CN107405115B - 用于检测血红蛋白及其复合物的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，其具有连接到导电迹线的至少双电极构件。设置在双电极构件上的具有一体化受体‑膜的受体，以通过裂解剂接收来自所述血液样品的红细胞(RBC)的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物，并将非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物及其电化学活性复合物。本发明还提供了并入有本发明的装置的护理点生物传感器以及测量方法，用于通过确定减少体积的血液样品中的氧化还原电流值来检测和定量测量减少体积的血液样品中血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白的浓度。

Description

用于检测血红蛋白及其复合物的装置和方法
技术领域
本发明一般涉及用于定量测量生物样品中的生物分析物的生物传感器(biosensor)和方法。更具体地，本发明涉及用于将减少体积的血液样品中的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物和复合物，用于精确检测和定量测量血红蛋白、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白和肌红蛋白的电化学活性生物传感器。
背景技术
氧是自然界中用于人体中许多不同功能的最通用的试剂。与极性溶剂相比，氧更易溶于非极性溶剂。简单扩散不能足够快地将氧气递送到多细胞生物体中的内部细胞；因此需要载体如血红蛋白和肌红蛋白。血红蛋白是人体内的氧载体蛋白。
血红蛋白是具有四级结构的球状可溶蛋白，其含有四个血红素(heme)辅基形式的铁(Fe+2)原子。血红蛋白的直接电化学检测是困难的。血红素铁中心埋在球蛋白链内，分子非常难以在电极表面连通。血红蛋白是RBC内部的氧运输金属蛋白，分子量为64,500道尔顿。人体中存在不同形式的血红蛋白，例如氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、高铁血红蛋白、羧基血红蛋白、硫血红蛋白等。氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白可以结合并运输氧分子，而其它形式的血红蛋白不能结合氧。
在许多发展中国家以及发达国家的少数群体中，糖尿病已成为全世界的主要健康问题。根据国际糖尿病联合会，全世界全球有3.82亿人是糖尿病患者，预测表明到2035年将有5.92亿人患有糖尿病。3.82亿糖尿病患者中的大部分年龄在40至59岁之间，其中80％生活在低和中等收入国家。所有类型的糖尿病都在增加，特别是2型糖尿病：到2035年糖尿病患者的数量将增加55％。另外2100万孕期高血糖症病例被认为加剧了糖尿病的全球负担。在人和财政方面，糖尿病的负担巨大，在2013年造成510万死亡，卫生支出约5480亿美元(世界总支出的11％)。
2型糖尿病与增加的心血管和总死亡率有关。流行病学数据表明，典型的心血管危险因素如高胆固醇血症、高血压和吸烟单独并不能解释2型糖尿病中过高的心血管发病率和死亡率风险。相反，过高的发病率和死亡率与疾病本身相关。1型糖尿病是长期微血管和大血管并发症的主要病因。糖尿病肾病是全世界肾衰竭的最常见原因。因此，理解发病机理并预防这些长期并发症已经是糖尿病研究的主要目标。糖尿病研究的主要焦点是通过严格的血糖控制预防糖尿病并发症。已经确定的事实是，高血糖是微血管或大血管糖尿病并发症的主要原因，无论是严重或轻微程度。近来，已经确定在血糖控制的各种标志物中，糖化血红蛋白(GHb)是用于长期糖尿病管理的最可靠的生物标志物。
糖尿病控制和并发症试验(Diabetes Control and Complications Trial，DCCT)和英国前瞻性糖尿病研究(United Kingdom Perspective Diabetes Study，UKPDS)已经显示了紧密血糖控制的重要性，以便预防或延缓糖尿病患者的微血管疾病。糖尿病控制和并发症试验(DCCT)表明HbA1c水平与糖尿病并发症的进展相关。糖尿病并发症的进展风险随着HbA1c(糖化血红蛋白)呈指数增加。
糖化血红蛋白(GHb)通过葡萄糖和其它己糖的醛基与血红蛋白的氨基末端缬氨酸的组合的非酶促、底物浓度依赖性不可逆过程形成。GHb的估计提供了一种可靠的方法来评估糖尿病患者的血糖控制。在血糖控制的各种标志物中，已经建立糖化血红蛋白(GHb)作为监测糖尿病并发症的长期进展的最可靠的生物标志物。根据WHO，HbA1c可用作糖尿病的诊断测试。建议将6.5％的HbA1c作为诊断糖尿病的截点。HbA1c测试的实验室数值以糖化血红蛋白的百分比数值形式给出相对于总血红蛋白的糖化血红蛋白。
存在不同方法可用于在实验室中以及在护理点装置(point of care device)中的糖化血红蛋白检测。这些方法中的大多数基于使糖化组分与总血红蛋白的分离，然后使用两种不同的技术检测总血红蛋白和糖化血红蛋白组分。检测后，可以通过将糖化血红蛋白除以总血红蛋白的百分比糖化血红蛋白的形式计算结果。在本发明中，我们公开了使用单一试剂技术检测百分比糖化血红蛋白(％GHb)的电化学方法。
总血红蛋白是贫血和其它血液病症的生物标志物。根据WHO报告，贫血是全球健康问题，影响全世界16.2亿人。贫血的最高发病率为学龄前儿童，占47.4％。四分之一的人患有贫血，在他们中，孕妇和学龄前儿童面临的风险最大。
高铁血红蛋白是血红蛋白的氧化形式，其中铁的氧化态为+3。这种形式的血红蛋白不能结合氧。在健康人中，高铁血红蛋白的百分比可以在1-3％之间变化。这个百分比可由于化学暴露和氧化应激而增加。高铁血红蛋白是高铁血红蛋白血症的已知的生物标志物。
高铁血红蛋白血症是由氧化应激和化学暴露引起的疾病，其中血红素辅基的铁中心被氧化并且不能结合氧。用于高铁血红蛋白血症的一般治疗是亚甲蓝和抗坏血酸。可以使用有机染料亚甲基蓝染料(MB)治疗高铁血红蛋白血症。
然而，高铁血红蛋白是总血红蛋白的小百分比，因此需要提供电化学方法来检测总血红蛋白和高铁血红蛋白。
肌红蛋白是单体血红素蛋白(hemeprotein)，主要存在于肌肉组织中，在此其作为细胞内氧存储位点。血清中的肌红蛋白是肌肉组织损伤和心肌梗死的公知标志物。
用于检测血红蛋白的大多数已知装置和方法是基于免疫学技术或者诸如拉曼光谱和微流体的复杂仪器，其不是最适合于低成本的护理点装置。
因此，非常需要具有可以以电化学的方式检测和定量血液样品中的生物分析物，例如总血红蛋白、糖化白蛋白和高铁血红蛋白以及肌红蛋白的一次性装置。
US7855079B2公开了一种使用酶技术的用于糖化血红蛋白的光学方法。
US2008206563B2公开了一种测定血液样品中糖化血红蛋白的百分比的方法，其中以电化学的方式进行至少一个测定步骤。所述方法包括通过在阴极的氧电还原反应中以电化学的方式测量样品中的氧的量来确定样品中血红蛋白的总量。
US8460525B2公开了一种用于确定血液样品中糖化血红蛋白的百分比的电化学装置。所述装置包括阴极和阳极以及一个以上小室。所述装置可以包括能够将氧还原为水的酶，用于通过在阴极的氧电还原反应中以电化学的方式测量样品中的氧的量来确定样品中的血红蛋白的总量。
US8557590B2公开了一种用于测量糖化血红蛋白的方法，包括用溶血物质(haemolysate)使血液样品溶血；使溶血的血液样品与珠缀合物反应，在珠缀合物中珠与糖化血红蛋白结合物质缀合；测量所述作用的血液样品中的总血红蛋白的量；使正常血红蛋白同与珠缀合物缀合的糖化血红蛋白分离。
US2012/0261257A1公开了通过使用两种不同技术的总血红蛋白和糖化血红蛋白的电化学检测。通过使用氧化石墨烯和氨基苯基硼酸(APBA)将糖化血红蛋白结合在电极表面来检测糖化血红蛋白。使用石墨烯改性的电极使用氧化石墨烯测量总血红蛋白。
WO2013096856A1公开了基于拉曼光谱法的糖化血红蛋白检测。
EP0256851B1公开了基于铁氰化物介体的血红蛋白检测的电化学方法。
EP2568281A1公开了基于血红蛋白的氧化的血红蛋白的电化学检测。
US4876205公开了通过监测血红蛋白将铁氰化物还原成亚铁氰化物时产生的电流变化的血红蛋白的电化学测定。
US20040186359A1公开了一种用于肌红蛋白检测的光学生物传感器，其基于与被监测的标志物特异性结合的亲和配体或结合构件。
Hegesh等人的J.Clin.Chim.Acta,30(1970)679-682公开了基于与高铁血红蛋白的氰化物反应的高铁血红蛋白的检测，并测量632nm处的光吸收的变化。这些已知的装置基于酶或基于抗体感测生物分析物，其稳定性需要严格的储存条件。已知的装置还利用电子介体来增强电流，防止生物分析物与电极表面的直接连通。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种电化学活性装置，其用于收集和保留具有非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物的血液样品，用于随后定量测量减少体积的血液样品中的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
本发明的一个目的是提供一种装置保持器(device holder)，其适于接收电化学活性装置，所述电化学活性装置用于随后定量测量减少体积的血液样品中的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种护理点生物传感器(point-of-carebiosensor)，其适于接收电化学活性装置，所述电化学活性装置用于在施加氧化还原电位时通过测量流过电化学活性装置的氧化还原电流来检测和定量测量减少体积的血液样品中的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
本发明的另一个目的是提供一种通过精确测量流过电化学活性电极的氧化还原电流来检测和定量测量减少体积的血液样品中的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于定量测量减少体积的血液样品中的糖化血红蛋白的方法。
附图说明
图1是电化学活性装置的示意性分解图，描绘了用于接收减少体积的血液样品中的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物并且将其转化为电化学活性生物分析物和复合物的双电极布置。
图2是根据本发明的一个方面的电化学活性装置的三电极布置的示意性分解图。
图3(a)是根据本发明的另一个方面的电化学活性装置的两对三电极布置的示意性分解图。
图3(b)是根据本发明的另一个方面的电化学活性装置的具有托盘的两对三电极布置的示意性分解图。
图4(a)是用于测量血红蛋白的具有三电极布置的电化学活性装置的示意性顶视图。
图4(b)是电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层设置在受体-膜的表面上，并且裂解剂设置在裂解膜上。
图4(c)是电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体和裂解盐层设置在电极表面上的受体-膜上。
图4(d)是电化学装置的示意性横截面图，其中受体设置在电极的表面上，并且具有裂解盐层的裂解-膜设置在受体的表面上。
图4(e)是电化学装置的示意性横截面图，其中受体和裂解剂施加在电极上。
图4(f)是电化学装置的示意性横截面图，其中受体和裂解剂是电极的一体化部件(integral part)。
图5(a)是用于测量百分比糖化血红蛋白的具有两组三电极布置的本发明电化学活性装置的示意性顶视图。
图5(b)是电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体设置在受体-膜的表面上，并且具有裂解盐层的裂解-膜设置在受体层的表面上。
图5(c)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体和裂解盐层设置在受体-膜上。
图5(d)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体设置在电极的表面上，并且具有裂解盐层的裂解-膜设置在受体的表面。
图5(e)是电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体和裂解盐层设置在电极上。
图5(f)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体和裂解盐层与电极一体化设置。
图5(g)是电化学活性装置的示意性横截面图，其中具有受体-膜的受体设置在电极上，糖化血红蛋白过滤膜和硼酸盐/酯(boronate)亲和剂设置在受体层上，具有裂解盐的裂解-膜设置在顶部。
图5(h)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体设置在电极顶部的受体膜上，糖化血红蛋白过滤膜设置在受体的顶部上，裂解盐和硼酸盐/酯亲和剂一起设置在糖化血红蛋白过滤膜的顶部上。
图5(i)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体、裂解盐层和硼酸盐/酯亲和剂一起设置在位于电极顶部的糖化血红蛋白过滤膜上。
图6(a)是用于定量测量绝对高铁血红蛋白的具有两组三电极布置的本发明电化学活性装置的示意性顶视图。
图6(b)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中具有受体层的受体-膜和具有裂解盐层的裂解膜设置在电极上。
图6(c)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在受体-膜上。
图6(d)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层设置在具有裂解-膜和裂解盐的电极上。
图6(e)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在电极层的顶部上。
图6(f)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层是电极层的一体化部件。
图7(a)是用于测量血液样品中的百分比血红蛋白的具有两组三电极布置的本发明电化学活性装置的示意性顶视图。
图7(b)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体-膜与受体层和具有裂解盐层的裂解-膜一起设置在电极上。
图7(c)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在受体-膜上。
图7(d)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层与裂解-膜和裂解盐层一起设置在电极上。
图7(e)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在电极层上。
图7(f)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层与电极一体化。
图7(g)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中裂解-膜与裂解盐层一起设置在受体层105b上。
图7(h)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在受体-膜上。
图7(i)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中裂解-膜与裂解盐层一起设置在受体层上。
图7(j)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层设置在电极上。
图7(k)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层和裂解盐层与电极一体化。
图8(a)是用于肌红蛋白测量的具有三电极布置的本发明电化学活性装置的示意性顶视图。
图8(b)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体-膜设置在电极上，受体层设置在受体-膜上。
图8(c)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层设置在电极上。
图8(d)是本发明电化学活性装置的示意性横截面图，其中受体层与电极一体化。
图9是本发明装置保持器的透视图，其保持电化学装置并适于接收具有血红蛋白生物分析物及其复合物的所需血液样品。
图10(a)是护理点生物传感器的透视图，其保持用于定量测量和显示血红蛋白生物分析物及其复合物的本发明装置。
图10(b)是本发明的护理点生物传感器的广泛的内部电子架构的示意图。
图11是血红蛋白的氧化还原反应的示意图。
图12是血液样品中转化为碱性高铁血红素(hematin)后的血红蛋白的循环伏安图。
图13(a)是血红蛋白在以不同浓度转化为碱性高铁血红素的循环伏安图。
图13(b)是描绘在不同血红蛋白浓度下的还原电流Vs血红蛋白的图。
图14(a)和(b)描述了在咪唑和吡啶HCl存在下具有血红蛋白的氮碱复合物的循环伏安图。
图15是描述将全血转化为高铁血色原(hemichrome)的方法步骤的流程图。
图16是描述通过使用本发明的装置和护理点生物传感器定量测量Hb生物分析物的浓度的方法步骤的高级流程图。
图17是描述通过使用本发明的装置和护理点生物传感器定量测量糖化Hb的浓度的方法步骤的高级流程图。
图18是亚甲基蓝的循环伏安图。
图19是描述高铁血红蛋白血症中亚甲基蓝的氧化还原行为的示意图。
图20是描述定量测量血液样品中MetHb浓度的方法步骤的高级流程图。
图21(a)是将血红蛋白转换成吡啶高铁血色原(hemichrome)后的循环伏安图，图21(b)是氧化电流Vs血红蛋白浓度的变化图。
图22(a)是描绘血红蛋白的病理范围的氧化电流Vs血红蛋白的图，图22(b)描绘血红蛋白的病理范围的氧化电流Vs血红蛋白的变化的图。
图23(a)是血红蛋白转化为咪唑-高铁血红蛋白复合物后的循环伏安图，图23(b)是氧化电流Vs血红蛋白的图。
图24是总血红蛋白和没有糖化Hb的血红蛋白的循环伏安图。
图25是描绘％糖化血红蛋白Vs氧化电流的图。
图26是不同浓度的肌红蛋白的循环伏安图。
图27是氧化还原电流Vs肌红蛋白浓度的图。
发明内容
本发明提供了一种用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，其具有连接到导电迹线(conductive track)的至少双电极构件。设置在双电极构件上的具有一体化受体-膜的受体，以通过裂解剂接收来自所述血液样品的红细胞(RBC)的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物，并且将非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物及其电化学活性复合物。本发明还提供了并入有本发明的装置的护理点生物传感器以及测量方法，用于检测和定量测量减少体积的血液样品中血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白的浓度。本发明的装置、护理点生物传感器和方法通过确定减少体积的血液样品中的氧化还原电流值来帮助精确测量血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白的浓度。
发明详述
因此，本发明提供了一种用于收集和保留血液样品的电化学活性装置。本发明还提供了用于保持具有血液样品的电化学活性装置的保持器，以及护理点生物传感器，其用于通过测量减少体积的具有生物分析物的血液样品中氧化还原电流值来精确检测和定量测量血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白生物分析物。
在本发明的一个方面中，用于收集和保留血液样品的电化学活性装置设置有设置在基板上的至少一对导电迹线。具有至少一对电极的电极构件连接到导电迹线，并且电极构件用受体官能化以将所需的血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物。因此，与裂解剂化学接触的受体被设置为接收来自减少体积的血液样品的非电化学活性生物分析物，并将其转化为电化学活性生物分析物用于测量其浓度。
在本发明的另一个方面，用于保持本发明电化学活性装置的保持器设置有具有装置检测、数据存储和信号调节电路的壳体。通用串行总线(Universal Serial Bus，USB)连接器设置在壳体的一端，并且导电端口设置在壳体的另一端。保持器适于通过导电端口接收电化学活性装置。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于测量血液样品中的血红蛋白生物分析物及其复合物的浓度的护理点生物传感器。护理点生物传感器包括壳体，其具有显示构件和用于插入本发明电化学活性装置的接口。护理点生物传感器设置有用于插入微型USB和微型SD卡的插槽。数字控制器设置在壳体中并且被配置为向装置施加氧化还原电位，所述装置装载有具有血红蛋白生物分析物及其复合物的血液样品。数字控制器还被配置为通过测量相应的氧化还原电流并将其与血红蛋白及其复合物的浓度线性匹配来显示血红蛋白生物分析物及其复合物的浓度。
在本发明的另一个方面，提供了一种测量减少体积的血液样品中生物分析物的浓度的方法，其通过向用受体官能化的至少双电极构件施加氧化还原电位，使得非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物成为电化学活性。使受体负载减少体积的具有血红蛋白生物分析物及其复合物的所需血液样品，并且通过与相应的氧化还原电流线性匹配来确定血液样品中血红蛋白生物分析物的浓度。
在本发明的另一个方面，非电化学活性生物分析物是血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
现在，通过参考附图描述本发明的优选实施方案。图1描绘了适于收集和保留生物样品，用于随后测量存在于生物样品中的血红蛋白分析物的电化学活性装置。
如图1所示的装置100设置有基板101，基板101用作基座，在该基座上构造装置的其它构件。在该实施方案中，基板101示例性地示出为细长环形结构。然而，这里应当理解，取决于使装置100保持的生物传感器的形状和构造，基板101可以采取其它形状，例如矩形或圆形。基板101可以由适合于并入图案化电极的任何合适的刚性或柔性材料制成。例如，可以使用诸如聚氯乙烯(PVC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环氧纤维复合体、聚酰胺复合体和纸的材料作为基板101的优选材料。然而，用于基板101的优选刚性材料可以是陶瓷、玻璃或任何其它类似材料。在任何情况下，进行用于基板101的合适材料的选择以确保基板101不仅能够提供所需的强度和柔性，而且能够用作电绝缘体。有利地，基板101的性质是亲水的，以防止生物样品在与基板101物理接触时渗透。基板101的表面通常具有光滑的纹理。然而，基板101也可以设置有粗糙表面和/或腔或孔。基底101的边缘还具有合适的轮廓，例如锥形或弯曲的，以便于容易地进入和离开生物传感器。
一对导电迹线102a和102b设置在基板101上。导电迹线102a和102b通过使用任何图案化方法形成，例如丝网印刷、光刻、热蒸发、溅射、激光图案化，优选丝网印刷。在图1中的示例性方面，形成一对导电迹线102a和102b用于实施。然而，可以适当地增加或改变所需导电迹线数目。导电迹线102a和102b的路径在图1中示例性地示为直线迹线。可以使用用于导电迹线的其它合适的构造(例如多边形)。导电迹线102a和102b的材料可以是导电材料，例如铜、铝、金、银、铂、碳或任何其它合适的导电材料或这些材料的合金。导电迹线102a和102b的材料也可以是电化学活性的，例如金、铂、汞、碳、玻璃碳和石墨。导电迹线102a和102b用于与如下所述的本发明的生物传感器建立电连接。
如图1所示，电极对103a和103b分别电连接到导电迹线102a和102b。电极103a和103b覆盖在导电迹线102a和102b上并且设置在导电迹线102a和102b的末端，以便在导电迹线102a和102b上方形成层，如图1所示。用于电极103a和103b的材料选自具有电化学活性的金属、有机物或合金，例如金、铂、汞、碳、玻璃碳和石墨。在如图1所示的电极的布置中，电极103a用作工作电极，而电极103b是对电极。
如图1所示，受体-膜104设置在电极对103a和103b上，其作为用于如下文所述受体的一体化的基底构件。用于膜104的材料可以是聚合物、纤维素、硝化纤维、尼龙、棉织物、滤纸或任何其它市售可得膜，例如来自PAL lifesciences的BIODYNE膜或GE Healthcare膜等。
本发明的装置100用于检测和定量测量人血液样品中的单独的或组合的生物分析物，例如血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
因此，在本发明中，将受体105与受体-膜104一起设置在电极103a和103b上，受体105将非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为相应的电化学活性生物分析物。受体-膜104主要适于保持受体105或提供基底以保持作为受体105的下文所述物质。所使用的受体膜104具有所需的孔隙率，其大于血红蛋白生物分析物的大小，优选在7nm至14微米的范围内，以有助于生物分析物的所需水平的渗透性。受体-膜104也可以制成受体105的一体化部件。受体-膜104的材料是聚合物、纤维素、织物、纸或任何其它合适的材料。
在该优选实施方案中，受体105显示为电化学活性物质层，例如有机物质、无机物质或作为这些物质的组合的物质。
因此，用于受体105的有机物质选自具有N-杂原子的杂环有机物质，例如吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤。在本发明中，选择吡啶和咪唑作为用于受体105的优选有机物质。
然而，用于受体105的合适的无机物质是碱，优选NaOH和KOH。
在其中将有机物质和无机物质的组合用于受体105的方面，优选的有机物质是亚甲蓝(MB)和无机氧化剂，例如硝酸钠(NaNO3)、亚硝酸钠(NaNO2)或十二烷基硫酸钠。
在本发明的另一个方面，用硼酸盐/酯亲和剂处理用来测量血液样品中糖化血红蛋白(GHb)的浓度水平的受体-膜104。硼酸盐/酯试剂选自合适的硼酸和衍生物，例如苯基硼酸(PBA)、氨基苯基硼酸(APBA)及其衍生物，优选氨基苯基硼酸(APBA)。
在本发明的替代方面，在没有受体-膜104的情况下，受体105也可以直接设置在电极表面上用于检测生物分析物。
裂解剂被设置为与受体105化学接触并且优选地设置在裂解膜上，以接收血液样品并从所述血液样品的红细胞(RBC)中释放非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物，使得受体105可以使生物分析物成为电化学活性成分。
裂解剂选自由以下组成的组：二辛基磺基琥珀酸钠(diocetyl sodiumsulfosuccinate)、十二烷基苯磺酸钠、月桂基二甲基氧化胺、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(octyl phenoxy poly ethoxy ethanol)、铁氰化钾、月桂基硫酸钠(sodium laurylsulfate)、十二烷基硫酸锂、亚硝酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵(cetyle trymethyl ammoniumbromide)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)、脱氧胆酸钠(sodiumdeoxychelate)、N-月桂酰肌氨酸、双十二烷基二甲基溴化铵、辛基酚环氧乙烷缩合物和盐酸，优选十二烷基硫酸钠和双十二烷基二甲基溴化铵。
用于本发明中的定量测量其浓度的生物分析物包括其非电化学活性形式的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
受体105与电极103a和103b的化学接触的开始以如下方式进行。制备受体105的溶液并分配在具有104的电极103a和103b上并干燥，以在电极103a和103b和膜104上形成固体化学层。
可选地，将受体溶液与所需的经裂解血液样品预混合，并将减少体积的预混合溶液分配在具有膜104的电极103b和103b上。
在本发明的另一个方面，单独制备受体溶液并分配在具有膜104的电极103a和103b上。之后，将具有血红蛋白生物分析物的所需血液样品施加在电极上。
钝化层106被设置为覆盖导电迹线，如图1所示。钝化层106用于为装置的导电元件提供保护并且精确地限定电极区域。
在本发明的另一个方面，如图2所示，三电极103a、103b和103c的组的布置与如图1所示的受体结合实施，其中电极103a、103b和103c分别连接到导电迹线102a、102b和102c，以收集和保留生物样品。电极数量的增加有助于以更高的精度检测血液样品中的单一生物分析物。在该实施方案中，电极103c用作参考电极。参考电极103c的优选材料是银(Ag)、氯化银(AgCl)、银/氯化银(Ag/AgCl)或饱和甘汞，其中电极的电位不随时间改变。
在如图3(a)所示的本发明的另一个方面，两对三电极103a、103b、103c、103d、103e和103f设置在导电迹线102a、102b、102c、102d、102e和102f上，并且适于测量给定血液样品中的多种生物分析物的浓度。在这方面，如图3(b)所示，在电极上设置屏蔽的孔或托盘以划分不同的感测区域，以便于对血液样品的独立感测。因此，两个单独受体与电极对中的每一对结合设置，以接收这些样品并且进行这两个不同血液样品中血红蛋白及其复合物的浓度的单独测量。此外，如果认为必要，可以提供物理分区以分离电极。
如图4(a)所示，描绘了用于检测血液样品中的血红蛋白的电化学活性装置的顶视图。
图4(b)是相应的横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b、102c。具有连接到导电迹线102a、102b、102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c的3电极布置。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105设置在受体-膜104的表面上。裂解-膜107设置在受体层105的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图4(c)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b、102c。具有连接到导电迹线102a、102b、102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c的3电极布置。受体层105和裂解盐层108都设置在受体-膜104上。
图4(d)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b、102c。具有连接到导电迹线102a、102b、102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c的3电极布置。受体层105设置在电极103a、103b和103c的表面上。裂解-膜107设置在受体层105的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图4(e)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。具有连接到导电迹线102a、102b、102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c的3电极布置。受体层105和裂解盐层108都设置在电极层103a、103b和103c的顶部上。
图4(f)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。具有连接到导电迹线102a、102b、102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c的3电极布置。受体层105和裂解盐层108都是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
如图4(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)所示的实施方案用于测量血液样品中的血红蛋白生物分析物。
如图5(a)所示，示出了用于检测糖化血红蛋白的本发明电化学活性装置的顶视图。
图5(b)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105设置在受体-膜104的表面上。裂解-膜107设置在受体层105的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图5(c)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都设置在受体-膜104上。
图5(d)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105设置在电极103a、103b和103c的表面上。裂解-膜107设置在受体层105的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图5(e)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都设置在电极层103a、103b和103c的顶部上。
图5(f)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
图5(g)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105设置在受体-膜104的表面上。糖化血红蛋白过滤膜109设置在受体层105的顶部。硼酸类硼酸盐/酯亲和物质110设置在血红蛋白过滤膜109的顶部。裂解-膜107设置在硼酸盐/酯亲和剂110的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图5(h)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105设置在受体-膜104上。糖化血红蛋白过滤膜109设置在受体层105的顶部。硼酸类硼酸盐/酯亲和物质110连同裂解盐层108一起设置在血红蛋白过滤膜109的顶部上。
图5(i)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105、裂解盐层108和硼酸盐/酯亲和物质110一起设置在位于电极顶部的糖化血红蛋白过滤膜109上。
如图5(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)所示的实施方案用于测量血液样品中的百分比糖化血红蛋白(％GHb)生物分析物。
如图6(a)所示，示出了用于检测血液样品中的绝对高铁血红蛋白生物分析物的本发明电化学活性装置的顶视图。
图6(b)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105b设置在受体-膜104的表面上。裂解-膜107设置在受体层105b的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图6(c)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都设置在受体-膜104上。
图6(d)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105设置在电极103a、103b和103c的表面上。裂解-膜107设置在受体层105的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图6(e)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都设置在电极层103a、103b和103c的顶部上。
图6(f)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105和裂解盐层108都是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
图6(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)中所示的实施方案用于测量血液样品中的绝对高铁血红蛋白(MetHb)生物分析物。
如图7(a)所示，示出了用于血液样品中的百分比血红蛋白测量的本发明电化学活性装置的顶视图。
图7(b)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105a设置在受体-膜104的表面上。裂解-膜107设置在受体层105a的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图7(c)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105a和裂解盐层108都设置在受体-膜104上。
图7(d)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105a设置在电极103a、103b和103c的表面上。裂解-膜107设置在受体层105a的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图7(e)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105a和裂解盐层108都设置在电极层103a、103b和103c的顶部上。
图7(f)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的左半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的左半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105a和裂解盐层108都是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
图7(g)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105b设置在受体-膜104的表面上。裂解-膜107设置在受体层105b的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图7(h)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105b和裂解盐层108都设置在受体-膜104上。
图7(i)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105b设置在电极103a、103b和103c的表面上。裂解-膜107设置在受体层105b的表面上。裂解盐层108设置在裂解-膜107的表面上。
图7(j)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105b和裂解盐层108都设置电极层103a、103b和103c的顶部上。
图7(k)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上在基板101的右半部分中设置有导电迹线102a、102b和102c。基板101的右半部分中的3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105b和裂解盐层108都是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
如图7(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)和(k)中所述的实施方案用于测量血液样品中的百分比高铁血红蛋白(％MetHb)生物分析物。
如图8(a)所示，描绘了用于肌红蛋白检测的具有三电极系统的电化学活性装置的顶视图。
图8(b)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体-膜104设置在电极103a、103b和103c的表面上。受体层105设置在受体-膜104的表面上。
图8(c)是描绘基板101的相应横截面图，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105设置在电极103a、103b和103c的表面上。
图8(d)是一个相应横截面图，其描绘了基板101，基板101的表面上设置有导电迹线102a、102b和102c。3电极布置具有连接到导电迹线102a、102b和102c的工作电极103a、对电极103b和参考电极103c。受体层105是电极层103a、103b和103c的一体化部件。
图8(a)、(b)、(c)和(d)所示的实施方案用于测量血液样品中的肌红蛋白生物分析物。
因此，本发明提供了一种用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，包括设置在基板上的至少一对导电迹线。连接到导电迹线的至少双电极构件。该装置设置有具有一体化受体-膜并设置在电极构件上的受体。裂解剂设置成与受体化学接触以接收血液样品，并从血液样品的红细胞(RBC)中释放非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物。受体设置在双电极构件上，以接收非电化学活性的血红蛋白生物分析物及其复合物，并将非电化学活性的血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性的生物分析物及其电化学活性复合物。在交替的实施方案中，受体直接设置在所述至少双电极构件上，而没有受体-膜。
本发明的装置设置在壳体中，其中壳体是筒或盒。
至此，描述了电化学活性装置的说明性实施方案。现在，通过参考图9描述保持电化学活性装置的装置保持器的说明性实施方案。用于感测血液样品中的生物分析物的装置保持器200包括具有装置检测和内部电路的壳体201。装置保持器200适于优选地连接到具有显示构件的外部处理器。装置插入端口203设置在壳体201中。允许通过装置插入端口203的本发明的装置100被设置成接收减少体积的所需血液样品。USB插头202连接到壳体201，如图9所示。装置保持器200用于收集和保留生物样品用于随后的测试。装置保持器200还设置有装置检测、数据存储、信号调节和数据获取特征，以识别存储在装置100上的生物分析物的类型。装置保持器200使得用户能够将保持器200插入生物传感器中，并且收集生物样品用于测量。
因此，本发明提供了用于保持具有所需血液样品的电化学活性装置100的装置保持器200。装置保持器200具有设置在壳体201中的装置检测和信号调节电路。USB连接器202设置在壳体201的一端，并且导电端口203设置在壳体201的另一端。用于收集和保留血液样品的电化学活性装置100通过导电端口203连接到装置保持器200。装置100设置有最少对的导电迹线102a和102b，其被图案化或设置在基板101上。双电极构件103a和103b连接到该对导电迹线102a和102b。受体105与受体膜104一体化并且设置在双电极构件103a和103b上。裂解剂与受体105化学连接以接收血液样品并从血液样品的红细胞(RBC)中释放非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物。在该布置中，受体105设置为接收非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物，并将非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物和电化学复合物。
本发明的装置保持器200在插入具有显示单元的处理器之后启动。然后将装置装载到装置保持器200中。设置在壳体200内的设备检测电路装置或电路适于检测指定的装置。当装置保持器200检测到装置时，然后向装置100装载生物样品，并且通过数模转换器(DAC)中的内部电路将所需的氧化还原电位相对于参考电极施加到装置100的工作电极。使用I-V的转换器通过内部电路测量通过对电极和工作电极的氧化还原电流。
用于感测生物样品中的生物分析物的护理点生物传感器300，如图10(a)所示，生物传感器包括壳体301。设置在壳体301上的微型USB 302和微型SD卡303。微型USB 302用于对生物传感器300充电，微型SD卡用作存储装置。壳体301还设置有显示构件304，其可以是LCD、LED、OLED、OMLED、TFT或包括触敏设备的任何其它这样的显示装置。装置插入端口305设置在壳体301中。装置插入端口305设置有金属接触件以通过电的方式接合所述装置。换句话说，设置插入端口305以通过装置100的电极构件接收装置100。提供护理点生物传感器300以便于用户以简单的方式与护理点生物传感器300一起使用装置100。最初将装置100插入装载的护理点生物传感器300中，并装载1-300μL范围内的减少体积的选择的生物样品，所述范围需要最小侵入手段收集生物样品。用户也可以在室温下随意使用生物传感器300，而不用考虑其他环境因素，例如湿度、温度变化和存储条件。通过使用生物传感器300，用户能够在大幅缩短的时间内测量所需生物分析物的浓度水平，因为生物分析物瞬时结合受体。由于在生物传感器300中利用生物分析物的固有结合性质来测量浓度水平，因此在显示构件304上向用户提供生物分析物的浓度的即时和准确的显示。通过使用本发明的生物传感器300，用户能够使用生物传感器，而不需要在测试之前主动制备生物样品。
现在，参考图10(b)来描述护理点生物传感器300的内部电子硬件架构。数据库构件306设置在壳体301中，以存储血液样品中存在的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白的氧化还原电流和生物分析物浓度的标准值。数据库306还包括与生物分析物的浓度的历史和当前数据有关的数据。执行生物传感器300的各种功能所需的可执行文件存储在护理点生物传感器300的介质上。数字控制器307设置在壳体301中并且连接到数据库构件306，并且被配置为向具有电化学活性受体的至少双电极构件施加氧化还原电位并测量相应的氧化还原电流，所述电化学活性受体具有具血红蛋白及其复合物的血液样品。数字控制器307被设置为通过与浓度值线性匹配来测量血红蛋白生物分析物及其复合物的氧化还原电流，并显示血红蛋白生物分析物及其复合物的测量的浓度值。
施加到护理点生物传感器300的电源由连接到生物传感器300的电源单元308调节。电源单元308包括具有充电电路的在线和离线可再充电电池。信号调节和装置检测单元309连接到微控制器307，以检测护理点生物传感器300中装置100的存在，并将氧化还原电位施加到电极并测量来自所选生物样品的氧化还原电流。湿度和温度传感器310和311设置在壳体301中。一旦通过微控制器307完成生物分析物的浓度水平的测量，将浓度水平连同所需生物分析物的浓度水平的历史数据一起显示在显示构件304上。
因此，用于测量血液样品中生物分析物浓度的护理点生物传感器包括具有显示构件和导电端口的301。用于收集和保留血液样品的电化学活性装置100通过导电端口203连接到装置保持器200。装置100设置有最少对的导电迹线102a和102b，其是图案化的或设置基板101上。双电极构件103a和103b连接到该对导电迹线102a和102b。受体105与受体-膜104一体化并且设置在双电极构件103a和103b上。裂解剂与受体105化学连接以接收血液样品并从血液样品的红细胞(RBC)中释放非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物。在该布置中，受体105被配置为接收非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物，并将非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物转化为电化学活性生物分析物和电化学复合物。数字控制器设置在壳体中并且被配置为施加氧化还原电位并且测量来自装置的氧化还原电流。数字控制器还被配置为通过线性匹配血红蛋白及其复合物的浓度来检索和显示血红蛋白及其复合物的浓度水平。护理点生物传感器的数据库构件被配置为存储血液样品中的血红蛋白生物分析物及其复合物的浓度的标准值以及相应的氧化还原电流连接到数字控制器。
本发明还提供了用于精确检测和定量测量血液样品中的血红蛋白生物分析物及其复合物的方法。根据标准方案，通过微创手段以非常小的体积(即微升(μL)的范围)从人受试者收集所需的血液样品。在本发明的方法中，可用于测量生物分析物的生物样品的优选体积优选在1-300微升(μL)的范围内。所需的样品体积受装置的受体的表面积的大小支配。减少的样品收集显著减小了受试者的创伤，因为其通过微创样品提取技术获得。减少体积的生物样品还避免了用户需要采血器收集产品。
在本发明的方法中，通过实施电化学的原理来进行生物分析物的测定和精确测量。因此，有利地选择来测量的生物分析物是球状蛋白——血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白，其通过在施加电位后测量通过电化学活性装置的氧化还原电流来测量。
在本发明的方法中，受体物质有利地作为如下文所述的优选化学物质的溶液制备。例如，在选择吡啶和NaOH作为优选受体的情况下，NaOH优选溶解在蒸馏水或可溶解这些物质的任何其它溶剂中。
在基于咪唑的受体物质的情况下，优选溶解在蒸馏水或可溶解这些物质的任何其它溶剂中。
在使用亚甲蓝(MB)作为受体的情况下，化学物质优选溶解在蒸馏水或任何其它能够溶解这种化学物质的溶剂中。
在使用亚甲基蓝(MB)和氧化剂优选地NaNO2作为受体的情况下，化学物质优选溶解在蒸馏水或可以溶解这种化学物质的任何其它溶剂中。
在使用无机物质优选地NaOH作为受体的情况下，化学物质优选溶解在蒸馏水或可以溶解这种化学物质的任何其它溶剂中。
在施加生物样品之前，将如此制备的受体溶液施加到本发明的装置的电极构件或膜上。
可选地，在施加生物样品之前，将如此制备的受体溶液施加到装置的电极构件或膜上，并在使其在表面上干燥以形成本发明的化学层。
可选地，也可以将受体溶液与生物样品预混合，并将混合溶液施加到装置的电极构件或膜上。
因此，受体物质可以是有机物质或无机物质或这些物质的组合。
在本发明的另一个方面，有机物质选自由具有N-杂原子的杂环有机物质，优选吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶、嘌呤，更优选吡啶和咪唑组成的组。
在本发明的另一个方面，现在描述用于检测和测量血红蛋白的方法。为了测试血液样品中血红蛋白的存在，使减少体积的生物样品(血液)与本发明的装置的受体化学性接触。
血红蛋白的结构吸引研究人员对这种分子进行电化学检测。血红蛋白在其结构中包含四个氧化态+2的铁，但是在其天然形式中，该铁深埋在球蛋白链中并且不可用于参与电化学反应。
如图11所示，血红蛋白根据溶液的条件显示不同的铁氧化态。在碱性条件下，血红蛋白可通过分离球蛋白部分而转化为碱性高铁血红素(hematin)。高铁血红素是血红蛋白结构中血红素辅基的氧化形式。高铁血红素是相对小的分子，并且可以比血红蛋白分子更容易与电极表面连通。如图12所示，高铁血红素在循环伏安法中产生还原峰。然而，高铁血红素显示良好的还原峰，但是用于总血红蛋白的电化学检测的碱性高铁血红素法不是优选的。基于碱性高铁血红素的血红蛋白的电化学检测的还原电流响应不是线性的，这是因为在碱性溶液中，高铁血红素形成二聚体并吸附在电极表面，因此阻断电极界面处的任何电荷转移。因此，如图13(a)和图13(b)所示，难以获得可重复的线性响应。在水溶液中，高铁血红素产生不可逆的还原峰。吸附后，很难得到线性电流响应。
在本发明的一个方面，用于血红蛋白检测的受体是吡啶和NaOH。
高铁血红素的卟啉环满足三价铁的四个XY配位位置。两个剩余的配位位置在Z轴上垂直位于所述铁的上方和下方。当Z轴上的这些位置被π-键配体如吡啶、咪唑、氰化物或其它具有N-杂原子的杂环化学物质占据并形成配位复合物时，这些复合物也称为高铁血色原(hemichrome)。高铁血色原由杂环试剂的氮碱基(nitrogen base)的配位形成并且在循环伏安法实验中产生可逆的氧化还原峰，如图14(a)和(b)所示。吡啶高铁血色原形成的流程图总结在图15中。
考虑到非电化学活性血红蛋白转化为电化学活性的吡啶高铁血色原，选择吡啶和NaOH作为配体受体，以检测血红蛋白浓度。使用吡啶高铁血色原的峰值氧化还原电流值来比较血液样品中血红蛋白浓度的变化。
在测量所需血液样品中的血红蛋白浓度之前。收集多份人血液样品中与标准血红蛋白浓度(g/dL)有关的数据并将其存储在数据库构件中。因此，数据库构件含有标准血红蛋白浓度(g/dL)的值以及吡啶高铁血色原的相应氧化还原电流值(μA)。以迭代方式获得指定浓度的优选氧化还原电流值，其中对于所选择的血红蛋白浓度，重复测试导致相同的氧化还原电流值。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且通过生物传感器确保并显示匹配的血红蛋白浓度。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取了血液样品中的血红蛋白浓度值后显示该值。
现在，通过参考图16来描述测量生物分析物的方法步骤。选择本发明的生物传感器并启动。然后将装置装载到生物传感器中。生物传感器适于指示检测指定的装置。当生物传感器检测到装置时，向装置装载生物样品，并且通过数模转换器(DAC)将所需的氧化还原电位相对于参考电极施加到装置的工作电极。氧化还原电位是化学物质获得电子并因此被还原的趋势的量度。每种化学物质都有自己固有的氧化还原电位。电位越正，物质对于电子的亲和力和被还原的趋势越大。通过使用I-V转换器测量通过对电极和工作电极的氧化还原电流。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且通过生物传感器确保和显示匹配的血红蛋白浓度。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取了血液样品中的血红蛋白浓度值后显示该值。
在本发明方法的另一个方面，采用咪唑作为受体，使用SDS作为裂解和氧化剂，以形成咪唑-高铁血红蛋白复合物。SDS裂解RBC并将血红蛋白分子转化为其中铁的氧化态为+3的高铁血红蛋白分子。咪唑的N-杂原子与该铁配位并形成咪唑-高铁血红蛋白复合物，其显示可逆的CV。考虑到咪唑与高铁血红蛋白的配位表现出还原和氧化电流峰，选择咪唑作为受体，以检测血红蛋白浓度。
考虑到将非电化学活性血红蛋白转化为电化学活性咪唑-高铁血红蛋白复合物，选择咪唑和/或氧化剂作为配体受体以检测血红蛋白浓度。使用咪唑-高铁血红蛋白复合物的峰值氧化还原电流来比较血红蛋白值的变化。
在测量所需血液样品中的血红蛋白浓度之前。收集多份人血液样品中与标准血红蛋白浓度(g/dL)有关的数据并将其存储在数据库构件中。因此，数据库构件含有标准血红蛋白浓度(g/dL)的值以及咪唑高铁血红蛋白复合物的相应氧化还原电流值(μA)。以迭代方式获得指定浓度的优选氧化还原电流值，其中对于所选择的血红蛋白浓度，重复测试导致相同的氧化还原电流值。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且通过生物传感器确保并显示匹配的血红蛋白浓度。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取了血液样品中的血红蛋白浓度值后显示该值。
在本发明的另一个方面，通过使用本发明的生物传感器确定糖化血红蛋白的浓度。如此使用的生物传感器有利地具有如图5(a)所示的电极配置。两组电极中的每一组用咪唑和裂解剂处理。电极组中的一组设置有用硼酸或其衍生物处理的膜。
硼酸和硼酸衍生物对碳水化合物如葡萄糖、糖化蛋白如糖化血红蛋白具有亲和力。在本发明中，硼酸亲和原理(或硼酸盐/酯亲和原理)用于从总血红蛋白组分中分离糖化血红蛋白组分。
将减少量的血液施加到两组电极上，并且进行如图17所示的处理步骤。氧化还原电位施加到这两组电极，并且从这些电极测量相应的氧化还原电流。通过计算两组电极中测量的氧化还原电流的差异，获得糖化血红蛋白的浓度。
考虑到将非电化学活性血红蛋白转化为电化学活性咪唑-高铁血红蛋白复合物，选择咪唑和/或氧化剂作为配体受体，以检测总血红蛋白和没有糖化血红蛋白组分的血红蛋白浓度。将这两种组分的差用于计算糖化血红蛋白的百分比(％GHb)。咪唑-高铁血红蛋白复合物的峰值氧化还原电流用于比较血液样品中的糖化血红蛋白的变化。
在测量所需血液样品中的血红蛋白浓度之前。收集多份人血液样品中与标准血红蛋白浓度(g/dL)有关的数据并将其存储在数据库构件中。因此，数据库构件含有标准血红蛋白浓度(g/dL)的值以及咪唑高铁血红蛋白复合物的相应氧化还原电流值(μA)。以迭代方式获得指定浓度的优选氧化还原电流值，其中对于所选择的血红蛋白浓度，重复测试导致相同的氧化还原电流值。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且通过生物传感器确保并显示匹配的血红蛋白浓度。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取了血液样品中的血红蛋白浓度值后显示该值。
亚甲基蓝(MB)是公知的电化学氧化还原染料。MB在循环伏安图中显示可逆的氧化还原峰，如图18所示。MB通常用在用于DNA染色的生物学中和作为高铁血红蛋白血症的解毒剂。在高铁血红蛋白血症治疗中，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)酶的存在下，MB(通过获得电子)还原成无色亚甲基蓝(leucomethyleneblue，LMB)。此后，LMB向高铁血红蛋白分子中的三价铁形式(Fe+3)的铁提供电子，并将其转化回血红蛋白分子中的亚铁形式(Fe+2)。在NADPH酶的存在下将MB还原成LMB是该过程的关键，如图19所示。在本发明中，使用循环伏安法通过电化学途径将MB还原成LMB。如果在还原形式的MB(LMB)中加入任何含Fe+3的元素或元素三价铁，则MB将其电子提供给三价铁形式(Fe+3)并将其还原成亚铁形式的铁(Fe+2)。在该反应中，LMB进一步氧化成MB形式，而Fe+3形式的铁还原成铁Fe+2形式，如以下反应所示：
MB+2e-+H+→LMB
LMB+2Fe+++→MB+2Fe++
在本发明的另一个方面，用于高铁血红蛋白检测的受体是亚甲基蓝(MB)。
由于从LMB向Fe+3提供电子引起的催化电流，在加入高铁血红蛋白之后，MB的还原电流峰值增加。
基于高铁血红蛋白与MB的活性的上述原理，在本发明的方法中，采用基于MB的受体用于高铁血红蛋白检测。如此使用的生物传感器有利地具有如图6所示的电极配置。将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且用生物传感器确保和显示匹配的高铁血红蛋白浓度。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取了血液样品中的高铁血红蛋白浓度值后显示该值。
在本发明关于总血红蛋白(Hb)中检出的高铁血红蛋白的百分比(％MetHb)的一个方面，使用亚甲基蓝(MB)和咪唑的组合作为受体。
在本发明的另一个方面，通过使用本发明的生物传感器确定高铁血红蛋白的百分比(％MetHb)。如此使用的生物传感器有利地具有如图7(a)所示的电极配置。用咪唑和裂解剂处理两组电极中的一组。另一组电极提供有MB。
将减少量的血液或血浆施加到两组电极上并且进行如图20所示的处理步骤。将氧化还原电位施加到两组电极，并且从这些电极测量相应的氧化还原电流。通过计算两组电极中测量的浓度的差异，获得百分比MetHb浓度。
在测量所需血液样品中的％MetHb之前。收集多份人血液样品中与标准血红蛋白浓度(g/dL)和标准高铁血红蛋白浓度有关的数据并将其存储在数据库构件中。因此，数据库构件含有标准血红蛋白和高铁血红蛋白浓度(g/dL)的值以及相应氧化还原电流值。以迭代方式获得指定浓度的优选氧化还原电流值，其中对于所选择的血红蛋白和高铁血红蛋白浓度，重复测试导致相同的氧化还原电流值。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且确保匹配的血红蛋白和高铁血红蛋白浓度并用于计算％MetHb。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在具有氧化还原电流值之后，计算高铁血红蛋白百分比值并显示该值。
在本发明的另一个方面，MB-NaNO2受体的组合用于检测血红蛋白。在裂解RBC后，氧化剂将所有血红蛋白组分转化为高铁血红蛋白，其可以通过使用亚甲基蓝作为受体来检测。在NaNO2-MB的组合作为用于总血红蛋白检测的受体的情况下，由于当MB溶液中加入高铁血红蛋白时还原的亚甲蓝形式(LMB)将其电子提供给高铁血红蛋白复合物并增加电极表面的MB浓度的事实，峰值还原电流增加。如此使用的生物传感器有利地具有如图4(a)所示的电极配置。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且匹配的总血红蛋白浓度由生物传感器确保并显示。可选地，线性拟合方程也可以用于通过使用氧化还原电流值来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取出血液样品中的总血红蛋白浓度值后显示该值。
在本发明的另一个方面，使用NaOH作为受体来测定人血液样品中的肌红蛋白含量。上述受体与这种生物样品一起用于上述步骤，以确定肌红蛋白含量。如此使用的生物传感器有利地具有如图8(a)所示的电极配置。
在碱性条件下，肌红蛋白可通过分离球蛋白部分而转化为碱性高铁血红素。高铁血红素是血红蛋白结构中血红素辅基的氧化形式。高铁血红素是相对小的分子，并且可以比血红蛋白分子更容易与电极表面连通。如图12所示，高铁血红素在循环伏安法中产生还原峰。高铁血红素显示良好的还原峰，可用于人血浆中肌红蛋白的电化学检测。
这里应当注意，与人血液中的血红蛋白相比，肌红蛋白的生理浓度非常低，因此在肌红蛋白的检测中二聚体形成不明显。
基于碱性高铁血红素的肌红蛋白的电化学检测的还原电流响应是线性的，这是由于与血红蛋白相比肌红蛋白的浓度非常低的事实，并且我们利用肌红蛋白浓度获得了氧化还原电流的线性响应。
将测量的氧化还原电流与存储的氧化还原电流值匹配，并且匹配的肌红蛋白浓度由生物传感器确保并显示。可选地，使用氧化还原电流值也可以使用线性拟合方程来计算生物分析物的浓度。生物传感器在提取血液样品中的肌红蛋白的浓度值之后显示该值。
因此，本发明的方法定量和精确地测量血液样品中血红蛋白生物分析物及其复合物的浓度。在该方法中，将氧化还原电流施加到具有连接到该对导电迹线的电极构件的电化学活性装置。使具有血红蛋白分析物及其复合物的所需血液样品与双电极构件的裂解剂接触。在接触时，血液样品的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物从红细胞(RBC)释放。释放的非电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物通过与受体-膜一体化的受体转变为相应的电化学活性血红蛋白生物分析物及其复合物。通过测量相应的氧化还原电流并将其与血红蛋白及其复合物的浓度线性匹配来确定电化学活性血红蛋白及其复合物的浓度。
在本发明的方法中，减少体积的血液样品在1-300微升(μL)的范围内。
现在以下列实施例的形式说明本发明的主题。提供这些实施例是为了说明的目的，并且不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1：使用吡啶和NaOH作为受体测定血液血红蛋白浓度和相应的还原电流
用4ml冷去离子(DI)水裂解1.5ml全血。将2ml的1％NaOH加入到该裂解溶液中以将血红蛋白成分转化为高铁血红素。将1.5ml吡啶加入到高铁血红素溶液中以将其转化为吡啶高铁血色原。从该主溶液，通过适当稀释吡啶高铁血色原溶液制备不同浓度的血红蛋白溶液。300μL的最终体积用于测试。
获取所需体积的血液样品并将其分配在生物传感器装置的电极上，并且通过使用CHI电化学工作站的值获得相应的循环伏安图，其使用的电位窗变化为0.4V至-1.2V，扫描速率为0.6V/sec，如图21(a)所示。
冷DI水裂解血液样品中的RBC并释放Hb分子。NaOH使血红蛋白分子变性并分离氯高铁血红素(hemin)和球蛋白部分。然后吡啶将氯高铁血红素转化为吡啶高铁血色原，其是电化学活性分子。因此，如图21(a)和21(b)所示，吡啶高铁血色原表现出峰值氧化还原电流随着血红蛋白浓度线性增加。如果血液样品中血红蛋白的浓度增加，氯高铁血红素的形成也增加，从而增加电极上的吡啶高铁血色原浓度，导致峰值氧化还原电流的增加。
记录血红蛋白的浓度值(g/dL)以及相应的氧化电流值(μA)，并如表1所示制成表格。
表1由如下给出的线性拟合方程制作，所述方程由重复性数据图导出：
y＝-10.37x-23.68
在上述方程中，“y”表示氧化还原电流值，“x”表示分析物的浓度。
表1
Hb浓度(g/dL) 氧化电流(μA)
0.96 81
1.2 104
1.44 134
1.68 116
1.92 188
2.16 199
2.4 232
实施例2：用吡啶和NaOH受体测量血红蛋白
将300μL样品体积的吡啶高铁血色原置于电极上，然后从在CHI电化学工作站中指定0.4V至-1.2V的电位窗的循环伏安图中记录峰值还原电流值。峰值还原电流的测量值为238μA。在表1中找到该电流值，并且检索到相应的血红蛋白浓度为2.4g/dL。
实施例3：使用吡啶和NaOH作为受体测定生理范围的血液血红蛋白浓度和相应的还原电流
用4ml冷去离子水裂解1.5ml全血。将2ml的1％NaOH加入到该裂解溶液中以将血红蛋白成分转化为高铁血红素。将固体牛氯高铁血红素加入该溶液中以进一步增加生理范围的高铁血红素含量。然后将1.5ml吡啶加入到高铁血红素溶液中，将其转化为吡啶高铁血色原。从该主溶液，通过适当稀释吡啶高铁血色原溶液制备不同浓度的血红蛋白溶液。300μL的最终体积用于测试。
获取所需体积的血液样品并将其分配在生物传感器装置的电极上，并且通过使用CHI电化学工作站的值获得相应的循环伏安图，其使用的电位窗变化为0.4V至-1.2V，扫描速率为0.6V/sec，如图22(a)所示。
冷DI水裂解血液样品中的RBC并释放Hb分子。NaOH使血红蛋白分子变性并分离氯高铁血红素和球蛋白部分。然后吡啶将氯高铁血红素转化为吡啶高铁血色原，其是电化学活性分子。因此，如图22(a)和22(b)所示，吡啶高铁血色原表现出峰值氧化还原电流随着血红蛋白浓度线性增加。如果血液样品中血红蛋白的浓度增加，将形成更多氯高铁血红素，从而增加电极上的吡啶高铁血色原浓度，导致峰值氧化还原电流的增加。
记录血红蛋白的浓度值(g/dL)以及相应的氧化电流值(μA)，并如表2所示制成表格。表2由如下给出的线性拟合方程制作，所述方程由重复性数据图导出：
y＝45.43-151.39
在上述方程中，“y”表示氧化还原电流值，“x”表示分析物的浓度。
表2
Hb浓度(g/dL) 氧化电流(μA)
4 38
8 208
12 391
17 674
21 788
25 958
实施例4：用吡啶和NaOH受体测量生理范围的血红蛋白
将300μL样品体积的吡啶高铁血色原置于电极上，然后在CHI电化学工作站中从指定0.4V至-1.2V的电位窗的循环伏安图中记录峰值还原电流值。峰值氧化电流的值为1014μA。在表1中搜索该电流值，并且获得相应的血红蛋白浓度为25g/dL。
实施例5：使用咪唑作为受体十二烷基硫酸钠(SDS)作为裂解剂测定生理范围的血液血红蛋白浓度和相应的还原电流。
将5gm的咪唑、200mg SDS溶解在10ml DI水中，然后将一滴100μL的这种溶液分散在一张滤纸膜上并在室温下干燥24小时。将该膜设置在图案化电极的顶部上。
取300μL体积的血液样品并分配在生物传感器装置的电极上，并且通过使用CHI电化学工作站的值获得相应的循环伏安图，其使用的电位窗变化为0V至-1.0V，扫描速率为0.6V/sec，如图23(a)所示。
在血液样品中，十二烷基硫酸钠(SDS)裂解RBC并将血红蛋白分子转化为氧化形式高铁血红蛋白。咪唑形成电化学活性的咪唑-高铁血红蛋白复合物。如图23(a)和图23(b)所示，对于更高的血红蛋白浓度，咪唑-高铁血红蛋白复合物的量更高，从而表现出峰值氧化还原电流随着血红蛋白浓度线性增加。如果血液样品中血红蛋白的浓度增加，则形成更多的高铁血红蛋白，从而增加电极上的咪唑-高铁血红蛋白复合物浓度，导致峰值氧化还原电流的增加。
记录血红蛋白的浓度值(g/dL)以及相应的氧化电流值(μA)，并如表3所示制成表格。表3由如下给出的线性拟合方程制作，所述方程由重复性数据图导出：
y＝7.090x+83.044
在上述方程中，“y”表示氧化还原电流值，“x”表示分析物的浓度。
表3
Hb浓度(g/dL) 氧化电流(μA)
2 95
4.5 118
9 150
13.4 174
实施例6：使用咪唑作为受体和SDS作为裂解剂测量生理范围的血红蛋白
将300μL样品体积的全血的置于固定在电极顶部的膜上，然后在CHI电化学工作站中从指定0V至-1.0V的电位窗的循环伏安图中记录峰值还原电流值。峰值氧化电流的值为144μA。在表1中找到该电流值，并且由此获得相应的血红蛋白浓度为9g/dL。
实施例7：使用咪唑作为受体和SDS作为裂解剂测定生理范围的百分比糖化血红蛋白(％GHb)浓度和相应的还原电流。
将1.5gm咪唑、100mg SDS溶解在10ml DI水中，然后将一滴100μL的这种溶液分散在一张滤纸膜上并在室温下干燥24小时。该膜用于检测全血液样品品中的总血红蛋白。
将1.5gm咪唑、100mg SDS和310mg氨基苯基硼酸(APBA)溶解在10ml DI水中，然后将一滴100μL的这种溶液分散在一张滤纸膜上并在室温下干燥24小时。该膜用于检测全血液样品中没有糖化血红蛋白成分的血红蛋白成分。
取300μL体积的血液样品并分配在固定在生物传感器装置的两组三电极的顶部上的膜上，并且通过使用CHI电化学工作站的值获得相应的循环伏安图，其使用的电位窗变化为0V至-1.0V，扫描速率为0.6V/sec，如图24所示。
在血液样品中，十二烷基硫酸钠(SDS)裂解RBC并将血红蛋白分子转化为氧化形式高铁血红蛋白。咪唑形成电化学活性的咪唑-高铁血红蛋白复合物。咪唑-高铁血红蛋白复合物因此表现为峰值氧化还原电流随着血红蛋白浓度线性增加，如图24所示。如果血液样品中血红蛋白的浓度增加，则形成更多的高铁血红蛋白，从而增加电极上的咪唑-高铁血红蛋白复合物浓度，导致峰值氧化还原电流的增加。
用氨基苯基硼酸(APBA)处理第二膜以过滤血液样品中的糖化血红蛋白成分，并获得没有糖化血红蛋白成分的血红蛋白信号，如图25所示。
百分比糖化血红蛋白与通过使用下式计算的具有和不具有糖化血红蛋白组分的氧化电流的百分比变化成比例，：
Figure GDA0001241114280000291
其中ΔIox是电流的百分比变化，I-ox是总血红蛋白的氧化电流，I-ox-APBA是不存在糖化血红蛋白组分时血红蛋白的氧化电流。
记录百分比糖化血红蛋白的浓度值以及氧化电流的相应百分比变化，并制成表4所示的值。
表4由如下给出的线性拟合方程制作，所述方程由重复性数据图导出：
y＝7.2233x+26.064
在上述方程中，“y”表示氧化还原电流值，“x”表示分析物的浓度。
表4
％GHb 氧化电流的百分比变化(％)
5.3 60
6.3 71.875
7.3 85.10638298
8.8 93.65079365
9.4 89.02439024
10.3 99.11392405
实施例8：用咪唑作为受体和SDS作为裂解剂测量生理范围的百分比糖化血红蛋白。
将300μL样品体积的全血的置于固定在两组三个电极的顶部上的膜上，然后在CHI电化学工作站中从指定0V至-1.0V的电位窗的循环伏安图中记录峰值还原电流值。总血红蛋白血液样品的峰值氧化电流值为80μA，而没有糖化血红蛋白组分的峰值氧化电流值为32μA。％GHb计算如下：
Figure GDA0001241114280000301
在表4中找到该电流值，并且因此获得对应的％GHb为5.3。
实施例9：使用NaOH作为受体测定生理范围的肌红蛋白浓度和相应的氧化还原电流。
在磷酸盐缓冲盐水中制备Sigma肌红蛋白的标准溶液。将1％NaOH溶液加入肌红蛋白溶液中。NaOH破坏肌红蛋白结构并释放游离的碱性高铁血红素。
峰值还原电流线性地取决于肌红蛋白浓度的浓度。因此，样品中增加的肌红蛋白的量增加碱性高铁血红素的量。
将300μL肌红蛋白样品分配在生物传感器装置的电极上，并且通过使用CHI电化学工作站的值获得相应的循环伏安图，其使用的电位窗变化为-0.30V至-0.9V，扫描速率为0.1V/sec，如图26所示。
峰值还原电流线性地依赖于肌红蛋白浓度，如图27所示
记录肌红蛋白的浓度值(ng/ml)以及相应的还原电流值(μA)，并如表5所示制成表格。
表5由如下给出的线性拟合方程制作，所述方程由重复性数据图导出：
y＝0.0432x+10.096
在上述方程中，“y”表示氧化还原电流值，“x”表示分析物的浓度。
表5
肌红蛋白(ng/ml) 还原电流(μA)
10 13
100 16
333 20.5
666 33.8
833 46
1000 57.8
实施例10：用NaOH作为受体测量生理范围的肌红蛋白。
将300μL样品体积的全血的置于电极的顶部，然后在CHI电化学工作站中从指定-0.3V至-0.9V的电位窗的循环伏安图中记录峰值还原电流值。峰值氧化电流的值为46μA。在表1中搜索该电流值，并且因此获得肌红蛋白的相应浓度为833ng/ml。
本发明的优点
在本发明中，将基于非酶促和非抗体的受体与电极结合用于定量测量血液样品中的生物分析物，即血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白样品
本发明采用将人血红蛋白及其复合物转化电化学活性物质的方法来用于以电化学的方式检测与人血红蛋白相关的生物分析物。
在本发明的生物分析物的定量测量中，使用减少体积的样品体积的微创技术。
还应当理解，所附权利要求旨在覆盖本文所描述的本发明的所有一般和具体特征以及由于语言原因而被认为落入其之间的本发明范围的所有陈述。

Claims (30)

1.一种用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，包括：
(i) 设置在基板上的至少一对导电迹线；
(ii) 具有裂解膜的包括至少两个电极的至少一个电极构件，其中所述至少两个电极连接到所述至少一对导电迹线并且被配置为接收血液样品，并从所述血液样品中释放包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物；
(iii) 具有一体化受体-膜的N-杂环有机受体，其选自由吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤组成的组，其设置在所述至少一个电极构件和所述裂解膜之间，其中所述受体被配置为与所述生物分析物形成为电化学活性受体-高铁血色原的配位复合物，并且在施加氧化还原电位时提供可逆的氧化还原电流峰。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述基板是聚合物或纸。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个电极构件包括三个电极，所述至少一个电极构件设置在所述基板上。
4.根据权利要求1所述的装置，包括多个包括两个电极的电极构件，其设置在所述基板上。
5.根据权利要求1所述的装置，包括多个包括三个电极的电极构件，其设置在所述基板上。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述至少一个电极构件包括图案化电极。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述受体-膜包括聚合物、纤维素、硝化纤维素、棉织物或纸。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述受体-膜包括尼龙。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述裂解膜包括至少一种裂解剂。
10.根据权利要求9所述的装置，其中所述裂解剂选自由二辛基磺基琥珀酸钠、十二烷基苯磺酸钠、月桂基二甲基氧化胺、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、铁氰化钾、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、亚硝酸钠、鲸蜡基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、N-月桂酰肌氨酸、双十二烷基二甲基溴化铵、辛基酚环氧乙烷缩合物和盐酸组成的组。
11.根据权利要求10所述的装置，其中所述裂解剂选自由十二烷基硫酸钠和双十二烷基二甲基溴化铵组成的组。
12.根据权利要求9所述的装置，其中所述裂解剂与选自NaOH或KOH的无机物质组合。
13.根据权利要求1所述的装置，其中所述生物分析物是非电化学活性的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)或肌红蛋白。
14.根据权利要求1或13所述的装置，其中当所述生物分析物是糖化血红蛋白时，糖化血红蛋白膜设置在所述裂解膜下方且在具有所述受体-膜的所述至少一个电极构件上并且用硼酸盐/酯亲和剂处理，所述硼酸盐/酯亲和剂选自由硼酸及其衍生物组成的组。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为苯基硼酸(PBA)。
16.根据权利要求14所述的装置，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为氨基苯基硼酸(APBA)。
17.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置设置在壳体中，所述壳体是筒或盒。
18.一种用于保持具有血液样品的电化学活性装置的保持器，所述保持器包括：
(i) 设置在壳体中的装置检测和信号调节装置；
(ii) 设置在所述壳体的一端的USB连接器和设置在所述壳体的另一端的导电端口；和
(iii) 通过所述导电端口连接到所述保持器的用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，其中所述装置包括：设置在基板上的至少一对导电迹线，具有裂解膜的包括至少两个电极的至少一个电极构件，其中所述至少两个电极连接到所述至少一对导电迹线并且被配置为接收血液样品，并从所述血液样品中释放包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物；具有一体化受体-膜的N-杂环有机受体，其选自由吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤组成的组，其设置在所述至少一个电极构件和所述裂解膜之间，其中所述受体被配置为与所述生物分析物形成为电化学活性受体-高铁血色原的配位复合物，并且在施加氧化还原电位时提供可逆的氧化还原电流峰。
19.根据权利要求18所述的保持器，其中当所述生物分析物是糖化血红蛋白时，糖化血红蛋白膜设置在所述裂解膜下方且在具有所述受体-膜的所述至少一个电极构件上并且用硼酸盐/酯亲和剂处理，所述硼酸盐/酯亲和剂选自由硼酸及其衍生物组成的组。
20.根据权利要求19所述的保持器，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为苯基硼酸(PBA)。
21.根据权利要求19所述的保持器，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为氨基苯基硼酸(APBA)。
22.一种用于测量血液样品中生物分析物的浓度的护理点生物传感器，所述生物传感器包括：
(i) 具有显示构件和导电端口的壳体；
(ii) 通过所述导电端口连接到保持器的用于收集和保留血液样品的电化学活性装置，所述装置具有：设置在基板上的至少一对导电迹线；具有裂解膜的包括至少两个电极的至少一个电极构件，其中所述至少两个电极连接到所述至少一对导电迹线并且被配置为接收血液样品并从所述血液样品中释放包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物；具有一体化受体-膜的N-杂环有机受体，其选自由吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤组成的组，其设置在所述至少一个电极构件和所述裂解膜之间，其中所述受体被配置为与所述生物分析物形成为电化学活性受体-高铁血色原的配位复合物，并且在施加氧化还原电位时提供可逆的氧化还原电流峰；和
(iii) 数字控制器，其设置在所述壳体中并且被配置为施加氧化还原电位并测量来自所述装置的氧化还原电流，通过线性匹配血红蛋白及其复合物的浓度来检索和显示血红蛋白及其复合物的浓度水平。
23.根据权利要求22所述的护理点生物传感器，其中当所述生物分析物是糖化血红蛋白时，糖化血红蛋白膜设置在所述裂解膜下方且在具有所述受体-膜的所述至少一个电极构件上并且用硼酸盐/酯亲和剂处理，所述硼酸盐/酯亲和剂选自由硼酸及其衍生物组成的组。
24.根据权利要求23所述的护理点生物传感器，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为苯基硼酸(PBA)。
25.根据权利要求23所述的护理点生物传感器，其中所述硼酸盐/酯亲和剂为氨基苯基硼酸(APBA)。
26.根据权利要求22所述的护理点生物传感器，其中数据库构件连接到所述数字控制器，所述数据库构件存储有血液样品中的包括血红蛋白或其复合物的生物分析物浓度的标准值以及相应的氧化还原电流。
27.一种用于测量血液样品中包括血红蛋白或其复合物的生物分析物的浓度的方法，包括以下步骤：
(i) 在具有含有裂解膜的包括至少两个电极的至少一个电极构件以及具有一体化受体-膜的选自由吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤组成的组的N-杂环有机受体的装置上，接收具有包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物的血液样品；
(ii) 从所述血液样品中释放包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物；
(iii) 采用所述生物分析物形成为电化学活性受体-高铁血色原的配位复合物；
(iv) 向所述至少一个电极构件施加氧化还原电压并且通过测量相应氧化还原电流来确定电化学活性受体-高铁血色原的浓度；以及
(v) 通过将所述氧化还原电流与血红蛋白及其复合物的浓度线性匹配来确定所述血液样品中的血红蛋白及其复合物的浓度。
28.根据权利要求27所述的方法，其中减少的体积在1-300微升(µL)的范围内。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物分析物包括非电化学活性的血红蛋白(Hb)、糖化血红蛋白(GHb)、高铁血红蛋白(MetHb)和肌红蛋白。
30.根据权利要求27或29所述的方法，其中如下测量糖化血红蛋白(GHb)：
(i) 在装置上接收具有包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物的血液样品，所述装置包括具有裂解膜的包括至少两个电极的至少一个电极构件，所述至少一个电极构件设置有糖化血红蛋白膜以从所述血液样品中过滤糖化血红蛋白；
(ii) 在所述至少一个电极构件和所述裂解膜上设置选自由吡啶、吡啶HCl、羟基吡啶、氰基吡啶、咪唑、吡唑、吲哚、嘧啶和嘌呤组成的组的N-杂环有机受体；
(iii) 从所述血液样品中释放包括非电化学活性血红蛋白或其复合物的生物分析物；
(iv) 采用所述生物分析物形成为电化学活性受体-高铁血色原的配位复合物；
(v) 向包括至少两个电极的所述至少一个电极构件施加相同的氧化还原电压，并通过测量相应的氧化还原电流来确定来自包括至少两个电极的所述至少一个电极构件的电化学活性受体-高铁血色原的两组浓度，其中，一组所述至少一个电极构件通过测量总氧化还原电流测量总血红蛋白的浓度，并且另一组所述至少一个电极构件通过测量非糖化氧化还原电流测量非糖化血红蛋白的浓度，所述非糖化氧化还原电流归因于通过糖化血红蛋白膜的糖化血红蛋白过滤；
(vi) 通过从所述总氧化还原电流减去所述非糖化氧化还原电流，并将所得差电流除以所述总氧化还原电流以获得百分比糖化氧化还原电流；以及
(vii) 通过将所述百分比糖化氧化还原电流与百分比糖化血红蛋白的值线性匹配来确定百分比糖化血红蛋。
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