CN107376014A - 一种咪唑‑4,5‑二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物骨组织工程，具体涉及一种咪唑‑4,5‑二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法。本发明通过仿生合成将生物矿化的机理引入到HAP的合成过程中，以具有pH响应性的咪唑‑4,5‑二羧酸改性壳聚糖为有机基质，从而得到具有特定结构、表面改性的羟基磷灰石。通过仿生合成的羟基磷灰石有望提高其生物活性和力学性能，可为仿生合成其他生物矿物提供借鉴。

Description

一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的 方法

技术领域

本发明属于生物骨组织工程领域，具体涉及一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成状羟基磷灰石的方法。

背景技术

上世纪七十年代中期，Roy首先人工合成了羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAP)，从此开创了人工骨材料的新纪元。羟基磷灰石是一种磷酸钙，其化学成份、晶体结构、物理化学性能与人体正常骨的无机成份相似，动物实验结果表明，羟基磷灰石植入人体后能通过正常新陈代谢途径置换Ca与P，并且羟基通过氢键与人体组织键合达到完美亲和，生物相容性极好，无免疫排异现象，且具有一定的骨的传导性，为新骨的沉积与再生提供优良的生理支架，并且可与骨组织形成直接的骨性结合。因此，HAP作为一种生物性能优越的人工骨材料，在临床具有重要的应用价值。但是，由于HAP不具有良好的生物活性和pH响应性，使其应用受到一定限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，该方法制备的羟基磷灰石具有良好的生物活性和pH响应性，在骨修复和骨替代等领域具有广阔的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，是基于壳聚糖支链上的组氨酸具有很好的生物活性，而咪唑基团也具有良好的pH响应性，本发明通过将咪唑-4,5-二羧酸接枝到壳聚糖上获得咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖，以咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖为有机模板仿生合成HAP既保证产物具有良好的生物活性又赋予了其pH响应性，具体包括以下步骤：

1）将钙盐和磷酸盐分别溶解于模拟体液中，得到钙盐溶液和磷酸盐溶液；

2）取适量磷酸盐溶液于烧杯中，并利用集热式磁力搅拌器来控制体系温度为32-37^oC，然后往烧杯中添加咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖，所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖是由咪唑-4,5-二羧酸接枝到壳聚糖上而获得，再将钙盐溶液以每秒1滴的速率滴加入烧杯中，所述钙盐溶液与磷酸盐溶液的用量比满足Ca/P摩尔比为1.67，所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖与磷酸盐的用量比为100ml∶0.024-0.096g，滴加钙盐溶液的过程中，使用氨水控制体系pH在10.00~10.50之间；

3）滴加结束后，将溶液搅拌20-30min，陈化6-48h，然后抽滤、收集沉淀，用无水乙醇和蒸馏水对沉淀进行多次洗涤，然后将沉淀置于烘箱中于50-60^oC下干燥48-72h，得到羟基磷灰石。

所述钙盐为氯化钙，所述磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。

进一步，所述步骤1）配置的钙盐溶液中Ca²⁺浓度为0.05mol·L^-1~0.4mol·L^-1。

所述步骤1）配置的钙盐溶液为浓度0.2mol·L^-1的氯化钙溶液，磷酸盐溶液为浓度0.12mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液，所述步骤2）中，磷酸氢二钠溶液、咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖、氯化钙溶液的用量比为25ml∶0.006g∶25ml。

所述步骤3），搅拌时间为30min，陈化时间为24h，烘干温度为60℃，干燥时间为72h

所述步骤3）得到的羟基磷灰石为棒状，其半径为60nm。

本发明所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖由以下方法制备而成：

（1）将壳聚糖溶于0.10mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲溶液中，以三口烧瓶作为反应容器，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐作为缩合剂，加入N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联剂，搅拌均匀后，再加入咪唑-4,5-二羧酸，得到混合物；

所述壳聚糖、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、咪唑-4,5-二羧酸的摩尔比为1∶1.2-1.4∶1-1.2∶0.33-3；

（2）将上述混合物于室温下用电动磁力搅拌反应12-48h，将搅拌后的混合物粘液转移至透析袋中，将透析袋置于蒸馏水中透析6-8天；

（3）将透析得到的透析液转移至培养皿中，用保鲜膜封口后于-12 ~ -24℃下冷冻24-60h，然后取出冷冻后的透析产物，在保鲜膜上戳若干个孔，最后将透析产物真空冷冻干燥24-36h，得到产物咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖。

壳聚糖是优良的组织工程方面的材料，改性之后的壳聚糖不仅能用于生物矿物质的蛋白分离和仿生合成，还能用于医学领域的应用，也可用于基因转染载体和组织工程材料。壳聚糖在医学上的主要应用方面有：可增强凝血功能及促进伤口的愈合、并可作为药物的一种缓释基质、应用于人造组织及器官等方面、具有免疫调节等作用，是一种理想的组织工程材料，也作为一种培养细胞的理想支架，在组织工程学方面有良好的应用前景。壳聚糖在仿生合成过程中具有绿色、环保、节约、高效等特点，符合当今经济发展要求。但是壳聚糖溶解性较差，咪唑基可提高壳聚糖的溶解性，其聚合物还有良好的pH响应性。因此本发明利用咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖，提高其溶解性，并赋予较大缓冲容量和pH响应性，进一步以具有pH响应性的咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖为有机基质，在模拟体液中利用仿生合成技术将生物矿化引入到无机材料中来，其反应条件温和，可以控制目标产物的形状、分散性及成核过程，从而得到具有特定结构、表面改性的羟基磷灰石。

本发明与现有技术相比，其主要优点为：

1．利用仿生合成的方法，将生物矿化的机理引入到HAP的合成过程中，以咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖为有机模板，在模板的作用下形成有机/无机复合体，从而得到具有良好的生物活性和pH响应性的HAP。

2．制备方法简单、反应条件温和、降低处理成本、提高经济效益。

3．本发明得到的是一种棒状的羟基磷灰石材料，既具有良好的生物活性，又具有良好的pH响应性，很有希望为生物硬组织工程合成人工骨提供借鉴。

附图说明

图1为本发明实施例2产物的FT-IR和XRD谱图，即陈化时间为48h、温度为37℃下合成的HAP（H0）的FT-IR和XRD谱图。

图2为本发明实施例2产物的FESEM谱图，即陈化时间为48h、温度为37℃下合成的HAP（H0）的FESEM谱图。

图3为本发明实施例3产物的FT-IR和谱图，即不同温度下合成的HAP（H1-H4）的FT-IR和XRD谱图（a：温度为32℃合成H1；b：温度为37℃合成H2；c：温度为42℃合成H3；d:温度为47℃合成H4）。

图4为本发明实施例3产物的ESEM谱图，即不同温度下合成的HAP的FESEM谱图（a：温度为32℃合成H1；b：温度为37℃合成H2；c：温度为42℃合成H3；d:温度为47℃合成H4）。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明进一步说明，但并不限制本发明。

本发明所用的所有试剂均为分析纯，均来自阿拉丁；

本发明所用的场发射扫描电子显微镜，型号为S-4800场发射扫描电子显微镜，生产厂家为日本日立公司。

实施例1

咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖（HIDCCS）的合成

称取1.2000g的壳聚糖溶于100mL（100mL0.10mol·L^-1）2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲溶液（pH=5.5）中，以三口烧瓶作为反应容器，加入1.9978g1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）作为缩合剂，0.8567gN-羟基琥珀酰亚胺作为偶联剂，电动搅拌均匀后，再加入3.4860g的咪唑-4,5-二羧酸。混合物放在室温下用电动磁力搅拌反应24h，使其充分搅拌均匀。将搅拌后的混合物粘液放进处理过的透析袋中，并扎好，防止漏出。放在蒸馏水中透析一周（每天约更换蒸馏水4-6次）。透析液转移至培养皿中，用保鲜膜包好后放入-18℃冷冻柜中冷冻24h。之后将其取出，在保鲜膜上戳若干个小孔（防止真空干燥过层中产品全部上漂），最后真空冷冻干燥24h，得到产物咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖。

实施例2：

利用咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成球形羟基磷灰石的方法，包括如下步骤：

取适量的氯化钙和磷酸氢二钠溶于模拟体液中，实验中的体系均以Ca/P物质的量比为1.67来投料，用烧杯取25mL磷酸二氢钠溶液（0.12mol·L^-1），利用集热式磁力搅拌器来控制温度37^oC。再添加咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖0.006g,再取25mL氯化钙（0.2mol·L^-1），以每秒1滴的速率滴加，滴加氯化钙过程中，使用氨水控制溶液pH在10.00~10.50之间。滴加结束后，搅拌30min，陈化48h，进行抽滤，用无水乙醇和蒸馏水进行多次洗涤，用烘箱控制温度为60^oC下烘干3天，得产物H0。

实施例3：

不同温度（32、37、42、47度）下，利用咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖材料仿生合成棒状羟基磷灰石

取适量的氯化钙和磷酸氢二钠溶于模拟体液中，实验中的体系均以Ca/P物质的量比为1.67来投料，用烧杯取25mL磷酸二氢钠溶液（0.12mol·L^-1），利用集热式磁力搅拌器来控制温度32^oC。再添加咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖0.006g,再取25mL氯化钙（0.2mol·L^-1），以每秒1滴的速率滴加，滴加氯化钙过程中，使用氨水控制溶液pH在10.00~10.50之间。滴加结束后，搅拌30min，陈化24h，进行抽滤，用无水乙醇和蒸馏水进行多次洗涤，用烘箱控制温度为60^oC下烘干3天，得产物H1。

利用集热式磁力搅拌器来控制温度分别为32℃、37℃、42℃、47℃，其它条件同上，分别得到产物H2、H3、H4。

本实施例不同温度下合成的HAP（H1-H4）的FT-IR和XRD谱图如图3所示，不同温度下合成的HAP的FESEM谱图如图4所示。本实施例在较温和的反应温度下考察改性壳聚糖对仿生合成羟基磷灰石的调控影响，说明在32-47℃下可以较好地调控HAP，此外，结果表明当反应温度为42℃下所形成的棒状HAP最佳。

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）将钙盐和磷酸盐分别溶解于模拟体液中，得到钙盐溶液和磷酸盐溶液；

2）取适量磷酸盐溶液于烧杯中，并利用集热式磁力搅拌器来控制体系温度为32-47^oC，然后往烧杯中添加咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖，所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖是由咪唑-4,5-二羧酸接枝到壳聚糖上而获得，再将钙盐溶液以每秒1滴的速率滴加入烧杯中，所述钙盐溶液与磷酸盐溶液的用量比满足Ca/P摩尔比为1.67，所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖与磷酸盐的用量比为100ml∶0.024-0.096g，滴加钙盐溶液的过程中，使用氨水控制体系pH在10.00~10.50之间；

3）滴加结束后，将溶液搅拌20-30min，陈化6-48h，然后抽滤、收集沉淀，用无水乙醇和蒸馏水对沉淀进行多次洗涤，然后将沉淀置于烘箱中于50-60^oC下干燥48-72h，得到羟基磷灰石。

2.根据权利要求1所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述钙盐为氯化钙，所述磷酸盐为磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。

3.根据权利要求1所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述步骤1）配置的钙盐溶液中Ca²⁺浓度为0.05mol·L^-1~0.4mol·L^-1。

4.根据权利要求3所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述步骤1）配置的钙盐溶液为浓度0.2mol·L^-1的氯化钙溶液，磷酸盐溶液为浓度0.12mol·L^-1的磷酸氢二钠溶液。

5.根据权利要求4所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述步骤2）中，磷酸氢二钠溶液、咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖、氯化钙溶液的用量比为25ml∶0.006g∶25ml。

6.根据权利要求1所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述步骤3），搅拌时间为30min，陈化时间为24h，烘干温度为60℃，干燥时间为72h。

7.根据权利要求1所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述步骤3）得到的羟基磷灰石为棒状，其半径为60nm。

8.根据权利要求1所述的一种咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖仿生合成羟基磷灰石的方法，其特征在于：所述咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖由以下方法制备而成：

（1）将壳聚糖溶于0.10mol/L的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲溶液中，以三口烧瓶作为反应容器，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐作为缩合剂，加入N-羟基琥珀酰亚胺作为偶联剂，搅拌均匀后，再加入咪唑-4,5-二羧酸，得到混合物；

所述壳聚糖、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、咪唑-4,5-二羧酸的摩尔比为1∶1.2-1.4∶1-1.2∶0.33-3；

（2）将上述混合物于室温下用电动磁力搅拌反应12-48h，将搅拌后的混合物粘液转移至透析袋中，将透析袋置于蒸馏水中透析6-8天；

（3）将透析得到的透析液转移至培养皿中，用保鲜膜封口后于-12 ~ -24℃下冷冻24-60h，然后取出冷冻后的透析产物，在保鲜膜上戳若干个孔，最后将透析产物真空冷冻干燥24-36h，得到产物咪唑-4,5-二羧酸改性壳聚糖。