CN103404434A

CN103404434A - 多重蓝莓病毒的早期防治技术

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Publication number: CN103404434A
Application number: CN2013103341766A
Authority: CN
Inventors: 严成其; 陈剑平; 钱长根; 钱尖锐; 朱宏芬; 毛东海; 王芳; 沈岚; 刘健; 张国芳; 黄坚; 杨勇; 王栩鸣; 余初浪; 周洁; 张维林; 羊健; 程晔
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CN103404434B

Abstract

本发明提供了蓝莓培育的方法，用于在蓝莓培育的过程中防治或降低病毒污染，其包括对蓝莓进行预处理，获得消毒的根尖；在培养基上将根尖培养成再生植株幼芽；在培养基上将幼芽培养成小苗；在培养基上使得小苗长成试管苗；并任选分组取样并检测其中的样品是否侵染病毒，尤其是特定病毒。另外，本发明还提供了多重RT-PCR同步快速检测蓝莓病毒的方法，其中采用了混合引物对。

Description

多重蓝莓病毒的早期防治技术

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体而言，本发明涉及蓝莓培育的方法，或涉及蓝莓培育中防治或降低（多重）病毒污染的方法，另外还涉及与之配套的多重（种）病毒同步快速检测技术。

背景技术

蓝莓是杜鹃花科越橘属的灌木，其果实属于浆果，颗粒小但花青素含量高，这与草莓等蔷薇科草本植物属于截然不同的植物。

蓝莓的人工栽培历史较短，病虫害尤其是病毒病害等方面的研究还比较少，果农对病毒病害的发生发展缺乏认知和防治经验，目前通常只是以蓝莓幼苗的生根和存活来评价是否脱毒（参见中国专利201210405781.3号等）。然而，本发明人发现，大量危害蓝莓的病毒的早期（幼苗时期）症状不明显，例如：对于蓝莓红环斑病毒（Blueberry red ringspot virus，BRRV），发病植株的可分辨的叶片症状要到8、9月才出现；对于蓝莓枯焦病毒（Blueberry scorch virus，BLScV），受侵染植株要到刚开花时才明显表现出花萎蔫和死亡；对于蓝莓急性坏死病毒（Blueberry shock virus，BLShV）只在开花期花粉传播；对于蓝莓鞋带病毒(Bluebeberry shoestring virus，BSSV)，导致的叶片脱落等症状也在叶生长期才能表现出来；另外，对于蓝莓坏死环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）、蓝莓叶片斑点病毒（Blueberry leaf mottle virus，BLMV）等，发病也基本不影响蓝莓幼苗的生根和存活。这些病毒的危害是极其有害的，不但损耗了果农的早期投入，更使得土地错过最佳利用时期，损失难以挽回。

为此，本发明人经过长期而艰苦的研究，凭借一些运气，开创性地采用以蓝莓的根尖为外植体进行脱毒和组培，相对于中国专利201210405781.3号等茎尖（芽）脱毒技术，大大降低了污染率，再配合多重病毒同步快速检测，几乎可以杜绝上述病毒的侵染。另外，在本发明中，可以不使用成本较高的WPS培养基，尤其是几乎可以不添加矿物质，方便了配制；经过优化的各种引物和配比，消除了检测中的相互干扰，可以对蓝莓组织直接实施高灵敏度的病毒检测，无需分离、纯化。

发明内容

本发明目的在于提供新的蓝莓培育的方法，或新的蓝莓培育中防治或降低（多重）病毒污染的方法，以及新的多重RT-PCR同步快速检测蓝莓病毒的方法等。本发明的方法相对于现有技术，操作更为简便，繁殖效率更高，针对的病毒污染的种类多，污染率低,苗质的长期种植优势明显。

具体而言，在第一方面，本发明提供了蓝莓培育的方法，其包括

1）对蓝莓进行预处理，获得消毒的根尖；

2）在培养基上将根尖培养成再生植株幼芽，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ BA 0.1-0.3mg/L+ZT0.3-0.5 mg/L+ 2，4-D 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L；

3）在培养基上将幼芽培养成小苗，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ BA 0.2-0.5 mg/L+ ZT0.3-0.5 mg/L+ NAA 0.05-0.1mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2 g/L+蔗糖15-25g/L；

4）在培养基上使得小苗长成试管苗，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ ZT0.3-0.5 mg/L+ NAA 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L；和

5）任选地，对步骤1）获得的根尖、步骤2）获得的幼芽、步骤3）获得的小苗和/或步骤4）获得的试管苗之任一或多种进行分组取样，检测样品是否侵染病毒，并弃去侵染病毒的样品所在的组。

相应地，本发明提供了蓝莓培育中防治或降低病毒污染的方法，其包括：

1）对蓝莓进行预处理，获得消毒的根尖；

2）在培养基上将根尖培养成再生植株幼芽，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ ZT0.3-0.5 mg/L+ BA 0.1-0.3mg/L+2，4-D 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L；

3）在培养基上将幼芽培养成小苗，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ ZT0.3-0.5 mg/L+ BA 0.2-0.5 mg/L+ NAA 0.05-0.1mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2 g/L+蔗糖15-25g/L；

5）任选地，对步骤1）获得的根尖、步骤2）获得的幼芽和步骤3）获得的小苗之任一或多种进行分组取样，检测样品是否侵染病毒，并弃去侵染病毒的样品所在的组。

优选本发明第一方面的蓝莓培育中防治或降低病毒污染的方法是多重方法，即同时防治或降低多种病毒污染。

优选在本发明第一方面的方法中,病毒是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV之任一或多种。优选本发明第一方面的方法是多重方法，如优选其中病毒是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV。

优选在本发明第一方面的方法中：

步骤1）是：将蓝莓放入灭菌细沙内于37土3℃下进行热处理，直至抽生根系；取1-2cm长的主根根尖，消毒并水洗后，直接将前端0.1-0.2mm根尖切下作为外植体；

步骤2）是：将根尖接种在培养基上，在23土3℃、光照16土2小时∕天下培养，培养的初始六周的光强由1000土200lux渐变至4000土500lux，然后继续培养直至从根尖诱导出再生植株幼芽；

步骤3）是：将幼芽接种在培养基上，在23土3℃，光强3000土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成8-12cm cm长的小苗；和/或；

步骤4）是：将小苗接种到培养基上，在23土3℃，光强2500土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长出根系。

本发明第一方面的方法可以不包括步骤5）。因为，即使只使用基于根尖的培育步骤，就能显著降低多种病毒的污染。当然，本发明第一方面的方法也可以包括步骤5）。这样，可以让防治效果更为彻底。

也优选在本发明第一方面的方法中，检测样品是否侵染病毒是通过采用由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对的RT-PCR进行检测的。

进一步优选其中，混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8： P9：P10的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.5~0.7：0.5~0.7：0.7~0.9：0.6~0.8：0.6~0.8：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.6：0.6：0.8：0.8：0.7：0.7：0.9：0.9。

在第二方面，本发明提供了多重RT-PCR同步快速检测蓝莓病毒的方法，其中采用由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对。

除了检测所需的引物，RT-PCR所用的试剂以及方法流程是本领域技术人员所熟知的，而且有许多已经商品化了。然而，引物的增多容易引起相互干扰，为此本发明人进行了优化，已经能同时检测多达6种之多的蓝莓病毒，这是现有技术所没有报道的。优选其中，混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8：P9和P10的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.5~0.7：0.5~0.7：0.7~0.9：0.6~0.8：0.6~0.8：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.6：0.6：0.8：0.8：0.7：0.7：0.9：0.9。

也优选在本发明第二方面的方法中，检测的对象是蓝莓的根尖、幼芽、小苗和/或试管苗之任一或多种，优选是本发明第一方面的方法中获得的根尖、幼芽、小苗和/或试管苗之任一或多种。

在第三方面，本发明提供了蓝莓根尖和/或由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对在蓝莓培育中的应用；相应地，也提供了蓝莓根尖和/或由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对在蓝莓培育中防治或降低病毒污染中的应用。

优选在本发明第三方面的应用中，蓝莓培育和/或其中防治或降低病毒污染是本发明第一方面的方法。

优选在本发明第三方面的应用中，病毒是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV之任一或多种，更优选是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV、BLMV。

本发明取得的有益效果在于：操作更为简便，繁殖效率更高，针对的病毒污染的种类多，污染率低,苗质的长期种植优势明显。

附图说明

图1是本发明的蓝莓脱毒与组培方法培育出的蓝莓苗在实验田中的长势照片。

图2是现有技术培育出的蓝莓苗在实验田中的长势照片。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行说明，其中未特别详细说明的材料、试剂均为本领域技术人员所熟知的，可以从市场所购买（蓝莓品种为莱格茜；MS基本培养基可购自武汉晟亚生物技术有限公司，型号M524（其中已经添加琼脂），也可以参见植物组培的书籍或实验手册。

实施例1 多重同步快速RT-PCR检测蓝莓组织的病毒侵染

委托合成核苷酸序列如下的蓝莓病毒特异性引物对，并混合成BRRV的两种引物含量分别为4μM、BLScV的两种引物含量分别为6μM、BLShV的两种引物含量分别为8μM、TRSV的两种引物含量分别为7μM、BLMV的两种引物含量分别为9μM的混合引物溶液：

BRRV上游引物P1: 5‘-GTAGTATTTAATTATATAGTTG-3’

BRRV下游引物P2: 5‘-GGTATATATTCGAATTTTGG-3’

BLScV上游引物P3: 5‘-CAGTTATGCCTCCGAAAG-3’

BLScV下游引物P4: 5‘-CCCGCATTTCGATGATTGCG-3’

BLShV上游引物P5: 5‘-TTTATTCAATTTCGAAGCGAA-’

BLShV下游引物P6: 5‘-TTCGCTTCGAAATTGAATAAA-’

TRSV上游引物P7: 5‘-GACGAAGTTATCAATA -3’

TRSV下游引物P8: 5‘-TCCGTCCAATCACGCGAATA -3’

BLMV上游引物P9: 5‘-TGACATTGCTTGTGGTAATTT-3’

BLMV下游引物P10: 5‘-AAATTACCACAAGCAATGTCA-3’

取蓝莓组织2g,粉碎后，放入100mL含0.5%Triton X-100和0.4 %Na ₂ SO ₃ 的溶液中于37 ℃浸提20min，然后于室温（25℃）浸提1h，过滤，取滤液以12 ,000r/ min离心10min，得样品溶液。

采用RT-PCR反转录试剂盒（可购自海基生物科技有限公司，商品编号D0501），混合上述样品溶液2.5μL、5×RT MasterMix 2μL和Oligo (dT)20 Primer 0.5μL，用去离子水补足至10μL，反应程序为25℃温育10mim，42℃ 反转录45mim，95℃灭活 2mim，得到反转录cDNA溶液。

混合上述反转录cDNA溶液4μL、上述混合引物溶液1μL和2×Taq PCR Mix 12.5μL，用去离子水补足至25μL，进行PCR，条件为94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸 1 min，共30个循环；最后72℃延伸 10 min。

以上引物及配比在检测蓝莓组织（尤其是蓝莓试管苗组织）时不会引起相互干扰，而且BRRV病毒呈阳性，将扩增出约1690kb病毒基因组条带位置，否则未扩增出，呈阴性；BLScV病毒呈阳性，将扩增出928bp左右条带，否则未扩增出，呈阴性；BLShV病毒呈阳性，将扩增出360b左右条带，否则未扩增出，呈阴性；TRSV病毒呈阳性，将扩增出500bp左右条带，否则未扩增出，呈阴性；BLMV病毒呈阳性，将扩增出519bp左右条带，否则未扩增出，呈阴性；这些条带很容易通过琼脂糖电泳条带来分辨。

实施例2 蓝莓脱毒与组培方法1

配制如下培养基：

1)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ BA（6-卞氨基嘌呤） 0.1mg/L+ ZT（Zeatin，玉米素）0.3 mg/L+2，4-D（2，4－二氯笨氧乙酸） 0.1mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

2)增殖培养基：MS基本培养基+ BA 0.2 mg/L+ ZT0.3 mg/L+ NAA（萘乙酸） 0.05mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3）生根培养基：MS基本培养基+ NAA 0.1mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

根尖脱毒与组培步骤如下：

1）材料预处理：将蓝莓放入灭菌细沙内于37土2℃下进行热处理5-8周，直至抽生根系；取1-2cm长的主根根尖，依次经70%（V/V）酒精消毒30秒，用0.1%氯化汞加一滴吐温摇动消毒8分钟及用无菌水洗3-5次后，将前端0.1-0.2mm长的根尖切下作为外植体；

2）根尖诱导再生植株培养：将外植体接种在根尖诱导培养基上，在23土2℃，光强1000lux、光照16小时∕天下培养，两周后光强增至1500lux，四周（即，再过两周后）光强增强到2000 lux，六周后增强到4000 lux，继续培养10周，直至从根尖诱导出再生植株幼芽；

3）幼芽增殖培养：将再生植株幼芽接种在增殖培养基上，在23土2℃，光强3000lux、光照16小时∕d下培养约1个月，直至长成8-12cm长的小苗；

4) 生根培养：将小苗接种到生根培养基上，在23土2℃，光强2500lux、光照16小时∕d下培养，直至约１周后长出根系成为试管苗。由此完成脱毒和组培过程，可以移栽大田或大棚种植。

实施例3 蓝莓脱毒与组培方法2

配制如下培养基：

1)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ BA（6-卞氨基嘌呤） 0.2mg/L+ ZT0.4mg/L +2，4-D（2，4－二氯笨氧乙酸）+ 0.2mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

2)增殖培养基：MS基本培养基+ BA 0.3 mg/L+ ZT0.4mg/L +NAA（萘乙酸） 0.07mg/L +水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3）生根培养基：MS基本培养基+ NAA 0.2mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

根尖脱毒与组培步骤同实施例2的步骤。

实施例4 蓝莓脱毒与组培方法3

配制如下培养基：

1)根尖诱导培养基：MS基本培养基+ ZT0.5mg/L + BA 0.3mg/L+2，4-D 0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

2)增殖培养基：MS基本培养基+ BA 0.5 mg/L+ ZT0.5mg/L+ NAA 0.1mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L；

3）生根培养基：MS基本培养基+ NAA 0.3mg/L+水解乳蛋白1 g/L+蔗糖20 g/L。

根尖脱毒与组培步骤同实施例2的步骤。

实施例5 本发明与现有技术的比较结果

在浙江省农科院病毒学与生物技术研究所的卫星车间内进行脱毒和组培试验，生产蓝莓试管苗。实验组参照实施例2-4所述的方法进行，共进行39组（每种方法不小于做10组）；对照组参照中国专利申请201210405781.3号所记载的方法以及类似方法进行，共进行39组。取各组培与产生的试管苗，每组随机取样32个组织混合后，根据实施例1所述的方法进行检测。最后将试管苗移栽实验田，观察长期种植的长势。

检测结果如表1所示，实验组检出的污染（组内任何一个样品检出任何一种病毒就算本组污染）有13组，污染率为33.3%，而对照组污染27组，污染率高达69.2%。在不弃去污染组的情况下，实验组再生植株平均为136天，基本相同于对照组的134天；实验组的试管苗的移栽成活率98%，略高于对照组的96%；愈伤组织天数也基本一致；但是，实验组的蓝莓苗的月平均繁殖速度为2.9倍，高于对照组的2.6倍；尤其是，移栽后，大田长期种植情况却出现了显著的分化，实验组移栽后长期长势良好（如图1所示），但是对照组移栽后随着时间的推移，死亡率显著增加，长期长势（如图2所示）显著不如实验组的。由此可见，这些病毒对植株的早期危害不大，但是长期危害巨大（尤其是这将造成更严重的损失），而本发明的方法早期优势有限，但是所培育的蓝莓苗比现有技术的在试管苗繁殖速度方面仍旧有显著提高，长期优势明显，如果配合实施例1所述的方法使用，将污染组弃去，势必进一步增强长期的优势。

表1 本发明与现有技术的脱毒和组培的效果对比表

Claims

1.蓝莓培育的方法（或蓝莓培育中防治或降低（多重）病毒污染的方法），其包括

1）对蓝莓进行预处理，获得消毒的根尖；

2）在培养基上将根尖培养成再生植株幼芽，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ BA 0.1-0.3mg/L+ZT 0.3-0.5 mg/L+ 2，4-D 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L；

3）在培养基上将幼芽培养成小苗，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基+ BA 0.2-0.5 mg/L+ZT 0.3-0.5 mg/L +NAA 0.05-0.1mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2 g/L+蔗糖15-25g/L；

4）在培养基上使得小苗长成试管苗，其中所述培养基的配方是：MS基本培养基ZT 0.3-0.5 mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L+水解乳蛋白0.8-1.2g/L+蔗糖15-25g/L；和

2.权利要求1所述的方法，其中病毒是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV之任一或多种，优选是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV。

3.权利要求1所述的方法，其中，

步骤3）是：将幼芽接种在培养基上，在23土3℃，光强3000土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长成8-12cm cm长的小苗；和/或，

步骤4）是：将小苗接种到培养基上，在23土3℃，光强2500土500lux、光照16土2小时∕天下培养，直至长出根系。

4.权利要求1或2所述的方法，其中检测样品是否侵染病毒是通过采用由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对的RT-PCR进行检测的。

5.权利要求4所述的方法，其中混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8： P9：P10的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.5~0.7：0.5~0.7：0.7~0.9：0.6~0.8：0.6~0.8：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.6：0.6：0.8：0.8：0.7：0.7：0.9：0.9。

6.多重RT-PCR同步快速检测蓝莓病毒的方法，其中采用由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对。

7.权利要求6所述的方法，其中混合引物对中P1：P2：P3：P4：P5：P6：P7：P8：P9：P10：的含量比为0.3~0.5：0.3~0.5：0.5~0.7：0.5~0.7：0.7~0.9：0.6~0.8：0.6~0.8：0.8~1：0.8~1：0.9~1.1，优选为0.4：0.4：0.6：0.6：0.8：0.8：0.7：0.7：0.9：0.9。

8.蓝莓根尖和/或由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10组成的混合引物对在蓝莓培育和/或其中防治或降低病毒污染中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其中蓝莓培育和/或其中防治或降低病毒污染是权利要求1-5之任一所述的方法。

10.权利要求8所述的应用，其中病毒是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV之任一或多种，优选是BRRV、BLScV、BLShV、TRSV和BLMV。