CN107320524A - 一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物 - Google Patents

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CN107320524A CN201710523263.4A CN201710523263A CN107320524A CN 107320524 A CN107320524 A CN 107320524A CN 201710523263 A CN201710523263 A CN 201710523263A CN 107320524 A CN107320524 A CN 107320524A
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许海玉
李慧
徐颖
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Abstract

本申请涉及一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物。所述的药物组合物包含淫羊藿、牡蛎、骨碎补、丹参和大豆异黄酮。本申请还公开了上述组合物在制备用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物中的用途。本申请的药物组合物显示出雌激素样的作用，在大鼠模型中，能够提高血中雌激素水平、提高雌激素受体的表达水平、促进子宫和阴道的生长发育、促进骨代谢、提高骨密度、降低破骨细胞数目以及降低血脂，提示对围绝经期综合征具有潜在的防治作用。

Description

一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物
技术领域
本申请涉及中医领域；更具体地涉及一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的中药组合物及其用途。
背景技术
围绝经期综合征(又称更年期综合征)，指妇女绝经前后出现性激素波动或减少所致的一系列以自主神经系统功能紊乱为主，伴有神经心理症状的一组症候群。绝经可分为自然绝经和人工绝经两种。自然绝经，指卵巢内卵泡用尽或剩余的卵泡对促性腺激素丧失了反应，卵泡不再发育和分泌雌激素，不能刺激子宫内膜生长，导致绝经。人工绝经，是指手术切除双侧卵巢或用其他方法停止卵巢功能，如放射治疗和化疗等。
围绝经期是正常的生理变化，主要表现为：月经改变，少数妇女出现功能性子宫出血，甚至造成严重贫血；泌尿生殖道改变，生殖器官开始萎缩，粘膜变薄，易发生老年性阴道炎及性交疼痛等；神经精神症状，主要为潮红、发热、出汗等血管舒张症状，情绪不稳定、激动易怒、抑郁多烦、记忆力减退、工作能力下降等；皮肤皱纹逐渐增多，有的出现瘙痒、毛发开始变白脱落；腹部和臀部脂肪增多，容易发胖；心血管系统变化，血压易波动，常出现高血压、心前区闷痛不适、心悸、气短，动脉硬化发生率增加，冠心病发病率也上升；以及绝经后骨质疏松症(PMOP)。
围绝经期综合征的治疗方法包括心理治疗，了解绝经是生理变化过程，必要时可选用镇静药；为预防骨质疏松，可以摄入含钙丰富的食物、坚持体质锻炼，并补充钙剂；此外还涉及雌激素替代治疗。
从中医学角度而言，并没有围绝经期综合征的病名。中医妇科学将其称为经断前后诸证，又称为绝经前后诸证(彭仙，围绝经期综合征的中医治疗近况，光明中医，2014年5月，29卷)。
基础研究和临床试验的结果显示，一些中草药(比如淫羊藿、葛根、丹参、骨碎补、接骨木、蛇床子、山茱萸、莬丝子、女贞子以及仙茅)以及药用植物(比如大豆异黄酮、总状升麻、红花子、黑榆以及黄蜀葵花)提取物或生物活性成分具有抗绝经后骨质疏松症的作用(许英，中草药及药用植物治疗绝经后骨质疏松症——从基础研究到临床评价，辽宁中医杂志，2009年第10期)。
邹丽宜等人报道，复方丹参制剂(丹参、黄芪、白术和淫羊藿)通过促进成骨和抑制破骨，对糖皮质激素所致的骨质疏松症有一定的防治作用(复方丹参制剂对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠的防治作用，中国临床康复，2005年第11月)。
CN101138597A公开了一种可用于预防和治疗骨质疏松症的中药制剂，其含有12至48份的淫羊藿、12至48份的丹参、12至48份的补骨脂、18至48份的熟地、5至58份的牡蛎，该中药制剂具有明显的补肾壮骨作用，对骨质疏松症有明显的防治作用。
发明内容
本公开提供了一种新型的用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物，其包含作为活性成分的淫羊藿、牡蛎、骨碎补、丹参和大豆异黄酮。
在一个实施方案中，提供了一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物，其包含：
40至100个重量份的淫羊藿；
40至100个重量份的牡蛎；
40至100个重量份的骨碎补；
20至60个重量份的丹参；和
0.2至2个重量份的大豆异黄酮。
在一些实施方案中，淫羊藿在本公开组合物中所占重量份是40至100个重量份。在本申请中，当提及重量份的数值范围时，就好比提及了落入该范围内的每一个具体的数值，例如但不限于40、50、60、70、80、90、100个重量份。在优选的实施方式中，淫羊藿在本公开组合物中所占重量份是50至70，例如50、55、60、65、70。在具体的实施方式中，淫羊藿在本公开组合物中所占重量份是60。
在一些实施方案中，牡蛎在本公开组合物中所占重量份是40至100个重量份。在本申请中，当提及重量份的数值范围时，就好比提及了落入该范围内的每一个具体的数值，例如但不限于40、50、60、70、80、90、100个重量份。在优选的实施方式中，牡蛎在本公开组合物中所占重量份是50至70，例如50、55、60、65、70。在具体的实施方式中，牡蛎在本公开组合物中所占重量份是60。
在一些实施方案中，骨碎补在本公开组合物中所占重量份是40至100个重量份。在本申请中，当提及重量份的数值范围时，就好比提及了落入该范围内的每一个具体的数值，例如但不限于40、50、60、70、80、90、100个重量份。在优选的实施方式中，骨碎补在本公开组合物中所占重量份是50至70，例如50、55、60、65、70。在具体的实施方式中，骨碎补在本公开组合物中所占重量份是60。
在一些实施方案中，丹参在本公开组合物中所占重量份是20至60个重量份。在本申请中，当提及重量份的数值范围时，就好比提及了落入该范围内的每一个具体的数值，例如但不限于20、25、30、35、40、45、50、55、60个重量份。在优选的实施方式中，丹参在本公开组合物中所占重量份是30至50，例如30、35、40、45、50。在具体的实施方式中，丹参在本公开组合物中所占重量份是40。
同时，在本公开的组合物中，丹参的含量小于淫羊藿的含量。在本公开的组合物中，丹参的含量小于牡蛎的含量。在本公开的组合物中，丹参的含量小于骨碎补的含量。
在一些实施方案中，大豆异黄酮在本公开组合物中所占重量份是0.2至2个重量份。在本申请中，当提及重量份的数值范围时，就好比提及了落入该范围内的每一个具体的数值，例如但不限于0.2、0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.8、2.0个重量份。在优选的实施方式中，大豆异黄酮在本公开组合物中所占重量份是0.8至1.5，例如0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5。在具体的实施方式中，大豆异黄酮在本公开组合物中所占重量份是1。
在一个实施方案中，根据本公开的药物组合物制备成选自以下的形式：片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂和丸剂。在一个具体的实施方式中，根据本公开的药物组合物是片剂。
在一个实施方案中，根据本公开的药物组合物还含有可药用载体，例如但不限于乙醇、淀粉、硬脂酸镁、糊精、阿拉伯胶、明胶、纤维素、纤维素衍生物、矫味剂(如糖浆、葡萄糖)。
根据本公开的又一方面，提供了组合物在制备预防和/或治疗围绝经期综合征的药物中的用途，其中所述组合物包含淫羊藿、牡蛎、骨碎补、丹参和大豆异黄酮。在一个实施方案中，所述组合物其包含：40至100个重量份的淫羊藿；40至100个重量份的牡蛎；40至100个重量份的骨碎补；20至60个重量份的丹参；和0.2至2个重量份的大豆异黄酮。
在一些实施方案中，围绝经期综合征选自：绝经后骨质疏松症、高血脂症及其组合。
在一些实施方案中，对围绝经期综合征的预防和/或治疗表现为选自以下的一项或更多项：提高血中雌激素水平、提高雌激素受体的表达水平、促进子宫和阴道的生长发育、促进骨代谢、提高骨密度、降低破骨细胞数目、降低血脂及其组合。在一个具体的实施方案中，雌激素选自：卵泡生成激素、黄体生成激素和雌二醇。在一个具体的实施方案中，改善骨代谢选自：提高血钙浓度、提高血磷浓度、改善成骨细胞分化、改善骨吸收及其组合。在一个具体的实施方案中，改善成骨细胞分化表现为：降低碱性磷酸酶的水平和/或降低骨钙素的水平。在一个具体的实施方案中，改善骨吸收表现为降低I型胶原羧基末端肽的水平。在一个具体的实施方案中，提高骨密度表现为改善骨微结构，所述骨微结构选自：总骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隔及其组合。在一个具体的实施方案中，降低血脂是指降低血清中的总胆固醇和/或甘油三酯水平。
根据一些实施方式，提供了一种药物组合物的制备方法，包括步骤：
1)提供40至100个重量份的淫羊藿、40至100个重量份的骨碎补、以及20至60个重量份的丹参，混合后获得混合物；
2)相对于所述混合物的重量，采用8至12倍重量/体积比的溶剂对所述的混合物进行浸提，得到浸提液；
3)去除所述浸提液中的溶剂后，并进行浓缩和干燥，得到干粉；
4)向所述干粉中加入40至100个重量份的牡蛎和0.2至2个重量份的大豆异黄酮，进行混合得到所述药物组合物。
在一些实施方式中，根据本公开的药物组合物的制备方法还任选地包括对药物组合物进行粉碎和过筛的步骤。在一些实施方式中，对所述药物组合物进行过60至100目筛。在具体的实施方式中，对所述药物组合物进行过80目筛。
在一些实施方式中，相对于所述混合物的重量，采用10倍重量/体积比的溶剂对所述的混合物进行浸提。
在本公开中，适用于中药材浸提的溶剂包括但不限于乙醇。在具体的实施方式中，用60％的乙醇进行浸提。
在一些实施方式中，采用旋转蒸发去除所述浸提液中的剩余溶剂。在具体的实施方式中，在60至70℃去除浸提液中的剩余溶剂。在具体的实施方式中，在65℃去除浸提液中的剩余溶剂。
在一些实施方式中，通过减压干燥的方式进行所述干燥。在具体的实施方式中，减压至几近真空。在具体的实施方式中，在30至50℃进行减压干燥。在具体的实施方式中，在40℃进行减压干燥。
在一些实施方式中，在步骤2)中，所述浸提可以重复1至3次，以及合并每次的浸提液，用于随后的步骤中。
根据一些实施方式，提供了一种药物组合物的制备方法，包括步骤：
1)提供60个重量份的淫羊藿、60个重量份的骨碎补、以及40个重量份的丹参，混合后获得混合物；
2)相对于所述混合物的重量，采用10倍重量/体积比的60％乙醇对所述的混合物进行1至3次浸提，得到浸提液；
3)在60至70℃采用旋转蒸发去除所述浸提液中的乙醇后，并进行浓缩，在30至50℃通过减压干燥的方式进行干燥，得到干粉；
4)向所述干粉中加入60个重量份的牡蛎和1个重量份的大豆异黄酮，进行混合；
5)对步骤4)的产物进行粉碎并过60至100目筛，得到所述药物组合物。
根据另一些实施方式，还提供了上述方法所获得的药物组合物。
根据另一些实施方式，还提供了上述方法所获得的药物组合物在制备预防和/或治疗围绝经期综合征的药物中的用途。
具体实施方式
实验材料
1.仪器与设备
BMJ-1生物组织包埋机(天津天利航空机电有限公司)；QPJ-C轮转式切片机(天津天利航空机电有限公司)；KPJ-1A烤片机(天津天利航空机电有限公司)；ZPJ-1A展片机(天津天利航空机电有限公司)；GHP-9080隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)；正置显微镜(OLYPUS产品，BX50)；旋涡混合器(北京金北德工贸有限公司，KA-1000)；电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，SFG-02.400)；自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂，SZ-93)；全自动酶标仪(Thermo公司，MK3型)；低温离心机(Sigma公司，3K15)；生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司，HFsafe-TE1200)；CO2培养箱(上海力申科学仪器有限公司，HF151UV)。
2.药品与试剂
雌二醇和(30％)丙烯酰胺购于Sigma公司；
戊酸雌二醇(补佳乐)购于拜耳公司；
苏木染液和伊红染液购于北京中衫金桥生物技术有限公司；
两步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒和0.01M PBS购于武汉博士德生物工程有限公司；
PIPA裂解液、5×上样缓冲液、封闭专用脱脂奶粉和ECL发光剂购于北京普利莱基因技术有限公司；
兔抗鼠ERα多克隆抗体购于北京盛世中方生物技术有限公司；
兔抗鼠ERβ多克隆抗体购于北京盛世中方生物技术有限公司；
辣根酶过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和蛋白分子量Marker(14-100kDa)购于北京中杉金桥技术有限公司产品；
PVDF膜购于Millipore公司；
牛血清白蛋白购于Roche产品；
DMEM(高糖)、无酚红DMEM、特级胎牛血清FBS和0.25％胰酶购于Gibco公司；
活性炭过滤胎牛血清CDT-FBS(SH30068.03)购于Hyclone公司；
噻唑蓝MTT和二甲基亚砜DMSO购于北京科海荣京生物科技有限公司；
二甲苯购于北京化工厂；
亚甲基蓝购于上海试剂三厂；
多聚甲醛购于北京益利精细化学品有限公司。
实施例1.本申请药物组合物的制备
称量药材10.0g丹参、15.0g淫羊藿、15.0g骨碎补；
向上述药材加10倍量(400mL)的60％乙醇，回流提取3小时，过滤后得滤液，再提取2次后，合并滤液；
将得到的总滤液置于旋转蒸发仪中，在65℃的条件下减压浓缩；
至无乙醇味后放入蒸发皿中，在水浴锅上浓缩成浸膏；
转移至减压真空干燥机中干燥(40℃)，得提取物干粉；
然后加入15.0g牡蛎粉和250mg大豆异黄酮，混匀后粉碎过80目筛后备用。
实施例2.本申请药物组合物的雌激素样作用
1.实验方法(未成熟小鼠模型)
1.1实验动物
昆明小鼠50只，雌性，出生后21天，体重9至12g，购自军事医学科学院，SPF级，许可证号为：SCXK(军)2012-0004。
1.2实验分组与给药
取健康、出生21天的雌性小鼠30只，适应性饲养2天，根据体重随机分为空白对照组(Con)、本申请药物组合物的低中高剂量组、戊酸雌二醇(EV)组，每组10只。
本申请药物组合物的低、中、高剂量组分别按(1.3g/kg、2.6g/kg、5.2g/kg)灌胃；阳性药组(即EV组)按0.11mg/kg灌胃给药；空白对照组给予等体积的蒸馏水。
每天1次，连续给药5天。
1.3取样
小鼠末次给药后24h，称重，摘眼球取血，3000rpm离心15min，分离血清，-80℃贮存备用。小鼠脱颈处死，迅速剖腹摘取子宫和阴道，称重后计算子宫系数，并分取左侧子宫角，宫颈近端阴道部分放入4％的多聚甲醛溶液中固定待作病理形态学观察和免疫组织化学检测，右侧子宫角，宫颈远端阴道部分立即置于-80℃冷藏待Western-bolt检测。
1.4组织病理学观察
子宫和阴道组织经4％甲醛固定48h后，常规脱水，石蜡包埋切片，行苏木精-伊红染色。在光学显微镜下进行组织病理学检查。
1.5血液学检查
小鼠血清E2、LH、FSH水平由北京鑫方程生物科技有限公司检测。
1.6免疫组化
按“1.4”项方法制备组织切片，常规脱蜡至水，3％双氧水封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤，0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)修复抗原，暴露抗原决定簇。PBS洗涤，牛血清室温封闭30min，滴加兔抗鼠ERα/ERβ多克隆抗体(1∶30稀释)，用两步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒进行ERα/ERβ免疫组织化学染色。显微镜下观察显色效果，至棕黄色时用蒸馏水中止显色，脱水，二甲苯透明，树脂封片。在光学显微镜下进行免疫组织化学检查。应用IPP(Image Pro Plus6.0，USA)图像分析系统进行半定量分析，计算IOD值。
1.7统计学分析
应用SPSS17.0软件对数据进行分析处理，各组数据以均数±标准差来表示，以P<0.05作为统计学具有显著性差异的标准。
2.实验结果
2.1本申请药物组合物对未成熟小鼠子宫系数的增加作用，结果见表1。
表1.本申请药物组合物对未成熟小鼠子宫系数的增加作用(n＝10)
结果表明：本申请药物组合物的各剂量组具有促进未成熟小鼠的子宫系数的增长的作用，作用效果类似于苯甲酸雌二醇。
2.2本申请药物组合物增加未成熟小鼠血清中雌激素水平的影响，结果见表2。
表2.对未成熟小鼠血清中雌激素水平的影响(n＝10)
注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***P<0.001。
结果表明：与空白对照组相比，本申请药物组合物具有升高未成熟小鼠血清中E2含量，降低LH、和FSH含量的作用，作用效果和趋势与经典的雌激素受体激动剂戊酸雌二醇相似，提示本申请药物组合物可能具有雌激素样作用。
2.3本申请药物组合物促进未成熟小鼠子宫阴道生长发育作用
空白对照组宫腔大，子宫内膜上皮为呈单层正方形状，子宫内膜间质紧密，基本不见腺体，环形肌细胞排列疏松；与正常对照组比较，给予本申请药物组合物后低剂量组子宫内膜上皮呈柱状，子宫内膜厚度变大，腺体数目增多；中剂量组与对照组相比，子宫内膜增厚，内膜上皮及腺上皮呈高柱状且多见核下空泡，腺体变大数目增多；阳性组较对照组，子宫内膜上皮层数增多，子宫内膜明显增厚，内膜间质水肿，子宫肌层变薄。
空白对照组阴道有1-2层鳞状上皮；与正常对照组相比，本申请药物组合物低剂量组阴道上皮鳞状层增多且最外层出现粘液化上皮，可见杯状细胞及分泌物；中剂量组鳞状层高度及细胞角化程度比正常对照组都有明显增高，鳞状细胞变大；阳性组较正常组鳞状上皮及角化上皮增厚明显。
2.4本申请药物组合物促进未成熟小鼠子宫和阴道组织中雌激素受体ERs蛋白的表达，结果见表3。
ERα、ERβ在各组未成熟小鼠子宫内膜上皮、腺上皮细胞、子宫间质中均有表达，以腺上皮及腔上皮最为明显，但ERβ在子宫间质中表达不明显；ERα、ERβ在各组未成熟小鼠阴道表达分布无明显差异，在阴道鳞状上皮细胞、角化上皮、基质纤维细胞、平滑肌细胞中均有表达，都以鳞状上皮细胞表达最强。
与空白对照组相比，本申请药物组合物中、低剂量组显著提高子宫(***P<0.001)、阴道(***P<0.001或**P<0.01)ERα及ERβ的表达，且子宫、阴道中ERα表达均强于ERβ。阳性组较对照组子宫(***P<0.001)、阴道(***P<0.001)ERs表达上升明显。
表3.本申请药物组合物对未成熟小鼠子宫和阴道组织中雌激素受体ERs蛋白表达的影响(n＝10)
注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***P<0.001。
结果表明：本申请药物组合物能够升高未成熟小鼠的子宫和阴道组织ERα、ERβ蛋白水平的表达，其作用效果类似于雌激素受体激动剂戊酸雌二醇。
实施例3.本申请药物组合物防治围绝经期综合征(提高去卵巢大鼠骨密度、降血脂)
1.实验方法
1.1实验动物
健康2月龄SD雌性大鼠60只(200±10)g，均购自军事医学科学院，清洁级。合格证号SYXK-(军)2011-004。
1.2造模、分组及给药
取健康成熟SD雌性大鼠60只，随机分为去卵巢组(OVX)、假手术组(Sham)、阳性组(EV)、本申请药物组合物高、中、低剂量组，每组10只。
10％水合氯醛(iP)麻醉(0.3ml/100g)，去卵巢组、阳性组及本申请药物组合物组行双侧卵巢摘除术，假手术组仅切除卵巢附近脂肪。伤口充分愈合后进行阴道涂片，美兰染色观察阴道上皮细胞，连续5天处于间情期，证明去势成功。
去卵巢组、假手术组灌给等体积的蒸馏水，本申请药物组合物低、中、高剂量组分别按(1g/kg、2g/kg、4g/kg)灌胃，阳性组按0.07mg/kg灌胃给药，1次/d，连续12周。每周按照体重调整给药量，处死前禁食12h。
1.3取样
大鼠末次给药后24h称重，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血。血液4℃静置1h，3000rpm离心15min，取血清，-20℃保存，用于血液学指标检测。处死后，取右侧股骨，剔除周围软组织，4％多聚甲醛固定48h，10％的EDTA脱钙，用于骨组织形态学观察；取左侧胫骨，剔除周围软组织，置于-80℃，以备Micro-ct检测；取大鼠脊椎骨用浸过生理盐水的纱布包裹，置于-80℃保存，用于骨密度检测。
1.4血脂及骨生化指标检测
通过放射免疫分析法检测去卵巢大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、骨钙素(BGP)、骨钙(Ga)、骨磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)含量；通过酶联免疫法检测去卵巢大鼠I型胶原C端肽(CTX-I)含量。均由北京康佳宏原生物科技有限公司检测。
1.5大鼠腰椎骨密度检测
取大鼠腰椎骨组织，室温解冻后，置于Osteocore3Digital 2D(双能X线)骨密度仪扫描台上，得到扫描图像后，进行分析测量各组大鼠L4-6BMD值。
1.6骨形态计量学检测
大鼠胫骨Micro-ct分析仪器及条件：
Skyscan1172、分辨率(μm)：6.88、源电压(kV)：100、源电流(μA)：100、暴露时间(ms)：1700、旋转步长(deg)：0.400。分析生长板最低点下500μm处，ROI(兴趣区域)：500×500×500(μm)。扫描分析骨体积分数(BV/TV)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb/Th)、骨矿物质密度(BMD)及骨小梁数量(Tb.N)。
1.7组织病理学观察检测
1.7.1HE染色：
骨组织固定48小时，用10％EDTA-2Na脱钙，每隔3天换一次脱钙液，连续一个月。
骨组织用流水冲洗过夜。
脱水后包埋：80％乙醇50min—90％乙醇50min—95％乙醇60min—100％乙醇两次各60min—二甲苯两次各50min—石蜡包埋。
切5μm厚片，45℃下烤片12h，常温保存。
二甲苯两次各15min—100％乙醇两次、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇各15min—蒸馏水冲洗3min—苏木素5min—蒸馏水冲洗1min—0.5％盐酸乙醇分化4s—蒸馏水洗1min—氨水反蓝15s—蒸馏水洗1min—伊红3min—80％乙醇8s—90％乙醇1min—95％乙醇两次各5min—100％乙醇两次各5min—二甲苯两次各10min—中性树胶封片。
1.7.2TRAP染色
取4μm骨组织切片，63℃烤片25min。
脱蜡至水：二甲苯两次各15min—100％乙醇两次各2min—95％乙醇2min—90％乙醇2min—80％乙醇5min，置于自来水中。
片子放入0.1M Cacl2/Mgcl2溶液中20h，密封。
PBS 10min，蒸馏水洗2遍。
擦干玻片上的水，滴加TRAP染液：在预热的4.5ml蒸馏水中分别加入醋酸盐溶液200μl、酒石酸溶液100μl、AS-BI溶液50μl、品红-亚硝酸钠溶液各50μl(提前配置，混匀静置)，充分混匀后置于水浴锅中预热37℃。
TRAP染液覆盖整个组织，37℃孵育2h。
蒸馏水洗2遍，擦干玻片上的水，滴加苏木素1min。
用纸巾吸去多余的染液后去蒸馏水洗2遍，自来水反蓝，自然晾干。中性树胶封片，镜下观察破骨细胞并计数。
1.8统计方法
应用SPSS15.0版统计软件对数据进行分析处理，各组数据以均数±标准差来表示，以P<0.05作为统计学具有显著性差异的标准。
2.结果
2.1本申请药物组合物对去卵巢大鼠骨代谢生化指标的影响
结果表明，与sham组相比，大鼠去卵巢后血清中的钙离子，磷离子浓度显著降低(##P<0.01)；与OVX相比，本申请药物组合物的各剂量组均明显上升大鼠血中钙、磷离子浓度(***P<0.001或**P<0.01或*P<0.05)(参见表4)。
BGP、ALP可直接反映成骨细胞尤其是新形成的成骨细胞的活动和功能状态，是成骨细胞分化成熟的主要标志之一。本实验结果显示，与sham组相比，OVX组血清中碱性磷酸酶和骨钙素显著升高(###P<0.001)；与OVX组相比，本申请药物组合物组显著降低血清ALP、BGP的含量(***P<0.001或*P<0.05)，高剂量组尤为明显(表5)。
I型胶原的羧基末端肽(CTX-I)是目前公认的骨吸收的指标。结果显示，与sham组相比，大鼠去卵巢后，血中CTX-I水平明显升高(###P<0.001)；阳性组及本申请药物组合物各剂量组与OVX组相比，CTX-I含量显著降低(**P<0.01)(表5)。
表4.本申请药物组合物对去卵巢大鼠Ca、P的影响(n＝10)
注：与正常对照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***P<0.001。
表5.本申请药物组合物对去卵巢大鼠ALT、CTX-1、BGP(ng/ml)的影响(n＝10)
注：与OVX照组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与Sham组比较，##P<0.01。
2.2本申请药物组合物提高去卵巢大鼠腰椎骨密度
骨密度(BMD)下降是骨质疏松的主要病理表现，因而世界卫生组织以BMD值作为诊断骨质疏松症的“金标准”。本实验选大鼠腰椎(L4-6)进行X-双能射线实验，结果显示与sham组相比，OVX组BMD值显著上升(###P<0.001)；与OVX组相比，本申请药物组合物治疗后，显著提高大鼠腰椎BMD值(**P<0.01)。
表6.本申请药物组合物对去卵巢大鼠腰椎骨密度BMD(g/cm2)的影响(n＝10)
注：与sham组相比，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
2.3本申请药物组合物对去卵巢大鼠胫骨Micro-ct三维扫描分析
各组大鼠胫骨标本进行Micro-ct分析，在相同条件下进行重建的三维图像，结合二维图像显示，OVX较sham组相比，骨小梁明显变稀，骨缺失严重；与OVX组相比，本申请药物组合物高、中剂量组骨小梁变密集、空隙率下降、连续性增加、微观结构明显著改善。Micro-CT分析统计结果显示，与sham组相比，去卵巢后大鼠BV/TV、Tb/Th、Tb.N值均显著下降(###P<0.001)，提示大鼠去势12周后，骨疏模型成功。与OVX组比较，本申请药物组合物高、中剂量组Tb.Th、BV/TV、Tb.N均显著性提高，Tb.Sp显著降低(**P<0.01，**P<0.01或*P<0.05)。
表7.本申请药物组合物对去卵巢大鼠股骨Micro-ct扫描分析结果(n＝10)
注：与sham组相比，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
2.4本申请药物组合物对股骨病理学影响
HE染色结果显示，sham组大鼠股骨骨小梁粗细程度均匀，形态完整，排列紧密，小梁间距较小并相互连接成网状。与sham相比，大鼠去卵巢后骨股骨小梁明显变细，骨连接性变差，骨周围组织明显退化出现空隙，局部出现裂痕并且伴随着大量的脂肪空泡出现，呈明显的骨疏改变。给予本申请药物组合物治疗12周后，与OVX组相比，骨小梁数目明显变多，骨小梁面积接近sham组，给药各剂量组骨小梁呈网状整齐排列，且部分区域骨小梁间隔增大。阳性组骨小梁面积较OVX大。
2.5本申请药物组合物对股骨破骨细胞数目的影响
股骨TRAP染色后，破骨细胞数量统计结果显示，与sham组相比较，大鼠去卵巢后破骨细胞数目明显上升；与OVX组相比，本申请药物组合物治疗后，高、中剂量组破骨细胞数目显著下降。低剂量组与模型组相比无统计学差异。
表8.本申请药物组合物对去卵巢大鼠股骨破骨细胞数目的影响(n＝10)
注：与sham组相比，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01
2.6本申请药物组合物对去卵巢大鼠血脂的影响
与sham组相比，去卵巢后大鼠血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)水平明显升高(##P<0.01)；高密度脂蛋白(HDL)明显下降；
与OVX组相比，本申请药物组合物中、高剂量给药组TG、TC、LDL水平均显著下降，HDL明显升高，其中高剂量组作用最为显著(**P<0.001)，中剂量组次之(*P<0.05)。
表9.本申请药物组合物对去卵巢大鼠血脂的影响(n＝10)
注：与sham组相比，##P<0.01；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。
本申请的药物组合中含有专用于续筋接骨的骨碎补和类雌激素作用的大豆异黄酮，提高围绝经期女性的雌激素水平，防止骨钙流失，全方具有补肾温阳，壮骨柔筋，活血调经的功效。在配伍比例上，以淫羊藿、骨碎补、牡蛎为主，轻用活血的丹参，少量的大豆异黄酮，防治围绝经期女性的骨质疏松，针对性强。
本公开的药物组合对内分泌系统，骨骼系统及心血管、血液系统具有调节作用，对围绝经期女性的骨质疏松症、高血脂症有防治作用，克服了现有产品的功能主治作用单一的局限性。

Claims (10)

1.一种用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物，其包含：
40至100个重量份，优选60个重量份的淫羊藿；
40至100个重量份，优选60个重量份的牡蛎；
40至100个重量份，优选60个重量份的骨碎补；
20至60个重量份，优选40个重量份的丹参；和
0.2至2个重量份，优选1个重量份的大豆异黄酮。
2.根据权利要求1所述的用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物，其是选自以下的形式：片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂和丸剂；优选地，所述药物组合物是片剂。
3.根据权利要求1所述的用于预防和/或治疗围绝经期综合征的药物组合物，其还含有可药用载体。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物在制备预防和/或治疗围绝经期综合征的药物中的用途，
优选地，所述围绝经期综合征选自：绝经后骨质疏松症、高血脂症及其组合；
优选地，所述预防和/或治疗表现为选自以下的一项或更多项：
提高血中雌激素水平、提高雌激素受体的表达水平、促进子宫和阴道的生长发育、促进骨代谢、提高骨密度、降低破骨细胞数目、降低血脂及其组合；
优选地，所述的雌激素选自：卵泡生成激素、黄体生成激素、雌二醇及其组合；
优选地，所述的促进骨代谢选自：提高血钙浓度、提高血磷浓度、改善成骨细胞分化、改善骨吸收及其组合；
优选地，所述的改善成骨细胞分化选自：降低碱性磷酸酶的水平、降低骨钙素的水平及其组合；
优选地，所述的改善骨吸收表现为降低I型胶原羧基末端肽的水平；
优选地，所述的提高骨密度表现为改善骨微结构；
所述骨微结构选自：总骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隔及其组合；
优选地，所述的降低血脂选自：降低血清中的总胆固醇水平、降低血清中的甘油三酯水平及其组合。
5.一种药物组合物的制备方法，包括步骤：
1)提供40至100个重量份的淫羊藿、40至100个重量份的骨碎补、以及20至60个重量份的丹参，混合后获得混合物；
2)相对于所述混合物的重量，采用8至12倍重量/体积比的溶剂对所述的混合物进行浸提，得到浸提液，优选地所述溶剂为乙醇，更优选60％的乙醇；
3)去除所述浸提液中的溶剂后，并进行浓缩和干燥，得到干粉；
4)向所述干粉中加入40至100个重量份的牡蛎和0.2至2个重量份的大豆异黄酮，进行混合得到所述药物组合物；
5)任选地，对所述药物组合物进行粉碎和过筛。
6.根据权利要求5所述的方法，其中：
在步骤3)中，采用旋转蒸发去除所述浸提液中的溶剂，优选在60℃至70℃、更优选65℃去除所述浸提液中的溶剂；
在步骤3)中，通过减压干燥的方式进行所述干燥，优选在30℃至50℃、更优选40℃进行所述干燥；
在步骤5)中，对所述药物组合物进行过60至100目筛，优选80目。
7.根据权利要求5所述的方法，其中：
在步骤2)中，相对于所述混合物的重量，采用10倍重量/体积比的溶剂对所述的混合物进行浸提；
优选地，所述浸提可以重复1至3次，以及合并每次的浸提液。
8.根据权利要求5所述的方法，其中：
所述淫羊藿为60个重量份；
所述牡蛎为60个重量份；
所述骨碎补为60个重量份；
所述丹参为40个重量份；以及
所述大豆异黄酮为1个重量份。
9.一种药物组合物，其是通过权利要求5-8任一项所述方法获得的，任选地所述药物组合物还含有可药用载体。
10.权利要求9所述的药物组合物在制备预防和/或治疗围绝经期综合征的药物中的用途，
优选地，所述围绝经期综合征选自：绝经后骨质疏松症、高血脂症及其组合；
优选地，所述药物组合物是选自以下的形式：片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂和丸剂；优选地，所述药物组合物是片剂。
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