上文“材料和方法”段落中描述的程序，测定肌动蛋白对样品Y24(2)、Y24(3)和Y24(6)(上述)中二胺修饰的DNA酶I的酵素活性的影响。
与未修饰的DNA酶I相比，肌动蛋白对二胺修饰的DNA酶I的抑制作用明显较低。肌动蛋白抑制未修饰型肌动蛋白IC50约为0.75微克/毫升(0.777±0.025微克/毫升)，而对于EDA修饰的或HMD修饰的DNA酶I，不能测量IC50值，因为即使在最高浓度的的肌动蛋白测试(100微克/毫升)下，抑制率也低于80％，在所获得的数据中并且没有观察到S型或高原型态。
这些结果表明，通过DNA酶羧基与二胺进行酰胺化所形成的修饰的DNA酶I对肌动蛋白具有相当大的抗性，而没有任何实质性的酵素活性损失。
实施例2
具有烷基胺修饰的(alkylamine-modified)羧基的DNA酶I
为了确定使用简单的烷基单胺(alkyl monoamine)进行酰胺化对DNA酶I活性的影响，使用丁胺和EDC对DNA酶I进行修饰。
以根据浓度的方式，使用丁胺形成酰胺，用未带电荷的酰胺基取代带负电荷的羧基，如使用等电聚焦所证实(数据未显示)。
此外，如实施例1所述使用甲基绿分析和光密度测量所决定(数据未显示)，通过丁胺的改性对DNA酶I的活性影响相对较小。
实施例3
具有乙醇胺修饰的(ethanolamine-modified)羧基的DNA酶I
为了评估用亲水单胺(hydrophilic monoamine)进行酰胺化对DNA酶I活性的影响，使用乙醇胺和EDC对DNA酶I进行修饰。
将1毫升DNA酶I(4.9毫克/毫升，4.9毫克)的溶液与3.3毫升pH为5的0.1豪摩尔浓度MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)缓冲液混合，然后加入100摩尔当量的EDC(550微升，28豪摩尔浓度的EDC，在DMSO中)。将反应混合物在室温下摇动1小时，然后移除200微升反应混合物作为对照样品。然后在剩余的反应混合物中加入1,000摩尔当量的乙醇胺(9.2微升)。
将反应混合物的pH升提至7.9，然后将反应混合物在室温下再搅拌3小时。移除100微升反应混合物作为额外的对照样品，然后使用VivaspinTM离心浓缩器(3,000Da分子量切割)将剩余的反应混合物透析到DNA酶制剂缓冲液(0.15摩尔浓度NaCl，1豪摩尔浓度CaCl2)中。所获得的乙醇胺修饰的DNA酶在本文中称为“L172”。
使用乙醇胺形成酰胺导致用未带电荷的酰胺基取代带负电荷的羧基。
如图3所示，使用等电聚焦(pH范围3至10)确认乙醇胺对DNA酶I的酰胺化。
为了评估乙醇胺对DNA酶I进行修饰对酵素活性的影响，使用如实施例1所述的甲基绿分析和光密度测量来评估乙醇胺修饰的DNA酶样品的DNA酶活性。
如图4所示，测量DNA酶活性所决定的DNA酶I浓度和测量光密度所决定的DNA酶I浓度相似，从而表明通过乙醇胺的所述修饰基本上不影响DNA酶的活性。
然后使用上文“材料和方法”段落中描述的程序，测定肌动蛋白对乙醇胺修饰的DNA酶I的酵素活性的影响。
如图5所示，与未修饰的DNA酶I相比，肌动蛋白对乙醇胺修饰的DNA酶I的抑制作用明显较低。通过肌动蛋白抑制未修饰的DNA酶I的IC50约为0.75微克/毫升，而无法测量乙醇胺修饰的DNA酶I的IC50值，即使在最高的肌动蛋白浓度(50微克/毫升)下，抑制也不超过约20％。
根据上文“材料和方法”段落中描述的程序，在温育30分钟下，测定DNA酶对囊性纤维化患者的痰液样品流变性的影响。
如图6和图7所示，乙醇胺修饰的DNA酶I(浓度为0.05或0.2微克/毫升)比未修饰的DNA酶I(PRX-110，图6和7)和DNA酶(图7)更有效率地降低囊性纤维化患者痰液的粘度。
这些结果表明，使用单胺(如乙醇胺)的酰胺化显著增强了DNA酶I在肌动蛋白存在下降解DNA的能力，并降低了痰液的粘度。
实施例4
具有氨或Tris单胺修饰的(ammonia or Tris monoamine-modified)羧基的DNA酶I
为了进一步评估使用亲水性单胺进行酰胺化对DNA酶I活性的影响，使用氨或三(羟甲基)氨基甲烷)(Tris(tris(hydroxymethyl)aminomethane))和EDC修饰DNA酶I。
将1毫升DNA酶I(4.9毫克/毫升，4.9毫克)的溶液与3.2毫升具有pH为5的0.1摩尔浓度单胺缓冲液混合，然后加入100摩尔当量的EDC(800微升的20毫摩尔浓度EDC，于DMSO溶液中)。将反应混合物在室温下摇动1小时，然后移除250微升反应混合物作为对照样品。将剩余的反应混合物的pH提升至约8，然后将反应混合物在室温下再搅拌3小时。移除100微升反应混合物作为额外的对照样品，然后使用VivaspinTM离心浓缩器(3,000Da分子量切割)将剩余的反应混合物透析到DNA酶制剂缓冲液(0.15摩尔浓度NaCl，1豪摩尔浓度CaCl2)中。
使用上述通用方法，使用Tris缓冲液制备Tris-修饰的DNA酶(本文称为“L171(1)”)，并且使用氯化铵缓冲液制备氨修饰的DNA酶(本文称为“L171(2)”)。
使用Tris或氨形成酰胺，导致未带电荷的酰胺基取代带负电荷的羧基。
如图8所示，使用等电聚焦(在3至10的pH范围内)确认由Tris和氨基乙醇胺对DNA酶I的酰胺化。
如其中进一步所示，在对照组中酰胺化更广泛，其中在1小时后pH并未从约5调整至约8，从而表明在DNA酶上额外的羧酸酯基团在pH 5下继续发生酰胺化。
为了评估通过Tris或氨修饰DNA酶I对酵素活性的影响，使用如实施例1所述的甲基绿分析和光密度测量来评估修饰的DNA酶样品的DNA酶活性。
如图9所示，测量DNA酶活性所决定的DNA酶I浓度和测量光密度所决定的DNA酶I浓度相似，从而表明通过Tris或氨的所述修饰影响DNA酶的活性很小或不影响。
然后使用上文“材料和方法”段落中描述的程序，测定肌动蛋白对修饰的DNA酶I的酵素活性的影响。
如图10所示，与未修饰的DNA酶I相比，Tris修饰的DNA酶I和氨修饰的DNA酶I皆对肌动蛋白的抑制不敏感。肌动蛋白抑制未修饰的DNA酶I的IC50约为0.75微克/毫升，而无法测量Tris-修饰的DNA酶I、氨修饰的DNA酶I或乙醇胺修饰的DNA酶I的IC50值，即使在最高的肌动蛋白浓度(50微克/毫升)下，抑制也不超过约20％。
这些结果表明，任何一种单胺的酰胺化显著增强了DNA酶I在肌动蛋白存在下降解DNA的能力。
通过用Tris修饰所获得的肌动蛋白抑制抗性的DNA酶I(本文称为“AIR DNA酶”)的DNA酶活性的动力学进一步与未修饰的植物重组人类DNA酶I进行比较，通过测量在23.2和289微克/毫升之间的不同DNA浓度的DNA水解速率(根据超色度测定，hyperchromicity)，如在“材料和方法”段落所述。
如图11所示，Tris(单胺)修饰的AIR DNA酶显示与未修饰的DNA酶I相似的动力学，Tris修饰的AIR DNA酶的KM为53.1±8.2微克/毫升，而未修饰的DNA酶I的KM为82.0±6.1微克/毫升。AIR DNA酶的Vmax为每分钟0.0249±0.0012个光密度单位，而未修饰的DNA酶的Vmax为每分钟0.0296±0.0008次光密度单位。
这些结果表明，AIR DNA酶的动力学性质(如Vmax，KM)本质上不受Tris对DNA酶的修饰所影响。
为了研究影响DNA酶I修饰的因素，对上文L171(1)所述的方法进行轻微修饰。初步结果表明，通过除去反应物(例如通过缓冲液交换)终止反应比通过增加pH值终止反应导致较少的聚集(aggregation)；pH为5是进行反应的合适的pH；反应基本在2小时后完成；DMSO和MES缓冲液是适用于EDC的溶剂；室温是进行反应的合适温度；与Tris的反应可以在MES缓冲液中进行；而钙的存在轻微地抑制了酰胺化反应，但是减少了二聚化(dimerization)。
实施例5
肌动蛋白抑制抗性修饰DNA酶I对痰液的影响
将痰样品与肌动蛋白抑制抗性的DNA酶I(AIR DNA酶)温育，所述AIR DNA酶如同实施例4中L171(1)所述制备，然后使用在上文中“材料和方法”中描述的程序评估痰液流变学、DNA含量和DNA断裂。在未处理的痰液中以及在与dornase alfa DNA酶I(链道酶，)温育处理过的痰液中所测定的痰液流变学、DNA含量和DNA片的结果进行比较。
如图12A和图12B所示，每克痰液中的2微克AIR DNA酶几乎消除了痰液中的所有DNA，并且甚至比每克痰液中的2微克dornase alfa DNA酶更有效率地减少痰液中DNA含量。
如图13所示，每毫升痰液中的2微克AIR DNA酶
比每克痰液中的2微克甚至5微克的dornase alfa DNA酶显著地更有效率地破坏痰液的弹性结构。
然后来自各种囊性纤维化患者的额外痰液样品中评估DNA片段化和痰液流变性质，如图14至图16D所示。对于6名患者，样品够大足以将AIR DNA酶的影响与植物重组人类DNA酶和dornase alfa DNA酶I进行比较，并且这些样品的结果总结于图17中。
如图14所示，大多数痰液样品中，每克痰液2微克AIR DNA酶比每克痰液2微克植物重组人类DNA酶I显著地更有效率地减少痰液中DNA含量。
如图15所示，每毫升2微克的AIR DNA酶消除了来自3个不同患者的痰液样品中几乎所有DNA，并且甚至比dornase alfa DNA酶显著地更有效率地降低每个患者的痰液中DNA含量。
如图16A至图16D所示，在每克痰液20、2、0.2和0.05微克AIR DNA酶的浓度下，在破坏痰液弹性结构方面，比相同浓度的dornase alfa DNA酶I通常更显著有效。
类似地如图17所示，AIR DNA酶在破坏痰液弹性结构方面，比植物重组人类DNA酶I(PRX-110)或dornase alfa DNA酶I平均更显著有效。
这些结果表明，AIR DNA酶对肌动蛋白抑制抗性与增强的DNA断裂和增强的痰弹性结构破坏有关。
实施例6
不同碳二亚胺(carbodiimides)对DNA酶I羧基修饰的影响
除了使用DIC(二异丙基碳二亚胺，diisopropylcarbodiimide)、DTC(二叔丁基碳二亚胺，di-t-butylcarbodiimide)或CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸盐N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)代替EDC，如上文所述由Tris进行DNA酶I的羧基修饰。
最终反应混合物含有1毫克/毫升DNA酶I，25或50摩尔当量的DIC或CMC，或50或100摩尔当量的DTC，100摩尔当量的Tris和100毫摩尔浓度MES作为缓冲液(pH 5)；并在室温下持续反应2.5小时。
如图18所示，在修饰DNA酶I时，使用CMC导致比DTC和DIC的等电点变化更大。
如图19所示，通过SDS-PAGE测定，与使用DIC相比，使用CMC还导致除单体DNA酶I(低分子量物质以及高分子量物质)以外的物质的量减少。
这些结果表明CMC在酰胺化DNA酶I羧酸时比DIC和DTC更有效。
此外，使用两家供应商(Sigma和Molekula)的CMC，并对结果进行了比较。当使用不同供应商的CMC时，没有观察到显著差异。
实施例7
缓冲液对DNA酶I羧基修饰的影响
如实施例6所述，使用CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)和MES缓冲液，以不同的MES浓度通过Tris对DNA酶I进行羧基修饰，以评估缓冲液浓度对酰胺化反应的影响。
最终反应混合物含有2毫克/毫升DNA酶I、75摩尔当量的CMC、100摩尔当量的Tris和20、60、100或200毫摩尔浓度MES作为缓冲液(pH 5)；并在室温下持续反应2.5小时。
通过等电聚焦、胶体电泳(SDS-PAGE)、粒径排阻色谱法和酵素活性(使用甲基绿)和肌动蛋白抑制的分析，在所测定的浓度范围内，缓冲液浓度对所得产物并未显示任何显著影响。
这些结果表明低缓冲液浓度适用于DNA酶I的修饰，如20和15毫摩尔浓度MES缓冲液。
另外，为了评估pH对酰胺化反应的影响，使用如上所述的CMC进行DNA酶I的羧基修饰，于pH为4、4.5、5、5.5或6之下。
最终反应混合物在指定的pH值下含有1毫克/毫升DNA酶I、35摩尔当量的CMC、100摩尔当量的Tris和100毫莫尔浓度MES作为缓冲液；并在室温下持续反应2.5小时。
如图20所示，在4.5至5.5的pH范围内的酰胺化比在pH为4或6时的酰胺所导致的等电点变化更大。
如图21所示，在任何测试的pH条件下，酰胺化并未导致DNA酶I的分子量显著变化，表明无高分子量物质(例如二聚体(dimer)、多聚体(polymer)或聚集体(aggregates))或低分子量物质(例如分解产物)大量形成。
这些结果表明，高于4但小于6的pH值对于酰胺化反应特别有效。
实施例8
反应温度对DNA酶I羧基修饰的影响
在不同的反应温度下，使用CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)，如上所述通过乙二胺(EDA)进行DNA酶I的羧基修饰，以评估反应温度对酰胺化反应的影响。
用300微升MES缓冲液(100毫摩尔浓度，pH5)和300微升水稀释4毫克DNA酶(5.4毫克/毫升，740微升)。将33.2毫克(2000当量)的乙二胺二盐酸盐(ethylene diaminedihydrochloride)于600微升水中加入，将反应混合物分成4等份，将其在不同温度下摇动。
最终反应混合物含有2毫克/毫升DNA酶I、60摩尔当量的CMC、2000摩尔当量的EDA、2毫莫尔浓度CaCl2和15毫莫尔浓度MES作为缓冲液(pH为5)；并在12℃、16℃、20℃或25℃下持续反应2.5小时。
通过在迷你捕获管柱上(mini-trap column)进行纯化以终止反应；以150毫莫尔浓度NaCl和1毫莫尔浓度CaCl2稀释蛋白质。
如图22所示，在20至25℃下，反应后未观察到未修饰的DNA酶。
实施例9
反应时间对DNA酶I羧基修饰的影响
使用不同的反应时间，如实施例8所述通过乙烯二胺(EDA)进行DNA酶I的羧基修饰，以评估反应时间对酰胺化反应的影响。
最终反应混合物含有2毫克/毫升DNA酶I，60摩尔当量的CMC、2000摩尔当量的EDA，2毫莫尔浓度CaCl2和15毫莫尔浓度MES作为缓冲液(pH为5)；并在室温下持续反应1、1.5、1.5、2或2.5小时。
如图23所示，在大约2小时后反应完成，通过反应2小时与2.5小时获得的产物的等电点之间没有显著差异。
实施例10
胺过量对DNA酶I羧基修饰的影响
使用不同浓度的EDA，如实施例8所述通过乙烯二胺(EDA)进行DNA酶I的羧基修饰，以评估胺反应物浓度对酰胺化反应的影响。
最终反应混合物含有2毫克/毫升DNA酶I，75摩尔当量的CMC、100、500、1000、2000、4000或6,000摩尔当量的EDA和15毫莫尔浓度MES作为缓冲液(pH为5)；并在室温下持续反应2.5小时。根据本文所述的方法，获得的修饰的DNA酶I通过粒径排阻色谱法和等电聚焦来表征。
如下表1和图24所示，通过粒径排阻色谱法测定，较高比例的EDA导致较低浓度的高分子量物质和二聚体物质。如其中进一步所示，EDA比例的上述效果是在100至2000当量EDA的相对EDA浓度下最强，在2000至6000EDA的当量范围内则没有显著差异。
类似地，如图24所示，500当量或更高的相对EDA浓度比100当量的EDA导致更大程度的酰胺化，如通过等电聚焦所测定。
这些结果表明，使用超过1000当量的EDA来修饰DNA酶I是有利的，因为二聚体和高分子量物质的比例降低(并且酰胺化效率增加)，但是使用4,000当量的EDA是不是特别有利，因为可能需要除去比使用2000当量EDA更大量的EDA，而不会在修饰的DNA酶I的性质上提供任何显著的优点。
表1：与100至6,000当量的乙二胺(EDA)反应时修饰的DNA酶I单体、二聚体和高分子量物质(HMW)的量
实施例11
碳二亚胺(carbodiimide)和钙浓度对DNA酶I羧基修饰的影响
使用不同浓度的CMC，如实施例8所述以乙酰胺(EDA)进行DNA酶I的的羧基修饰，以评估碳二亚胺试剂浓度对酰胺化反应的影响。在存在或不存在2毫摩尔浓度钙离子的情况下进一步进行反应，以评估钙离子对酰胺化反应的影响。
最终反应混合物含有2毫克/毫升DNA酶I，35、45、55或65摩尔当量的CMC、2000摩尔当量的EDA，0或2毫莫尔浓度钙离子和15毫莫尔浓度MES作为缓冲液(pH为5)；并在室温下持续反应2.5小时。根据本文所述的方法，获得的修饰的DNA酶I通过粒径排阻色谱法和等电聚焦来表征。
如图25所示，使用的CMC的量与DNA酶I在酰胺化时等电点改变的程度相关，表明更大量的CMC导致DNA酶I上更多羧酸位点的酰胺化。
所述结果表明，相对高量的CMC有利地增强DNA酶I的修饰程度，例如65当量的CMC，从而增强对肌动蛋白抑制的抗性。
如图26进一步所示，通过等电聚焦测定，修饰的DNA酶I的性质不受钙离子的存在或不存在显著影响。
所述结果表明，为了提高蛋白质的稳定性，酰胺化反应中可以包括2毫摩尔的钙，而没有任何明显的不良影响。
实施例12
通过用二胺(diamine)修饰所制备的示例性肌动蛋白抑制抗性DNA酶I
如实施例8所述，使用60摩尔当量的CMC和2000摩尔当量的EDA，在20至25℃的温度下，以乙二胺(EDA)进行DNA酶I的羧基修饰。
将通过EDA修饰所获得的EDA修饰的(EDA-modified)DNA酶I对肌动蛋白抑制的敏感性与与未修饰的DNA酶I的敏感性进行比较。
如图26所示，与DNA酶I相比，EDA修饰的DNA酶I不太容易受到肌动蛋白的抑制。肌动蛋白抑制DNA酶I的IC50为0.23微克/毫升，DNA酶I的活性在肌动蛋白浓度高于10微克/毫升时被完全消除，而EDA修饰的DNA酶I的抑制即使在最高肌动蛋白浓度的测试(50微克/毫升)下也不超过约13％，而在肌动蛋白浓度约为2微克/毫升或更低时小于10％。图26中所描绘在高肌动蛋白浓度下Pulmozyme酶I的约30％的基线，不代表实际的DNA酶活性，并且是从OD中计算活性而不减去空白OD值的结果。
实施例13
碳二亚胺(carbodiimide)过量对修饰DNA酶I的肌动蛋白抗性的影响
通过使用不同浓度的DIC和EDC，如实施例6所述进行DNA酶I的羧基修饰，以评估碳二亚胺试剂浓度对所得的修饰的DNA酶I的酵素性质的影响。
最终反应混合物含有11毫克/毫升DNA酶I，25或50摩尔当量的DIC或EDC和0.1MTris(pH 5)；并在室温下持续反应2.5小时。根据本文所述的方法，获得的修饰的DNA酶I通过等电聚焦和通过测定肌动蛋白对DNA酶的抑制来表征。
如图27所示，与25当量的碳二亚胺相比，DNA酶I与50当量的碳二亚胺(DIC或EDC)进行酰胺化时等电点变化较大，表明较大量的碳二亚胺导致DNA酶I上更多羧酸位点的酰胺化，证实了实施例11中所述的使用CMC所获得的结果。如其中进一步所示，使用EDC比使用相应量的DIC导致更大程度的酰胺化。
如图28所示，与25当量的碳二亚胺相比，通过与50当量的碳二亚胺(DIC或EDC)酰胺化，DNA酶I活性对肌动蛋白抑制的抗性更高。如其中进一步所示，使用EDC比使用相应量的DIC导致更高程度的对肌动蛋的抗性。如其中进一步显示的，未修饰植物重组人DNA酶I的肌动蛋白抑制的IC50为0.4微克/毫升，而各修饰的DNA酶I的IC50无法计算，因为即使最高肌动蛋白浓度测试下(50微克/毫升)仍有相当的活性。
这些结果表明，肌动蛋白抗性的程度与通过酰胺化修饰的DNA酶I中的羧酸位点的数量相关，并且这取决于反应条件，包括所用碳二亚胺试剂的量和类型。
使用以下反应混合物和条件以Tris进一步进行DNA酶I的羧基修饰：
(1)最终反应混合物含有约1毫克/毫升DNA酶I、100摩尔当量的EDC和0.1毫摩尔浓度Tris(pH 5)；其中反应在室温下持续1小时；
(2)最终反应混合物含有约1毫克/毫升DNA酶I、25摩尔当量的EDC(其逐滴加入)、100摩尔当量的Tris和100毫摩尔浓度MES缓冲液(pH 5)；其中反应在室温下持续2.5小时，并使用1毫摩尔浓度CaCl2和150毫摩尔浓度NaCl的溶液进行超滤(ultra-filtrated)；以及
(3)最终反应混合物含有约1毫克/毫升DNA酶、35摩尔当量CMC、100摩尔当量的Tris(其逐滴加入)和100毫摩尔浓度MES缓冲液(pH 5)；其中反应在室温下持续2.5小时，并使用1毫摩尔浓度CaCl2和150毫摩尔浓度NaCl的溶液进行超滤。
所获得的修饰的DNA酶I通过等电聚焦，通过分析肌动蛋白对DNA酶的抑制，并通过测定修饰的DNA酶I对痰液流变学的影响来表征，根据本文所述的程序。
如图29至图31C所示，每个修饰的DNA酶I样品中的酰胺化程度通过等电点增加(图29)所表示，与肌动蛋白的抑制程度(图30)相关，并与痰液样品中弹性结构破坏程度相关(图31A至图31C)，上述DNA酶I用100摩尔当量的EDC和0.1摩尔浓度Tris修饰，表现出最大程度的酰胺化、对肌动蛋白的抗性以痰液结构的破坏。
如图30所示，未修饰植物重组人DNA酶I的肌动蛋白抑制的IC50为0.89微克/毫升，而各修饰的DNA酶I的IC50无法计算，因为即使最高肌动蛋白浓度测试下(50微克/毫升)仍有相当的活性。
使用DNA酶I而不是植物重组人类DNA酶I以Tris进一步进行DNA酶I的羧基修饰。
最终反应混合物含有约1毫克/毫升DNA酶I、25摩尔当量的EDC和100毫摩尔浓度Tris和100毫摩尔浓度MES作为缓冲液(pH 5)。反应在室温下持续2.5小时，并使用1毫摩尔浓度CaCl2和150毫摩尔浓度NaCl的溶液进行超滤(ultra-filtrated)。所获得的修饰的DNA酶I通过等电聚焦，并通过分析肌动蛋白对DNA酶的抑制来表征，根据本文所述的程序。
如图32所示，当与Tris和EDC反应时，DNA酶I的等电点升高，表明哺乳动物重组DNA酶I发生酰胺化。
如图33所示，
DNA酶I的肌动蛋白抑制的IC50为0.19微克/毫升，而各修饰的DNA酶I的IC50无法计算，因为即使最高肌动蛋白浓度测试下(50微克/毫升)仍有相当的活性。
上述结果证实，本文所述通过从各种来源的酰胺化以对DNA酶进行修饰I，导致肌动蛋白抑制抗性(AIR)的DNA酶，并且所述抗性程度与DNA酶I的酰胺化程度相关。
实施例14
较大规模制备肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)
根据上文使用乙二胺(EDA)修饰DNA酶的方法，以更大规模(10至40克蛋白质)制备肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)。将植物重组人类DNA酶I加入到反应溶液中。将偶联剂CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐，N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)溶于水中，加入到含有植物重组人类DNA酶I和乙二胺(EDA)的反应溶液中。使用过量的EDA(EDA：DNA酶I的摩尔比为2000:1)和过量的CMC(CMC:DNA酶I的摩尔比为60:1)进行反应，并在温度在20至25℃范围内进行2小时。使用上述技术所获得的AIR DNA酶的性质与未修饰植物重组人类DNA酶I和/或DNA酶I的性质进行比较。
如图34所示DNA酶I比AIR DNA酶I和未修饰的植物重组人类DNA酶I具有更多的负电荷，如通过等电聚焦所测定。
所述结果表明在哺乳动物重组DNA酶I中存在着哺乳动物特征性的带负电荷的聚醣(glycan)，例如唾液酸(sialic acid)和甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate)。此外，由于蛋白质的修饰减少了带负电荷基团的数量并引入带正电荷的基团，AIR DNA酶I比未修饰的植物重组人类DNA酶I带有更少负电荷。
如图34进一步所示，DNA酶I比未修饰的植物重组人类DNA酶I表现出更异质(heterogeneous)的等电点pH。
所数结果表明DNA酶I包含具有不同糖基化模式的物质于蛋白质上，其特征在于不同量的带电荷的醣基(saccharides，例如带负电荷的唾液酸(sialic acids)和甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate))，而植物重组人类DNA酶未表现出糖基化模式的差异，这与非离子聚醣(non-ionic glycan)的植物重组人类DNA酶中的存在一致，以做为植物糖基化的特征。
如在图35和36中，未修饰的植物重组人类DNA酶I的分子量约为32,200Da(图35)，而AIR DNA酶的分子量为约32,700Da(图36)，如MALDI-ToF质谱所测定。这些结果表明DNA酶I的修饰增加了分子量，表明EDA分子与蛋白质结合。
根据261个氨基酸序列(无糖基化)的未修饰植物重组人类DNA酶I的理论预测分子量为29,311Da。因此上述结果进一步表明聚醣的分子量为约2900Da。
确认通过EDA修饰所获得的AIR DNA酶对肌动蛋白抑制的抗性，并与肌动蛋白存在下未修饰植物重组人类DNA酶I和Pulmozyme DNA酶I的活性进行比较。
如图37所示，即使在所测试的最高肌动蛋白浓度(50微克/毫升)下，AIR DNA酶也显示出对肌肉抑制的抗性，而被肌动蛋白抑制的植物重组人DNA酶I的IC50为0.47微克/毫升，DNA酶I被肌动蛋白抑制的IC50为0.2微克/毫升。
为了评估通过EDA修饰所获得的AIR DNA酶的效力和酵素动力学，AIR DNA酶、未修饰植物重组人类DNA酶I和DNA酶I的最大速度(Vmax)、米氏常数(KM)和比活性(kcat)依照材料和方法部分所述的程序测定，使用1.5至240微克/毫升的DNA浓度范围。
如图38A和图38B以及在下表2中所示，植物重组人DNA酶I比DNA酶I显示出更大的DNA酶活性，无论是在更大的比活性(kcat)方面(表明酵素效力较高)以及较低的米氏常数(KM)方面(表明对DNA的亲和性较高)。
不受任何特定理论的约束，认为与哺乳动物重组DNA酶I相比，植物重组人类DNA酶I的较低的米氏常数与较弱的负电荷有关(例如图34所示)，其使得与带负电荷的DNA具有更大的亲和力。
如图38A和图38B以及在下表2中所示，EDA修饰的AIR DNA酶的比活性(kcat)与未修饰植物重组人DNA酶I的比活性(kcat)相似，表明用EDA修饰DNA酶I没有本质上影响比活性，而AIR DNA酶的米氏常数比未修饰的植物重组人类DNA酶I(和DNA酶I)的米氏常数几乎低7倍，而AIR DNA酶的kcat/KM比率比未修饰植物重组人类DNA酶I(和DNA酶I)的比率几乎高7倍。所述结果表明，用二胺修饰DNA酶I可大大提高DNA酶I的催化效率和DNA酶I对DNA的亲和力，从而在较低的DNA浓度下显著增强酵素活性。
表2：AIR DNA酶和未修饰的植物重组人类DNA酶I和Pulmozyme DNA酶I的比活性(kcat)、米氏常数(KM)和催化效率(kcat/KM)
使用上述方法测定EDA修饰的AIR DNA酶对来自囊性纤维化患者的痰液样品中痰液流变学，DNA含量和DNA断裂的影响。
图39A至图39C和图40A至图40C显示AIR DNA酶破坏痰液弹性结构的功效(图39A和图40A)和减少痰液中DNA含量(图39B和图40B)和断裂痰液中DNA(图39C和图40C)，所述痰液来自两个示例性囊性纤维化患者，浓度为每克痰液0.2或2微克。如其中进一步所显示，由AIR DNA酶引起的痰液中弹性结构的破坏、唾液中的DNA含量的降低以及痰液中DNA断裂是剂量依赖性的。
如图41A至图41C所示，AIR DNA酶在破坏痰液的弹性结构(图41A)和减少痰液中DNA含量(图41B)和断裂痰液中DNA(图41C)，所述痰液来自一示例性囊性纤维化患者，浓度为每克痰液2微克。
。使用与图39A至图39C相同的痰液样品获得所述数据。
如表3所示，10例囊性纤维化患者对至少一项治疗产生反应的，10例患者中有6例对AIR DNA酶的反应比DNA酶I强，10例患者中有9例对AIR DNA酶的反应至少和DNA酶I相当.
表3：来自14例囊性纤维化(CF)患者的痰液对AIR DNA酶和DNA酶I的离体(ex vivo)处理的反应类型
表3总结来自各类型的患者离体反应的代表性数据，显示在图42A至图46中。
图42A和图42B显示了AIR DNA酶和DNA酶I在浓度为2微克DNA酶/克痰液时，破坏弹性结构的功效，来自三列囊肿纤维化患者中痰液表现出对AIR DNA酶产生强烈反应，但对DNA酶I没有显著反应的两例患者。
图43A和图43B显示了AIR DNA酶和DNA酶I在浓度为2微克DNA酶/克痰液时，破坏弹性结构的功效，来自三列囊肿纤维化患者中痰液表现出对AIR DNA酶产生强烈反应，但对DNA酶只有较弱反应的两例患者。
图44A和图44B显示了AIR DNA酶和DNA酶I在浓度为2微克DNA酶/克痰液时，破坏弹性结构的功效，来自三列囊肿纤维化患者中痰液表现出对AIR DNA和DNA酶均产生强烈反应的两例患者。
图45A和图45B显示了AIR DNA酶和DNA酶I在浓度为2微克DNA酶/克痰液时，破坏弹性结构的功效，来自三列囊肿纤维化患者中痰液表现出对AIR DNA和DNA酶均不产生显著反应的两例患者。
图46显示了AIR DNA酶和DNA酶I在浓度为2微克DNA酶/克痰液时，破坏弹性结构的功效，来自(14例患者中)仅一列囊肿纤维化患者中痰液表现出对DNA酶I的反应比对AIR DNA酶强烈。
上述结果表明，通过EDA大规模修饰DNA酶I所制备的AIR DNA酶在囊性纤维化患者痰液中比DNA酶I更有效。
实施例15
用于肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)的示例性制剂
用于提高未修饰的DNA酶I的稳定性的150毫摩尔浓度NaCl和1毫摩尔浓度CaCl2的配方被修改，以特别适用于如上所述制备的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)(例如实施例14)。
为了评估制剂对AIR DNA酶稳定性的影响，将DNA酶溶液以40℃以上的温度进行热应激2小时，并用TissueLyserTM装置摇动溶液施加剪切应力。通过在600nm的波长下的光穿透来监测聚集体的形成。
CaCl2以浓度依赖的方式提高AIR DNA酶的热稳定性。
聚山梨醇酯80(Polysorbate 80)显著增强了AIR DNA酶对剪切应力的稳定性。此外没有观察到CaCl2和聚山梨醇酯80之间的干扰。
此外，已经发现CaCl2和聚山梨醇酯80可用于肺部递送的药物产品(例如，CaCl2在Pulmozyme DNA酶I制剂中，聚山梨醇酯80在PulmicortTM哮喘药物中)。
根据这些结果，制备含有10毫摩尔浓度CaCl2、0.01％聚山梨醇酯80、140毫摩尔浓度NaCl和5毫克/毫升的AIR DNA酶的一示例性制剂，选用NaCl浓度以与10毫摩尔浓度CaCl2结合时，维持为一等渗溶液。制剂的pH在5至6的范围内。
实施例16
示例性的肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)的糖基结构(Glycanstructures)
人类DNA酶I具有两个可以被占据的潜在的糖基化位点(SEQ ID NO：1中的N18和N106；SEQ ID NO：2中的N19和N107)。如上所述制备的肌动蛋白抑制抗性的修饰的植物重组人类DNA酶I(AIR DNA酶)的聚醣结构为根据国际专利申请公开号WO 2013/114374中所描述的方法的特征。
如图47所示，糖基化位点处的寡糖(oligosaccharides)具有典型的植物聚醣(glycan)结构，其中所有结构均含有连接在二等分甘露糖(bisecting mannose)上的一β(1-2)连接的木糖(β(1-2)linked xylose)，并且其中大部分含有连接在近端N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)的一α(1-3)连接的岩藻糖(α(1-3)linked fucose)。
特别地，主要的聚醣(各自具有33-60％分布)含有具有一核心结构(Man3GlcNAc2)以及额外的一β(1-2)连接的木糖和一α(1-3)连接的岩藻糖，以及一额外取代的一或两个β(1-2)连接的GlcNAcs，所述GlcNAcs连接到非还原性甘露糖上。
如上所述，聚醣的分子量为约2900Da。所述分子量对应于每个蛋白质大约两个聚醣，表示蛋白质通常在N18/19和N106/107都被糖基化。
实施例17
修饰的DNA酶I具有二胺修饰的羧基
如实施例8和14(使用DNA酶I而不是植物重组人类DNA酶I)所述，使用CMC进行以乙二胺(ethylene diamine，EDA)的DNA酶I的羧基修饰。在60或80摩尔当量的CMC、15毫摩尔浓度MES和2毫摩尔浓度CaCl2的存在下，在pH 5下使500微克DNA酶I和2000摩尔当量的乙二胺在25℃下反应2小时。鉴于在DNA酶I(其唾液酸残基)中存在另外的羧酸，使用80摩尔当量的CMC(而不是如上所述的60当量)进行测试。
将通过EDA修饰所获得的EDA修饰的DNA酶I对肌动蛋白抑制的敏感性与未修饰的DNA酶I进行比较。
如图48所示，DNA酶I通过乙二胺进行酰胺化，在80当量CMC存在下酰胺化程度大于在60当量CMC存在下酰胺化程度。
如图49所示，与未修饰的DNA酶I相比，以乙二胺修饰的PulmozymeDNA酶I对于肌动蛋白抑制显示出相当大的抗性，使用80当量的CMC所制备的修饰的Pulmozyme DNA酶I对肌动蛋白抑制比使用60当量的CMC所制备的修饰的Pulmozyme DNA酶I更具抗性。
这些结果证实，通过修饰来自不同来源的DNA酶，包括植物产生的和哺乳动物产生的DNA酶，可以获得对肌动蛋白抑制的抗性。
实施例18
肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)的毒理学研究
为了评估AIR DNA酶的安全性(例如如上所述以EDA修饰制备)，在Sprague-Dawley大鼠上进行了遵从GLP的28天的AIR DNA酶的吸入毒性研究。在28天的大鼠研究中，没有观察到与AIR DNA酶相关的死亡或对体重、食物消耗、眼底检查、血液学、临床化学或尿液分析的影响。总体而言，将化学修饰前用DNA酶处理的大鼠的研究与用AIR DNA酶处理的大鼠的研究做比较，显示出类似的安全性。在本研究中所收集的数据使得成为AIR DNA的安全桥梁。在大鼠中所达到的AIR DNA酶的最高吸入安全剂量相当于人类每日5毫克剂量的12倍。
为了进一步评估AIR DNA酶的安全性，另外可以在另一种动物物种中进行额外的吸入毒性研究(约1个月)，例如，在两种食蟹猴中进行1个月的慢性毒理学研究，以支持临床研究开发。
实施例19
肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)的安全性和药代动力学研究
为了进一步评估AIR DNA酶的安全性(例如如上所述通过使用EDA修饰制备)，在健康成年人中进行随机双盲安慰剂对照的I期研究，以评估单次和/或多次上升吸入剂量的AIR DNA酶的安全性和耐受性，通过评估治疗突发性不良事件的数量和严重程度(例如发音困难dysphonia、呼吸困难dyspnea、咽炎pharyngitis、喉炎laryngitis或鼻炎rhinitis(全部非传染性的)、结膜炎conjunctivitis、消化不良dyspepsia，皮疹ras和荨麻疹urticarial和胸痛(胸膜性pleuritic/非心脏non cardiac)和/或发热pyrexia(一般))。此外任选地评估AIR DNA酶的单次上升吸入剂量的药代动力学、在多次上升吸入剂量之后AIRDNA酶的血浆浓度的低谷(trough)和/或抗AIR DNA酶抗体是否在治疗后产生。
制备AIR DNA酶作为一用于吸入的2毫升无菌非病原性的冷冻溶液，其含有5毫克/毫升的AIR DNA酶、140毫摩尔浓度的氯化钠、10毫摩尔浓度的氯化钙和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80。安慰剂是不含DNA酶的相应制剂。使用雾化器系统通过吸入将制剂进行给药。
在研究的一个阶段，受试者被分配接受1.25、2.5或5.0毫克的AIR DNA酶(或匹配的安慰剂)的单一吸入剂量。在给予AIR DNA酶前0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4和8小时抽取血液样品，用于AIR DNA酶的药代动力学评估，并且根据所测定的AIR DNA酶血浆浓度，计算以下药代动力学参数：AUC(last)、AUC0-∞、Cmax、tmax、消失速率常数(kel)、消失半衰期(t1/2)和清除率(CL)。
在研究的另一个阶段，受试者被分配接受连续五天每天接受1.25,2.5或5.0毫克AIR DNA酶(或匹配的安慰剂)的多次吸入剂量。在AIR DNA酶给药前每天抽取血液样品，用于测定AIR DNA酶的血浆浓度的低谷(trough)。
安全评估是根据生命体征(vital signs)的基线、身体检查、12导联心电图参数、肺量计、脉搏血氧饱和度和安全实验室评估(血液学、化学和尿分析)的变化。
实施例20
肌动蛋白抑制抗性修饰DNA酶I(AIR DNA酶)的功效评估
为了评估AIR DNA酶的功效(例如如上所述通过使用EDA修饰制备)以及安全性、耐受性和药代动力学，一双盲安慰剂对照组的II期和/或III期研究(可选地为一IIa期研究)在囊性纤维化患者中进行，其先使用DNA酶治疗至少4个月，并且停止使用DNA酶治疗(例如约2周的清除期)。
如上所述制备AIR DNA酶，例如作为一用于吸入的2毫升无菌非病原性的冷冻溶液，其含有5毫克/毫升的AIR DNA酶、140毫摩尔浓度的氯化钠、10毫摩尔浓度的氯化钙和0.01％(w/v)聚山梨醇酯80。安慰剂是不含DNA酶的相应制剂。使用雾化器系统通过吸入将制剂进行给药。
通过以1.25、2.5和/或5.0毫克AIR DNA酶(或匹配的安慰剂)的剂量每天吸入一次或两次，将AIR DNA酶进行给药，优选地为每天一次，剂量为2.5毫克AIR DNA酶，任选约4周。
通过肺活量测定(spirometry)以监测肺部功能，而评估功效，并将结果与E.R.S.的预测标准值进行比较。E.G.K.S.1993年(欧洲呼吸学会和欧洲煤炭协会EuropeanRespiratory Society and European Community for Coal and Steel)[“标准化肺功能测试，欧洲呼吸学会官方声明”Standardized lung function testing.Officialstatement of the European Respiratory Society,Eur Respir J Suppl 1993,16:1-100]。女性和男性的值分别是年龄和身高的函数。测定的肺功能的参数(例如从基线的变化)例如包括1秒内的强制呼气量(FEV1)、强制肺活量(FVC)、FEV1：FVC的比率(FER或Tiffeneau-Pinelli指数)、强制呼气流量(FEF)25-75％、峰值呼气流量(PEF)。用于评估肺功能的额外参数(任选地监测的)包括肺清除指数、呼吸道感染次数和/或每个患者住院天数。通过在给药后监测AIR DNA酶个体血浆浓度来测定吸入的AIR DNA酶的药代动力学。还可以评估以下参数：痰液流变学(可选地使用上文描述的流变学程序)、痰液DNA片段大小、AIR DNA酶浓度和/或活性(任选地使用上述方法)、痰液促炎症标记物(sputum pro-inflammatory markers)、痰液中细菌负载，通过定量的细菌培养所测定，并存在抗药物抗体。
在AIR DNA酶治疗前不久中止DNA酶给药的患者中，可以进行AIRDNA酶治疗前后所述对象的状态比较，以及评估DNA酶治疗和AIR DNA酶治疗的功效。
12岁以下的儿童、过去6个月内使用烟草/含尼古丁产品的使用者、FVC低于40％的对象、FEV1不超过40％或至少90％或预测正常的对象(根据E.R.S.E.G.K.S.1993年的表格中，年龄、性别和身高)，以及在过去一个月内缺乏医疗稳定性的对象、或持续吸入的抗生素和类固醇治疗至少四个月的对象，优选地从研究中排除。
安全评估可选择地根据生命体征、身体检查、ECG参数、肺活量测试、脉搏血氧饱和度、治疗诱导的针对AIR DNA酶的抗体和/或安全实验室评估(血液学、血清化学和尿液分析)。
儿童(年龄小于12岁)任选地用不同的剂量和/或方案(例如较低的总剂量)进行不同的单一研究或多个研究，例如如上所述。
实施例21
示例性肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)对不同类型化脓性肺部疾患者者的痰液的功效
为了进一步评估AIR DNA酶(例如如上所述通过使用EDA修饰制备)在化脓性肺部疾病中的囊性纤维化的功效，AIR DNA酶能够降低从不同类型的化脓性肺部疾病的患者分离出的痰液粘度在离体(ex-vivo)研究中进行评估，其包括与非囊性纤维化相关的化脓性肺部疾病。
选择具有化脓性肺部疾病的患者(优选年龄在18-100岁)，如非囊性纤维化支气管扩张(non-cystic fibrosis bronchiectasis)或慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)。可以排除患有HIV、HBsAg、丙型肝炎和/或活性结核病的患者。患者数量可选地在约50至约100的范围内。
在从患者获得痰液样品(可以从各患者中选择多于一个样品)后，在用AIR DNA酶离子体处理之前和之后评估痰液的DNA浓度、DNA断裂和痰液流变学参数(使用如上所述程序)，以确定AIR DNA酶在降低痰液粘度方面是有效的。任选地分析一部分痰液中细菌的存在。痰液样品任选地可以在4℃或-80℃下储存。
实施例22
对不同类型化脓性肺部疾患者者的肌动蛋白抑制抗性的修饰的DNA酶I(AIR DNA酶)的功效评估
为了评估通过吸入给药的AIR DNA酶的功效(例如如上所述通过使用EDA修饰制备)以及任选地安全性、耐受性和药代动力学，一双盲安慰剂对照组的II期和/或III期研究(可选地为一IIa期研究)在具有不同类型化脓性肺部疾病的患者中进行，其包括与非囊性纤维化相关的化脓性肺部疾病。
任选地根据实施例20中所述的方法制备和施用AIR DNA酶并通过吸入给药。
功效(例如对肺功能的影响)、吸入的AIR DNA酶的药代动力学、痰液流变学、抗药物抗体的存在和/或DNA片段大小、AIR DNA酶浓度和/或活性、痰液促炎症标记物(sputumpro-inflammatory markers)、痰液中细菌负载的安全性评估和/或评价任选地如实施例20所述的方式进行
12岁以下的儿童、过去6个月内使用烟草/含尼古丁产品的使用者、FVC低于40％的对象、FEV1不超过40％或至少90％或预测正常的对象(根据E.R.S.E.G.K.S.1993年的表格中，年龄、性别和身高)，以及在过去一个月内缺乏医疗稳定性的对象、或持续吸入的抗生素和类固醇治疗至少四个月的对象，优选地从研究中排除。
虽然本发明结合其具体实施例而被描述，显而易见的是，许多替代、修改及变化对于那些本领域的技术人员将是显而易见的。因此，其意在包括落入所附权利要求书的范围内的所有替代、修改及变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体在此通过引用并入本说明书中。其程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体及单独地指明而通过引用并入本文中。此外，所引用的或指出的任何参考文献不应被解释为承认这些参考文献可作为本发明的现有技术。本申请中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。
序列表
<110> 波塔力克斯有限公司
陈泽尔布尔, 里拉其
卢朵弗尔, 宜尔雅
舒尔曼, 艾薇朵尔
福克斯, 里亚特
乌郭尔瑟夫, 尤利娅
内塔, 哈奇特
盖里, 西凡
拉维拉维亚德, 艾尔拉德
雪提尔, 尤瑟夫
<120> 修饰的DNA酶及其用途
<130> 64114
<150> US 62/247,856
<151> 2015-10-29
<150> US 62/169,724
<151> 2015-06-02
<150> US 62/163,497
<151> 2015-05-19
<150> US 62/099,565
<151> 2015-01-04
<150> US 62/099,560
<151> 2015-01-04
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 260
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys Met
1 5 10 15
Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg Tyr
20 25 30
Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala Val
35 40 45
Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr His
50 55 60
Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr Tyr
85 90 95
Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg Glu
100 105 110
Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu Phe
115 120 125
Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile
130 135 140
Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu
145 150 155 160
Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val
165 170 175
Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe
180 185 190
Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His
195 200 205
Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala
210 215 220
Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr Gly
225 230 235 240
Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val Glu
245 250 255
Val Met Leu Lys
260
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(262)
<223> 纯化的植物表达的重组人类DNA酶I的推定的氨基酸序列
<400> 2
Gly Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys
1 5 10 15
Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg
20 25 30
Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala
35 40 45
Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr
50 55 60
His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr
85 90 95
Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg
100 105 110
Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu
115 120 125
Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu
130 135 140
Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly
145 150 155 160
Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr
165 170 175
Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr
180 185 190
Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr
195 200 205
His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly
210 215 220
Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr
225 230 235 240
Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val
245 250 255
Glu Val Met Leu Lys
260
<210> 3
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(99)
<223> ABPI前导信号多肽的编码序列
<400> 3
atgattgtgc tttctgtggg atctgcttct tcttctccaa ttgtggtggt gttctctgtg 60
gctcttcttc ttttctactt ctctgagact tctcttggc 99
<210> 4
<211> 849
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgaggggca tgaagctgct gggggcgctg ctggcactgg cggccctact gcagggggcc 60
gtgtccctga agatcgcagc cttcaacatc cagacatttg gggagaccaa gatgtccaat 120
gccaccctcg tcagctacat tgtgcagatc ctgagccgct atgacatcgc cctggtccag 180
gaggtcagag acagccacct gactgccgtg gggaagctgc tggacaacct caatcaggat 240
gcaccagaca cctatcacta cgtggtcagt gagccactgg gacggaacag ctataaggag 300
cgctacctgt tcgtgtacag gcctgaccag gtgtctgcgg tggacagcta ctactacgat 360
gatggctgcg agccctgcgg gaacgacacc ttcaaccgag agccagccat tgtcaggttc 420
ttctcccggt tcacagaggt cagggagttt gccattgttc ccctgcatgc ggccccgggg 480
gacgcagtag ccgagatcga cgctctctat gacgtctacc tggatgtcca agagaaatgg 540
ggcttggagg acgtcatgtt gatgggcgac ttcaatgcgg gctgcagcta tgtgagaccc 600
tcccagtggt catccatccg cctgtggaca agccccacct tccagtggct gatccccgac 660
agcgctgaca ccacagctac acccacgcac tgtgcctatg acaggatcgt ggttgcaggg 720
atgctgctcc gaggcgccgt tgttcccgac tcggctcttc cctttaactt ccaggctgcc 780
tatggcctga gtgaccaact ggcccaagcc atcagtgacc actatccagt ggaggtgatg 840
ctgaagtga 849
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Arg Gly Met Lys Leu Leu Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Ala Val Ser Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr
20 25 30
Phe Gly Glu Thr Lys Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val
35 40 45
Gln Ile Leu Ser Arg Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp
50 55 60
Ser His Leu Thr Ala Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp
65 70 75 80
Ala Pro Asp Thr Tyr His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn
85 90 95
Ser Tyr Lys Glu Arg Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser
100 105 110
Ala Val Asp Ser Tyr Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn
115 120 125
Asp Thr Phe Asn Arg Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe
130 135 140
Thr Glu Val Arg Glu Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val
165 170 175
Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn
180 185 190
Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu
195 200 205
Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr
210 215 220
Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly
225 230 235 240
Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn
245 250 255
Phe Gln Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser
260 265 270
Asp His Tyr Pro Val Glu Val Met Leu Lys
275 280
<210> 6
<211> 786
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(786)
<223> 无前导序列的重组DNA酶I的编码序列
<400> 6
cttaaaatcg ctgctttcaa catccaaact ttcggagaga ctaagatgtc taacgctact 60
cttgtgtcct acatcgttca gattctctcc agatacgata ttgctcttgt tcaggaagtt 120
agggattctc accttactgc tgtgggaaag cttcttgata acctcaatca ggatgctcca 180
gatacttacc actacgttgt gtctgaacca cttggaagaa actcctacaa agagcgttac 240
ctctttgttt accgtccaga tcaagtttct gctgtggatt cctactacta cgatgatgga 300
tgtgagccat gcggaaacga tactttcaat agagagccag ctatcgttcg ttttttcagt 360
aggttcactg aagttcgtga gtttgctatt gtgccacttc atgctgctcc aggtgatgct 420
gttgctgaga ttgatgctct ctacgatgtg taccttgatg ttcaagagaa gtggggattg 480
gaggatgtta tgctcatggg agatttcaat gctggatgct cttatgttag gccatctcag 540
tggtcatcta ttaggctttg gacttcccca actttccaat ggcttatccc agattccgct 600
gatacaactg ctactccaac tcattgtgct tacgatagga ttgtggtggc tggaatgctt 660
cttagaggtg ctgttgttcc agattctgct ctcccattca atttccaagc tgcttacgga 720
ctttctgatc aacttgctca ggctatttct gatcactacc cagttgaggt gatgttgaag 780
tgatga 786
<210> 7
<211> 885
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> gene
<222> (1)..(885)
<223> 重组人类DNA酶I的编码序列 (ABPI+DNA酶I)
<400> 7
atgattgtgc tttctgtggg atctgcttct tcttctccaa ttgtggtggt gttctctgtg 60
gctcttcttc ttttctactt ctctgagact tctcttggcc ttaaaatcgc tgctttcaac 120
atccaaactt tcggagagac taagatgtct aacgctactc ttgtgtccta catcgttcag 180
attctctcca gatacgatat tgctcttgtt caggaagtta gggattctca ccttactgct 240
gtgggaaagc ttcttgataa cctcaatcag gatgctccag atacttacca ctacgttgtg 300
tctgaaccac ttggaagaaa ctcctacaaa gagcgttacc tctttgttta ccgtccagat 360
caagtttctg ctgtggattc ctactactac gatgatggat gtgagccatg cggaaacgat 420
actttcaata gagagccagc tatcgttcgt tttttcagta ggttcactga agttcgtgag 480
tttgctattg tgccacttca tgctgctcca ggtgatgctg ttgctgagat tgatgctctc 540
tacgatgtgt accttgatgt tcaagagaag tggggattgg aggatgttat gctcatggga 600
gatttcaatg ctggatgctc ttatgttagg ccatctcagt ggtcatctat taggctttgg 660
acttccccaa ctttccaatg gcttatccca gattccgctg atacaactgc tactccaact 720
cattgtgctt acgataggat tgtggtggct ggaatgcttc ttagaggtgc tgttgttcca 780
gattctgctc tcccattcaa tttccaagct gcttacggac tttctgatca acttgctcag 840
gctatttctg atcactaccc agttgaggtg atgttgaagt gatga 885
<210> 8
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(33)
<223> 拟南芥衍生的ABPI内质网靶向信号肽
<400> 8
Met Ile Val Leu Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ile Val Val
1 5 10 15
Val Phe Ser Val Ala Leu Leu Leu Phe Tyr Phe Ser Glu Thr Ser Leu
20 25 30
Gly
<210> 9
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(293)
<223> 植物重组人类DNA酶I
<400> 9
Met Ile Val Leu Ser Val Gly Ser Ala Ser Ser Ser Pro Ile Val Val
1 5 10 15
Val Phe Ser Val Ala Leu Leu Leu Phe Tyr Phe Ser Glu Thr Ser Leu
20 25 30
Gly Leu Lys Ile Ala Ala Phe Asn Ile Gln Thr Phe Gly Glu Thr Lys
35 40 45
Met Ser Asn Ala Thr Leu Val Ser Tyr Ile Val Gln Ile Leu Ser Arg
50 55 60
Tyr Asp Ile Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Asp Ser His Leu Thr Ala
65 70 75 80
Val Gly Lys Leu Leu Asp Asn Leu Asn Gln Asp Ala Pro Asp Thr Tyr
85 90 95
His Tyr Val Val Ser Glu Pro Leu Gly Arg Asn Ser Tyr Lys Glu Arg
100 105 110
Tyr Leu Phe Val Tyr Arg Pro Asp Gln Val Ser Ala Val Asp Ser Tyr
115 120 125
Tyr Tyr Asp Asp Gly Cys Glu Pro Cys Gly Asn Asp Thr Phe Asn Arg
130 135 140
Glu Pro Ala Ile Val Arg Phe Phe Ser Arg Phe Thr Glu Val Arg Glu
145 150 155 160
Phe Ala Ile Val Pro Leu His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu
165 170 175
Ile Asp Ala Leu Tyr Asp Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly
180 185 190
Leu Glu Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr
195 200 205
Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr
210 215 220
Phe Gln Trp Leu Ile Pro Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr
225 230 235 240
His Cys Ala Tyr Asp Arg Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly
245 250 255
Ala Val Val Pro Asp Ser Ala Leu Pro Phe Asn Phe Gln Ala Ala Tyr
260 265 270
Gly Leu Ser Asp Gln Leu Ala Gln Ala Ile Ser Asp His Tyr Pro Val
275 280 285
Glu Val Met Leu Lys
290

Claims (50)

1.一种修饰的DNA酶I蛋白，包括一DNA酶I蛋白的一氨基酸序列，其中至少一氨基酸残基是一非细胞修饰的氨基酸残基，所述修饰的DNA酶I蛋白的特征在于：至少一特性选自于由以下所组成的一群组：
(1)在一修饰的DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％；
(2)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少20％；
(3)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(4)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性在不存的至少150％；
(5)在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少两倍。
2.如权利要求1所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：
在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在1微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的DNA水解活性的至少80％。
3.如权利要求1和2中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少70％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％。
5.如权利要求1至4中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少200％。
6.如权利要求1至5中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少200％。
7.如权利要求1至6中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少三倍。
8.如权利要求1至7中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：至少两个氨基酸残基，任选地至少5个氨基酸残基，是非细胞修饰的氨基酸残基。
9.如权利要求1至8中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白质的至少一羧酸基被以下通式的一酰胺基所取代：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'和R”各自独立地选自于一氢元素和一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基所组成的一群组，任选地被一或多个杂原子插入。
10.如权利要求9的所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：R'和R”中的至少一者是所述饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入。
11.一种修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述修饰的DNA酶I蛋白包括一DNA酶I蛋白的一氨基酸序列，其中所述DNA酶I蛋白质的至少一羧酸基被以下通式的一酰胺基所取代：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'和R”各自独立地选自于一氢元素和一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基所组成的一群组，任选地被一或多个杂原子插入。
12.如权利要求11的所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：R'和R”中的至少一者是所述饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入。
13.如权利要求11至12中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：至少一特性选自于由以下所组成的一群组：
(1)在一修饰的DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少50％；
(2)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在人类非肌肉肌动蛋白不存在下所述修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少20％；
(3)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在5微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(4)在一DNA酶I浓度为45纳克/毫升时，在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下的一DNA水解活性为在50微克/毫升人类非肌肉肌动蛋白存在下一未修饰的DNA酶I蛋白的一DNA水解活性的至少150％；
(5)在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50为一未修饰的DNA酶I蛋白在人类非肌肉肌动蛋白存在下相对于DNA水解活性的一IC50的至少两倍。
14.如权利要求9至12中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：
所述酰胺基具有以下通式：
-C(＝O)-NR'R”
其中R'选自于烷基、烯基和炔基所组成一群组，所述烷基、烯基和炔基的各者未被取代或被一或多个选自于羟基和氨基所组成的一群组的取代基所取代。
15.如权利要求14所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：R'包括1至10个碳原子。
16.如权利要求14至15中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述烷基、所述烯基或所述炔基被一或多个羟基取代。
17.如权利要求14的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：R'是三(羟甲基)甲基。
18.如权利要求14至15中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述烷基、所述烯基或所述炔基被一或多个氨基取代。
19.如权利要求18所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：R'是2-氨基乙基。
20.如权利要求9至19中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述至少一羧酸基选自于一氨基酸残基的一侧链内的一羧酸基和一C-末端羧酸基所组成的一群组。
21.如权利要求20的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述氨基酸残基的侧炼是选自于下述所组成的一群组的一氨基酸残基的一侧链：一谷氨酸残基、一天冬氨酸残基、一N-甲基-谷氨酸残基、一N-甲基天冬氨酸残基、一α-甲基谷氨酸残基、一α-甲基天冬氨酸残基、一γ-羧基谷氨酸残基、一N-(羧甲基)甘氨酸残基、一N-(2-羧乙基)甘氨酸残基和一α-氨基己二酸残基。
22.如权利要求9至21中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白质的至少两个所述羧酸基，任选地至少五个所述羧酸基，被所述酰胺基取代。
23.如权利要求1至22中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：相对于DNA水解活性的一米氏常数低于一未修饰的DNA酶I蛋白相对于一DNA水解活性的一米氏常数。
24.如权利要求1至23中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：相对于DNA水解活性的一米氏常数不超过20微克/毫升的DNA。
25.如权利要求1至24中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：相对于DNA水解活性的一比活性为一未修饰的DNA酶I蛋白相对于DNA水解活性的一比活性的至少70％。
26.如权利要求1至24中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：相对于DNA水解活性的一催化效率大于一未修饰的DNA酶I蛋白质相对于DNA水解活性的一催化效率。
27.如权利要求1至26中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：小于10重量百分比的所述修饰的DNA酶I为一多聚体形式。
28.如权利要求1至27中任一项所述的修饰的DN酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白是一重组蛋白。
29.如权利要求1至27中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白是一植物重组蛋白。
30.如权利要求1至29中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白对于一人类DNA酶I蛋白具有至少80％的同源性。
31.如权利要求1至29中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白包括一N-末端甘氨酸残基。
32.如权利要求31所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白包括或具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
33.如权利要求1至29中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述DNA酶I蛋白包括或具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
34.一种制备权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括
使所述DNA酶I蛋白在一偶联剂存在下，与以下通式的一含胺化合物反应：HNR’R”
其中R'和R”的各者是一饱和或不饱和的取代或未取代的烃基，任选地被一或多个杂原子插入，所述杂原子独立地选自于一氢元素及一取代的或未取代的烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂脂环和杂芳基所组成的一群组。
35.权利要求34的方法，其特征在于：所述含胺化合物具有以下通式：
H2N-R’
其中R'是一饱和或不饱和的烷基，所述饱和或不饱和的烷基未被取代或被一或多个选自于羟基和氨基所组成的一群组的取代基所取代。
36.如权利要求34和35中任一项所述的方法，其特征在于：所述偶联剂是一碳二亚胺。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于：所述碳二亚胺是CMC(N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基-对-甲苯磺酸盐)。
38.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白作为一活性成分以及一药学上可接受的载体。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括一钙盐。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中钙的浓度在5至15毫摩尔浓度的一范围内。
41.如权利要求38至40中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括一聚山梨醇酯80。
42.如权利要求38至41中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包括约10毫摩尔浓度的CaCl2、约0.01％的聚山梨酯80、约140毫摩尔浓度的NaCl和约5毫克/毫升的所述修饰的DNA酶I蛋白。
43.如权利要求38至42中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物被配制成通过一雾化器递送。
44.如权利要求38至43中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述修饰的DNA酶I蛋白是一至少90％纯的DNA酶I蛋白。
45.如权利要求38至44中任一项所述的药物组合物或如权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述药物组合物或所述修饰的DNA酶I蛋白被应用于降低痰液液的粘度。
46.如权利要求38至44中任一项所述的药物组合物或如权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述药物组合物或所述修饰的DNA酶I蛋白被应用于降低痰液中的DNA含量。
47.如权利要求38至44中任一项所述的药物组合物或如权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述药物组合物或所述修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一疾病或病症，所述疾病或病症与在一有需要的对象的一流体、分泌物或组织中过量的细胞外DNA相关。
48.如权利要求47所述的药物组合物或所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述疾病或病症是一肺部疾病或病症。
49.如权利要求38至44中任一项所述的药物组合物或如权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述药物组合物或所述修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一有需要的对象的囊性纤维化。
50.如权利要求38至44中任一项所述的药物组合物或如权利要求1至33中任一项所述的修饰的DNA酶I蛋白，其特征在于：所述药物组合物或所述修饰的DNA酶I蛋白被应用于治疗一疾病或病症，所述疾病或病症选自于由下述所组成的一群组：一支气管炎、一非囊性纤维化支气管扩张症、一慢性阻塞性肺疾病(COPD)、一红斑狼疮、一狼疮肾炎、一柯凯因氏综合症、一天使人综合症、一男性不育症、一转移性癌症、一病毒、细菌、真菌或原生动物感染性败血症、一心肌梗塞、一动脉粥样硬化、一糖尿病、一迟发型超敏反应和一子宫紊乱。
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