CN107334795A - 凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用 - Google Patents

凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，可有效解决治疗链脲佐菌素致糖尿病的用药问题，所述的凌霄花总黄酮是，将凌霄花粉碎成粗粉，用乙醚回流提取，脱脂，弃去乙醚；凌霄花药渣挥干乙醚，用80%乙醇回流提取，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散成分散液，上AB‑8型大孔吸附树脂，依次用蒸馏水、10%乙醇、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得凌霄花总黄酮，本发明可有效解决从凌霄花中提取凌霄花总黄酮，并有效用于治疗反复脑缺血，开拓了凌霄花的新用途和药用价值，是药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。

Description

凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖 尿病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病致病原因很多，其中由链脲佐菌素所引起的糖尿病称为链脲佐菌素致糖尿病，对人的身体健康危害很大。
凌霄花是紫葳科、凌霄属攀援藤本植物，拉丁学名：(Campsis grandiflora)，具有行血去瘀、凉血祛风的功效，用于经闭，产后乳肿，风疹发红，皮肤瘙痒，痤疮。但至今未见有从凌霄花中提取凌霄花总黄酮用于制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，可有效解决治疗链脲佐菌素致糖尿病的用药问题。
本发明解决的技术方案是，一种凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，所述的凌霄花总黄酮是，将凌霄花粉碎成粗粉，用乙醚回流提取，脱脂，弃去乙醚；凌霄花药渣挥干乙醚，用80％乙醇回流提取，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散成分散液，上AB-8型大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱，弃去水液；继用10％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得凌霄花总黄酮。
本发明可有效解决从凌霄花中提取凌霄花总黄酮，并有效用于治疗反复脑缺血，开拓了凌霄花的新用途和药用价值，是药物上的一大创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况为本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，一种凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，所述的凌霄花总黄酮是，将凌霄花粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脱脂，弃去乙醚；凌霄花药渣挥干乙醚，加凌霄花10倍重量的、质量浓度80％乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加凌霄花10倍重量的、质量浓度80％乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；继用4倍柱体积的、质量浓度10％乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的、质量浓度80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得凌霄花总黄酮，凌霄花总黄酮质量含量60％以上。
本发明所制备的凌霄花总黄酮作为唯一活性成分有效用于制备治疗链脲佐菌素致糖尿病的药物，是治疗链脲佐菌素致糖尿病药物上的创新，并经实验取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
1实验材料
1.1实验试剂
本发明凌霄花总黄酮；盐酸二甲双胍片：上海信谊药厂有限公司生产，生产批号48141111；STZ：sigma公司生产，批号20150625；葡萄糖体外诊断试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，生产批号153391；GSP体外测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所生产，批号20151117；胰岛素体外测定试剂盒，R&D公司生产，批号20151101A；胰岛素抗体体外测定试剂盒，R&D公司生产，批号20151101A；NO体外测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号20151112；NOS体外测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号20151113；胆固醇体外测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号201151116；甘油三酯体外测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号20151117；SOD体外测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产，批号20151112。
1.2实验仪器
紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司，型号UV1000；高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H1850R；酶标仪，BioTek(美国)公司，型号CYT3MFVDG。
1.3实验动物
Wistar大鼠，雄性，体重180～220g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供，合格证号：37005400000044，许可证号：SCXK(鲁)2013—0001；实验室许可证号SYXK(豫)2015-0005，伦理编号：DWLL15010021。
2试验方法
2.1造模与给药
取106只大鼠，正常饮食饮水一周，称量体重后平均选择12只为空白组，待造模大鼠以STZ 50mg/kg(溶于柠檬酸缓冲溶液)剂量舌下静脉注射，用毛细管眼眶静脉从取血，测定7天后的血糖，选取造模大鼠血糖值处于16.7mmol/L至21mmol/L之间，并具有糖尿病症状的60只。随机分为模型组、大、中、小剂量凌霄花总黄酮、二甲双胍组共5组，每组12只。模型组和空白组灌胃给药同体积的生理盐水(0.1ml/10g)，盐酸二甲双胍片组(0.23g/kg相当于临床用量的10倍)，大、中、小剂量凌霄花总黄酮组(0.2、0.1、0.05g/kg)，连续给药31天，测给药的第10、20、30天时血糖值。第31天，给药后2h，取血，分离血清，测血清中胰岛素、胰岛素抗体、GSP、胆固醇、甘油三酯、SOD、NO含量、NOS活力。取血后处死大鼠，取胰腺、肾脏、肝做病理切片，观察其病理改变。做大鼠胰脏、肾脏、胸腺、脾脏、肝脏病理切片，观察病理组织变化。
3统计学处理方法
数据分析用SPSS17.0医用统计包进行数据资料的统计学处理，计量资料用平均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，方差检验齐者用LSD法，方差不齐者用Games-Howell法检验，等级资料采用Ridit检验。
4实验结果
4.1对STZ致糖尿病模型大鼠动态血糖、GSP、胰岛素及胰岛素抗体的影响，见表1。
表1凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血糖的影响(n＝12)
与模型组比**P<0.01，与空白组比△△P<0.01
由上表可以看出，与空白组比，第10、20、30天，模型组血糖值升高(P<0.01)，有统计学意义，说明糖尿病大鼠模型成功，且没有自愈现象。相比于模型组，第20、30天，二甲双胍组、大、中、小剂量凌霄花总黄酮组糖尿病模型大鼠血糖值降低(P<0.01)。
4.2对STZ致糖尿病模型大鼠胰岛素、胰岛素抗体、GSP的影响，见表2
表2凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清胰岛素、胰岛素抗体、GSP水平的影响(n＝12)
与模型组比**P<0.01，*P<0.01；与空白组比△△P<0.01
由上表可知，与空白组比，模型组血清胰岛素水平降低(P<0.01)，血清高胰岛素抗体水平和GSP含量升高(P<0.01)，有统计学意义，说明糖尿病大鼠模型成功，且没有自愈现象。相比于模型组，二甲双胍组可升高血清胰岛素水平(P<0.01)，降低血清胰岛素抗体水平和GSP含量(P<0.01)；大、中、小剂量凌霄花总黄酮组可升高血清胰岛素水平(P<0.01，P<0.05)，可降低血清胰岛素抗体水平(P<0.01)，结果具有统计学意义。
4.3对STZ致糖尿病模型大鼠NO、NOS及SOD的影响，见表3
表3凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清NO、NOS及SOD水平的影响(n＝12)
与模型组比*P<0.05，与模型组比**P<0.01；与空白组比△△P<0.01
由上表可知，与空白组比，模型组NO、NOS升高(P<0.01)，SOD的含量降低(P<0.01)，有统计学意义，说明糖尿病大鼠模型成功，且没有自愈现象。相比于模型组，二甲双胍组和大、中、小剂量凌霄花总黄酮组均可降低模型大鼠血清中NO和NOS水平(P<0.01，P<0.05)，可显著升高SOD水平(P<0.01)。
4.4对STZ致糖尿病模型大鼠血清胆固醇、甘油三酯的影响，见表4
表4凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠血清胆固醇、甘油三酯水平的影响(n＝12)
与模型组比*P<0.05，与模型组比**P<0.01；与空白组比△△P<0.01
由上表可知，与空白组比，模型组大鼠血清胆固醇及甘油三酯含量升高(P<0.01)，有统计学意义，说明糖尿病大鼠模型血脂升高，且没有自愈现象。相比于模型组，二甲双胍组可降低模型大鼠血清胆固醇、甘油三酯含量(P<0.01)，大、中、小剂量凌霄花总黄酮组均可降低模型大鼠血清胆固醇、甘油三酯含量(P<0.01，P<0.05)，说明凌霄花总黄酮可以降血脂。
4.5对STZ致糖尿病模型大鼠胰腺组织的影响
表5凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠胰腺组织形态的影响
“-”胰腺中的胰岛数≥5，胰岛β细胞核分布松散，胞浆均匀丰富；“+”胰腺中的胰岛数＞4，少数胰岛β细胞的胞浆萎缩、核密集；“++”胰腺中2＜胰岛数＜3，一定数目的胰岛β细胞胞浆萎缩、核密集；“+++”胰腺中胰岛在＜2个，大量胰岛β细胞胞浆消失，几乎全部胰岛β细胞核密集
不同给药组大鼠胰腺病理观察结果如下：空白组大鼠胰岛细胞核松散分布，胞浆丰满；模型组大鼠胰岛细胞核分布极度密集，胞浆极度萎缩；二甲双胍组大鼠胰岛细胞核轻度密集，胞浆轻度萎缩；大剂量凌霄花总黄酮组大鼠胰岛细胞核轻度密集，胞浆较萎缩；中剂量凌霄花总黄酮组大鼠胰岛细胞核中度密集，胞浆萎缩；小剂量凌霄花总黄酮组大鼠胰岛细胞核中度密集，细胞胞浆萎缩。
经Radit检验，相比于空白组，模型组胰岛细胞数目减少甚至消失，胞浆明显萎缩，胰岛细胞退化，表明模型组组胰岛受到严重受损。相比于模型组，二甲双胍组、凌霄花总黄酮各剂量组，恢复胰岛细胞胞浆，对抗胰岛素的萎缩(P<0.01)；凌霄花总黄酮大剂量组见、中剂量组胰岛细胞胞浆较丰富，部分细胞核密集(P<0.01)；凌霄花总黄酮小剂量组部分胰岛细胞核较密集，胰岛胞浆少(P<0.01)。
4.6对STZ致糖尿病模型大鼠肾脏组织的影响，见表6
表6凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠肾脏组织形态的影响
“-”肾小球、肾小囊、肾小管正常；“+”肾小球稍有增生，肾小囊腔稍有变窄，肾小管轻度水肿；“++”肾小球细胞增生，肾小囊腔变窄，肾小管上皮细胞水肿且管腔变窄；“+++”肾小球细胞出现明显增生，肾小囊腔明显变窄或消失，肾小管上皮细胞出现明显水肿，管腔变窄或完全消失。
不同给药组大鼠肾脏病理观察结果如下：空白组大鼠肾小球、肾小囊、肾小管基本正常；模型组大鼠肾小球细胞增生，小管上皮细胞出现水肿，肾小囊变窄；二甲双胍组大鼠肾小球细胞轻度增生，肾小囊腔轻度变窄，小管上皮细胞轻度水肿；大剂量凌霄花总黄酮大鼠肾小球细胞稍有增生，肾小囊腔略微变窄，小管上皮细胞略有水肿；中剂量凌霄花总黄酮组大鼠肾小球细胞少量增生，肾小囊腔部分变窄，小管上皮细胞部分水肿；小剂量凌霄花总黄酮大鼠肾小球细胞增生，肾小囊腔变窄或消失，小管上皮细胞水肿。
经Radit检验，空白组肾小球，相比于空白组，模型组肾小球增生，小管上皮细胞出现水肿且管腔变窄(P<0.01)。相比于模型组，二甲双胍组、大、中、小剂量凌霄花总黄酮组均具有改善模型大鼠肾的病理损伤功能(P<0.01)。
4.7对STZ致糖尿病模型大鼠肝脏组织的影响，见表7
表7凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠肝组织形态的影响
“-”肝细胞、肝窦均正常；“+”肝细胞和肝窦比较正常，部分出现充血；“++”肝细胞水肿、肝窦变窄，部分有充血；“+++”肝细胞明显水肿，肝窦部分消失，大部分充血
经Radit检验，空白组的肝细胞窦清晰，肝细胞呈现放射状排列。模型组的肝窦极度变窄且水肿(P<0.01)，肝细胞排列不规律杂乱。相比于模型组，二甲双胍组肝细胞排列稍微凌乱呈放射状，肝窦可见(P<0.01)，凌霄花总黄酮大剂量组、中剂量组肝细胞排列呈稍微凌乱放射状，小剂量组肝细胞排列紊乱(P<0.01)。
4.8对STZ致糖尿病模型大鼠脾脏组织的影响，见表8
表8凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠脾脏组织形态的影响(n＝12)
与模型组比，**P<0.01；与空白组比，△△P<0.01
不同给药组大鼠脾脏病理观察结果如下：空白组大鼠脾脏红髓与白髓界限清晰，脾小结和淋巴细胞密集，脾窦正常；模型组大鼠脾脏红髓与白髓界限模糊，脾小结和淋巴细胞稀疏，脾窦充血；二甲双胍组大鼠脾脏红髓与白髓界限清晰，脾小结和淋巴细胞较密集，脾窦正常；大剂量凌霄花总黄酮组大鼠脾脏红、白髓边界清晰，脾小结和淋巴细胞密集，脾窦稍有充血；中剂量凌霄花总黄酮组大鼠脾脏红、白髓边界较清晰，脾小结和淋巴细胞较密集，脾窦稍有充血；小剂量凌霄花总黄酮组大鼠脾脏红髓与白髓界限较清晰，脾小结和淋巴细胞较密集，脾窦部分充血。
由表8可知，可见空白组脾小结的体积较大、淋巴细胞较为密集，皮质和髓质分界清晰，与空白组比模型组脾小结的数目减少且体积减小，皮质显著变薄(P<0.01)。与模型组相比，二甲双胍组、凌霄花总黄酮大、中、小剂量组剂量组能显著增大脾小结的体积(P<0.01)，和淋巴细胞个数。
4.9对STZ致糖尿病模型大鼠胸腺组织的影响，见表9
表9凌霄花总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病模型大鼠胸腺组织形态的影响(n＝12)
模型组比较**P﹤0.05；与空白组比较△△P﹤0.01
不同给药组大鼠胸腺病理观察结果如下：空白组大鼠胸腺皮质厚，皮质和髓质分界清晰，淋巴细胞密集；模型组大鼠胸腺皮质变薄，皮质和髓质界限模糊，淋巴细胞稀疏；二甲双胍组大鼠胸腺皮质厚，皮质和髓质分界较清晰，淋巴细胞密集；大剂量凌霄花总黄酮组大鼠胸腺皮质厚，皮质和髓质分界较清晰，淋巴细胞密集；中剂量凌霄花总黄酮组大鼠胸腺皮质较厚，皮质和髓质分界较清晰，淋巴细胞较密集；小剂量凌霄花总黄酮组大鼠胸腺皮质较厚，皮质和髓质分界部分模糊，淋巴细胞较密集。
由表9可以看出：空白组胸腺正常(P<0.01)，模型组胸腺皮质与髓质界限混乱。相比于模型组，二甲双胍组、大、中、小剂量凌霄花总黄酮组的模型大鼠胸腺的皮质厚度和淋巴细胞数增加(P<0.01，p<0.05)，结果具有统计学意义。
5结论
凌霄花总黄酮对因造模导致的大鼠血糖值、GSP、甘油三酯、胆固醇含量、胰岛素水平、NO水平和NOS活力均升高，胰岛素抗体水平和SOD活力降低现象有很好的改善作用。不仅能减少模型血脂，还能模型的清除自由基的能力，促使糖尿病模型动物的胰腺、肾脏、肝脏恢复，提高机体免疫力。
6临床实验资料
在动物试验确保安全的基础上，在临床上进行了对比试验，对比组采用饮食干预，试验组采用饮食干预加凌霄花总黄酮，有关试验情况如下：
选择未经药物治疗的轻型糖尿病患者60例，随机分为2组，每组30人：一组采取饮食干预，计算每日所需总热量按照成人糖尿病热量供给标准表，计算每日应摄入热能标准为理想体重(公斤)×千卡/公斤体重。按不同体型、劳动强度计算每日所需的热能。体型按消瘦、正常和肥胖划分，劳动强度分为卧床休息、轻度、中度和重度。其中，体型为消瘦时，不同劳动强度所需的热量依次为25～30、35、40、45～50千卡/公斤/天；体型为正常时，不同劳动强度所需的热量依次为20～25、30、35、40千卡/公斤/天；体型为肥胖时，不同劳动强度所需的热量依次为15～20、20～25、30、35千卡/公斤/天。另一组为在饮食干预基础上加用凌霄花总黄酮(制成胶囊，每粒0.3g，每次2粒，每天2次)。
4周后检测结果：控制饮食组开始时空腹静脉血糖为7.88±1.22mmoI/L，一个月后平均降低0.87mmoI/L；控制饮食加用凌霄花总黄酮组开始时空腹静脉血糖为7.86±1.14mmoI/L，一个月后平均降低1.65mmoI/L。控制饮食加用凌霄花总黄酮组疗效明显优于控制饮食组。
从上述实验中可以清楚的看出，本发明从凌霄花中提取的凌霄花总黄酮作为唯一活性成分有效用于制备治疗链脲佐菌素致糖尿病的药物，实现凌霄花总黄酮在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，其制备方法简单，易操作，开拓了凌霄花新的药用价值和商业价值，是治疗链脲佐菌素致糖尿病药物上的创新，经济和社会效益显著。

Claims (1)

1.一种凌霄花总黄酮作为唯一活性成分在制备治疗链脲佐菌素致糖尿病药物中的应用，所述的凌霄花总黄酮是，将凌霄花粉碎成过20-30目筛的粗粉，先加10倍重量的乙醚回流提取1h，脱脂，弃去乙醚；凌霄花药渣挥干乙醚，加凌霄花10倍重量的、质量浓度80%乙醇浸泡0.5h，回流提取1h，过滤，得第一次滤液；药渣再加凌霄花10倍重量的、质量浓度80%乙醇，回流提取1h，过滤，得第二次滤液，合并两次滤液，减压回收乙醇至无醇味，加蒸馏水分散至相当于含生药0.3g/mL的分散液，分散液上AB-8型大孔吸附树脂，先用2倍柱体积蒸馏水洗脱，弃去水液；继用4倍柱体积的、质量浓度10%乙醇洗脱，弃去洗脱液；再用6倍柱体积的、质量浓度80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，粉碎，得凌霄花总黄酮。
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