CN107384852A - 一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法及应用 - Google Patents
一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：将耳蜗上皮细胞，培养成单细胞，将单细胞加入含有表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子‑1、糖原激酶抑制剂‑3、丙戊酸、2‑磷酸‑L‑抗坏血酸、ALK5抑制剂的扩增培养基，扩增支持细胞，获得Lgr5+细胞，将加入含有LY411575因子与糖原激酶抑制剂‑3的诱导培养基，诱导分化培养10天，得到内耳毛细胞，诱导分化的内耳毛细胞进行基因水平和蛋白质水平的检测，确认为内耳毛细胞，该发明首先用含有因子的培养基促进支持细胞的分裂增殖；然后利用诱导培养基诱导支持细胞分化为内耳毛细胞，通过本方法诱导，能够获得高纯度、高比例的内耳毛细胞。
Description
技术领域
本发明涉及医疗新技术领域，更具体的说，是一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法及应用。
背景技术
耳聋是影响人类生活质量的常见慢性疾病之一，全世界耳聋障碍者约有3.6亿人。其中，感音神经性耳聋在临床上很常见，噪声暴露、耳毒性药物、细菌或病毒感染及衰老所引起的毛细胞缺失是导致感音神经性耳聋的主要原因。由于耳蜗毛细胞数量有限，大约有15000个，且损伤后无自发再生能力，常引起听力永久性下降，是目前临床治疗的难题。目前临床上主要通过使用助听器、人工耳蜗或药物治疗感音神经性耳聋，这些方法不能从根本上治疗耳聋。因此，探讨耳蜗毛细胞修复再生的方法和策略是治疗感音神经性耳聋的主要途径。
哺乳动物的耳蜗支持细胞(包括Hensen细胞、Deiters细胞以及内外柱细胞等)和毛细胞来源于胚胎期的听板。耳蜗毛细胞是听觉的感受器，可以将震动转化为电信号并通过听觉神经传递到大脑的听觉中枢，容易受到损害。研究表明，耳蜗支持细胞是毛细胞再生的来源，其中一部分支持细胞具有高度增殖能力的，在适宜的条件下培养，可以分化或转分化为毛细胞。富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Leucine-rich repeat containingG-protein coupled receptor5,Lgr5)是一种重要的7次跨膜蛋白偶联受体，这种7次跨膜GPCRs作为Wnt/β-catenin信号通路的下游靶向基因，其表达与耳蜗的发育密切相关。研究表明，Lgr5是人类肠干细胞和毛囊的标记物。Lgr5+细胞是耳蜗上皮支持细胞一周后就丧失了自发再生的能的一个子集，也是耳蜗祖细胞，但人出生后，在成人的耳蜗感觉上皮中不再发生细胞分裂或转化。研究表明，在耳蜗内形成Lgr5+细胞时，Wnt和Notch信号通路的激活是必需的，在支持细胞的发育中发挥重要的作用。Notch是毛细胞再生过程中重要因素，阻断Notch信号能够产生新的耳蜗毛细胞，这些细胞均来自于一类Lgr5蛋白的特殊支持细胞。抑制Notch信号通路能够促进Wnt信号通路的β-catenin转录因子和下游基因的上调，通过调控相关信号通路可促进支持细胞增殖转分化成新的毛细胞，使新形成的毛细胞重新进入细胞周期。本发明通过使用培养基中添加药物和因子混合物的方法来调节多种途径，促进扩增Lgr5支持细胞的机制，并将这些支持细胞分化成大量高纯度的毛细胞群体，从而达到毛细胞再生和恢复听觉的目的。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了支持细胞分化为内耳毛细胞的方法及其应用。
本发明的方案是：
一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：将耳蜗上皮细胞，培养成单细胞，将单细胞加入含有表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂的扩增培养基，扩增支持细胞，获得Lgr5+细胞，将加入含有LY411575因子与糖原激酶抑制剂-3的诱导培养基，诱导分化培养10天，诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测，得到内耳毛细胞。
作为优选的技术方案，所述诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测用qRT-PCR检测内耳毛细胞的标记分子。
作为优选的技术方案，所述标记分子为Myosin VIIa、Prestin和vGlunt3。
作为优选的技术方案，所述诱导培养基为无血清培养基。
作为优选的技术方案，所述扩增培养基为无血清培养基
本发明还提供一种组合物，无血清培养基中含有权利要求1中表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂的混合物。
作为优选的技术方案，所述混合物是无菌的。
作为优选的技术方案，还含有药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种组合物，其特征在于：无血清培养基中含有权利要求1中LY411575因子与糖原激酶抑制剂-3的混合物。
由于采用了上述技术方案一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：将耳蜗上皮细胞，培养成单细胞，将单细胞加入含有表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂的扩增培养基，扩增支持细胞，获得Lgr5+细胞，将加入含有LY411575因子与糖原激酶抑制剂-3的诱导培养基，诱导分化培养10天，得到内耳毛细胞，诱导分化的内耳毛细胞进行基因水平和蛋白质水平的检测，确认为内耳毛细胞，该发明首先用含有因子的培养基促进支持细胞的分裂增殖；然后利用诱导培养基诱导支持细胞分化为内耳毛细胞，通过本方法诱导，能够获得高纯度、高比例的内耳毛细胞。
该发明与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1.本发明添加表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂可以促进支持细胞和Lgr5+细胞增殖。
2.本发明添加LY411575因子和糖原激酶抑制剂-3的培养基可以促进支持细胞分化为内耳毛细胞，且分化效率较高。
3.本发明筛选出了促进支持细胞分裂的扩增培养基和诱导分化内耳毛细胞的诱导培养基。
4.本发明提供的毛细胞特异性标记分子可鉴定内耳毛细胞，为发展的新技术提供鉴定依据。
附图说明
图1为支持细胞显微图，40×放大倍数下，支持细胞在EFICVP6混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基内培养10天的细胞形态。
图2说明添加EFI和EFICVP6因子组合的DMEM+10％FBS培养基培养10天后，对内耳支持细胞数的影响情况。
图3说明添加EFICVP6因子与不添加任一种因子的DMEM+10％FBS培养基培养10天后，对内耳细胞总数、Lgr5+细胞数及百分比的影响情况。
图4说明添加LY411575和CHIR99021因子对Lgr5细胞分化为内耳毛细胞的影响情况。
图5说明第0天和第10天分化时，Real-time PCR检测Lgr5和内耳毛细标记基因的表达量情况。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，以解决上述背景技术中的问题。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施案例1：小鼠内耳支持细胞的培养
分离小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)的耳蜗上皮细胞，培养10天，每3天换一次液，获得单细胞。将细胞转移至含有：50ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)、50ng/mL成纤维母细胞因子(bFGF)、50ng/mL胰岛素因子-1(IGF-1)即EFI混合因子组合的DMEM+10％FBS(购自Gbico)培养基；50ng/mL表皮细胞生长因子(EGF)、50ng/mL成纤维母细胞因子(bFGF)、50ng/mL胰岛素因子-1(IGF-1)、3μM糖原激酶抑制剂-3(CHIR99021或C)、1mM丙戊酸(VPA或V)、100μg/mL2-磷酸-L-抗坏血酸(pVc或P)、2μM ALK5抑制剂(616452或6)即EFICUP6混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基，在37℃、5％CO2孵育箱中，培养10天，每天换液，观察Lgr5+细胞数量。支持细胞形态见图1。结果显示，加入EFICVP6(EGF、bFGF、IGF-1、CHIR99021、VPA、pVc、616452)的DMEM+10％FBS培养基与加入EFI(EGF、bFGF、IGF-1)的DMEM+10％FBS培养基相比较，支持细胞总数增加，而且Lgr5+细胞总数和百分比增加较为显著(>2000倍)。结果见图2。
实施案例2：不同因子组合对分化成Lgr5+细胞的影响
分离小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)的耳蜗上皮细胞，培养10天，每3天换一次液，获得单细胞。接种到含有：
EFICVP6混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加EGF的FICVP6(-EFI)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加bFGF的EICVP6(-bFGF)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加IGF-1的EFCVP6(-IGF-1)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加CHIR99021的EFIVP6(-CHIR)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加VPA的EFICP6(-VPA)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加pVc的EFICV6(-bFGF)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基；
未添加616452的EFICVP(-616452)混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基(因子用量同实施案例1)；在37℃、5％CO2孵育箱中，培养10天，每3天换一次液，观察Lgr5+细胞数及Lgr5+细胞百分比。结果表明，未添加bFGF的EICVP6和未添加CHIR99021的EFIVP6的培养基，Lgr5+细胞数和百分比均显著下降，且未添加CHIR的培养基对其影响最大；未添加EGF的FICVP6和未添加616452的EFICVP的培养基，导致细胞总数减少，进而导致Lgr5+细胞数减少；未添加VPA的EFICP6、未添加pVc的EFICV6和未添加IGF-1的EFCVP6的培养基，均引起Lgr5+细胞数减少。因此，EFICVP6混合因子组合的DMEM+10％FBS培养基是最佳扩增支持细胞的培养基。结果见图3。
实施案例3：Lgr5+细胞分化为内耳毛细胞
选用实施案例2得出的EFICVP6最佳培养基扩增支持细胞，培养10天，获得Lgr5+细胞。然后把此细胞加入诱导培养基，诱导培养基为：DMEM+10％FBS培养基；添加5μMLY411575(LY)因子的DMEM+10％FBS培养基；添加CHIR99021(C)因子的DMEM+10％FBS培养基；添加LY411575和CHIR99021(LYC)因子的DMEM+10％FBS培养基，诱导分化培养10天，统计毛细胞的细胞数。根据图4，得出添加LYC因子的DMEM+10％FBS培养基诱导分化出的毛细胞数量，优于不添加因子及只添加LY或C的培养基。因此，选择添加LYC因子的DMEM+10％FBS培养基作为最优诱导分化培养基。
实施案例4：诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测
将上述实施案例3中添加LY411575和CHIR99021(LYC)因子的DMEM+10％FBS培养基的内耳毛细胞群体，在第0天和10天分别取样，并收集到50mL离心管内，分别提取RNA，反转录成cDNA，并以此cDNA为模板进行Real-time PCR，检测引物见表1。以β-actin作为内参，检测Lgr5基因和毛细胞标志基因Myosin VIIa、Prestin、vGlut3、Pcdh15、Ribeye的表达量。根据得到的Ct值，以第0天毛细胞中基因的表达量为参照，分析诱导分化10天后毛细胞中目的基因的表达量。由图5得出，第10天与第0天相比，Lgr5表达下调，而Myosin VIIa、Prestin、vGlut3、Pcdh15、Ribeye基因表达均上调，因此，Lgr5+细胞诱导分化之后形成了毛细胞。根据图5还得出，Myosin VIIa、Prestin和vGlut3基因相对表达量变化较大，可作为鉴定毛细胞的标记基因。
表1用于Real-time PCR检测引物序列
实施案例5：内耳毛细胞标记分子特异蛋白表达检测
将实施案例3获得的毛细胞(在第0天和10天分别取样)，加入4％(w/v)多聚甲醛固定液于6孔培养板中，室温(25℃)固定15min后，用预冷的PBS(pH＝7.4)漂洗2遍，每遍5min，以去除多余的多聚甲醛；用Triton X-100(购自Sigma公司)室温孵育10min，对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5min，再经含1％(w/v)BSA的0.1％(v/v)PBST(100ml PBS缓冲液(Gbico，pH＝7.4)中加入100μL Tween-20(Sigma公司))淹没细胞，室温下封闭1h。第0天和10天的毛细胞均分成3组，分别加入一抗，组0-1和组10-1为抗Myosin VIIa(Santa Cruz公司)，组0-2和组10-2位抗Prestin(Santa Cruz公司)，组组0-3和组10-3为抗vGlut3(SantaCruz公司)，所用一抗均与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释比为1：200，一抗覆盖封闭后的细胞，4℃孵育过夜。完全去除含有一抗PBST的封闭液，用上述同样的方法稀释二抗，二抗均购自联科生物公司，室温下孵育1-2h后，用PBS浸洗三次，每次5min。结果表明，诱导分化10天后的细胞内可观察看到Myosin VIIa、Prestin和vGlut3三种标记毛细胞蛋白的荧光信号，而第0天的细胞未检测到荧光信号。因此，诱导分化的Lgr5+细胞能够表达内耳毛细胞的标记蛋白，表明本方法能够诱导支持细胞分化为内耳毛细胞。
最后，值得注意的是，以上所列举仅是本发明的若干个实施案例。显然，本发明不限于以上案例，还可以有许多变形。本技术领域的普通技术人员在不脱离本发明原理的前提下，做出的若干改进和修饰均应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：将耳蜗上皮细胞，培养成单细胞，将单细胞加入含有表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂的扩增培养基，扩增支持细胞，获得Lgr5+细胞，将加入含有LY411575因子与糖原激酶抑制剂-3的诱导培养基，诱导分化培养10天，得到内耳毛细胞，诱导分化的内耳毛细胞进行基因水平和蛋白质水平的检测，确认为内耳毛细胞。
2.如权利要求1所述的一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：所述诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测用qRT-PCR检测内耳毛细胞的标记分子。
3.如权利要求2所述的一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：所述标记分子为Myosin VIIa、Prestin和vGlunt3。
4.如权利要求1所述的一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：所述诱导培养基为无血清培养基。
5.如权利要求1所述的一种支持细胞分化为内耳毛细胞的方法，其特征在于：所述扩增培养基为无血清培养基。
6.一种组合物，其特征在于：含有权利要求1中表皮细胞生长因子、成纤维母细胞因子、胰岛素因子-1、糖原激酶抑制剂-3、丙戊酸、2-磷酸-L-抗坏血酸、ALK5抑制剂的混合物。
7.如权利要求6所述的一种组合物，其特征在于：所述混合物是无菌的。
8.如权利要求6所述的一种组合物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体。
9.一种组合物，其特征在于：无血清培养基中含有权利要求1中LY411575因子与糖原激酶抑制剂-3的混合物。
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