CN107384970A - 一种大肠埃希氏菌代谢粗提物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种大肠埃希氏菌代谢粗提物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠埃希氏菌代谢粗提物及其制备方法与应用。本发明将大肠埃希氏菌GZ‑34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离；在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜去除不溶物，得到大肠埃希氏菌代谢粗提物。该粗提物的主要生防机制表现为抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、–两个单倍体菌系的有性配合，因形成不了具有侵染致病力的双核菌丝体，从而达到生防效果。同时又较少影响病原菌的两个无致病性单倍体菌丝本身的形态生长。这种生防机制具有较大的创新意义。将其应用到甘蔗病害的防治，对甘蔗的食用及其加工产品来说更加安全可靠。

Description

一种大肠埃希氏菌代谢粗提物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物病害防治领域，特别涉及一种大肠埃希氏菌代谢粗提物及其制备方法与应用。
背景技术
甘蔗黑穗病由黑粉菌(Sporisorium scitamineum Syd.)引起的一种世界性病害，也是危害我国甘蔗生产的最主要真菌性病害。近年来，在我国云南、广东、广西等主产蔗区普遍发生，并呈日趋加重之态势，特别在旱地蔗及宿根蔗地上更为严重。抗病性较强品种发病率低于10％，感病品种发病率可高达50％以上，严重的甚至高达80-90％，造成巨大的经济损失。
甘蔗鞭黑粉菌属半专性寄生菌，单倍体菌体可以在人工培养基上生长，菌丝体在培养基上不能存活太久。冬孢子椭圆形，棕色或黑色，单孢具乳突，大小5-6μm(吴伟怀等，海南岛甘蔗病害种类初步调查[J].热带作物学报,2007,28(4):000112-116.；Antoine etal.，1961)。冬孢子萌发形成担子，担子上着生4个透明、椭圆形的担孢子，2个为“+”交配型单倍体，2个为“-”交配型单倍体(Alexander andSrinivasan，1966；Antoine et al.，1961)，担孢子为单倍体，单倍体阶段为酵母状，不具有侵染能力，可以不断芽殖，“+”交配型单倍体和“-”交配型单倍体相结合形成双核菌丝体，菌丝白色、黄色或褐色，具有侵染甘蔗的能力(Albert and Schenck，1996；Ferreira and Comstock，1989)。
因此，有必要寻找一种更为高效的防治黑粉病的化合物。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法。
本发明的另一发明目的在于提供通过上述制备方法得到的大肠埃希氏菌代谢粗提物。
本发明的再一目的在于提供所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，包括如下步骤：将大肠埃希氏菌GZ-34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离；在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜去除不溶物，得到大肠埃希氏菌代谢粗提物。
所述的大肠埃希氏菌GZ-34，保藏编号为CCTCC NO:M 2016353，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN105969707 A公开。
所述的发酵所用的发酵培养基优选为LB培养基。
所述的LB培养基的组成如下：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L，pH7.0～7.2。
所述的发酵的条件优选为于35～37℃，200～250rpm发酵；更优选为于37℃、220rpm发酵。
所述的发酵的程度优选为达到大肠杆菌的对数生长期或稳定期；更优选为OD600＝3。
所述的固液分离的方式优选为离心。
所述的离心的条件优选为8000～12000×g离心10～20min；更优选为10000g离心15min。
所述的乙酸乙酯的用量优选为与所述的上清液等体积。
一种大肠埃希氏菌代谢粗提物，通过上述制备方法得到。
所述的大肠埃希氏菌代谢粗提物在防治黑粉病中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发明人首次发现大肠埃希氏菌GZ-34代谢粗提物对黑粉菌的生长和有性结合有很明显的抑制作用。
(2)本发明提供的大肠埃希氏菌代谢粗提物，是以大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)GZ-34为菌种，经过培养、分离和初步提纯得到；该方法步骤简洁，操作简单，这有利于进行工业化生产。
(3)本发明大肠埃希氏菌代谢粗提物，将其用于甘蔗病害的防治，其主要生防机制表现为抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、–两个单倍体菌系的有性配合，因形成不了具有侵染致病力的双核菌丝体，从而达到生防效果。同时又较少影响病原菌的两个无致病性单倍体菌丝本身的形态生长。这种生防机制具有较大的创新意义。将其应用到甘蔗病害的防治，对甘蔗的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
附图说明
图1是大肠埃希氏菌GZ-34的代谢粗提物对黑粉菌有性结合的抑制作用结果图；其中，图a、图b、图c和图d分别是加入0、3、4.5、6μl代谢粗提物的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、菌种和培养基
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)GZ-34，其保藏编号为CCTCC NO:M2016353，于2016年6月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，已在中国专利申请CN 105969707A公开。
甘蔗鞭黑粉菌，购买自ATCC(MYA-4638TM)，WT17和WT18为分离得到的+、–两个单倍体菌系。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，H2O定容至1000ml，pH 7.0-7.2。121℃灭菌20分钟。
LB液体培养基：与LB固体培养基的区别仅在于：不含琼脂。
Yeps固体培养基：酵母提取物10g、蛋白胨20g、蔗糖20g、琼脂20g，H2O定容至1000ml，pH6.8-7.2。121℃灭菌20分钟。
Yeps液体培养基：不加琼脂即可。
2.1培养基配制
配制如步骤1的培养基。
2.2大肠埃希氏菌GZ-34活化以及黑粉菌的活化
取-80℃保存的大肠埃希氏菌GZ-34在LB平板上划线活化，37℃培养箱过夜培养。
取80℃保存的黑粉菌WT17和WT18在Yeps固体培养基接种活化，28℃培养。挑取单菌落分别接种至Yeps液体培养基，28℃、200r/min过夜培养。
2.3大肠埃希氏菌GZ-34发酵
LB固体培养基活化的大肠埃希氏菌GZ-34菌株，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h获得种子液，按1％(v/v)的接种量接入1000mL LB液体培养基，37℃、220r/min振荡培养，至OD600达到3.0，10000×g离心15min去除菌体，收集上清液。
2.4大肠埃希氏菌GZ-34的代谢粗提物的提取
向上清液中加入等体积的乙酸乙酯，混合均匀后倒入分液漏斗中静置分层，放出下层水相，从上面倒出上层有机相，旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯，加入1mL甲醇溶解，过0.22μm的有机滤膜去除不溶物，得到粗提物，4℃保存。
2.5粗提物活性检测
将粗提物加入10ml融化的Yeps固体培养基中，分别加0、3、4.5、6μl大肠埃希氏菌GZ-34的代谢粗提物；取等体积WT17和WT18菌液混合，吸取1μl混合菌液点在培养基上，28℃培养3天，体式显微镜下观察有性结合情况。
3、结果
从图1的结果可看出，大肠埃希氏菌的代谢粗提物对黑粉菌的生长和有性结合有很明显的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将大肠埃希氏菌GZ-34进行发酵，得到的发酵液进行固液分离；在得到的上清液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集上层有机相，经旋转蒸发后溶解在甲醇中，用孔径为0.22μm的滤膜去除不溶物，得到大肠埃希氏菌代谢粗提物。
2.根据权利要求1所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的发酵所用的发酵培养基为LB培养基。
3.根据权利要求1所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的发酵的条件为于35～37℃，200～250rpm发酵。
4.根据权利要求1所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的发酵的程度为达到大肠杆菌的对数生长期或稳定期。
5.根据权利要求1所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的固液分离的方式为离心。
6.根据权利要求5所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的离心的条件为8000～12000×g离心10～20min。
7.根据权利要求1所述大肠埃希氏菌代谢粗提物的制备方法，其特征在于：所述的乙酸乙酯的用量为与所述的上清液等体积。
8.一种大肠埃希氏菌代谢粗提物，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的大肠埃希氏菌代谢粗提物在防治黑粉病中的应用。
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