CN107362237A - 一种具有抗真菌作用的茶枯提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抗真菌作用的茶枯提取物及其制备方法和其用途，制备方法包括如下步骤：茶枯适当粉碎，40‑80℃烘干0.5‑2h，过10‑30目筛，得到茶枯粉末；加入粉末5‑10倍体积的石油醚加热回流2‑4h，除去残留的茶油；抽滤后，滤渣继续烘干；使用3‑8倍粉末体积的70％乙醇，60‑85℃加热回流提取2‑4次，每次0.5‑2h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得茶枯流体总浸膏；总浸膏用1.5‑2.5倍量水混悬，使用HP20大孔树脂柱层析，依次用8‑15L的纯水、8‑15L 30％乙醇水、8‑15L 50％乙醇水、8‑15L 70％乙醇水、8‑15L 95％乙醇洗脱，减压回收溶剂30％乙醇子馏分、50％乙醇子馏分、70％乙醇子馏分、95％乙醇子馏分。其在制药、化妆品、个人卫生护理产品等等领域都可应用。

Description

一种具有抗真菌作用的茶枯提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及原料制备领域，一种具有抗菌作用的茶枯提取物的制备方法。
背景技术
真菌感染，特别是深部真菌感染及真菌耐药性是人类健康面临的重大问题，是人类致病和致死的主要原因之一。近年来，随着免疫抑制剂的广泛使用，肿瘤放疗、化疗的普遍开展，尤其是艾滋病患者的不断增加，真菌感染特别是深部真菌感染的发病率急剧增加。统计数据显示，在我国某三甲医院，2012年至2014年间，在医院因真菌感染而导致的死亡率达12.88％。真菌感染已经成为上述免疫功能低下的重大疾病患者死亡的主要原因之一。在抗真菌药物长期大量应用于临床的同时，真菌的耐药现象越来越普遍，耐药程度也越来越高，耐药性已成为临床抗真菌治疗失败的主要原因。念珠菌是最常见的深部致病真菌，已成为呼吸道、消化道和泌尿道致病真菌感染的主要原因。在艾滋病患者的继发感染中，念珠菌感染常常最普遍且最先出现。此外，与深度系统性念珠菌感染及局部感染相关的致病和致死也已成为健康的主要问题。据研究，近70％妇女有阴道念珠菌感染史，其中20％出现反复感染。而在此反复感染人群中，约半数病人每年有多次发作。念珠菌属中最常见的致病菌种为白色念珠菌，我国近几年的研究结果显示，白色念珠菌占临床分离致病菌的37.1％～76.5％，占临床分离念珠菌的64.8％～86.3％，可见白色念珠菌是最重要的侵入性机会致病真菌。
真菌感染的治疗至今仍完全依赖于药物治疗。目前，临床使用的抗真菌药物结构类型有限(主要为多烯类两性霉素B及其衍生物、唑类药物、棘白菌素类、尼可霉素等)，作用机理和靶点相对单一，且这些抗真菌药物存在种种的毒副作用和日益严峻的耐药性问题。因此，人们仍急切需要新型抗真菌药物，尤其是具有新结构类型、新作用机理或(和) 作用靶点的抗真菌药物。
油茶(Camellia oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶属植物，主要分布于热带、亚热带地区。我国的油茶资源丰富，福建、江西、湖南、广西等省均有大面积种植。茶枯为油茶籽榨油后剩下的渣饼，资源非常丰富。近年来，部分企业开始对茶枯衍生产品进行开发生产，但与其它国家的综合利用相比，在产品的品种、质量和市场占有率远不如发达国家，产品单一，产业链延伸不够。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗真菌作用的茶枯提取物及其制备方法和用途，以解决现有技术中存在的上述问题。
本发明提供的技术方案如下：
一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的制备方法，包括如下步骤：茶枯适当粉碎，40-80℃烘干0.5-2h，过10-30目筛，得到茶枯粉末；加入粉末5-10倍体积的石油醚加热回流2-4h，除去残留的茶油；抽滤后，残渣继续烘干；使用3-8倍粉末体积的70％乙醇，60-85℃加热回流提取2-4次，每次0.5-2h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得茶枯流体总浸膏；总浸膏用1.5-2.5倍量水混悬，使用HP20大孔树脂柱层析，依次用 8-15L纯水、8-15L 30％乙醇水、8-15L 50％乙醇水、8-15L 70％乙醇水、8-15L 95％乙醇洗脱，减压回收溶剂得30％乙醇子馏分、50％乙醇子馏分、70％乙醇子馏分、95％乙醇子馏分。
一种具有抗真菌作用的茶枯提取物，其是采用前述的方法制备。
在较佳的实施例中，前述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物，为50％或70％乙醇子馏分。
前述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的用途，其作为抗菌成分在制药、化妆品、个人卫生护理产品等方面的用途。
前述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的用途，所述抗真菌为抗白色念珠菌。
由上述描述可知，本发明提供了一种具有抗真菌作用的茶枯提取物及其制备方法，其提取物大孔树脂子馏分尤其是50％和70％子馏分，具有强的抗真菌能力，抑菌直径达到 20-24mm，其在制药、化妆品、个人卫生护理产品等领域等都可应用。
附图说明
图1为本发明实施例2的抗菌测试结果。
具体实施方式
实施例1
茶枯适当粉碎，60℃烘干1h，过20目筛，得到茶枯粉末(1.5kg)。石油醚(10L) 加热回流3h，除去残留的茶油。静置后除去上层溶液，残渣继续烘干。使用70％乙醇(5L) 80℃加热回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得茶枯流体总浸膏。总浸膏用2倍量水混悬，使用HP20大孔树脂(8L)柱层析，依次用纯水(15L)、 30％乙醇水(15L)、50％乙醇水(15L)、70％乙醇水(15L)、95％乙醇洗脱，减压回收溶剂得30％乙醇子馏分、50％乙醇子馏分、70％乙醇子馏分。
实施例2 体外抗真菌活性测试
本实验以白色念珠菌敏感菌株作为指示菌，采用纸片法体外药敏实验确定活性单体化合物，再用直接目测比浊法确定各子馏分的最小抑菌浓度(MIC值)及最小杀菌浓度(MFC 值)。
1、仪器与实验材料
1.1主要的仪器与设备
AIRTECH超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；BS200电子分析天平(德国赛多利斯公司)；LDZX-40SC型立式自控电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；电磁炉(中山市诺洁仕电器有限公司)；96孔细胞培养板(美国CONING COSTAR公司)；精密移液枪(法国Gilson公司)；BDS200倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)。
1.2主要的实验材料
培养基：江门市凯林贸易有限公司
两性霉素B药敏片(10μg)：广州瑞泰生物技术有限公司
两性霉素B：美国SIGMA公司
DMSO：广东光华化学厂有限公司
甲醇：山东禹王实业有限公司
1.3实验菌株
白色念珠菌敏感菌株：ATCC 10231，购于北纳联创生物技术有限公司。
2、实验方法
2.1菌株的活化：将保存在-80℃冰箱白色念珠菌在培养基平板上，置于34℃恒温箱培养 48h，使其活化。
2.2纸片法体外药敏实验
2.2.1样品溶液的制备：分别取化合物约2mg，精密称重。用适量甲醇溶解使其浓度为20 mg/mL。
2.2.2用移液器吸取20μL上述待测溶液于纸片上(直径为5mm)，待溶剂挥干后，将滤纸片置于制备好的含有白色念珠菌的沙氏固体培养基(含菌量约为2×106个/μL)中，每个质量重复做三次。以甲醇作为空白对照，34℃恒温培养24h，取出测量抑菌圈直径，记录数据。
2.2.3目测比浊法测定MIC及MFC的测定
A.菌液制备：用无菌1640培养液将活化后的白色念珠菌稀释至约1×106个/μL。
B.样品及对照品溶液的制备：分别取化合物约2mg，用少量DMSO(用量约为4‰)溶解成一定浓度，加PBS配制成浓度为400μM、200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、 6.25μM、3.125μM的样品溶液。对照品溶液的制备与之相同。
C.分别吸取化合物各浓度的样品溶液100μL置于96孔板中(每个浓度三个复孔)，再往每个样品孔中加入100μL的菌液，混匀，另三个对照孔分别取200μL的菌液，200μL PBS，200μL含2‰DMSO的菌液。对照品做法与之相同。
C.MIC及MFC值的确定：将种好的板置34℃培养箱培养24h，目测比浊法确定MIC值，以MIC的浓度为界线，将MIC浓度及以上浓度的孔板液吸取100μL，置于沙氏固体培养基中，涂布均匀，34℃培养24h，以不长菌的浓度视为MFC值。
3、实验结果
3.1纸片法体外药敏实验结果
Table 1纸片法体外药敏实验结果*(n＝3)
*两性霉素B:10μg，抑菌圈直径为21mm。
Table 2各子馏分的MIC及MFC值*
*两性霉素B:0.78μM(MIC)、6.25μM(MFC)。

Claims (5)

1.一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的制备方法，包括如下步骤：茶枯适当粉碎，40-80℃烘干0.5-2h，过10-30目筛，得到茶枯粉末；加入粉末5-10倍体积的石油醚加热回流2-4h，除去残留的茶油；抽滤后，残渣继续烘干；使用3-8倍粉末体积的70％乙醇，60-85℃加热回流提取2-4次，每次0.5-2h，合并提取液，减压回收溶剂至无醇味，得茶枯流体总浸膏；总浸膏用1.5-2.5倍量水混悬，使用HP20大孔树脂柱层析，依次用8-15L纯水、8-15L 30％乙醇水、8-15L 50％乙醇水、8-15L70％乙醇水、8-15L 95％乙醇洗脱，减压回收溶剂得30％乙醇子馏分、50％乙醇子馏分、70％乙醇子馏分、95％乙醇子馏分,即得具有抗真菌作用的茶枯提取物。
2.一种具有抗真菌作用的茶枯提取物，其特征在于：其是采用权利要求1所述的方法制备。
3.如权利要求2所述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物，其特征在于：所述的茶枯提取物为50％乙醇子馏分或70％乙醇子馏分。
4.如权利要求2所述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的用途，其特征在于：其作为抗菌成分在制药、化妆品、个人卫生护理产品方面的用途。
5.如权利要求2所述的一种具有抗真菌作用的茶枯提取物的用途，其特征在于：所述抗真菌为抗白色念珠菌。
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CN111449090A (zh) * 2020-04-13 2020-07-28 湖南润农生态茶油有限公司 一种茶枯提取物的制备方法

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