CN107334878A - 一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法。本发明的所述用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物，其特征在于，由下述各组分组成：紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根。本发明的中药组合物，组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经过应用试验验证，治疗效果显著，在临床上具有广阔的应用推广价值。

Description

一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组 合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物组合物领域，具体涉及一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法。
背景技术
产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性(G+)产芽胞的厌氧性梭菌，又名韦氏梭菌，拉丁文名C.perfringens，是人类气性坏疽的主要致病菌，主要分布于食物、污水、土壤、人畜粪便及肠道中，为人畜共患病原菌，可引起多种动物的坏死性肠炎、肠毒血症，同时也是人畜创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一。产气荚膜梭菌为梭菌属中为数不多的严格厌氧菌之一，能在20℃到50℃之间的缺氧环境下生长，在血平板上可以看到灰白色、圆形、边缘锯齿状大菌落，可见多数菌落有双溶血环，为该菌的菌落形态特征。该菌按照产生的毒素不同可分为五种血清型——A、B、C、D和E型，由于该菌的致病性与其产生的毒素有关，因此按照细菌产生的主要毒素进行定型，对疾病的诊断和流行病学检测具有重要意义。各血清型菌株中主要毒素的分布如表1所示：
表1 各血清型菌株中主要毒素的分布
注：+为含有毒素，-为不含毒素
产气荚膜梭菌所产生的这些毒素通过协同、辅助等方式造成宿主动物发病，正常情况下该菌的数量在动物肠道内保持相对平衡，当外界条件刺激或饲料突然改变时则会大量繁殖，同时释放出各种毒素，导致宿主发病。在五种类型中，对人有致病作用的主要是A型和C型，其中A型产气荚膜梭菌最为常见，产生的α毒素可以引起气性坏疽和肠胃炎型食物中毒；C型产气荚膜梭菌可立即导致家畜的致命性疾病和人的坏死性肠炎，致病性主要由β毒素引起。ε毒素易在家畜间传播，虽然仅见于B、D两种类型的产气荚膜梭菌中，但其可以使许多有经济价值的家畜传染性肠毒血症并快速死亡，对养殖业造成很大的影响。
对于产气荚膜梭菌导致疾病的防治，由于抗生素和化学抗菌药强大的抑菌效果，应用其防治疾病仍然是主要手段，但由于使用不当以及缺乏监管，造成的环境卫生和食品安全问题备受关注，而且耐药率逐渐上升，为养殖业造成相当大的经济损失。在我国，中药资源丰富、疗效准确、使用方便、毒副作用小且价格便宜。由于治疗经验的积累和临床证治的需要，长期以来，中医方剂已发展有汤、酒、茶、露、丸、散、膏、丹、片、锭、胶、曲，以及条剂、线剂等多种内服、外服剂型，现在又将中药传统剂型发展为口服液、冲剂、大输液等新的剂型，为中医临床治疗提供了了极大的便利。很多中药具有抑菌杀菌作用，其作用的有效成分也较为多样，其有效成分多为挥发油、有机酸、生物碱、萜类、黄酮、醌类、多糖类等。很多单味中药具有抑菌作用，例如经邓群等人研究十字花科植物中异硫氰酸苄酯(BITC)对产气荚膜梭菌就有良好的抑菌作用，现经实验证实有抗菌作用的中药已有100多种。在实际医疗中，复方制剂应该更为普遍，具有很好的抑制和杀灭细菌的作用，而且具有不易产生耐药性，抗菌谱广、可联合应用、剂型适用性广泛等优点，逐渐受到国内外研究者的重视。
发明内容
基于上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物及其制备方法。
具体地，本发明提供一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物，其由下述各组分组成：紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根。
其中，以重量份计，各组分为：
紫花地丁30-60份、败酱草30-60份、黄连25-50份、黄柏25-50份、大黄10-20份、虎杖30-60份、威灵仙20-40份、山豆根20-40份、车前子30-60份、五倍子15-30份、厚朴20-40份、五味子20-40份、吴芋25-50份、板蓝根30-60份。
本发明还提供一种如上所述的组合物的制备方法，其包括下述步骤：
1)按重量配比，分别准确称取紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根，用自来水清洗三遍至无泥沙，加水浸泡30-60分钟；
2)加热至沸腾，用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤，将药渣再加入水用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤；
3)合并两次滤液，用低速离心机以4000r/min离心10min除去沉淀，再用小火浓缩至0.5g/ml，置于4℃环境保存备用。
本发明中治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物，其中紫花地丁、败浆草、黄连、山豆根、板蓝根均具有清热解毒的作用；黄柏，大黄可泻热通肠，凉血解毒；虎杖散瘀定痛；威灵仙消痰水，散癖及积；车前子利水清热；五倍子敛肺、涩肠、止血、解毒；五味子收敛固涩，益气生津；厚朴，吴芋燥湿消痰。
本发明根据中兽医药学辨证施治理论和传统用药经验，结合临床兽医学等技术方法，对中药进行组方的筛选，其组方合理，安全有效，原料易得，制备工艺简单，易于操作，经过应用试验验证，治疗效果显著，在临床上具有广阔的应用推广价值。
附图说明
图1是试验例中革兰氏染色镜检。
图2是试验例中双溶血环显示图。
具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明的技术方案，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例及试验例中所用菌种及仪器等如下所示。
产气荚膜梭菌：购自中国工业微生物菌种管理与保藏中心(CICC)
仪器：ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温振荡器(ZD-85，国华企业)、电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-2，国画电器有限公司)、200g手提式高速万能粉碎机(DFT-200，温岭市林大机械有限公司)、电磁炉、GOODLOOK-1000型薄层色谱成像系统(上海科哲生化科技有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070，上海鸿都电子科技有限公司)、数控超声波清洗器(KH7200DB,昆山禾创超声仪器有限公司)、实验室专用超纯水机、TDZ4-WS台式低速离心机、玻璃砂芯过滤装置、锥形瓶、漏斗、量筒、烧杯等。
药材的薄层鉴定：薄层鉴定方法依据2010年版《中华人民共和国兽药典》(二部)中的性状鉴别方法对紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根14味药材进行薄层鉴定。
实施例1
分别准确称取紫花地丁30g、败酱草30g、黄连25g、黄柏25g、大黄10g、虎杖30g、威灵仙20g、山豆根20g、车前子30g、五倍子15g、厚朴20g、五味子20g、吴芋25g、板蓝根30g，放置于5L-10L的圆筒锅中，加水6L，浸泡45分钟；
(2)中药药液的制备
加热至沸腾，用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤，将药渣再加入1.5L水用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤。合并两次滤液，用低速离心机以4000r/min离心10min除去沉淀，再用小火浓缩至660ml(0.5g/ml，按照药材总重量与实际浓缩液体积的比值计算得该药液浓度)，装于试剂瓶后置于4℃冰箱保存备用。
实施例2
分别准确称取紫花地丁45g、败酱草45g、黄连37.5g、黄柏37.5g、大黄15g、虎杖45g、威灵仙30g、山豆根30g、车前子45g、五倍子22.5g、厚朴30g、五味子30g、吴芋37.5g、板蓝根45g，放置于5L-10L的圆筒锅中，加水3L，浸泡60分钟；
(2)中药药液的制备
加热至沸腾，用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤，将药渣再加入1.5L水用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤。合并两次滤液，用低速离心机以4000r/min离心10min除去沉淀，再用小火浓缩至660ml(0.5g/ml，按照药材总重量与实际浓缩液体积的比值计算得该药液浓度)，装于试剂瓶后置于4℃冰箱保存备用。
实施例3
分别准确称取紫花地丁60g、败酱草60g、黄连50g、黄柏50g、大黄20g、虎杖60g、威灵仙40g、山豆根40g、车前子60g、五倍子30g、厚朴40g、五味子40g、吴芋50g、板蓝根60g，放置于5L-10L的圆筒锅中，加水6L，浸泡30分钟；
(2)中药药液的制备
加热至沸腾，用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤，将药渣再加入1.5L水用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤。合并两次滤液，用低速离心机以4000r/min离心10min除去沉淀，再用小火浓缩至660ml(0.5g/ml，按照药材总重量与实际浓缩液体积的比值计算得该药液浓度)，装于试剂瓶后置于4℃冰箱保存备用。
试验例
产气荚膜梭菌：购自中国工业微生物菌种管理与保藏中心(CICC)。
1.培养基
选择适合厌氧菌生长的GAM肉汤培养基购自北京北纳创联生物技术有限公司，121℃15min灭菌；羊血琼脂平板购自青岛海博生物科技有限公司。
2.实验仪器
二氧化碳培养箱购自TABAI ESPEC CORD.Japan；超净台购自上海力申科学仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；低速离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；微孔滤膜(0.22μm)购自美国安捷伦公司。
3.实验方法
供试菌种的活化
用75％的酒精棉球擦拭冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热。立即滴2～3滴无菌水于加热部位，试管壁破裂，用镊子敲下破裂处，用移液枪吸取0.5ml左右的生理盐水于冻干管中将冻干菌粉全部溶解，从混匀的菌悬液中挑取1环接种于GAM肉汤培养基中，放置于温度为37℃、二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱中，培养24h，传代两次，摇匀菌液代待用。
产气荚膜梭菌的形态学观察
将复壮后的菌液取100μl加入血平板中，用涂布棒涂匀，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养24h，在血平板的菌落中挑取一个，涂于滴有生理盐水的载玻片上，固定，革兰氏染色镜检。
最小抑菌浓度的测定
(1)采用试管二倍稀释法测定药液对供试菌液的最小抑菌浓度。
在无菌条件下，制备相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1:10稀释，作为供试菌液。(1)取有硅胶塞的15ml试管20支，编号A1-9、B1-9、10、11。每管先加入GAM肉汤培养基5ml，121℃15min高压蒸汽灭菌，备用。将中药药液取100ml分为两份，一份经流通蒸气100℃、30min灭菌；另一份经过滤灭菌，保存备用。于第A1管中加入流通蒸气灭菌的受试中药水提物5.0ml，混匀后取出5.0ml放入A2管中，依次类推做1:2～1:512的倍比稀释，直到A9管取出5.0ml弃去，得到A1-A9管的浓度分别为：250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml、15.63mg/ml、7.81mg/ml、3.90mg/ml、1.95mg/ml、0.97mg/ml。在B1-9管中用同法操作，加入过滤灭菌的中药药液。第10管不加药物作为阳性对照，第11管加中药药液5ml混匀后取5ml弃去，不加细菌，作为阴性对照。在二氧化碳培养箱中培养24h后，选取培养液目视无明显浑浊的试管，涂于血平板后按相应试管的编号标明再培养24h，观察血平板上菌落生长的情况。
(2)取流通蒸气灭菌的500mg/ml的中药药液10ml，加无菌水40ml，得到50ml浓度为100mg/ml的供试药液备用。取试管16支，将其中9支试管编号为1-9并在每管内加入GAM肉汤培养基2.5ml，8号加5ml,与剩余试管一同灭菌备用。在灭菌后的空白试管中分别加入供试药液10ml、9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml，再分别加入无菌水0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，混匀，得到的药液浓度分别为：100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml，标记浓度。将各浓度中药药液取2.5ml，按照浓度从大到小分别加入1-7号试管中，得到浓度依次为：50mg/ml、45mg/ml、40mg/ml、35mg/ml、30mg/ml、25mg/ml、20mg/ml。8号不加药液作为阳性对照，9号取100mg/ml药液2.5ml，混匀作为阴性对照。在无菌条件下，制备相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1:10稀释，作为供试菌液，各管中加入100μl的供试菌液，置于37℃、二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养24h，选取培养液目视无明显浑浊的试管，取培养物100μl分别接种于血平板后按相应试管的编号标明，相同条件下培养24h，观察其生长状况。
结果与分析
产气荚膜梭菌的形态学观察
产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，菌落形态为白色或半透明圆形光滑菌落，且菌落边缘为锯齿状，表面潮湿，直径大多为2-5mm，培养时间超过24h菌落颜色会逐渐变为灰白色。其革兰氏染色镜检(如图1)，染色呈紫色，图中可见大量单独或成双排列以及呈短链排列的产气荚膜梭菌，细菌为两端呈圆形的梭菌。将菌落培养至48h时，可在血平板上见到清晰的双溶血环(如图2)。溶血环由θ毒素的作用引起的内环完全溶血和由α毒素所致的外环不完全溶血构成，需要在严格的厌氧条件下培养，在厌氧条件不严格的条件下，双溶血环则不明显或不会出现。
最小抑菌浓度的测定
中药复方水提物不同浓度的抑菌实验结果见表3和表4。由表3可知，经过两种灭菌方法处理的中药复方水提物，各方法所得水提物在不同浓度时对产气荚膜梭菌有不同程度的抑制作用。不同浓度的抑菌效果不同，但两种方法都显示抑菌效果最好的为4号，浓度为31.25mg/ml。在同一浓度下，不同处理方法得到的中药复方水提物对产气荚膜梭菌的抑制作用也不同，由流通蒸气灭菌法得到的水提物在31.25mg/ml至125mg/ml均有抑菌作用，且抑菌效果较为明显；过滤灭菌得到的水提物在相应的范围也有抑菌行为，但效果不如流通蒸气灭菌法。另外从中药水提物对产气荚膜梭菌的抑菌情况来看，药物浓度过高或过低，都不能对细菌的生长产生明显的抑制，甚至会因为中药药液自身所含有的营养物质而促进细菌的生长。
表3 不同方法提取且不同浓度提取物条件下菌落的生长状况
注：A为流通蒸气灭菌，B为过滤灭菌，+为菌落生长，-为菌落未生长，/
经过表3我们选择出了药液的灭菌方法为流通蒸气灭菌法，得到该复方药的水提物抑制产气荚膜梭菌的大概浓度范围为31.25mg/ml至62.5mg/ml，因此配制以5为梯度的浓度范围，再一次实验，所得结果如表4所示，3号平板目视无明显菌落生长，所以可以确定该中药复方水提物对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度为35mg/ml。
表4 不同浓度提取物下菌落的生长状况
注：+为菌落生长，-为菌落未生长。

Claims (3)

1.一种用于治疗产气荚膜梭菌引起的仔猪坏死性肠炎的中药组合物，其特征在于，由下述各组分组成：紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以重量份计，各组分为：
紫花地丁30-60份、败酱草30-60份、黄连25-50份、黄柏25-50份、大黄10-20份、虎杖30-60份、威灵仙20-40份、山豆根20-40份、车前子30-60份、五倍子15-30份、厚朴20-40份、五味子20-40份、吴芋25-50份、板蓝根30-60份。
3.一种如权利要求1或2所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)按重量配比，分别准确称取紫花地丁、败酱草、黄连、黄柏、大黄、虎杖、威灵仙、山豆根、车前子、五倍子、厚朴、五味子、吴芋、板蓝根，用自来水清洗三遍至无泥沙，加水浸泡30-60分钟；
2)加热至沸腾，用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤，将药渣再加入水用大火煎煮30min后改用文火熬煮1h，纱布过滤；
3)合并两次滤液，用低速离心机以4000r/min离心10min除去沉淀，再用小火浓缩至0.5g/ml，置于4℃环境保存备用。
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