CN107397793A - 夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。本发明为了验证夏桑菊对登革热DENV‑1病毒的作用，在体外培养细胞中进行夏桑菊的抗病毒试验，检测药物对病毒的抑制作用。实验结果表明，夏桑菊在体外细胞水平具有抑制登革热DENV‑1病毒的致细胞病变的作用，在登革热DENV‑1病毒经夏桑菊预处理后感染细胞后，抗病毒效果明显。

Description

夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用
技术领域
本发明涉及中药应用领域，特别是涉及夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。
背景技术
登革病毒属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，体积较小，约45-55nm，依抗原性不同分为四个血清型。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒病流行于热带和亚热带地区，成为继疟疾之后的最重要的热带病。每年约有5000万至1亿人感染，是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病，已成为全球公共卫生关注的焦点之一。登革热治疗目前尚无特效方法，主要采用对症、支持疗法。世界卫生组织对登革疫苗的研究非常重视，但目前还没有安全有效的疫苗，而疫苗也不能治疗已经发生的感染。另一方面，化学合成的抗病毒药物虽然有数种，但尚未有抗登革病毒的作用，并存在毒性较大的问题，因此寻找安全有效的天然抗DV药物已成为当务之急。夏桑菊的主要成分是夏枯草，野菊花和桑叶，具有清肝明目，疏风散热，除湿痹，解疮毒的作用，用于风热感冒，目赤肿痛，高血压，头晕耳鸣，咽喉肿痛，疔疮肿毒。
但尚未有现有技术公开夏桑菊颗粒在制备防治登革热的药物中的应用。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。
具体技术方案如下：
夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。
在其中一些实施例中，所述登革热为由登革热DENV-1病毒引起的登革热。
本发明较现有技术的优点以及有益效果为：
本发明的发明人及其团队通过大量实验和研究，发现夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。本发明为了验证夏桑菊对登革热DENV-1病毒的作用，在体外培养细胞中进行夏桑菊的抗病毒试验，检测药物对病毒的抑制作用。实验结果表明，夏桑菊在体外细胞水平具有抑制登革热DENV-1病毒的致细胞病变的作用，在登革热DENV-1病毒经药物夏桑菊预处理后感染细胞后，抗病毒效果明显。
附图说明
图1为夏桑菊浸膏对C6/36细胞毒性测定结果图；
图2为夏桑菊颗粒对C6/36细胞毒性测定结果图；
图3为利巴韦林对C6/36细胞毒性测定结果图；
图4为夏桑菊制剂(浸膏、颗粒剂)以及利巴韦林抗DENV-I病毒的细胞形态图；
图5为夏桑菊制剂(浸膏、颗粒剂)以及利巴韦林抗DENV-I病毒的活性测定MTT结果图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
本发明实施例中所用仪器、试剂等均为市售普通产品。
实施例1
1.材料和方法
1.1样品
夏桑菊浸膏(广州白云山群星药业股份有限公司，批号：B150301)、白云山牌夏桑菊颗粒(广州白云山群星(药业)股份有限公司提供，批号：MA0180)、阳性对照药：利巴韦林(杭州民生药业有限公司，批号：1409254)。
实验时将试验药物夏桑菊颗粒以及夏桑菊浸膏分别用PBS稀释成1g生药/ml作为原液，利巴韦林用PBS稀释成1mg/ml作为原液。
1.2细胞
C6/36白纹伊蚊细胞，由广东省疾病预防控制中心提供，用含有10％FBS的DMEM培养基维持培养。
1.3病毒
登革热DENV-1病毒，由广东省疾病预防控制中心提供，在C6/36细胞上测定其半数组织细胞感染剂量TCID50。
1.4仪器与试剂
仪器：Leica DMi1倒置显微镜(Leica，德国)、酶标仪(BioTek，美国)、LHS-150SC恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、二级生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美国)等；
试剂：细胞生长液(GM):DMEM(Gibco，Life Technologies，美国)+10％FBS(四季青，购自浙江天航生物有限公司)，细胞维持液(MM):DMEM+2％FBS，MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,Sigma，美国，批号：101446022)，DMSO(二甲基亚砜)(购自天津市富宇精细化工有限公司，批号：20151111)。1.5夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒、利巴韦林对C6/36细胞毒性测定
1.5.1实验步骤：
第一天将生长状态良好的C6/36细胞消化计数后用细胞生长液GM稀释至1×106/ml，加入96孔板，100μl/孔，放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
第二天夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒、利巴韦林分别用细胞维持液MM按倍比法系列将原液稀释成：1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048的9个滴度，分别加至已长成单层C6/36细胞的96孔培养板中，每孔100μl药物+100μlMM，每个滴度加3个复孔，同时设立空白对照孔。置37℃培养，观察7天，记录其病变情况，7天后，弃去培养基，用PBS洗一次，加入180μl细胞维持液和20μlMTT，孵育4h后，弃去培养基，加入DMSO150μl/孔，摇床上低速震荡10min，使结晶溶解，于450nm测定吸光度值，试验重复三次。
1.5.2实验结果：
(1)夏桑菊浸膏对C6/36细胞毒性测定
MTT结果中夏桑菊浸膏在1/256稀释时细胞存活率>80％，在1/128稀释时细胞存活率<80％(如图1所示)，CPE结果与MTT结果相似，在1/256稀释倍数时，无细胞病变(如表1所示)，因此，根据MTT结果和CPE结果，选取夏桑菊浸膏的最大无毒剂量为1/256稀释。
表1.夏桑菊浸膏对C6/36细胞毒性实验CPE结果
注:“-”表示阴性，细胞无病变；“+”表示阳性，细胞产生病变。
(2)夏桑菊颗粒对C6/36细胞毒性测定
MTT结果中夏桑菊颗粒在1/256稀释时细胞存活率>80％，在1/128稀释时细胞存活率<80％(如图2所示)，而CPE结果显示，夏桑菊颗粒在1/128稀释时无细胞病变(如表2所示)，因此，依据CPE结果选取夏桑菊颗粒的最大无毒剂量为1/128稀释。
表2.夏桑菊颗粒对C6/36细胞毒性实验CPE结果
注:“-”表示阴性，细胞无病变；“+”表示阳性，细胞产生病变。
(3)利巴韦林对C6/36细胞毒性测定
利巴韦林在1/32稀释时无细胞病变出现且细胞存活率>80％，在1/16稀释时细胞存活率<80％(如图3及表3所示)，因此，利巴韦林的最大无毒剂量为1/32稀释。
表3.利巴韦林对C6/36细胞的毒性实验CPE结果
注:“-”表示阴性，细胞无病变；“+”表示阳性，细胞产生病变。
1.6 DENV-1病毒感染性的测定
1.6.1实验步骤
第一天将生长状态良好的C6/36细胞消化计数后用细胞生长液GM稀释至1×106/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备8个孔；放入37℃，5％CO2培养箱中培养。
第二天加病毒，将DENV-1病毒做梯度用细胞维持液MM稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8连续8个稀释度；吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
第三天追加培养液在每个孔再加入100μlMM，利于细胞的生长。连续观察细胞状态并记录，每日在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，CPE记录方法为：无CPE为“-”，25％以下细胞病变为“+”，25％～50％细胞病变为“++”，50％～75％细胞病变为“+++”，75％～100％的细胞病变为“++++”。用Reed-Muench两氏法或Karber法计算病毒TCID50。
1.6.2实验结果
DENV-1病毒感染性的测定
用Reed-Muench两氏法测定病毒滴度，结果如表4所示：
表4 Reed-Muench两氏法测定病毒滴度
根据在倒置显微镜下连续观察细胞病变，Reed-Muench法计算TCID50。
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)-(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)
＝(90.9-50)/(90.9-33.3)
＝0.71
lgTCID50＝距离比例*稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数
＝0.71*(-1)+(-3)
＝-3.71
TCID50＝10-3.71/0.1ml
将该病毒稀释103.71接种100μl可使50％的细胞发生病变。
100TCID50＝10-1.71/0.1ml
1.7药物抑制DENV-1病毒实验
1.7.1实验步骤
设置实验组(包括夏桑菊浸膏和夏桑菊颗粒组)和阳性对照药物组(利巴韦林组)，实验组和阳性对照药物组均平行加3孔，同时设置病毒对照组(100TCID50DENV-1病毒液100μl+100μlMM)，以及空白对照组(200μl MM)。药物浓度根据药物对细胞毒性试验结果选择，以无细胞毒性的最高药物浓度为起始浓度，根据药物毒性浓度，实验组和阳性对照药物组各做3个药物浓度(夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒以及利巴韦林的浓度的具体设置请见表5)；试验病毒液：应先根据病毒滴定结果将DENV-1病毒稀释到100TCID50备用。
实验组和阳性对照药物组(病毒经药物预处理后感染细胞组)将药物与病毒于37℃预处理1小时后再感染细胞；
第一天：C6/36细胞以1×106/ml浓度接种于96孔板培养孔中，每孔100μl，培养生长成单层。
第二天：用MM将药物(夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒或利巴韦林)的原液以无毒性浓度作为起始浓度，稀释3个滴度(夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒以及利巴韦林的稀释滴度的具体设置请见表5)，加入以无细胞毒性的最高药物浓度开始的药液100μl+100μl 100TCID50DENV-1病毒液，37℃作用1h；将长成单层细胞的96孔板细胞培养液吸掉，加入病毒-药物混合液200μl；
另做病毒对照孔：100TCID50DENV-1病毒液100μl+100μlMM；
空白对照孔：200μl MM；
置37℃培养7d后观察细胞状态，并用MTT法测细胞的存活率。
1.7.2实验结果
夏桑菊对DENV-1的抑制作用
用MTT法检测DENV-I病毒经药物预处理后感染细胞作用7天后细胞的存活率的实验中，药物夏桑菊颗粒和夏桑菊浸膏与病毒对照组相比，其细胞存活率均大于病毒对照组，如图5(图中的数值代表：平均值±标准差，n＝3.*P<0.05,**P<0.01与病毒组相比)所示，病毒对照组的细胞存活率为59.6％，而夏桑菊浸膏在256倍稀释时，细胞存活率为75.6％；在512倍稀释时，细胞存活率为79.1％；在1024倍稀释时，细胞存活率为72.9％，均比病毒的细胞存活率高。夏桑菊颗粒在128、256和512倍稀释时，细胞存活率均比病毒的细胞存活率(59.6％)高，分别是79％、72.8％和71.1％，都有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。
当登革热DENV-I病毒经药物预处理后感染细胞作用7天后，显微镜观察，其CPE结果与MTT结果相似，如图4所示，空白对照组的细胞形态完好，生长正常，判定为“-”；DENV-I病毒组细胞病变严重可判定为“++++”；如表5所示，夏桑菊浸膏在256倍稀释的浓度下，细胞病变程度较轻，大多数判定为“++”；512倍稀释浓度细胞病变大多数判定为“+++”；而1024倍稀释浓度的细胞病变多判定为“++”；夏桑菊颗粒中，稀释倍数128、稀释倍数256和稀释倍数512这三个浓度，细胞病变较轻，可判定为“++”；利巴韦林，稀释倍数在32倍和64倍，是多数以“++”为主，在128倍稀释倍数下，则是以“+++”为主。
通过病毒经药物预处理后感染C6/36细胞的给药方式，由MTT结果和CPE结果可知，药物夏桑菊对DENV-I病毒有明显的抑制效果。
表5 夏桑菊浸膏、夏桑菊颗粒以及利巴韦林抗DENV-I病毒的CPE结果
注：CPE的记录方法为：无CPE为“-”，25％以下细胞病变为“+”，25％-50％细胞病变为“++”，50％-75％细胞病变为“+++”，75％-100％细胞病变为“++++”。
本发明为了观察夏桑菊制剂(颗粒以及浸膏)对登革热DENV-1病毒的作用，在体外培养细胞中进行夏桑菊制剂(颗粒以及浸膏)的抗病毒试验，检测药物对病毒的抑制作用。在每个感染阶段均设置了病毒对照和空白细胞对照，即使培养基中可能出现的交互效应，通过设立对照可以消除。而利巴韦林有抗病毒的作用，且文献报道，利巴韦林在LLC-MK2细胞系中可显著抑制DV-1-4，并且不显示细胞毒性，利巴韦林已被证明能够抑制黄病毒，其抗病毒活性主要是通过抑制胞内鸟嘌呤核苷酸合成的必需酶-单磷酸次黄嘌呤核苷(IMP)脱氢酶的合成进行的。因此本发明选择利巴韦林作为阳性对照药物。
本次实验结果表明，夏桑菊在体外细胞水平具有抑制登革热DENV-1病毒的致细胞病变的作用。在登革热DENV-1病毒经药物夏桑菊预处理后感染细胞后，抗病毒效果明显。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用。
2.根据权利要求1所述的夏桑菊在制备防治登革热的药物中的新应用，其特征在于，所述登革热为由登革热DENV-1病毒引起的登革热。
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