CN108853245B - 一种治疗围绝经期综合征的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中药组合物及其制备方法和应用，其中，该中药组合物是利用醇溶液通过对所述中药组合物的原料进行提取得到，其中，所述原料包括：1‑3质量份的肉苁蓉和1‑3质量份的巴戟天。该中药组合物安全有效，能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，并且对生殖系统无副作用。

Description

一种治疗围绝经期综合征的中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及制药领域，具体地，涉及中药组合物及其制备方法和应用，更具体地，涉及中药组合物、制备该中药组合物的方法，以及该中药组合物在制备药物中的用途。

背景技术

围绝经期综合征是妇科常见病，发病率高达85％-90％，主要的症状有眩晕、心悸、焦症、抑郁等，绝经后还可导致骨质疏松、贫血、生殖靶器官萎缩、膀胱炎反复发作、心脑血管疾病等。

目前西医治疗围绝经期综合征主要采用激素替代疗法，通过补充外源性的雌激素、孕激素以改善由于雌激素水平低下而引发的症状。但激素替代疗法存在较多的不良反应和潜在危险性：短期应用可致阴道不规则出血、体重增加和乳房胀痛等，长期应用增加乳腺癌、心血管疾病、中风、肺栓塞、血栓形成和增高老年痴呆的发生率，因此临床应用逐渐减少。由于对激素副作用的畏惧心理，越来越多的女性转向传统中医药疗法。

传统中医药疗法具有完整的理法方药体系、良好的临床效果和较小的副作用，一直受到关注，致力于寻找较为理想的、安全有效的、价格适度的、为广大女性病患接受的治疗围绝经综合征的中药新药。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种中药组合物，该中药组合物安全有效，能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，并且对生殖系统无副作用。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种中药组合物。根据本发明的实施例，所述中药组合物是利用醇溶液通过对所述中药组合物的原料进行提取得到，其中，所述原料包括：1-3质量份的肉苁蓉和1-3质量份的巴戟天。

肉苁蓉补肾强阴，益精血，巴戟天补肾阳，强筋骨。肉苁蓉甘咸而温，质地滋腻，性柔而不燥，补肾壮阳之中还兼有强阴润燥益精之功；巴戟天辛甘而温，性偏燥而不柔，温阳助火力胜，兼有祛风除湿之力。肉苁蓉和巴戟天相须为用，增强温肾壮阳之力，且二者润燥相宜，具有补火而无燥水之妙。发明人发现，该药物组合物通过调补肾气阴阳、润燥益精，还可以达到防治绝经前后诸症之功。并且，该中药组合物能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，尤其是焦症、抑郁、骨质疏松和生殖靶器官萎缩等症状，并且安全有效，副作用较小，适于临床应用。此外，发明人发现，利用醇溶液对原料进行提取，乙醇可以将组合物原料中的有效成分更充分地提取溶出，并改善了组合物中各组份的配比，使得到的中药组合物药效明显改善。

另外，根据本发明上述实施例的中药组合物还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述醇溶液为乙醇溶液，更优选地，所述醇溶液为70％乙醇溶液。

根据本发明的实施例，该原料进一步包括：1-3质量份的牛膝和1-2质量份的蜀椒。由此，治疗效果好。

根据本发明的实施例，该原料进一步包括：0.5-1.5质量份的青盐。由此，治疗效果好。

根据本发明的实施例，该原料包括：1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.5-2.5质量份的牛膝和1.2-1.8质量份的蜀椒和0.8-1.2质量份的青盐。由此，治疗效果更佳。

根据本发明的实施例，该原料包括：1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.8-2.2质量份的牛膝和1.3-1.6质量份的蜀椒和0.8-1.2质量份的青盐。由此，治疗效果更佳。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述中药组合物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将预定量的前述的中药组合物的原料利用醇溶液进行提取处理，以便得到提取液；以及将所述提取液进行浓缩处理，以便得到所述中药组合物。

根据本发明实施例的方法，能高效提取前述中药组合物的原料中的有效成份，有效成份损失少，并且提取方法简单、易操作。

根据本发明的实施例，所述醇溶液为乙醇溶液，优选地，所述醇溶液为70％乙醇溶液。由此，有利于充分提取中药材中的有效成份，减少有效成份的损失。

根据本发明的实施例，该提取处理包括：将预定量的所述的中药组合物的所述原料利用7-13倍质量的70％乙醇溶液进行第一提取，以便得到第一提取液和药渣，其中，所述第一提取的时间为4-6小时；以及将所述药渣利用5-11倍质量的70％乙醇溶液进行第二提取，以便得到第二提取液，其中，所述第二提取的时间为4-6小时。由此，有利于充分提取中药材中的有效成份，减少有效成份的损失。

根据本发明的又一方面，本发明提供了前述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗围绝经期综合征。该药物具有前述中药组合物的全部技术特征，由此，该药物能安全有效，能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，尤其是焦症、抑郁、骨质疏松和生殖靶器官萎缩等症状，并且副作用较小，适于临床应用。

根据本发明的实施例，所述围绝经期综合征包括围绝经期循环中雌激素水平下降、生殖靶器官子宫、阴道及乳腺的萎缩。

根据本发明的又一方面，本发明提供了前述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗骨质疏松和焦虑症。该药物不仅对卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现的焦虑和骨质疏松有效，对其它原因引起的焦虑和骨质疏松也有良好的治疗效果。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的制备中药组合物的方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的药物对动物的影响结果示意图(200×)，其中，Ⅰ为OVX组，Ⅱ为Sham组，Ⅲ为EV组，Ⅳ为QYFE组；

图3显示了根据本发明一个实施例的药物对去卵巢大鼠脏器指数的影响的结果示意图，其中，与Sham组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与OVX组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；

图4显示了根据本发明一个实施例的子宫的HE染色结果示意图，其中Ⅰ为OVX组，Ⅱ为Sham组，Ⅲ为EV组，Ⅳ为QYFE低剂量组，Ⅴ为QYFE中剂量组，Ⅵ为QYFE高剂量组；

图5显示了根据本发明一个实施例的阴道的HE染色结果示意图，其中Ⅰ为OVX组，Ⅱ为Sham组，Ⅲ为EV组，Ⅳ为QYFE低剂量组，Ⅴ为QYFE中剂量组，Ⅵ为QYFE高剂量组；

图6显示了根据本发明一个实施例的乳腺腺腔的HE染色结果示意图，其中Ⅰ为OVX组，Ⅱ为Sham组，Ⅲ为EV组，Ⅳ为QYFE低剂量组，Ⅴ为QYFE中剂量组，Ⅵ为QYFE高剂量组；

图7显示了根据本发明一个实施例的酶联免疫吸附检测结果示意图，其中，与Sham组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与OVX组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；

图8显示了根据本发明一个实施例的药物对ER亚型表达的结果示意图，其中，子宫(200×)、阴道(400×)、乳腺腺腔(400×)，其中，Ⅰ为OVX组，Ⅱ为Sham组，Ⅲ为EV组，Ⅳ为QYFE低剂量组，Ⅴ为QYFE中剂量组，Ⅵ为QYFE高剂量组；

图9显示了根据本发明一个实施例的药物对ER亚型表达的影响的结果示意图，与Sham组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与OVX组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；

图10显示了根据本发明一个实施例的药物对ER亚型蛋白水平影响的结果示意图，其中，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与OVX组相比，^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001；

图11显示了根据本发明一个实施例的旷场实验操作示意图；

图12显示了根据本发明一个实施例的旷场实验大鼠活动轨迹示意图；

图13显示了根据本发明一个实施例的旷场实验大鼠在中央场的活动时间(s)结果示意图，其中，与sham组相比，##P<0.01，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图14显示了根据本发明一个实施例的旷场实验大鼠在中央场的活动距离(mm)结果示意图，其中，与sham组相比，##P<0.01，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图15显示了根据本发明一个实施例的O型迷宫实验示意图；

图16显示了根据本发明一个实施例的O型迷宫实验大鼠活动轨迹示意图；

图17显示了根据本发明一个实施例的O型迷宫实验大鼠在开臂的活动时间(s)的结果示意图，其中，与sham组相比，##P<0.01，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图18显示了根据本发明一个实施例的去卵巢大鼠血清焦虑相关的递质检测结果示意图，其中，与sham组相比，##P<0.01，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图19显示了根据本发明一个实施例的去卵巢大鼠骨代谢生化指标结果示意图，其中，与sham组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与OVX组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；

图20显示了根据本发明一个实施例的去卵巢大鼠股骨HE染色示意图(400×)，其中，Ⅰ为sham组，Ⅱ为OVX组，Ⅲ为QYFE高剂量组，Ⅳ为QYFE中剂量组，Ⅴ为QYFE低剂量组，Ⅵ为EV组；

图21显示了根据本发明一个实施例的去卵巢大鼠股骨TRAP染色图(400×)，其中，Ⅰ为sham组，Ⅱ为OVX组，Ⅲ为QYFE高剂量组，Ⅳ为QYFE中剂量组，Ⅴ为QYFE低剂量组，Ⅵ为EV组；

图22显示了根据本发明一个实施例的去卵巢大鼠股骨TRAP染色破骨细胞结果示意图，其中，与sham组相比，###P<0.001；与OVX组相比，***P<0.001；

图23显示了根据本发明一个实施例的药物对未成熟小鼠的影响的结果示意图，其中，Ⅰ为空白Con组、Ⅱ为EV组、Ⅲ为药物水提取物组、IV为药物70％乙醇提取物组、V为药物95％乙醇提取物组、VI为药物原方打粉组；

图24显示了根据本发明一个实施例的药物对未成熟小鼠的子宫重量的影响的结果示意图，其中，与空白Con组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；

图25显示了根据本发明一个实施例的药物对细胞的生存率的影响的结果示意图，其中，与空白Con组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；

图26显示了根据本发明一个实施例的药物对转染ER/-ERE荧光素酶报告基因的HEK-293细胞的荧光素酶表达的影响结果示意图，其中，与空白Con组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

中药组合物及其制备方法

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种中药组合物。根据本发明的实施例，该中药组合物是利用醇溶液通过对所述中药组合物的原料进行提取得到，其中，原料包括1-3质量份的肉苁蓉和1-3质量份的巴戟天。

肉苁蓉补肾强阴，益精血，巴戟天补肾阳，强筋骨。肉苁蓉甘咸而温，质地滋腻，性柔而不燥，补肾壮阳之中还兼有强阴润燥益精之功；巴戟天辛甘而温，性偏燥而不柔，温阳助火力胜，兼有祛风除湿之力。肉苁蓉和巴戟天相须为用，增强温肾壮阳之力，且二者润燥相宜，具有补火而无燥水之妙。发明人发现，该药物组合物通过调补肾气阴阳、润燥益精，还可以达到防治绝经前后诸症之功。并且，该中药组合物能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，尤其是焦症、抑郁、骨质疏松和生殖靶器官萎缩等症状，并且安全有效，副作用较小，适于临床应用。此外，发明人发现，利用醇溶液对原料进行提取，得到的中药组合物药效明显改善。

发明人根据该药物组合物的成份特点，对药物提取液的选择进行了大量的实验，研究发现，采用乙醇溶液，尤其是70％乙醇溶液，可以将组合物原料中的有效成分更充分地提取溶出，并改善了组合物中各组份的配比，相对于原料直接打粉和其它提取液得到提取物，70％乙醇的提取物的药效明显改善。根据本发明的实施例，该原料进一步包括：1-2质量份的蜀椒和1-3质量份的牛膝。其中，牛膝活血脉、补肝肾，蜀椒温补脾阳，以肉苁蓉为君药，以巴戟天为臣药，佐以牛膝和蜀椒，牛膝既补且行能引君臣药入肾经，同时，蜀椒温补脾阳，使药物的治疗效果更佳。

根据本发明的实施例，该原料进一步包括：0.5-1.5质量份的青盐。以青盐为使药能引诸药入肾经，润燥潜降，同时以肉苁蓉为君药，以巴戟天为臣药，以牛膝和蜀椒为佐药，通过调补肾气阴阳、润燥益精，进一步提高本发明实施例的中药组合物防治绝经前后诸症的功效。发明人对该中药组合物的中药成份和配比进行了深入的摸索，发现青盐、蜀椒、肉苁蓉、牛膝和巴戟天共同组成的药物组合物的治疗效果更佳，并且，对各组份的配比进行了优化。中药有效组分配伍形成的复方，是不同于传统中药饮片复方的新研究模式，由于多成分组合后的药效并不是单一成分的线性叠加，往往具有非线性特点，因此需要发明人基于大量的理论基础和研发经验，对中药多组分配伍与生物效应间数据分析和关系描述进行深入的研究，才能获得疗效更好、毒性更小的药物组合物。根据本发明的一个优选实施例，该中药组合物的原料包括：1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.2-1.8质量份的蜀椒和1.5-2.5质量份的牛膝和0.8-1.2质量份的青盐。由此，治疗效果更佳。根据本发明的又一个优选实施例，该中药组合物的原料包括：1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.3-1.6质量份的蜀椒、1.8-2.2质量份的牛膝和0.8-1.2质量份的青盐。由此，治疗效果更佳。根据本发明的再一个优选实施例，该中药组合物的原料包括：1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.3-1.6质量份的蜀椒、1.8-2.2质量份的牛膝和0.8-1.2质量份的青盐。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备前述中药组合物的方法。根据本发明实施例的方法，能高效提取前述中药组合物的原料中的有效成份，有效成份损失少，并且提取方法简单、易操作。

参考图1，根据本发明的实施例，该方法包括：

S100提取处理

根据本发明的实施例，将预定量的前述的中药组合物的原料利用醇溶液进行提取处理，得到提取液。其中，“预定量”是指满足前述的中药组合物的各组分的配比要求的各中药组分的用量。

根据本发明的实施例，利用乙醇溶液进行该提取处理。该中药组合物的有效成份易溶于乙醇，利用乙醇溶液进行提取处理，有利于充分提取中药材中的有效成份，减少有效成份的损失，并且中药组合物的疗效更佳。进一步地，发明人分别用多种不同浓度的乙醇溶液对中药组合物的原料进行提取，研究发现，当利用70％乙醇溶液进行提取时，得到的中药组合物的药效更佳。

根据本发明的实施例，该提取处理包括：将预定量的所述的中药组合物的原料利用7-13倍质量的70％乙醇溶液进行第一提取，以便得到第一提取液和药渣，其中，第一提取的时间为4-6小时；然后，将药渣利用5-11倍质量的70％乙醇溶液进行第二提取，得到第二提取液，其中，第二提取的时间为4-6小时。优选地，利用9-11倍体积的70％乙醇溶液进行第一提取，7-10倍体积的70％乙醇溶液进行第二提取。由此，提取的效率高，并有利于有效成份充分溶解于提取液中，有效成份损失少。根据本发明的一些实施例，该方法的药物提取率达48.9％左右。

S200浓缩处理

根据本发明的实施例，将该提取液进行浓缩处理，得到中药组合物。具体地，可以将几次的提取液合并后，浓缩干燥至恒重，干燥保存药物。

药物的用途

根据本发明的又一方面，本发明提供了前述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗围绝经期综合征。该药物具有前述中药组合物的全部技术特征，由此，该药物能安全有效，能有效改善妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适，尤其是焦症、抑郁、骨质疏松和生殖靶器官萎缩等症状，并且副作用较小，适于临床应用。

其中，需要说明的是，本文中的“围绝经期综合征”系指妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适。在绝经过渡期，可造成患者眩晕、心悸、焦症、抑郁等，绝经后还可导致骨质疏松、贫血、生殖靶器官萎缩、膀胱炎反复发作、心脑血管疾病等。

本发明实施例的药物对围绝经期循环中雌激素水平下降、生殖靶器官子宫、阴道及乳腺的萎缩的治疗效果更佳。

根据本发明的又一方面，本发明提供了前述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗骨质疏松和焦虑症。该药物不仅对卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现的焦虑和骨质疏松有效，对其它原因引起的焦虑和骨质疏松也有良好的治疗效果。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

利用本发明实施例的方法制备中药组合物，具体如下：

1、实验材料

青盐100g、蜀椒150g、肉苁蓉200g、牛膝200g、巴戟天200g，各药材均购于北京同仁堂药店。

2、实验方法

(1)将上述药材混合后用70％乙醇回流2次，每次5h，其中，第一次提取2.5升70％乙醇提取，第二次提取采用2升70％乙醇提取。

(2)合并步骤(1)的两次提取物，浓缩干燥至恒重，经计算，药物提取率为48.9％，干燥保存药物。

实施例2

本实施例中，对实施例1得到的药物(本实施例中，也称为QYFE)进行药效研究，具体如下：

1、实验原料

(1)试剂：

ICI182,780购于上海瀚香生物科技有限公司，以DMSO助溶，再用蒸馏水稀释至0.25mg/mL；雌二醇和(30％)丙烯酰胺购于Sigma公司；戊酸雌二醇(补佳乐)购于拜耳公司；苏木染液和伊红染液购于北京中衫金桥生物技术有限公司；两步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒和0.01M PBS购于武汉博士德生物工程有限公司；PIPA裂解液、5×上样缓冲液、封闭专用脱脂奶粉和ECL发光剂购于北京普利莱基因技术有限公司；兔抗鼠ERα多克隆抗体购于北京盛世中方生物技术有限公司；兔抗鼠ERβ多克隆抗体购于北京盛世中方生物技术有限公司；辣根酶过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和蛋白Marker(14-100kDa)购于北京中杉金桥技术有限公司产品；PVDF膜购于Millipore公司；牛血清白蛋白购于Roche产品；DMEM(高糖)、无酚红DMEM、特级胎牛血清FBS和0.25％胰酶购于Gibco公司；活性炭过滤胎牛血清CDT-FBS(SH30068.03)购于Hyclone公司；噻唑蓝MTT和二甲基亚砜DMSO购于北京科海荣京生物科技有限公司；二甲苯购于北京化工厂；亚甲基蓝购于上海试剂三厂；多聚甲醛购于北京益利精细化学品有限公司。

(2)动物及细胞

SD大鼠购自军事医学科学院，人乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院上海生命科学研究院。

2、实验内容：

围绝经期综合征系指妇女绝经前后由于卵巢功能衰竭所致的雌激素水平下降而出现明显的不适。在绝经过渡期，可造成患者眩晕、心悸、焦症、抑郁等，绝经后还可导致骨质疏松、贫血、生殖靶器官萎缩、膀胱炎反复发作、心脑血管疾病等。因此，本实施例采用去卵巢大鼠模型考察实施例1的中药组合物的提取物对围绝经期生殖靶器官萎缩，焦虑，骨质疏松的药效并进一步进行机制研究。

2.1、动物造模及给药：

根据体重将大鼠随机分为6组：去卵巢OVX组、假手术Sham组、阳性药戊酸雌二醇(Estradiol Valate，EV)组(0.11mg·kg-1)、QYFE低剂量组(0.693g·kg-1)、QYFE中剂量组(1.386g·kg-1)，QYFE高剂量组(2.773g·kg-1)，每组均为10只。动物到达适应环境两天后做去势手术，按照体重每100g给0.3mL的10％水合氯醛的标准给大鼠麻醉，用剃毛机剃除腹部毛发，腹部皮肤涂上碘伏消毒，剪开卵巢所在区域的鼠皮，找到两侧形似绣球状的卵巢并摘除，Sham组不摘卵巢，仅切除卵巢附近范围大小相近体积的脂肪，用青霉素对伤口进行消炎，缝合打开的腹部皮肤。待腹部的伤口基本愈合后开始阴道涂片，除Sham组，其余各组连续五天均处于动情间期，说明本次造模成功。所有动物均给予标准化饮食并不限制其活动。动物按剂量灌胃给药，OVX组与Sham组以等量生理盐水对照处理，共给药12周。

2.2药效检测

2.2.1药物抗生殖靶器官萎缩作用

2.2.1.1药物对去卵巢大鼠动情周期的影响

为避免客观因素，固定涂片的时间。生理盐水从4℃拿出后恢复室温，用较小的胶头滴管吸取少量插进动物阴道内(生理盐水过多会稀释细胞密度)，轻轻抽吸2～3下，弃去白色的分泌物，取稍有浑浊的阴道分泌物于载玻片上，用胶头滴管轻轻推散均匀，一组制作于一张载玻片上，放置一旁晾干。

玻片在95％乙醇溶液中固定8～10min，转移到美蓝染液中染色10～15min(镜下观察染色情况随时调整染色时间)，清水冲洗掉玻片周围的染液，用纸擦干细胞周围的水，镜下观察，判断并记录各组动情周期。动情周期的判断标准见表1。

表1阴道涂片动情周期评判标准表

从图2的阴道涂片结果可以看出，OVX组的阴道分泌物中小点状的蓝色细胞居多，兼有少量的蓝色有核细胞，判断其处于动情间期；Sham组和EV组的分泌物中基本全为形状不规则的角化块状细胞，判断其处于动情期；QYFE低、中、高剂量组的分泌物与EV组大致相同，均为角化无规则的块状细胞，也处于动情期。实验结果表明实施例1的药物可使去卵巢大鼠恢复动情期。

2.2.1.2药物对去卵巢大鼠脏器指数的影响

取材24h大鼠禁食不禁水，

称重，按照体重每100g给0.3mL的10％水合氯醛的标准给大鼠麻醉，剖腹用一次性采血针取腹主动脉的血液，收集于普通抗凝管内，让血滴进抗凝管，避免挂壁，室温静置半个小时，于4℃低温3000rpm离心15min，血清放到-80℃供后期检测。剃毛机剃除大鼠腹部毛发，摘取腹部两侧的乳腺，在腹部以下的位置找到Y字型的子宫及与其相连的阴道，于结节处断开子宫和阴道，找到并摘取肾上方的肾上腺，子宫和肾上腺称重记录。子宫和阴道各取一半放到10％甲醛溶液中用作后期HE观察组织形态。

结果如图3所示，OVX组对照Sham组的子宫严重萎缩(P<0.001)；在给与阳性对照药EV与实施例1的药物治疗后，子宫萎缩现象得到明显改善，并且还能促进肾上腺的增重。结果中高剂量组2.773g·kg-1作用均最显著，与阳性对照药EV组作用趋势一致。

2.2.1.3药物对去卵巢大鼠子宫、阴道、乳腺组织病理形态学的影响

随机从各组大鼠中选取一只大鼠处死，并手术摘取大鼠子宫、阴道、乳腺组织进行病理学研究。

A、组织固定：

将各组织固定48h后，置于包埋盒中，标号，将所有包埋盒用纱布包起来，用皮绳扎好，置于1L烧杯中，流水冲洗40min。

B、脱水和包埋：

(1)脱水：酒精逐级脱水，80％酒精30min→90％酒精30min→95％酒精Ⅰ20min→95％酒精Ⅱ20min→100％酒精Ⅰ15min→100％酒精Ⅱ15min；

(2)透明：二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ15min；

(3)包埋前5小时打开电热恒温鼓风干燥箱，调节温度至67度，将石蜡置于其中使之融化；同时打开包埋机，调温度至67度使蜡池中的蜡块融化；

(4)包埋：石蜡Ⅰ30min、石蜡Ⅱ15min、石蜡Ⅲ10min；

(5)取玻璃板和蜡板，滴蜡Ⅲ-放组织-覆盖标签纸-置于通风处冷却。

C、切片：

将蜡块放在冷冻机上冷冻30分钟，取出，按“修、切、展、贴、烤”步骤制作石蜡切片，厚度为4μm。

D、HE染色观察：

(1)脱蜡：二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ20min；

(2)水化：100％酒精Ⅰ、100％酒精Ⅱ、95％酒精、90％酒精、80％酒精各10min；

(3)自来水涮一下(2min)，不要太剧烈，以免脱片；

(4)苏木素10min、自来水洗1min×3遍；

(5)分化：盐酸乙醇5s、自来水洗1min×3遍；

(6)返蓝：氨水15s、自来水洗1min×3遍；

(7)伊红20min；

(8)酒精脱水：80％酒精2min、90％酒精2min、95％酒精3min、100％酒精Ⅰ5min、100％酒精Ⅱ5min；

(9)透明：二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min；

(10)封片：中性树胶封片。

图4的HE染色结果显示，Sham组的子宫体积与宫腔大，内膜细胞层多而较厚，基质细胞分化，腺体多且丰富；OVX组对照Sham组子宫萎缩严重，不仅体积和宫腔变窄变小，腺体也萎缩变少，而且内膜基质只较小的单层细胞排列，固有层紧密；与OVX组比，阳性药EV组与QYFE组的子宫萎缩得到较好改善，体积变大，宫腔变宽，子宫内膜增厚，腺体增多，内膜基质细胞增厚且呈柱状。表明QYFE能够像EV一样恢复去卵巢大鼠子宫的生长发育。

图5的HE染色结果显示，Sham组阴道壁细胞层多而厚，上皮细胞呈梭形，并有一层较厚的粉红色角化层；相比之下，OVX组阴道细胞层小而薄，几乎无角化；与OVX组比，阳性药EV组与QYFE组阴道上皮增厚，且出现了一定程度的角化。表明QYFE和阳性药EV能够恢复去卵巢大鼠阴道的生长发育，抑制其萎缩。

图6的HE染色结果显示，Sham组乳腺腺腔大，且壁厚，周围可见分泌物；与Sham组比较，OVX的乳腺几乎不发育，萎缩严重；与OVX组比，阳性药EV组及QYFE组乳腺腺腔变大，且外伸出导管腔，并有分泌物，且随QYFE剂量增加乳腺恢复越明显。表明QYFE和阳性药EV作用相似，都能够抑制去卵巢大鼠的乳腺萎缩。

2.2.1.4酶联免疫吸附(ELISA)法

采用酶联免疫吸附ELISA法检测未成熟小鼠血清中E₂、LH、FSH的含量水平，所有检测步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

(1)从ELISA试剂盒中取出实验所需板条，室温放置20min；

(2)前两排设置成标准品孔和空白孔，剩余孔为样品孔，按照说明书加入50μL的不同浓度的标准品，空白孔中加入浓度为0的标准品；

(3)样本孔中先加待测血清样本10μL于孔底，注意不能挂壁，再加稀释液40μL稀释样本；

(4)向每孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体100μL，空白孔中什么也不加，所有孔均用封板膜封住，于37℃水浴锅中孵育60min；

(5)甩去孔内所有液体，于纸上拍干，所有孔加满洗涤液洗涤，1min后甩去洗涤液，再于纸上拍干，反复洗涤5次；

(6)按照底物A：底物B为1：1的比例向所有孔中各加50μL，37℃水浴锅中避光孵育15min；

(7)所有孔加入终止液50μL终止反应，尽快在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果如图7所示，与Sham组比较，OVX组在降低了血清中的E₂水平的同时升高了LH和FSH的水平升高；与OVX组比较，QYFE中、高剂量组(1.386、2.773g·kg^-1)血清中E₂含量则升高(P＜0.05)，高剂量组(2.773g·kg^-1)血清中LH含量明显降低(P<0.01)，低、中、高剂量组(0.693、1.386、2.773g·kg^-1)血清中FSH含量明显降低(P<0.05，P<0.01)，此变化与阳性对照药E₂组趋势一致。提示，QYFE改变了去卵巢大鼠血清中性激素水平，从而调节去卵巢大鼠的雌激素样作用，结果与图4-6所示结果相符。

2.2.1.5免疫组织化学检测

用微波修复法检测去卵巢大鼠子宫、阴道、乳腺组织中雌激素受体ERα和ERβ蛋白表达的分布情况。

(1)烤片：将玻片放在玻片架上置于烘箱(温度62℃)中烘烤30分钟。

(2)脱蜡：将玻片依次放入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，二甲苯Ⅲ各10分钟。

(3)水化：将玻片分别放入100％酒精5分钟，95％酒精5分钟，90％酒精5分钟，80％酒精5分钟，70％酒精5分钟，最后自来水冲洗10分钟。

(4)修复：将玻片用0.01M的PBS浸泡5分钟，胰蛋白酶37℃修复15分钟，再用PBS洗涤5分钟×4次。

(5)灭活：将玻片放置在0.01M PBS浸泡5分钟×4次，然后将玻片放在湿盒内，用吸水纸擦去玻片上过多的水分，加入3％H2O2的水溶液中10分钟(按照100mL 30％的H2O2加900mL的去离子水配制)。

(6)洗涤：将玻片放置在0.01M PBS浸泡5分钟×4次。

(7)封闭：加上100μL的血清室温孵育35分钟。

(8)一抗孵育：擦去过多的血清，勿洗，加入一抗4℃孵育过夜。

(9)复温：室温复温45分钟，然后用0.01M PBS浸泡5分钟×4次。

(10)二抗孵育：滴加HRP标记的二抗，37℃孵育30分钟。

(11)洗涤：PBS(0.01M)清洗5分钟×4次。

(12)显色：DAB显色2～10分钟，直至镜检中棕黄色至理想的结果，用去离子水终止显色实验。

(13)洗涤：将终止显色的玻片用自来水冲洗10分钟。

(14)复染：苏木素染色2分钟，用自来水冲洗10分钟。

(15)分化：复染过的玻片，然后用1％的盐酸酒精分化数秒，除去与组织非特异性结合的苏木素染液(苏木素染细胞核)，再用自来水冲洗10分钟。

(16)脱水透明：将已冲洗的玻片按照70％酒精，80％酒精，90％酒精，95％酒精，100％酒精，二甲苯，二甲苯，二甲苯各5分钟进行实验。

(17)封片：用中性树胶封片，然后置于晾片板上在通风橱内凝固。

从图8和9的免疫组化结果可以看出，与Sham组比较，OVX组子宫内膜上皮与间质、阴道壁细胞层、乳腺上皮中ERα和ERβ受体表达量极低，当给予QYFE药物后，作用效果与阳性药EV相似，均能显著提高这些靶器官中的ERα和ERβ表达含量。

2.2.1.6Western-blot蛋白检测

检测QYFE对去卵巢大鼠子宫、阴道、乳腺组织中雌激素受体ER和ER蛋白表达的情况。

A、组织提蛋白制备WB实验样品：

(1)将组织由-80℃转移至冰上，称取组织重量，在研钵中加液氮把组织碾碎至粉末状，用预冷的PBS洗涤2次，离心之后弃去PBS；

(2)根据组织重量按1:5～1:10加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白酶裂解液，置于冰上静置裂解60min，每10min涡旋30s；

(3)4℃离心15min，离心力12000r·min^-1，所得上清即是总蛋白，将其转移至新的EP管，-20℃保存。

B、Bradford法测定蛋白浓度

(1)蒸馏水5倍稀释并过滤5×考马斯亮蓝，避光操作，使用前升至室温；

(2)标准曲线的制备：取10μL 4000μg·mL^-1BSA溶入70μL蒸馏水，混匀，取40μL连续一倍稀释7次得到BSA 500μg·mL^-1﹑250μg·mL^-1﹑125μg·mL^-1﹑62.5μg·mL^-1﹑31.25μg·mL^-1﹑15.625μg·mL^-1﹑7.813μg·mL^-1﹑3.906μg·mL^-1共8个梯度浓度，取每一浓度组10μL蛋白及190μL 1×考马斯亮蓝染料加入96孔板，每组设3个平行孔，并设空白对照组，室温震荡5到10分钟，595nm波长处测OD值，绘制蛋白标准曲线，相关系数R≥0.999；

(3)样品总蛋白浓度的测定：取蛋白，加入蒸馏水稀释40倍，每组蛋白样品取10μL及190μL 1×考马斯亮蓝染料加入96孔板，每组设置3个平行孔，室温条件下震荡5到10分钟，595nm波长处测吸光度值，计算样品总蛋白浓度；

(4)样品制备：以上样体积10～50μL，上样量50～150μg为计，根据测到的总蛋白浓度，统一调整蛋白浓度至2μg·mL^-1，各组加入一定量的5×SDS-PAGE Loading buffer和蒸馏水，混匀，95℃煮5min变性蛋白，冰上冷却后分装，放-80℃保存。

C、Western-blot

制备SDS-PAGE凝胶：配制10％分离胶和5％浓缩胶。

上样：取各组蛋白至冰上，将凝胶电泳玻璃板置于电泳槽中，加入配制好的1×电泳液(现配现用)；小心拔出梳子，用枪头吹打孔道，去掉残余的胶；按“1×SDS-PAGELoading buffer、Maker、各蛋白样品组”顺序，剩余孔道用1×SDS-PAGE Loading buffer补齐，除Maker为5μL外，其他各孔分别加入20～50μL，保证上样量一致。

电泳：盖上槽盖，接通电源，恒压80V约30min，此时溴酚蓝开始进入分离胶，调整电压至120V，继续电泳约90min，当溴酚蓝到达分离胶底部时，关闭电源。

转膜：根据上样数目及目标蛋白位置裁剪合适长、宽的PVDF膜，置于甲醇中活化2～3min，蒸馏水中清洗5min后转移至1×转膜液中；从电泳槽中取出胶板，轻轻撬开薄玻璃板，参照Maker切到所需部分凝胶，静置于1×转膜液中(转膜液4℃预冷30分钟以上)；同时裁取4张滤纸，并取塑料夹及海绵一同浸泡在盛有1×转膜液的托盘中；按“负极(黑板)-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-正极(白板)”顺序安置，凝胶与PVDF膜之间注意排除气泡，然后将其装在盛有1×转膜液的转膜装置中，于冰水混合物中转膜2h，恒流300mA。

封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，以贴近凝胶的一面为正面作标准，减去PVDF膜的一角标记正反面；将PVDF膜正面朝上置于含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，室温摇床封闭2h。

孵育一抗：使用一抗稀释液按比例稀释一抗，从封闭液中取出PVDF膜，用滤纸吸去残留封闭液，将PVDF膜置于杂交袋中，加相应抗体覆盖膜正面，排除气泡，用封膜机封口，4℃冰箱孵育过夜，第二天置于摇床上轻摇室温复温1h，TBST洗涤15min 3次。

孵育二抗：将PVDF膜转移至孵育盒中，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔(1×TBST配成5％脱脂奶粉作为二抗稀释液)，室温摇床孵育2h，TBST洗涤15min 3次。

显影：提前30min打开凝胶成像仪，预冷；将超敏发光液A和B按1:1配制，操作避光；取出PVDF膜置于一次性手套上，加显影液覆盖住PVDF膜正面，盖上锡箔纸，反应1min后，用滤纸吸去显影液，将膜放入凝胶成像仪中显影；用自动曝光、手动曝光或者系统曝光显影，并保存图像，分析蛋白条带灰度值，重复三次，计算目标蛋白与GAPDH的比值进行统计分析。

本项采用Western-blot的方法，考察QYFE对去卵巢大鼠生殖靶器官-子宫、阴道、乳腺中雌激素受体的蛋白表达情况。结果如图10所示，与Sham组比，OVX组ER、ER在子宫、阴道及乳腺中蛋白表达明显下降(^***P<0.001)；与OVX组比，QYFE各剂量组在子宫、阴道和乳腺中的ERs表达明显上升，且呈剂量相关性。实验结果表明QYFE可上调去卵巢大鼠靶器官-子宫、阴道、乳腺与雌激素受体的蛋白表达水平。

2.2.2药物组合提取物抗焦虑作用

2.2.2.1旷场实验

旷场实验可反应动物的位置偏好和探索能力，是检测焦虑样行为的经典实验。具体过程如下：本实验应在室温为25℃左右、光线较暗且安静环境下进行。如图所示，将旷场盒子(72cm length*72cm width*36cm height)放置在地面中央。在每个实验中，大鼠都放置在旷场的相同位置，轻拿轻放，探索时间为300s。录制好视频后，采用Top Scan软件分析其在中心场的持续时间(s)、活动路线路程(mm)。每只动物测试完成后都应用75％酒精擦拭干净旷场盒子，待干燥后再进行下一只动物的实验。所有动物在测试后都放回饲养的笼子并供给水食。检测指标为大鼠在旷场中心场的活动距离(mm)及其持续时间(s)。

旷场实验是用于评价动物自发活动以及焦虑状态的经典行为学实验，该实验简单、有效，是一项重要的行为学实验，结果如图12-14所示，与sham组相比，去卵巢组明显降低了大鼠在中央场的活动时间和活动距离，差异有统计学意义(###P<0.001或#P<0.05)。QYFE治疗后，QYFE各个剂量组与模型组差异显著，大鼠在中央场的活动时间和活动距离均明显提高(***P<0.001，**P<0.01或*P<0.05)。说明实施例1的药物可改善去卵巢大鼠的焦虑状态。

2.2.2.2O型迷宫实验

O型迷宫实验也是检测动物焦虑样行为的经典实验，该实验中动物进入开放臂的次数和时间是否减少可反映出动物是否表现出焦虑样行为，其实验过程如下：

本实验应在室温为25℃左右、光线较暗且安静环境下进行。按设置好的实验编号顺序依次将大鼠放入O迷宫某一开放臂，详见图15，点击软件开始按钮，Top Scan系统自动记录并保存300s内小鼠的活动情况。300s后检测软件自动停止记录，此时应及时将大鼠从O迷宫取下。每只大鼠测试完毕后应用75％酒精擦拭干净O迷宫装置，待酒精挥干后按实验分组和标号顺序抓取下一只实验动物并开始实验。当各组实验结束后，挑选常用的相关实验指标如进入开放臂的时间，导出实验数据至Excel并保存至相应文件夹下并分析各组小鼠不同指标之间的差异。

O型迷宫通常用来评价焦虑及恐惧情绪，结果如图16和17所示，与sham组相比，模型组小鼠在开臂区域的活动时间显著缩短，差异有统计学意义(##P＜0.01)；给药后，QYFE低、中、高剂量组在开臂区域的持续时间均高于模型组，且各剂量组与模型组相比，差异有统计学意义(**P<0.01，***P<0.001)。实验结果说明QYFE可改善去卵巢大鼠的焦虑状态。

2.2.2.3焦虑相关的血清学递质检测

通过酶联免疫吸附测定试剂盒检测去卵巢大鼠谷氨酸(GLU)、血清素/5-羟色胺(ST/5-HT)、γ氨基丁酸(GABA)、去甲肾上腺素(NA/NE)含量，结果如图18所示。

兴奋性传递增强或抑制性传递减弱导致的兴奋性/抑制性平衡的紊乱是引起焦虑症的内在原因之一。

谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质。与sham组相比，OVX组谷氨酸含量显著增高(P＜0.01)。与OVX组相比，EV组、QYFE低、高剂量给药组显著降低了谷氨酸的含量(P＜0.05或P＜0.01)。

5-羟色胺(5-HT)作为一种重要的单胺类神经递质，在体内诸多系统发挥着重要作用，在大脑区域中的5-HT神经递质被认为是诱发抑郁焦虑的重要物质。研究显示雌激素可通过调节5-HT表达而介导大鼠情绪变化。本研究结果显示，与sham组相比，OVX组5-HT含量显著升高(P＜0.001)，与OVX相比，EV、QYFE高中低剂量组均显著降低了5-HT含量(P＜0.05，或P＜0.001)。

在中枢神经系统，抑制性GABA能系统对抗兴奋性谷氨酸能神经系统，控制着跨突触递质传递和神经元的兴奋性，对维持神经元的兴奋和抑制状态平衡至关重要。本实验研究结果显示，与OVX组相比，QYFE中剂量组显著增加了GABA的含量(P＜0.05)。而其它剂量组与OVX组相比则无显著性差异。

现代医学认为焦虑症的发病机理与5-HT和NE等神经递质含量的增多有关。与sham组相比，OVX组去甲肾上腺素(NA)明显升高(P＜0.001)；与OVX组相比，EV、QYFE中、高剂量组显著降低了NA含量(P＜0.05，或P＜0.01)。

2.2.3、药物组合提取物抗骨丢失作用

2.2.3.1骨生化指标检测

通过酶联免疫吸附测定试剂盒检测去卵巢大鼠血清骨磷(P)、骨钙(Ga)、骨钙素(OC/BGP)、大鼠骨碱性磷酸酶(BALP)、I型胶原交联羧基端肽(CTXI)、I型前胶原氨基端原肽(PINP)含量，结果如图19所示。

骨代谢中，钙、磷离子是人体最主要的元素之一，参与多种细胞代谢，是骨矿化的基本物质。本实验结果表明，与sham组相比，大鼠去卵巢后血清中的钙离子，磷离子浓度显著降低(##P<0.01或#P<0.05)；与OVX相比，QYFE方各剂量组均明显上升大鼠血中钙、磷离子浓度(**P<0.01或*P<0.05)。

OC/BGP、BALP可直接反映成骨细胞尤其是新形成的成骨细胞的活动和功能状态，是成骨细胞分化成熟的主要标志之一。本实验结果显示，与sham组相比，OVX组血清中骨碱性磷酸酶和骨钙素显著升高(###P<0.001或##P<0.01)；与OVX组相比，QYFE方治疗组显著降低血清ALP、BGP的含量(**P<0.01或*P<0.05)，高剂量组尤为明显。

Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)是人体内含量最丰富的胶原类型，也是骨矿化环节中唯一的胶原类型，其血清中的含量指示成骨的活跃程度。结果显示，本次大鼠去卵巢后该指标变化不明显，且给药组也无显著性差异。

Ⅰ型胶原羧基末端肽(CTX-Ⅰ)是目前公认的骨吸收的指标，为总的Ⅰ型胶原C端交联物。结果显示，与sham组相比，大鼠去卵巢后，血中CTX-Ⅰ水平明显升高(###P<0.001)；阳性药及QYFE方各给药组与OVX组相比，CTX-Ⅰ含量显著降低(***P<0.001或**P<0.01或*P<0.05)。

2.2.3.2组织病理学观察检测

A、HE染色

(1)骨组织固定48小时，用10％EDTA-2Na脱钙，每隔3天换一次脱钙液，连续一个月。

(2)骨组织用流水冲洗过夜。

(3)脱水后包埋：80％乙醇50min—90％乙醇50min—95％乙醇60min—100％乙醇两次各60min—二甲苯两次各50min—石蜡包埋。

(4)切5μm厚片，45℃下烤片12h，常温保存。

(5)二甲苯两次各15min—100％乙醇两次、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇各15min—蒸馏水冲洗3min—苏木素5min—蒸馏水冲洗1min—0.5％盐酸乙醇分化4s—蒸馏水洗1min—氨水反蓝15s—蒸馏水洗1min—伊红3min—80％乙醇8s—90％乙醇1min—95％乙醇两次各5min—100％乙醇两次各5min—二甲苯两次各10min—中性树胶封片。

HE染色结果如图20所示，sham组大鼠股骨骨小梁粗细程度均匀，形态完整，排列紧密，小梁间距较小并相互连接成网状。与sham相比，大鼠去卵巢后骨股骨小梁明显变细，骨连接性变差，骨周围组织明显退化出现空隙，局部出现裂痕并且伴随着大量的脂肪空泡出现，呈明显的骨疏改变。给予QYFE方治疗12周后，与OVX组相比，骨小梁数目明显变多，骨小梁面积接近sham组，给药各剂量组骨小梁呈网状整齐排列，且部分区域骨小梁间隔增大。阳性药组骨小梁面积较OVX大。

B、破骨细胞TRAP染色

(1)取4μm骨组织切片，63℃烤片25min。

(2)脱蜡至水：二甲苯两次各15min—100％乙醇两次各2min—95％乙醇2min—90％乙醇2min—80％乙醇5min，置于自来水中。

(3)片子放入0.1M Cacl₂/Mgcl₂溶液中20h，密封。

(4)PBS 10min，蒸馏水洗2遍。

(5)擦干玻片上的水，滴加TRAP染液：在预热的4.5ml蒸馏水中分别加入醋酸盐溶液200μl、酒石酸溶液100μl、AS-BI溶液50μl、品红-亚硝酸钠溶液各50μl(提前配置，混匀静置)，充分混匀后置于水浴锅中预热37℃。

(6)TRAP染液覆盖整个组织，37℃孵育2h。

(7)蒸馏水洗2遍，擦干玻片上的水，滴加苏木素1min。

(8)用纸巾吸去多余的染液后去蒸馏水洗2遍，自来水反蓝，自然晾干中性树胶封片，镜下观察破骨细胞并计数。

股骨TRAP染色结果如图21和22所示，破骨细胞数量统计结果显示，与sham组相比较，大鼠去卵巢后破骨细胞数目明显上升；QYFE方治疗后，高、中、低剂量组破骨细胞数目显著下降。

3、结论

综上，本发明实施例的中药组合物具有雌激素样作用，其雌激素样作用是通过升高血中的雌激素水平及增加靶器官的雌激素受体的表达数目来共同实现的，并对绝经后骨质疏松及围绝经期焦虑具有治疗作用。因此，本发明实施例的中药组合物可作为由于卵巢功能低下而导致的围绝经期综合征的。

实施例3

本实施例中，分别用不同溶液提取药物组合物的原料，并比较提取物的药效，具体如下：

1、药物制备

药物的水提取物的制备方法：称取青盐30g、蜀椒45g、肉苁蓉60g、牛膝60g和巴戟天60g，水回流2次，每次5h，第一次10倍量水提取，第二次8倍量水提取，合并两次提取物浓缩干燥，药物干燥保存。分别配制成浓度为0.149、0.298、0.596g·mL^-1的药液，此次小鼠给药剂量为1.491、2.981、5.962g·kg^-1。

药物的70％乙醇提取物的制备方法：称取青盐30g、蜀椒45g、肉苁蓉60g、牛膝60g和巴戟天60g，70％乙醇回流2次，每次5h，第一次10倍量乙醇提取，第二次8倍量乙醇提取，合并两次提取物浓缩干燥，药物干燥保存。分别配制成浓度为0.101、0.201、0.402g·mL^-1的药液，此次小鼠给药剂量为1.005、2.011、4.021g·kg^-1。

药物的95％乙醇提取物的制备方法：称取青盐30g、蜀椒45g、肉苁蓉60g、牛膝60g和巴戟天60g，95％乙醇回流2次，每次5h，第一次10倍量乙醇提取，第二次8倍量乙醇提取，合并两次提取物浓缩干燥，药物干燥保存。分别配制成浓度为0.028、0.055g·mL^-1的药液，此次小鼠给药剂量为0.276、0.552g·kg^-1。

原方打粉组：称取青盐30g、蜀椒45g、肉苁蓉60g、牛膝60g和巴戟天60g，用打粉机研磨成细粉，过200目筛子即得，药物干燥保存，分别配制成浓度为0.181、0.361g·mL^-1的药液，此次小鼠给药剂量为1.807、3.613g·kg^-1。。

戊酸雌二醇EV溶液制备：先用二甲基亚砜(DMSO)助溶，再用蒸馏水稀释至0.0154g·L^-1。动物的给药剂量为0.154mg·kg^-1，置4℃备用。

美蓝染色液制备：准确称取亚甲基蓝粉末0.6g，氢氧化钾0.01g，加30mL 95％乙醇溶解充分，加100mL纯水稀释溶解，即得。

2.体内实验

2.1动物分组及给药

根据体重将小鼠随机分为12组：空白Con组、阳性药EV组(0.154mg·kg^-1)、药物水提取物低剂量组(1.491g·kg^-1)、药物水提取物中剂量组(2.981g·kg^-1)、药物水提取物高剂量组(5.962g·kg^-1)、药物70％乙醇提取物低剂量组(1.005g·kg^-1)、药物70％乙醇提取物中剂量组(2.011g·kg^-1)、药物70％乙醇提取物高剂量组(4.021g·kg^-1)、药物95％乙醇提取物低剂量组(0.276g·kg^-1)、药物95％乙醇提取物高剂量组(0.552g·kg^-1)、药物原方打粉低剂量组(1.807g·kg^-1)、药物原方打粉高剂量组(3.613g·kg^-1)，每组均为10只。所有动物均给予标准化饮食并不限制其活动。小鼠适应环境两天后开始灌胃给药，Con组以等量生理盐水对照处理，共给药7天。

2.2动情周期判断

在动物阴道口基本全都打开后开始制作阴道涂片(一般给药四天后即可以开始)。为避免客观因素，固定涂片的时间。生理盐水从4℃拿出后恢复室温，用较小的胶头滴管吸取少量插进动物阴道内(生理盐水过多会稀释细胞密度)，轻轻抽吸2～3下，弃去白色的分泌物，取稍有浑浊的阴道分泌物于载玻片上，用胶头滴管轻轻推散均匀，一组制作于一张载玻片上，放置一旁晾干。

玻片在95％乙醇溶液中固定8～10min，转移到美蓝染液中染色10～15min(镜下观察染色情况随时调整染色时间)，清水冲洗掉玻片周围的染液，用纸擦干细胞周围的水，镜下观察，判断并记录各组动情周期。动情周期的判断标准见表1。

2.3取材

取材前一天晚上给小鼠禁食不禁水，称重，将小鼠拽尾脱颈椎处死，剪开腹部以下的鼠皮找到Y字型的子宫，称重记录。

3、体外细胞实验

3.1药物制备

按照步骤“1、药物制备”分别制备药物的水提物、70％乙醇提物和95％乙醇提物。经浓缩，得水提物156g、70％乙醇提物124g、95％乙醇提物32g。4℃保存。

药物配置：药物水提物、70％乙醇提取物、95％乙醇提取物用DMSO配置成浓度为1g·mL^-1的母液，然后用无酚红DMEM稀释成浓度为0.0001～0.1mg·mL^-1的药液，细胞给药的DMSO含量不能超过千分之一；阳性对照药E₂与阴性对照药ICI 182,780均用DMSO助溶，最后用无酚红DMEM分别稀释成10^-8M和10^-7M。

MTT：将5mg MTT溶于1mL 0.01M PH 7.4的PBS液中，用0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，4℃避光保存，如变成灰绿色则不能用。

3.2细胞培养

(1)当培养皿内的细胞量为80％左右时，吸走原培养基，用PBS缓冲液润洗两次洗去死细胞，加1mL 0.25％胰酶消化，消化完全后吸走胰酶，加2～3mL DMEM培养基轻轻吹打细胞，将细胞吹散吹均匀；

(2)取新的培养皿，加入6～7mL DMEM培养基，将细胞按照1:2的比例接种，用十字晃动法使细胞在培养皿中分布均匀，放到培养箱中培养；

(3)每两天更换一次培养基，在细胞量再次达到80％左右时重复该流程操作或者直接冻存。

3.3E-Screen筛选实验

3.3.1无酚红饥饿培养：按上述3.2的方法常规培养，细胞长至60％左右时倒掉原培养基，用PBS缓冲液润洗两次，换成无酚红DMEM(含CDT-FBS)培养，置于培养箱中2天。

3.3.2铺96孔板：

(1)倒掉培养基，用PBS缓冲液润洗两次，加1mL 0.25％胰酶消化，消化充分后倒掉胰酶，加入2～3mL无酚红DMEM培养基轻轻吹打细胞层，尽量吹落，吹散成细胞混悬液；

(2)取事先消毒过的细胞计数板，盖好盖玻片，用移液枪各取10μL稀释4倍后的细胞混悬液沿玻片的上方缓慢添加于计数板两边的计数方格内，计数方格内不能出现气泡，压线的依照“数左不数右，数上不数下”的原则，用细胞计数器计数，数出两边四个大格内细胞的总数；

(3)计算出细胞的密度，按照每孔5000个细胞的密度，180μL体积，计算出铺96孔板所需的细胞量和培养基的量；

(4)用排枪混匀细胞悬液加到96孔板内，排枪的角度、力度尽量保持一致；

(5)镜下观察铺板情况，放入培养箱中培养1天。

3.3.3加药：预先设计96孔板的给药顺序，每孔加入药物20μL(此时孔内为180μL培养基和20μL药物)，加药时移液枪的角度和力度尽量保持一致，放入培养箱中培养2天。

3.3.4加MTT：用排枪每孔加入20μL的MTT溶液，轻轻放入培养箱中培养4h。

3.3.5检测：用排枪移走孔内所有液体，注意将孔板倾斜30°用枪尖缓慢吸，移液枪的角度和力度尽量保持一致，一次吸尽，避免反复吸。每孔加入150μL DMSO溶液，在10min内用酶标仪于490nm波长下测各孔的吸光度值。

3.4转染ER/细胞的luciferase assays

3.4.1铺96孔板：

(1)取常规培养长至80％以上的细胞，倒掉培养基，用PBS缓冲液润洗两次，加1mL0.05％胰酶消化，消化充分后倒掉胰酶，加入2～3mL无酚红DMEM培养基轻轻吹打细胞层，尽量吹落，吹散成细胞混悬液；

(2)用细胞计数器计数，按照每孔80000个细胞的密度，180μL的体积，计算出铺96孔板所需的细胞量和培养基的量；

(3)用排枪混匀细胞悬液加到96孔板内，排枪的角度、力度尽量保持一致；

(4)镜下观察铺板情况，放入培养箱中培养1天。

3.4.2加药：预先设计96孔板的给药顺序，单独药物的给药组每孔加入药物20μL，加药时移液枪的角度和力度尽量保持一致，放入培养箱中培养1天。

3.4.3检测：用排枪移走孔内所有液体，注意将孔板倾斜30°用枪尖缓慢吸，移液枪的角度和力度尽量保持一致，一次吸尽，避免反复吸。每孔加入50μL lysis buffer，室温放置半个小时或缓慢振摇15min，目的是使样品与lysis buffer反应完全，取20μL转移到白色微孔板内，然后向每孔加入50μL Luciferase assay试剂，因为荧光容易淬灭，所以一次只能检测6个孔，立即测定Luciferase活性，实验重复三次。

4、统计方法

采用SPSS21.0软件对数据进行统计分析，各组数据以均数±标准差

表示，采用单因素方差分析对数据进行分析处理，以P<0.05表示具有统计学显著性差异的标准。应用Microsoft office软件分析实验数据，Adobe Photoshop软件整理结果图片。

5、结果

5.1药物不同提取物对未成熟小鼠动情周期的影响

从图23的阴道涂片结果可以看出，空白Con组的阴道分泌物中小点状的蓝色细胞居多，兼有少量的蓝色有核细胞，对照动情周期的评判标准表判断其处于动情间期；EV组的分泌物中几乎全为角化的多边形块状细胞，断定其处于动情期；药物水提取物与70％乙醇提取物低、中、高剂量组的分泌物与EV组大致相同，均为角化无规则的块状细胞，对照判断处于动情期。而药物95％乙醇提取物组和原方打粉组阴道涂片结果未改变其动情周期。提示药物水提取物与70％乙醇提取物可使未成熟小鼠提前进入动情期，具有雌激素样作用。

5.2药物不同提取物对未成熟小鼠子宫增重作用的影响

图24的子宫指数图中，与Con组相比，给予了EV后，未成熟小鼠子宫系数显著增加(P<0.001)；药物水提取物低、中剂量组(1.491、2.981g·kg^-1)，药物70％乙醇提取物低、中、高剂量组(1.005、2.011、4.021g·kg^-1)子宫系数增大，能够明显促进子宫增重(^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)，作用与阳性对照药EV相似。而药物95％乙醇提取物组和原方打粉组未引起子宫增重。

5.3药物不同提取物对人乳腺癌MCF-7细胞增殖作用的影响

图25所示的实验结果表明，药物水提物及70％乙醇提取物在浓度为0.00001mg·mL^-1～0.01mg·mL^-1范围内能够显著提高MCF-7细胞的增殖率，且差异均具有统计学意义，与阳性对照药作用类似，按照E-Screen筛选原理，证明其具有雌激素活性。而药物95％乙醇提取物只在浓度为0.00001mg·mL^-1时才能促进细胞增殖，其活性显然不如水提物及70％乙醇提取物。

5.4药物不同提取物对转染ERα/β-ERE荧光素酶报告基因的HEK-293细胞的荧光素酶表达的影响

如图26所示，通过转染ER/-EREHEK-293细胞的luciferase实验表明，与空白Con组相比，药物70％乙醇提取物在0.00001～0.01mg·mL^-1浓度范围内能显著促进ERα-ERE及ERβ-ERE荧光素酶报告基因的表达(^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)，作用效果与E₂一致，而药物水提取物及95％提取物则未出现明显促进表达的作用。

综上所述，实验结果表明，相对于药物水提物和95％乙醇提取物，70％乙醇提取物的药物效果具有显著改善。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物是利用醇溶液通过对所述中药组合物的原料进行提取得到，其中，所述原料为：

1-3质量份的肉苁蓉、1-3质量份的巴戟天、1-3质量份的牛膝、1-2质量份的蜀椒和0.5-1.5质量份的青盐，

所述醇溶液为70％乙醇溶液，

所述中药组合物适于预防和治疗围绝经期综合征，或预防和治疗骨质疏松和焦虑症，

对所述中药组合物的原料进行提取的方法包括：

将预定量的所述中药组合物的所述原料利用7-13倍质量的70％乙醇溶液进行第一提取，以便得到第一提取液和药渣，其中，所述第一提取的时间为4-6小时；以及

将所述药渣利用5-11倍质量的70％乙醇溶液进行第二提取，以便得到第二提取液，其中，所述第二提取的时间为4-6小时。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述原料为：

1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.5-2.5质量份的牛膝、1.2-1.8质量份的蜀椒和0.8-1.2质量份的青盐。

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，所述原料为：

1.5-2.5质量份的肉苁蓉、1.5-2.5质量份的巴戟天、1.8-2.2质量份的牛膝、1.3-1.6质量份的蜀椒和0.8-1.2质量份的青盐。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述中药组合物的方法，其特征在于，包括：

将预定量的权利要求1-3任一项所述的中药组合物的所述原料利用7-13倍质量的70％乙醇溶液进行第一提取，以便得到第一提取液和药渣，其中，所述第一提取的时间为4-6小时；以及

将所述药渣利用5-11倍质量的70％乙醇溶液进行第二提取，以便得到第二提取液，其中，所述第二提取的时间为4-6小时。

5.权利要求1-3任一项所述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗围绝经期综合征，

任选地，所述围绝经期综合征包括围绝经期循环中雌激素水平下降、生殖靶器官子宫、阴道及乳腺的萎缩。

6.权利要求1-3任一项所述中药组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和治疗骨质疏松和焦虑症。

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