CN107308173A - 连翘酯苷a在制备抗肝纤维化药物制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了连翘酯苷A在制备抗肝纤维化、抗氧化应激药物制剂中的应用，为治疗慢性肝病的肝纤维化提供了新的治疗手段，在治疗剂量下无明显的毒副作用，有良好的临床上药用前景。

Description

连翘酯苷A在制备抗肝纤维化药物制剂中的应用

技术领域

本发明涉及连翘酯苷A的新应用，尤其是涉及连翘酯苷A在制备抗肝纤维化药物制剂中的应用。

背景技术

连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实，其具有清热解毒，疏散风热之功效。中医临床上常用于治疗痈疽、丹毒、风热感冒、温热入营、高热烦渴。连翘酯苷A是连翘中主要的活性成分之一，其被认为对认知障碍、短暂性脑缺血有神经保护作用，具有改善学习记忆障碍、舒张血管、防治感染、解热等广泛的药理作用。

肝纤维化是慢性肝病的最终的病理过程，其涉及到了肝细胞的损伤，肝星状细胞的激活，假小叶的形成等过程。最终可造成肝脏组织中广泛纤维连接的形成，形成门脉高压状态，进一步造成该功能的损坏。目前，对肝纤维化的治疗没有较好的疗法，一般采用去除病因的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供连翘酯苷A的新用途，所述的连翘酯苷A的化学结构式如下所示:

本发明具体涉及连翘酯苷A在制备抗肝纤维化药物制剂的应用。

本发明具体涉及连翘酯苷A在制备抗氧化应激药物制剂的应用。

本发明所述药物制剂中连翘酯苷A还可以其药学上可以接受的盐、或者是连翘酯苷A及其药学上可以接受的盐的溶剂合物存在。

所述药物制剂除了包含治疗有效量的连翘酯苷A、其药学上可以接收的盐或它们的溶剂合物外，还包含药用辅料或其它可配伍的药物。

所述药用辅料是指常规的药用赋形剂，如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂和粘合剂中的一种或两种组合。

所述其它可配伍的药物为能与连翘酯苷A配伍其它天然药物或化学药品。

所述药物制剂可以是各种临床药物剂型，如胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片等。

本发明具有以下技术效果：

(1)本发明的连翘酯苷A具有良好的体内外抗肝纤维化具有良好的药用前景。

(2)本发明的连翘酯苷A在治疗剂量下未观察到明显的毒副作用，尤其是对肝脏、肺和肾脏的毒副作用。

附图说明

图1是连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的ALT、AST升高(A:ALT B：AST)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，与对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，#P<0.05；

图2是连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化四项的升高(A：HA B：LNC:CIV D:PCIII)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；

图3.1是连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化(HE染色)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，HE：苏木素-伊红染色，标尺＝300μm；

图3.2是连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化(天狼星红染色)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，Sirius Red：天狼星红染色，标尺＝200μm；

图4是连翘酯苷A抑制了肝纤维化过程中肝星状细胞的激活(TGF-β1免疫组化)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，IHC:免疫组化，标尺＝200μm，黑色箭头：TGF-β1阳性细胞；

图5是连翘酯苷A抑制肝纤维化过程中活性氧的生成，

Control：对照组，CCl4：四氯化碳诱导组，CCl4+FA：连翘酯苷A组，与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；

图6是连翘酯苷A提升肝纤维化小鼠模型中肝细胞的总抗氧化能力TAC，谷胱甘肽GSH、超氧化物歧化酶SOD水平(A:TAC B:GSH C:SOD)，

Control：对照组，CCl₄：四氯化碳诱导组，CCl₄+FA：连翘酯苷A组，与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例使用的连翘酯苷A均购自于成都普瑞法公司，纯度经HPLC-DAD峰面积归一化法测得均在99％以上。

实验方法：建立正常对照组、四氯化碳诱导组、连翘酯苷A组，每组12只小鼠。正常对照组：每周腹腔腹腔注射橄榄油溶液2次，每次5ul/g体重。四氯化碳诱导组：利用四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型进行造模，每周腹腔注射含四氯化碳20％的橄榄油溶液2次，每次剂量为5ul/g体重。连翘酯苷A组：该组小组每次经同四氯化碳诱导组相同的四氯化碳剂量处理建模后，同时给与腹腔注射连翘酯苷A，每次剂量为60mg/kg。腹腔注射8周后，麻醉后处死小鼠，取肝脏组织、血清用以后续实验。

1.连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝功能损害

8周实验结束后，麻醉小鼠，进行心脏取血，静置30min后，以3000rpm离心30min，取上清，利用小动物生化仪进行血清谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT水平测定。

实验结果：连翘酯苷A组小鼠血清总的ALT、AST水平明显低于模型组，各组间差异有统计学意义。实验显示，连翘酯苷A能够抑制四氯化碳诱导导致的小鼠ALT、AST升高，抑制肝功能损害(图1)。

2.连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化四项的升高

实验方法：8周实验结束后，麻醉小鼠后进行心脏取血，静置30min后，以3000rpm离心30min，取上清，利用ELISA试剂盒(蓝基生物)测定各组小鼠血清肝纤维化四项透明质酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(CIV)的水平。

实验结果：实验显示连翘酯苷A组小鼠肝纤维化四项HA、LN、PCIII、CIV的水平显著低于四氯化碳诱导组小鼠，各组间差异存在统计学差异。实验显示连翘酯苷A能够抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化四项的增高，抑制肝纤维化的过程(图2)。

3.连翘酯苷A抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化

实验方法：将各组小鼠肝脏组织固定、脱水、石蜡包埋后，切3μm片，利用HE染色和天狼星红染色，封片后在显微镜下拍照观察。

实验结果：HE染色显示，连翘酯苷A能够抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝纤维化，抑制纤维间隔以及假小叶的形成(图3.1)。天狼星红染色显示，连翘酯苷能够抑制四氯化碳诱导导致的小鼠肝内胶原新生的出现，抑制肝纤维化的产生(图3.2)。

4.连翘酯苷A抑制了肝纤维化过程中肝星状细胞的激活

实验方法：将各组小鼠肝脏组织固定、脱水、石蜡包埋后，切3μm片，利用抗TGF-β1抗体，进行免疫组织化学染色，利用DAB显色试剂盒显色，封片后显微镜下拍照观察。

实验结果：实验结果显示，连翘酯苷A处理组小鼠肝脏切片中，TGF-β1阳性的细胞明显少于四氯化碳诱导组，说明连翘酯苷A处理抑制了肝星状细胞的激活，进而抑制了肝纤维化过程(图4)。

5.连翘酯苷A抑制肝纤维化过程中活性氧的生成

实验方法：实验结束时取各组小鼠肝脏组织小块，以PBS冲洗按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(避光)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。PBS洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。将组织置于适量PBS中，研磨后混匀后，以12000rpm/分离心5min后取上清，利用荧光分光光度计测定ROS含量(激发波长488nm，发射波长525nm)。利用标准曲线计算各组ROS含量。

实验结果：结果显示，连翘酯苷A处理组小鼠肝脏组织中ROS的含量较四氯化碳诱导组明显降低，各组差异有统计学意义。实验说明，连翘酯苷A能够抑制肝纤维化过程中的ROS的生成(图5)。

6.连翘酯苷A提升肝纤维化小鼠模型中肝细胞的总抗氧化能力TAC，谷胱甘肽GSH、超氧化物歧化酶SOD水平

实验方法：实验结束时取各组小鼠结肠组织，以1:2比例加入PBS，将组织磨碎，后以3000rpm/分离心30min取上清。利用ROS试剂盒测定各组间结肠组织中ROS的含量。利用ELISA试剂盒测定组织中谷胱甘肽GSH，超氧化物歧化酶SOD水平。

实验结果：实验结果显示，连翘酯苷A处理组小鼠TAC水平较四氯化碳诱导组明显升高，同时有着显著增多的GSH水平以及SOD水平，各组差异有统计学意义。实验结果说明，连翘酯苷A能够抑制四氯化碳造成的TAC水平以及GSH、SOD水平的降低，从而抑制肝纤维化过程中的过氧化反应(图6)。

实施例1 胶囊剂的制备

连翘酯苷A 2g，乳糖20g，羟甲基淀粉钠0.1g，淀粉浆适量，硬脂酸镁0.1g混合，过筛制粒，干燥后混匀装入胶囊，每个胶囊含连翘酯苷A0.02g，每日口服1-2粒，每日两次。实施例2 片剂的制备

连翘酯苷A5g，乳糖200g，淀粉浆适量，硬脂酸镁1g，混合，过筛，干燥后压片。每片含苦参碱二聚体A或B 0.02g。每日口服1-2片，每日两次。

实施例3 注射液的制备

连翘酯苷A 2g，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀释，混匀，然后加入氯化钠适量，溶解后再加入注射用水至1000ml，调PH值5.5-6.5，滤过，灌封，灭菌，即得1000支注射用针剂。

实施例4 脂质体纳米粒的制备

连翘酯苷A 1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵灵脂500mg溶于25ml环己烷中，混合搅拌均匀。于37℃恒温水浴中减压旋转蒸发除去有机溶剂，使药物及辅料在烧瓶壁形成均匀脂质薄膜，于真空干燥器中放置过夜，除尽有机溶剂；另取聚乙二醇单硬脂酸酯3750mg,搅拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超声10min，定容至250ml，得淡黄色透明溶液。将此溶液冷冻干燥可得冻干粉。用球磨机研磨24小时，制得粒径均匀的纳米粒，混匀并分装。每袋含连翘酯苷A 0.005g。口服，一次一袋，每日两次。

实施例5 缓释剂的制备

将连翘酯苷A 50g，羟丙基甲基纤维素30g，乳糖10g，加适量粘合剂制备软材，过20目筛制粒。干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.3g，混合均匀，压片。每片含连翘酯苷A或B 0.005g。每日口服1-2片，每日一次。

实施例6 控释剂的制备

连翘酯苷A 1g，乳糖40g和淀粉浆适量直接装到旋转制粒机/包衣器制备颗粒，将稀释到15％固体的塑化乙基纤维素包衣剂悬浮液喷雾到连翘酯苷A颗粒的旋转床上。在喷雾期间，用泊洛沙姆188制成的分散体载体膜包衣连翘酯苷A颗粒，形成平均颗粒度大约为450μm的持续释放的颗粒。混匀装入胶囊，每个胶囊含连翘酯苷A 0.005g，每日口服1-2粒，每日两次。

实施例7 分散片的制备

取连翘酯苷A 50g，羟乙酸淀粉钠50g，预凝胶淀粉340g，低取代羧丙基纤维素25g，糖精钠3g，薄荷香精3g，混合均匀制粒，并控制粒度在35-80μm范围内，直接压片。每片含苦参碱二聚体A或B 0.005g。每日口服1-2片，每日两次。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.连翘酯苷A在制备抗肝纤维化药物制剂的应用。

2.连翘酯苷A在制备抗氧化应激药物制剂的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述药物制剂中包含含有治疗有效量的连翘酯苷A、其药学上可以接受的盐、或者它们的溶剂合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述药物制剂除了包含治疗有效量的连翘酯苷A、其药学上可以接收的盐或它们的溶剂合物外，还包含药用辅料或其它可配伍的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述药用辅料是常规的药用赋形剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述其它可配伍的药物为能与连翘酯苷A配伍其它天然药物或化学药品。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征是，所述药物制剂包括但不限于胶囊剂、颗粒剂、片剂、注射剂、脂质体纳米粒、缓释剂、控释剂或分散片。