CN107304219A - 部花青类化合物、包含其的生物分子标记用染料、试剂盒及造影剂组合物 - Google Patents

部花青类化合物、包含其的生物分子标记用染料、试剂盒及造影剂组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可通过在生物分子中实现嵌入来标记生物分子的新型部花青类化合物、包含上述部花青类化合物的生物分子标记用染料、试剂盒及造影剂组合物。

Description

部花青类化合物、包含其的生物分子标记用染料、试剂盒及造 影剂组合物
技术领域
本发明涉及可通过在生物分子中实现嵌入来标记生物分子的新型 部花青类化合物、包含上述部花青类化合物的生物分子标记用染料、 试剂盒及造影剂组合物。
背景技术
荧光性染料使用于伴随着包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸 (RNA)在内的核酸及核酸的多种生物样品的检测。由此，正积极进 行针对荧光性核酸染料的研究，上述荧光性核酸染料与核酸特异性键 合或者嵌入于核酸来形成呈现优秀的荧光性的复合物。
与核酸特异性键合或嵌入于核酸的染料可使用于纯溶液、细胞提 取物、电泳凝胶、微阵列芯片、活细胞或固定细胞、凋亡细胞及环境 样品等，并且可使用于检测各种样品内的脱氧核糖核酸及核糖核酸的 存在及量。尤其，这种荧光染料可使用于作为用于基因研究及医疗诊 断的代表性方法的通过聚合酶链反应(PCR)的核酸的检测。
此时，在普通的终点定量聚合酶链反应(end-point PCR)的情况 下，无法进行与样品核酸的量成比例的定量聚合酶链反应，因此主要 使用可通过在每次扩增循环过程中检测实时变化的荧光值来进行针对 核酸的量的定量分析的实时定量聚合酶链反应(real-time PCR或qPC R)。
这种实时定量聚合酶链反应从聚合酶链反应产物检测荧光信号来 进行定量分析，作为用于检测荧光信号的方法，主要公知的是利用荧 光探针(probe)的检测法和利用嵌入式荧光染料的检测法等。
利用荧光探针的检测法使用由荧光性染料和淬灭染料的复合物标 记化的探针(例如，寡核苷酸)。在由荧光性染料和淬灭染料的复合物 标记化的寡核苷酸与目标序列杂交的情况下，随着荧光染料以切割的 方式从复合物分离而产生荧光信号。
利用上述的荧光探针的检测法具有对目标序列的选择性和特异性 高的优点，但由于设计复杂且需要大量使用，因此存在高价的问题。
利用嵌入式荧光染料的检测法基于荧光性核酸染料(dye)或被称 为着色剂(stain)的脱氧核糖核酸-结合荧光性染料。荧光性核酸染料 由比较简单的分子构成，因此由于设计及制备简单而存在相对便宜的 优点。
但是，为了使用于实时定量聚合酶链反应而需要满足几个基准， 因此并不是通常公知的荧光性核酸染料都可使用于实时定量聚合酶链 反应。
例如，使用于实时定量聚合酶链反应的荧光性核酸染料在保存及 聚合酶链反应过程中需要充分的稳定性，并且需要具有使用于聚合酶 链反应的缓冲液的pH范围的耐性。并且，当核酸存在时，荧光性核酸 染料不需要产生荧光信号或者仅需要产生非常微弱的荧光信号，当核 酸存在时，需要产生相对强的荧光信号。
在现有核酸的标记使用最多的染料为溴化乙锭(ethidium bromid e)。
溴化乙锭：
例如，溴化乙锭为了对完成电泳的浆料进行染色而使用(事后-染 色)，并且在电泳前制备浆料时，预先添加上述溴化乙锭，以与电泳一 同实现染色而使用(事前-染色)。并且，溴化乙锭产生400nm以下的 紫外光，并且当与脱氧核糖核酸键合时，上述溴化乙锭具有约620nm 的发射光谱，因此存在可容易地视觉确认脱氧核糖核酸的存在及位置 的优点。
除了上述的溴化乙锭的优点以外，溴化乙锭相当于突变原(mu tagen)及致癌物质(carcinogen)，因此在使用时存在需要非常注意的 问题。尤其，研究报指出，溴化乙锭妨碍脱氧核糖核酸与核糖核酸的 合成，从而随着抑制脱氧核糖核酸复制可诱发突变。
由此，作为呈现非遗传毒性的替代用荧光染料，主要使用 greenⅠ。但是，由于greenⅠ抑制聚合酶链反应工序，因 此存在无法仅通过单纯地提高greenⅠ的浓度来获得更高的 最大荧光信号的限制。
即，直到使greenⅠ的浓度到达开始显著抑制聚合酶链 反应工序的基准浓度为止，使荧光信号的强度与greenⅠ的浓 度成正比地增加，但之后，随着greenⅠ的浓度的额外的增加 会减少脱氧核糖核酸扩增。由此，会减少观察到的荧光信号的强度或 者增加用于观察规定强度以上的荧光信号的循环阈值(thresholdcycle)。
并且，由于greenⅠ在特定化学环境下不稳定，因此在 缓冲液内，数日之内会分解相当量。
发明内容
技术问题
在上述的技术背景下，本发明的目的在于，提供作为适合使用于 利用嵌入式荧光染料的实时定量聚合酶链反应的嵌入式荧光染料的部 花青类化合物。
并且，本发明的目的在于，提供与溴化乙锭不同的非遗传毒性的 部花青类化合物。
并且，本发明目的在于，提供并不增加循环阈值且可与核酸浓度 成正比地增加荧光信号的强度的部花青类化合物。
并且，本发明的目的在于，提供包含上述的部花青类化合物的染 料、试剂盒及造影剂组合物。
而且，本发明的目的在于，确定利用上述的部花青类化合物的核 酸的存在与否或细胞的存活率以及定量的方法。
解决问题的方案
根据用于解决上述的技术问题的本发明的一实施方式，可提供具 有由下述由化学式1表示的结构的部花青(merocyanine)类化合物。
化学式1：
在上述化学式1中，Ar为取代或未取代的芳香族环，Y1及Y2分 别独立地选自硫、氧、硒、NR8及-CR8＝CR9-；R1至R9分别独立地选 自氢、氘、取代或未取代的C1-C10烷基、包含至少一种杂原子的取代 或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取 代的C2-C10炔基、取代或未取代的C1-C10烷氧基、取代或未取代的芳 氧基、取代或未取代的C1-C10卤代烷基、卤素、氰基、羟基、取代或 未取代的氨基、取代或未取代的酰胺基、氨基甲酸酯、巯基、硝基、 羧基、羧酸盐、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代 或未取代的芳烷基、季铵、磷酸、磷酸盐、膦酸酯、酮(-COR10)、醛、 酯(-COOR10)、酰氯、磺酸、磺酸盐、聚亚烷基氧化物以及-L-Z官能 团；当Ra(a为选自1至9中的整数)为酮基(-COR10)或酯基(-CO OR10)时，R10选自取代或未取代的C1-C10烷基、包含至少一种杂原子 的取代或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代 或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C2-C10烷氧基、取代或未取 代的C1-C10卤代烷基以及取代或未取代的C1-C10氨基烷基；当Rb(b 为选自1至10的整数)被取代时，上述官能团内的任意碳或末端碳能 够被选自磺酸、磺酸盐、酮、醛、羧酸、羧酸盐、磷酸、磷酸盐、酰 氯、聚亚烷基氧化物、季铵盐、酯以及酰胺中的至少一种取代；m为1 至3的整数；L为包含3个至150个的非氢原子的连接子；Z具有能够 产生荧光信号的荧光团或由化学式1表示的结构；由化学式1表示的 结构具有一个或两个-L-Z官能团。
其中，作为可产生荧光信号的荧光团，Z可选自菲啶(phenanthri dium)、香豆素(coumarins)、青色素(cyanine)、氟硼荧(bodipy)、 荧光素(fluoresceins)、若丹明(rhodamines)、芘(pyrenes)、碳派若 因(carbopyronin)、噁嗪(oxazine)、呫吨(xanthenes)、噻吨(thioxa nthene)以及吖啶(acridine)。
根据本发明的一实施例，-L-Z官能团可由下述化学式2表示。
化学式2：-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A 4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(C H2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-Z
在上述化学式2中，L1以及L2分别独立地为选择性地包含选自氮、 氧及硫中的至少一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含 选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基；A1至A10分别独立地为 选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支 型烷基或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元 环或6元环；x1至x9分别独立地为0或1至20的整数；y1至y9分 别独立地为0或1至20的整数。
并且，Z可选自菲啶(phenanthridium)、香豆素(coumarins)、青 色素(cyanine)、氟硼荧(bodipy)、荧光素(fluoresceins)、若丹明(r hodamines)、芘(pyrenes)、碳派若因(carbopyronin)、噁嗪(oxazine)、 呫吨(xanthenes)、噻吨(thioxanthene)以及吖啶(acridine)或者具 有除上述之外的荧光团结构。
根据另一变形例，A1至A10中的一个可由下述的化学式3表示。
化学式3：
在上述化学式3中，R11为选择性地包含选自碳、氮中的至少一种 杂原子或者选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基，R12由下述化 学式4表示。
化学式4：-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-] y13-A14-L3-Z
在上述化学式4中，L3为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少 一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含选自氮、氧及硫 中的至少一种杂原子的芳基；A11至A14分别独立地为选择性地包含选 自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支型烷基或者选择 性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元环或6元环；x11 至x13分别独立地为0或1至20的整数；y11至y13分别独立地为0 或1至20的整数。
并且，根据本发明的再一实施方式，可提供包含部花青类化合物 的生物分子标记用染料。
并且，根据本发明的还有一实施方式，可提供包含部花青类化合 物的生物分子标记用试剂盒。
并且，根据本发明的另一实施方式，可提供包含部花青类化合物 的造影剂组合物。
并且，根据本发明的又一实施方式，可提用于确定样品内核酸的 存在与否的电泳试剂盒。
并且，根据本发明的又一实施方式，可提供确定样品内核酸的存 在与否的方法或定量的方法。
并且，根据本发明的又一实施方式，可提供对样品内细胞的存活 率进行分析或定量的方法。
发明的效果
本发明的新型部花青类化合物可通过嵌入于生物分子来在可见光 区域呈现荧光信号，并且呈现非遗传毒性，并将上述内容作为基础， 本发明的部花青类化合物可有用地使用于生物分子标记用染料、生物 分子标记用试剂盒及造影剂组合物等。
附图说明
图1为示出作为普遍使用的染料的safe的电泳结果的图。
图2至图10为示出本发明多种实施例的部花青类化合物的电泳结 果的图。
图11为示出作为普遍使用的染料的safe的吸收及发射光 谱结果的图。
图12及图13为示出本发明多种实施例的部花青类化合物的吸收 及发射光谱结果的图。
图14为示出作为普遍使用的染料的safe的细胞渗透性实 验结果的图像。
图15至图17为示出本发明多种实施例的部花青类化合物的细胞 渗透性实验结果的图像。
图18为示出作为普遍使用的细胞循环分析染料的利用碘化丙啶 (propidiumiodide)的细胞循环分析结果的图表。
图19为示出利用化合物6的细胞循环分析结果的图表。
图20为示出作为荧光染料而使用化合物38的实时定量聚合酶链 反应的熔点曲线(melt curve)的图表。
图21为示出作为荧光染料而使用greenⅠ的实时定量聚 合酶链反应的熔点曲线的图表。
图22为示出作为荧光染料而使用EvaGreenTM的实时定量聚合酶 链反应的熔点曲线的图表。
图23至图25示出化合物38的光衰实验结果的图表。
图26至图28为示出greenⅠ(英杰(Invitrogen)公司 产品)的光衰实验结果的图表。
图29至图31为示出EvaGreenTM(美国Biotium公司产品)的光 衰实验结果的图表。
图32及图33为示出作为荧光染料而使用greenⅠ及化 合物38的实时定量聚合酶链反应的扩增曲线及实时定量聚合酶链反应 的熔点曲线的图表。
图34为示出作为荧光染料而使用化合物38的荧光染料浓度的实 时定量聚合酶链反应的扩增曲线的图表。
图35为示出作为荧光染料而使用greenⅠ的荧光染料浓 度的实时定量聚合酶链反应的扩增曲线的图表。
图36为示出作为荧光染料而使用EvaGreenTM的荧光染料浓度的 实时定量聚合酶链反应的扩增曲线的图表。
图37至图42为示出作为荧光染料而使用化合物36、化合物38、 化合物39及EvaGreenTM的实时定量聚合酶链反应的扩增曲线及熔点曲 线的图表。
具体实施方式
为了更容易地理解本发明而在本文中定义特定术语。除非另行定 义，本发明所使用的多种科学术语及技术术语，具有与本发明所属技 术领域的普通技术人员的常规理解具有相同的含义。
并且，只要在本说明书的文脉上并不进行指定，单数形态的术语 也可以包含其的复数形态，复数形态的术语也可以包含其的单数形态。
新型部花青类化合物
根据本发明的一实施方式，可提供具有由下述化学式1表示的结 构的部花青类化合物。
化学式1：
在上述化学式1中，Ar为取代或未取代的芳香族环，例如，苯并 (benzo)或萘基(naphto)，Y1及Y2可分别独立地选自硫、氧、硒、 NR8及-CR8＝CR9-，m为1至3的整数。
R1至R9可分别独立地选自氢、氘、取代或未取代的C1-C10烷基、 包含至少一种杂原子的取代或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代 的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C1-C10烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的C1-C10卤代烷基、 卤素、氰基、羟基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的酰胺基、 氨基甲酸酯、巯基、硝基、羧基、羧酸盐、取代或未取代的芳基、取 代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基、季铵、磷酸、磷酸盐、 膦酸酯、酮(-COR10)、醛、酯(-COOR10)、酰氯、磺酸、磺酸盐、 聚亚烷基氧化物以及-L-Z官能团。
当Ra(其中，a为选自1至9中的整数)为烯基或炔基时，上述 Ra可以为与烯基的sp2-杂化碳或炔基的sp-杂化碳直接键合或则通过与 烯基的sp2-杂化碳或炔基的sp-杂化碳键合的烷基的sp3-杂化碳间接键 合的形态。
在本文中，Ca-Cb官能团是指具有a个至b个的碳原子的官能团。 例如，Ca-Cb烷基是指具有a个至b个的碳原子且包含直链烷基及支链 烷基等的饱和脂肪族基。直链烷基或支链烷基的主链具有10个以下(例 如，C1-C10的直链、C3-C10的支链)的碳原子，优选为具有4个以下的 碳原子，更优选为具有3个以下的碳原子。
具体地，烷基可以为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲 丁基、异丁基、叔丁基、戊-1-基、戊-2-基、戊-3-基、3-甲基丁-1-基、 3-甲基丁-2-基、2-甲基丁-2-基、2，2，2-三甲基乙烯-1-基、正己基、 正庚基及N-辛基。
并且，在本文中，烷氧基是均指两种-O-(烷)基和-O-(未取代 的环烷)基，并且是具有一个以上的醚基及1个至10个碳原子的直链 碳化氢或支链碳化氢。
具体地，虽然包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧 基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1，2-二甲基丁氧基、 环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己氧基等，但并不限定于 此。
并且，在本文中，卤素是指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘 (-I)，卤代烷基是指由上述的卤素取代的烷基。例如，卤代甲基是指 甲基的的氢中的至少一种由卤素代替的甲基(-CH2X、-CHX2或-CX3)。
在本文中，芳烷基作为芳基由烷基的碳取代的形态的官能团，是- (CH2)nAr的总称。作为芳烷基的例，苄酯(-CH2C6H5)或苯乙基(- CH2CH2C6H5)等。
在本文中，除非另有定义，芳基是指包含单环或通过相互胶接或 共价键合连接的多环(优选为1个至4个环)的不饱和芳香族环。作 为芳基的非限制性例子包括苯基、联苯、邻三联苯(terphenyl)、间三 联苯、对联三苯、1-萘基、2-萘基、1-蒽基(anthryl)、2-蒽基、9-蒽 基、1-菲基(phenanthrenyl)、2-菲基、3--菲基、4--菲基、9-菲基、1- 芘基、2-芘基及4-芘基等。
在本文中，杂芳基是指如上定义的芳基内的一个以上的碳原子由 氮、氧或硫等的非碳原子取代的官能团。作为杂芳基的非限制性例子， 包括呋喃基(furyl)、四氢呋喃基、吡咯基(phrrolyl)、吡咯烷基(p yrrolidinyl)、噻吩基(thienyl)、四氢噻吩基、恶唑基(oxazolyl)、 异恶唑基(isoxazolyl)、三唑基(triazolyl)、噻唑基(thiazolyl)、 异噻唑基(isothiazolyl)、吡唑基(pyrazolyl)、吡唑烷基(pyrazolidi nyl)、恶二唑基(oxadiazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、咪唑基(i midazolyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、吡啶基(pyridyl)、哒嗪基 (pyridaziyl)、三嗪基(triazinyl)、哌啶基(piperidinyl)、吗啉基(m orpholinyl)、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、 哌嗪基(piperainyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)、萘啶(naphthyridinyl)、 苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基(indolyl)、吲哚啉基、吲嗪基、吲 唑基(indazolyl)、喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基(cinnolinyl)、 酞嗪基(phthalazinyl)、喹唑啉基、喹喔啉基、蝶啶基(pteridinyl)、 奎宁环基(quinuclidinyl)、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪(phen othizinyl)、吩恶嗪基、嘌呤基、苯并咪唑基(benzimidazolyl)及苯并 噻唑基等和胶接有它们的类似体。
在本文中，除非另有定义，碳化氢环(cycloalkyl)或包含杂原子 的碳化氢环(heterocycloalkyl)可分别理解成烷基或杂烷基的环形结构。
作为碳化氢环的非限制性例子，可包含环戊基、环己基、1-环己 烯基、3-环己烯基及环庚基等。作为包含杂原子的碳化氢环的非限制性 例子，可包括1-(1，2，5，6-四氢吡啶)、1-哌啶基、2-哌啶基、3- 哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢 噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
并且，其中，包含碳化氢环或杂原子的碳化氢环可具有通过与碳 化氢环、包含杂原子的碳化氢环、芳基或环芳基胶接或者共价键合而 连接的形态。
当Ra(其中，a为选自1至9中的整数)为酮基(-COR10)或酯 基(-COOR10)时，R10可选自取代或未取代的C1-C10烷基、包含至少 一种杂原子的取代或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C2-C10烷氧基、 取代或未取代的C1-C10卤代烷基以及取代或未取代的C1-C10氨基烷基。
当Rb(b选自1至10的整数)被取代时，上述官能团内的任意碳 或末端碳可被选自磺酸、磺酸盐、酮、醛、羧酸、羧酸盐、磷酸、磷 酸盐、酰氯、聚亚烷基氧化物、季铵盐、酯以及酰胺中的至少一种取 代。
其中，在维持聚合物的特性的范围内，聚亚烷基氧化物可根据需 要被额外地取代。例如，上述取代可以为用于增加或减少聚合物的化 学或生物学稳定性的化学键合。作为具体的例子，聚亚烷基氧化物内 的任意碳或末端碳可由羟基、烷基醚(甲基醚、乙醚、丙醚等)、羧 甲基醚、羧乙基醚、苄醚、二苄基亚甲基醚或二甲胺取代。在一实施 例中，聚亚烷基氧化物可以为由甲基醚终止的聚亚烷基氧化物(mPE G)，其中聚亚烷基氧化物由–(CH2CH2O)nCH3的化学式表示，可 根据与乙二醇重复单位的数量相当的n的大小改变聚亚烷基氧化物的 大小。
根据本发明的多种变形例，Ra(其中，a选自1至9中的整数)可 具有至少一种–L-Z官能团。
其中，L为使由化学式1表示的结构和作为可产生荧光信号的荧 光团的Z相连接的连接子，L为包含3个至150个的非氢原子的连接 子，具体地，可以为包含8个至150个的非氢原子的连接子。
并且，Z可以选自为菲啶(phenanthridium)、香豆素(coumarins)、 青色素(cyanine)、氟硼荧(bodipy)、荧光素(fluoresceins)、若丹 明(rhodamines)、芘(pyrenes)、碳派若因(carbopyronin)、噁嗪 (oxazine)，呫吨(xanthenes)、噻吨(thioxanthene)及吖啶(acridi ne)中的荧光团或者具有由化学式1表示的结构。
根据本发明的一实施例，-L-Z官能团可由下述的化学式2表示。
化学式2：-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A 8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-Z
在上述化学式2中，L1以及L2分别独立地为选择性地包含选自氮、 氧及硫中的至少一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含 选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基；A1至A10分别独立地为 选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支 型烷基或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元 环或6元环；x1至x9分别独立地为0或1至20的整数；y1至y9分 别独立地为0或1至20的整数。
并且，Z可具有选自菲啶、香豆素、青色素、氟硼荧、荧光素、 若丹明、芘、碳派若因、噁嗪、呫吨、噻吨以及吖啶(acridine)或者 除此之外的荧光团结构。
根据另一变形例，A1至A10中的一个可由下述化学式3表示。
化学式3：
在上述化学式3中，R11为选择性地包含选自碳、氮中的至少一种 杂原子或者选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基，R12由下述化 学式4表示。
化学式4：-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-]y13-A14-L3-Z
在上述化学式4中，L3为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少 一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含选自氮、氧及硫 中的至少一种杂原子的芳基；A11至A14分别独立地为选择性地包含选 自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支型烷基或者选 择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元环或6元环；x 11至x13分别独立地为0或1至20的整数；y11至y13分别独立地为 0或1至20的整数。
并且，本发明一实施例的部花青类化合物可具有还包含相反离子 的结构。相反离子作为有机阴离子或无机阴离子，可通过考虑部花青 类化合物的溶解度及稳定性等适当地选择。
作为本发明一实施例的部花青类化合物的相反离子的例子，包括 磷酸氟化离子、卤素离子、膦酸离子、高氯酸离子、高碘酸离子、六 氟化锑离子、酒石酸六氟化离子、氟硼酸离子及四氟离子等的无机酸 阴离子和硫氰酸离子、苯磺酸离子、萘磺酸离子、对甲苯磺酸离子、 烷基磺酸离子、苯羧酸离子、烷基羧酸离子、三氯烷基羧酸离子、烷 基磺酸离子、三卤代烷基磺酸及烟酸离子等的有机酸离子。并且，双 苯基二醇、硫代双酚螯合物及双二醇-α-二酮等的金属化合物离子、钠 及钾等的金属离子和季铵铵也可作为相反离子选择。
本发明的多种实施例的部花青类化合物如下。
化合物1：
化合物2：
化合物3：
化合物4：
化合物5：
化合物6：
化合物7：
化合物8：
化合物9：
化合物10：
化合物11：
化合物12：
化合物13：
化合物14：
化合物15：
化合物16：
化合物17：
化合物18：
化合物19：
化合物20：
化合物21：
化合物22：
化合物23：
化合物24：
化合物25：
化合物26：
化合物27：
化合物28：
化合物29：
化合物30：
化合物31：
化合物32：
化合物33：
化合物34：
化合物35：
化合物36：
化合物37：
化合物38：
化合物39：
称为本发明的多种实施例的部花青类化合物的目标的生物分子可 以为选自单链核糖核酸、双链核糖核酸、单链脱氧核糖核酸及双链脱 氧核糖核酸中的至少一种，部花青类化合物可嵌入于核酸内部。
生物分子标记用染料、试剂盒及造影剂组合物
根据本发明的再一实施方式，可提供本发明的多种实施例的包含 选自部花青类化合物中的至少一种的生物分子标记用染料、试剂盒及 造影剂组合物。
并且，根据需要，生物分子标记用试剂盒还可包含用于嵌入于作 为目标生物分子的核酸内的酶、溶剂(缓冲液等)及其它试剂等。
其中，作为溶剂可使用选自由磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液及三 (羟甲基)氨基甲烷缓冲液构成的组中的缓冲液、选自二甲基亚砜、 二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、乙醇及乙腈中的有机溶剂或水等， 根据溶剂的种类，可向青色素类化合物导入多种官能团，由此调节溶 解度。
在本发明一实施例的生物分子标记用染料内，二聚物和/或者三聚 体形态的多种部花青类化合物可通过分子之间的相互作用以相互凝聚 的状态存在。
此时，二聚物和/或者三聚体形态的多种部花青类化合物在凝聚的 状态下不会产生荧光信号。相反地，当存在生物分子(例如，核酸) 时，以凝聚的状态存在的二聚物和/或者三聚体形态的部花青类化合物 以相互分离的方式嵌入于核酸内，由此可产生荧光信号。
即，可实现嵌入的生物分子的存在与否起到作为本发明一实施例 的生物分子标记用染料的猝灭剂(quencher)的作用。
例如，本发明一实施例的生物分子标记用试剂盒可作为如下的电 泳试剂盒提供，即，上述电泳试剂盒在按大小分离作为生物分子的核 酸后，使生物分子标记用染料内的部花青类化合物嵌入于核酸内部， 以标记核酸。
具体地，上述电泳试剂盒包含：选自本发明的多种实施例的部花 青类化合物中的至少一种化合物；缓冲液、凝胶基质、用于形成凝胶 基质的至少一种物质、表面或用于形成表面的至少一种物质；以及使 用说明书，当核酸存在于样品内时，上述电泳试剂盒可用于确定固定 于上述基质或上述表面的样品内核酸的存在与否。
上述表面可以为固体表面、膜表面、玻璃表面、塑料表面或多晶 硅表面。上述基质可由选自藻酸盐、胶原、肽、纤维蛋白、玻尿酸、 琼脂糖、聚羟乙基异丁烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚氧化乙烯、 聚乙二醇双丙烯酸酯、明胶、基质胶(matrigel)、聚乳酸、羧甲基纤维素、代血浆、壳聚糖、胶乳及琼脂糖中的至少一种制备，并且可以 为珠或膜的形态。
并且，为了以口服或非口服方式给药，除了本发明多种实施例的 部花青类化合物以外，上述实施例的造影剂组合物还可包含药学上可 接受的载体。
作为药学上可接受的载体的具体的例子，包括乳糖、葡萄糖、蔗 糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸钠、明 胶、硅酸钙、微晶性纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、 甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等。
以下，对利用上述的生物分子标记用染料或生物分子标记用试剂 盒的生物分子的标记方法进行说明。
利用生物分子标记用染料的生物分子的标记方法
作为以本发明多种实施例的部花青类化合物标记生物分子的方法 可适用于可实现检测完成标记的固体或半固体状态的生物分子的荧光 的标记方法的所有生物分子的标记。
代替现有的荧光染料而使用部花青类化合物，从而可提供通过高 灵敏度实现化学质稳定性且操作性卓越的标记方法。
根据本发明的多种实施例，可实现通过在目标生物分子嵌入部花 青类化合物来对生物分子进行标记的方法等。并且，利用上述方法可 实现液体或浆料内生物分子的定量化、活细胞或凋亡细胞内生物分子 的染色以及基因芯片中的生物分子检测及定量化。
具体地，根据本发明的多种实施例，利用上述部花青类化合物可 确定样品内核酸的存在与否。更具体地，当核酸存在于样品内时，确 定样品内核酸的存在与否的方法包括：将核酸暴露于本发明多种实施 例的部花青类化合物来使上述部花青类化合物嵌入于核酸的内部，由 此形成复合物的步骤；以及确定上述部花青类化合物的荧光或其的不 存在的步骤。
上述部花青类化合物通过高灵敏度实现化学稳定性，从而与存在 于样品内的核酸容易地实现嵌入，由此形成复合物。并且，向所形成 的上述复合物照射充分的波长的光，由此可通过所发射的荧光信号简 单地确定样品内的核酸地存在与否。
例如，上述荧光信号可通过酶标仪、显微镜、荧光计、量子计数 器及流式细胞仪等的多种设备或肉眼进行检测。
并且，可利用上述部花青类化合物来确定所扩增的目标核酸的存 在与否。
具体地，作为进行核酸扩增反应的方法可以为确定所扩增的目标 核酸的存在与否的方法，上述确定所扩增的目标核酸的存在与否的方 法包括：提供包含目标核酸、用于扩增上述目标核酸所需的试剂及本 发明多种实施例的部花青类化合物的反应混合物的步骤；在适合形成 完成扩增的的目标核酸的条件下，使上述反应混合物发生聚合反应的 步骤；用光对上述反应混合物进行照明的步骤；以及对从上述反应混 合物发射的荧光进行检测的步骤。
除了目标核酸以外，上述反应混合物可包含多种扩增酶，适合于 目标核酸序列扩增的多种引物及脱氧核苷三磷酸盐等的试剂等。
上述部花青类化合物能够以无需抑制聚合酶链反应的方式使用， 因此可有用地使用于确定所扩增的目标核酸的存在与否。
并且，可利用上述部花青类化合物来对样品内核酸进行定量。具 体地，对样品内核酸进行定量的方法可包括：混合包含本发明多种实 施例的部花青类化合物的混合物和包含核酸的样品的步骤；使上述部 花青类化合物与上述样品内的核酸发生嵌入来形成复合物，并且为了 产生荧光信号而对上述样品和上述混合物进行充分时间的培养(incubating)的步骤；以及通过对所感应的荧光信号和规定的核酸量的荧光标 准特性进行比较来对样品内的核酸进行定量的步骤。
上述样品内的核酸的量可通过与将特定核酸量的荧光标准特性作 为基础进行检测的荧光信号进行比较来进行定量化。
为了核酸的定量化或者在使用细胞提取物的情况下为了评价细胞 数量而使用核酸的量与荧光强度之间的实质上的主要关系。作为一例， 核酸可浸渍于印迹(blot)或浆料等的惰性基质或者附着于微阵列芯片 或任意的其它固体表面等的固体表面。此时，将包含上述部花青类化 合物的溶液涂敷于含核酸的基质的表面、微阵列芯片的表面或其它固 体的表面，并进行充分时间的培养，以形成染料-核酸复合物。
并且，根据本发明的多种实施例，可实现通过向包含在目标细胞 内的生物分子嵌入部花青类化合物来对目标细胞的存活率孔目标细胞 进行定量的方等。
具体地，对样品内的细胞的存活率进行定量的方法可包括：混合 包含本发明多种实施例的部花青类化合物的混合物和包含凋亡细胞的 样品的步骤；使上述部花青类化合物与上述样品内的凋亡细胞发生嵌 入来形成复合物，并且为了产生荧光信号而对上述样品和上述混合物 进行充分时间的培养的步骤；以及通过对所感应的荧光信号和规定的 凋亡细胞量的荧光标准特性进行比较来对样品内的凋亡细胞进行定量 的步骤。
根据本发明的一实施例，上述部花青类化合物不会渗透细胞，即， 活细胞，但可渗透凋亡细胞。利用如上所述的特性，对上述部花青类 化合物进行充分时间的培养，以使上述部花青类化合物通过凋亡细胞 的膜来与膜内的核酸形成复合物。
作为另一其它具体例，分析样品内的细胞的存活率的方法包括： 混合与凋亡细胞发生嵌入的本发明多种实施例的部花青类化合物、包 含除了能够与细胞发生嵌入的上述部花青类化合物以外的化合物的水 溶液及包含细胞的样品的步骤；用光对包含上述部花青类化合物以及 与除了上述部花青类化合物以外的上述化合物发生嵌入的细胞的样品进行照明的步骤；以及对从上述样品发射的荧光进行检测的步骤，使 上述部花青类化合物及除上述部花青类化合物以外的上述化合物一同 与样品内的细胞发生嵌入，并在细胞之间通过荧光反应来产生从上述 样品发射的上述荧光，所发射的上述荧光与仅通过上述部花青类化合 物的荧光反应而产生的荧光不同。
根据本发明的一实施例，上述部花青类化合物可与凋亡细胞发生 嵌入。具体地，上述部花青类化合物可通过渗透凋亡细胞来与凋亡细 胞内的核酸发生嵌入。
相反地，除了上述部花青类化合物以外的化合物，例如吖啶橙(A O，Acridineorange)可与细胞发生嵌入，即，不仅与凋亡细胞，也能 够与活细胞发生嵌入。即，吖啶橙不仅与凋亡细胞发生嵌入，还可通 过渗透活细胞的模来与细胞内的核酸发生嵌入。
可通过检测荧光信号来分析样品内的细胞的存活率，上述荧光信 号由以使上述部花青类化合物及除了部花青类化合物以外的化合物与 核酸发生嵌入的方式形成的复合物产生。具体地，可通过检测及区分 由上述部花青类化合物和核酸的复合物产生的荧光信号的波长及由除 了上述部花青类化合物以外的化合物和核酸的复合物产生的荧光信号的波长来分析细胞的存活率。
并且，本发明可涉及利用如上所述的特征的用于分析样品内的细 胞的存活率的试剂盒。
具体地，分析样品内的细胞的存活率的试剂盒包含：本发明多种 实施例的部花青类化合物；以及使用说明书，当凋亡细胞存在于样品 内时，上述凋亡细胞与上述部花青类化合物发生嵌入来检测荧光。
并且，本发明也可以实现通过电泳来识别由部花青类化合物标记 的生物分子的方法。
脱氧核糖核酸基因芯片法
在脱氧核糖核酸基因芯片法中，使所要标记的目标核酸和染料发 生反应(即，使部花青类化合物嵌入于目标核酸内)来进行标记，此 时，对目标核酸准备具有互补的碱基序列的单链的探针核酸，并在基 板上混合变形成单链的目标核酸和探针核酸后，使荧光染料嵌入于目 标核酸内，由此可产生荧光信号。
在本标记方法中，作为固定于基板的探针核酸，当研究遗传基因 的表现时，可使用将互补脱氧核糖核酸(cDNA)等的互补脱氧核糖核 酸的文库、基因组的文库或者所有基因组作为模板并根据聚合酶链反 应法进行扩增而成的探针核酸。
并且，当研究遗传基因的变异等时，可使用基于成为标准的已公 知的序列来合成与变异等相对应的多种寡核苷酸的探针核酸。
将探针核酸固定于基板上的方法可根据核酸的种类或基板的种类 而选择适当的方法。例如，也可利用脱氧核糖核酸的电荷并向以多熔 素等的阳离子进行表面处理的板实现静电耦合的方法。
聚合酶链反应法
在聚合酶链反应法中，在所要标记的目标核酸的碱基序列中以染 料对互补的探针进行标记，在扩增目标核酸之前或者完成扩增后，使 目标核酸和探针发生反应来检测目标核酸的荧光。
具体地，目标核酸的延伸反应通过酶(脱氧核糖核酸聚合酶，核 糖核酸聚合酶)实现，此时，使酶识别由引物形成的双链核酸序列， 上述引物由目标核酸和寡核苷酸形成，并从所识别的上述位置实现延 伸反应，并且仅扩增作为目标的遗传基因领域。
当使酶合成时，将核苷酸(dNTP，NTP)作为原料来实现合成反 应。
此时，若向常规的核苷酸(dNTP，NTP)中以任意的比率混合具 有染料的核苷酸，则可合成导入有上述比率的染料的核酸。
并且，根据聚合酶链反应以任意的比率导入具有氨基的核苷酸后， 还可通过键合标记用染料来合成导入有标记用染料的核酸。
当合成酶时，将核苷酸作为原料实现合成反应，但当将此时的核 苷酸的3'的OH替换成H来使用时，不会产生进一步的核酸的延伸反 应，并在那时终止反应。
将这种核苷酸、双脱氧核苷三磷酸(ddNTP，dideoxy nucleotide triphospate)称为终止子。
若向常规的核苷酸混合终止子来合成核酸，则因以规定的比率导 入终止子，从而终止反应，由此合成多种长度的核酸。
若通过浆料电泳按大小分离上述核酸，则按长度的顺序使脱氧核 糖核酸变长。其中，若按终止子的各碱的种类以其它标记用染料进行 标记，则在合成反应的终点(3'末端)中观察到基于各碱的倾向，并将 标记于终止子的标记用染料作为基点来读取荧光信息，由此可获得该 目标核酸的碱基序列信息。
并且，还可以代替终止子而使用预先以标记用染料标记的引物， 并使引物和目标核酸实现杂交。
并且，作为探针还可使用戍糖核酸(PNA)。戍糖核酸是将作为 核酸的基本骨架结构的磷酸戊糖骨架取代成将甘氨酸作为单位的聚酰 胺骨架的，从而具有与核酸相似的三维结构，相对于具有互补的碱基 序列的核酸，实现非常特异性地且强有力地键合。由此，不仅应用于 原位杂交(ISH，in-situ hybridization)法等现有的脱氧核糖核酸分析 方法，还可应用于端粒(telomere，末端微粒)戍糖核酸探针，由此还 可作为端粒研究的试剂使用。
例如，在标记的过程中，使双链脱氧核糖核酸与戍糖核酸相接触 来进行杂交，上述戍糖核酸在脱氧核糖核酸的碱基序列的整体或一部 分具有互补的碱基序列且由标记用染料标记，对其混合物进行加热来 生成单链脱氧核糖核酸，并将混合物缓慢地冷却至室温来配制戍糖核 酸-脱氧核糖核酸复合物后，检测其荧光，由此进行标记。
在上述例子中，虽然对通过聚合酶链反应法扩增目标核酸来检测 产物的荧光的方法进行了说明，但在该方法中，通过电泳确认产物的 大小，然后检测荧光强度，因此需要研究扩增产物的量。
为此，还可以利用荧光染料的能量转移，并使用为了通过与聚合 酶链反应法的产物进行杂交来产生荧光而设计的探针，由此实时检测 产物的量。
例如，可使用标记供体和受体的脱氧核糖核酸。作为具体的标记 方法，可例举用于确定特定序列的核酸的存在的分子信标法、TaqMan -聚合酶链反应法或循环探针(cyclingprobe)法等。
其它标记方法
并且，也可利用本发明的标记用染料来观察细胞内的信号传递(s ignaling)现象。在内部信号传递或基于其的细胞的反应中参与有多种 酶等。在代表性信号传递现象中，使特殊的蛋白质磷酸化酶(protein kinase)活性化，由此诱导蛋白质的磷酸化来开始信号传递。
核苷酸(例如，腺苷三磷酸(ATP)或腺苷二磷酸(ADP))的 键合和水解对它们的活性起到重大的作用，可通过向核苷酸衍生物导 入标记用染料来以高灵敏度观察细胞内的信号传递现象。
并且，还可将本发明的标记用染料应用于利用核糖核酸干扰作用 (核糖核酸干扰)的遗传基因表现现象的观察。
核糖核酸干扰通过向细胞导入双链核糖核酸(dsRNA)并分解目 标遗传基因的信使核糖核酸(mRNA)来抑制表现，因此能够以标记用 染料标记所设计的双链核糖核酸来观察核糖核酸干扰现象。
以下，对本发明的具体实施例进行说明。但是，以下记载的实施 例仅用于具体地例示或说明本发明，本发明并不限定于这些实施例。
制备例
制备例1.化合物1的合成
(1)中间体1及中间体2的合成
向250mL的1口反应器中投入2-(甲硫基)苯并噻唑(2-(meth ylthio)benzothiazole)(11.115g，0.0614mol)和乙腈(110mL)，并 在常温下搅拌5分钟。然后，向反应器中投入四氢呋喃(Oxolane)， 即2-碘乙基-1，3-二氧戊环(21g，0.0921mol)，在环流条件下搅拌4 0小时后，进行冷却，然后通过浓缩及柱纯化来获得中间体1。(14g， 0.0523mol，85％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7.45-7.48(m，1 H)，7.38-7.43(m，1H)，7.26-7.32(m，2H)，5.00(t，J＝4.0Hz， 1H)，4.54-4.58(m，2H)，3.89-4.02(m，4H)，2.18-2.23(m，2 H)
然后，向100mL的1口反应器中投入中间体1(2.37g，0.01mol) 和乙腈(30mL)，并在常温下搅拌5分钟。向反应器中投入碘甲烷(m ethyl iodide，MeI)(1.26g，0.03mol)，并在环流条件下搅拌12小时 后，进行冷却，然后进行浓缩并投入乙酸乙酯(50mL)来析出固体。对所析出的固体进行过滤及真空干燥来获得中间体2(3g，0.00733mol， 73％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ8.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7. 92(d，J＝8.4Hz，1H)，7.76(t，J＝8.4Hz，1H)，7.64(t，J＝8.0 H，1H)，5.03(t，J＝3.6Hz，1H)，4.78(t，J＝7.2Hz，2H)，3.84- 4.00(m，2H)，3.21(s，3H)，2.38-2.42(m，2H)
(2)中间体3的合成
向50mL的1口反应器中投入4-甲基喹啉-5-醇(2g，0.0125mol)、 乙基6-碘己酸酯(10g，0.0375mol)、二甲基甲酰胺(4mL)，并在1 20℃的温度下搅拌12小时后，进行冷却，然后通过浓缩及柱纯化来获 得中间体3(3.5g，0.00828mol，67％)。1H-NMR(400MHz，DMSO- d6)δ9.19(d，J＝6.4Hz，1H)，7.952(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73-7.77 (m，2H)，7.22(d，J＝7.6Hz，1H)，4.85(t，J＝6.8Hz，2H)，4. 01(q，J＝7.6Hz，2H)，3.09(s，3H)，2.35(t，J＝7.6Hz，2H)，1. 89-1.93(m，2H)，1.55-1.61(m，4H)，1.12(t，J＝6.8Hz，3H)
(3)中间体4的合成
向100mL的1口反应器中投入中间体2(1.55g，3.814mmol)、 中间体3(1.64g，3.814mmol)及二氯甲烷(30mL)，并在常温下搅 拌5分钟。然后，向反应器中投入三乙胺(1.15g，11.442mmol)，在 常温下搅拌12小时后，通过浓缩及柱纯化来获得中间体4(1.5g，2.2 63mmol，59％)。
(4)中间体5的合成
向250mL的1口反应器中投入中间体4(1.5g，2.263mmol)、氯 仿(45mL)，在常温下搅拌5分钟后，向反应器中投入50％的硫酸水 溶液(9mL)，并搅拌12小时。然后，向反应器中投入水(10mL)， 并用二氯甲烷(2×50mL)进行提取，对有机层进行浓缩及柱纯化来合 成中间体5(0.4g，0.666mmol，29％)。1H-NMR(400MHz，MeOD) δ8.35(d，J＝7.2Hz，1H)，7.91(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82(t，J＝8. 0Hz，1H)，7.62-7.65(m，2H)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.42-7.44(m，1H)，7.36(d，J＝7.2Hz，1H)，7.11(d，J＝8.0Hz，1H)， 5.21-5.25(m，1H)，4.70-4.75(m，1H)，4.45-4.60(m，2H)，4. 13-4.20(m，1H)，2.87-2.92(m，1H)，2.52-2.56(m，1H)，2.33(t，J＝7.6Hz，2H)，1.94-2.02(m，2H)，1.66-1.73(m，2H)，1. 46-1.52(m，2H)
(5)化合物1的合成
向250mL的1口反应器中投入中间体5(200mg，0.35mmol)、 二甲基甲酰胺(4mL)，并在常温向搅拌5分钟后，向反应器中投入T STU(106mg，0.35mmol)、三乙胺(50μl，0.35mmol)，并在常温下 搅拌15分钟。然后，投入三乙胺(50μl，0.35mmol)、2，2'-氧基二乙胺(13μl，0.119mmol)，并在常温下搅拌3日后，向乙酸乙酯(40mL) 中投入反应液来析出固体。对所析出的固体进行过滤及柱纯化来获得 化合物1(110mg，0.0906mmol，26％)。1H-NMR(400MHz，MeOD) δ8.25(d，J＝6.8Hz，2H)，7.77-7.80(m，2H)，7.68-7.73(m，2H)， 7.51-7.54(m，4H)，7.41(t，2H，J＝8.8Hz，2H)，7.29-7.35(m，2 H)，7.16-7.20(m，2H)，7.01(d，J＝7.6Hz，2H)，5.04-5.11(m， 2H)，4.60-4.63(m，2H)，4.32-4.43(m，4H)，4.00-4.09(m，2 H)，3.44-3.47(m，4H)，3.30-3.32(m，4H)，2.79-2.82(m，2H)， 2.35-2.45(m，2H)，2.21(t，J＝7.2Hz，4H)，1.85-1.92(m，4H)， 1.61-1.69(m，4H)，1.39-1.45(m，4H)
制备例2.化合物2至化合物4的合成
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例中，将2，2'-氧基 二乙胺分别替换成4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺、1，2-双(2- 氨基乙氧基)乙烷、1，11-二氨基-3，6，9-三氧杂癸烷来合成化合物2、 化合物3及化合物4。
化合物2-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.25(d，J＝7.2Hz，2H)， 7.77(t，J＝8.0Hz，2H)，7.69-7.73(m，2H)，7.50-7.55(m，4H)， 7.41(t，J＝8.4Hz，2H)，7.30-7.32(m，2H)，7.17-7.20(m，2H)，7.01(d，J＝8.0Hz，2H)，5.05-5.10(m，2H)，4.60-4.63(m，2H)， 4.34-4.45(m，4H)，4.04-4.10(m，2H)，3.54-3.56(m，4H)，3. 48-3.50(m，4H)，3.42(t，J＝6.0Hz，4H)，3.18(t，J＝6.8Hz，4H)， 2.79-2.83(m，2H)，2.37-2.44(m，2H)，2.16(t，J＝6.8Hz，4H)， 1.85-1.92(m，4H)，1.60-1.70(m，8H)，1.37-1.42(m，4H)
化合物3-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.26(d，J＝8.0Hz，2H)， 7.77-7.79(m，2H)，7.69-7.72(m，2H)，7.52-7.54(m，4H)，7. 42(t，J＝8.4Hz，2H)，7.31-7.33(m，2H)，7.17-7.20(m，2H)， 7.02(d，J＝7.6Hz，2H)，5.05-5.12(m，2H)，4.60-4.64(m，2H)， 4.33-4.43(m，4H)，4.01-4.10(m，2H)，3.54-3.57(m，4H)，3. 50(t，J＝6.4Hz，4H)，3.32(t，J＝6.4Hz，4H)，2.80-2.83(m，2H)， 2.40-2.43(m，2H)，2.21(t，J＝7.2Hz，4H)，1.86-1.92(m，4H)， 1.63-1.68(m，4H)，1.42-1.46(m，4H)
化合物4-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.27(d，J＝7.2Hz，2H)， 7.77-7.80(m，2H)，7.69-7.73(m，2H)，7.52-7.54(m，4H)，7. 42(t，J＝8.4Hz，2H)，7.31-7.33(m，2H)，7.18-7.20(m，2H)， 7.02(m，J＝7.6Hz，2H)，5.06-5.11(m，2H)，4.60-4.64(m，2H)， 4.35-4.44(m，4H)，4.05-4.08(m，2H)，3.54-3.58(m，8H)，3. 48(t，J＝6.0Hz，4H)，3.32(t，J＝4.8Hz，4H)，2.80-2.84(m，2H)， 2.39-2.43(m，2H)，2.21(t，J＝7.2Hz，4H)，1.87-1.94(m，4H)， 1.63-1.40(m，4H)，1.40-1.46(m，4H)
制备例3.化合物5的合成
在制备例3中，在生成制备例1的中间体1的过程中，除了将2- (甲硫基)苯并噻唑替换成5-氯-2-(甲硫基)苯并噻唑的以外，以与 制备例1相同的方法合成化合物5。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8. 34(d，J＝6.4Hz，2H)，7.71-7.77(m，4H)，7.58(m，2H)7.46(t， J＝8.4Hz，2H)，7.27(t，J＝7.2Hz，2H)，7.20(t，J＝6.8Hz，2H)， 7.05(d，J＝7.6Hz，2H)，5.07(m，2H)，4.55-4.58(m，2H)，4. 41(m，4H)，400-4.03(m，2H)，3.46(m，4H)，3.29(m，4H)， 2.82(m，2H)，2.40-2.42(m，2H)，2.21(m，4H)，1.90(m，4 H)，1.65(m，4H)，1.41(m，4H)
制备例4.化合物6至化合物8的合成
在利用制备例3的中间体5来合成化合物1的例子中，将2，2'- 氧基二乙胺分别替换成1，2-双(2-氨基乙氧基)乙烷、1，11-二氨基- 3，6，9-三氧杂癸烷、4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺来合成化合 物6、化合物7及化合物8。
化合物6-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.33-8.36(m，2H)，7. 74-7.78(m，4H)，7.62-7.64(m，2H)，7.46-7.51(m，2H)，7.30 -7.34(m，2H)，7.25(t，J＝7.6Hz，2H)，7.05-7.07(m，2H)，5. 09-5.12(m，2H)，4.50-4.61(m，2H)，4.42-4.47(m，4H)，4.01 -4.05(m，2H)，3.54(m，4H)，3.46-3.48(m，4H)，3.29(m，4 H)，2.80-2.82(m，2H)，2.41-2.45(m，2H)，2.17-2.20(m，4H)， 1.89-1.92(m，4H)，1.62-1.66(m，4H)，1.40-1.42(m，4H)
化合物8-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.36-8.38(m，2H)，7. 75-7.82(m，4H)，7.62-7.65(m，2H)，7.49-7.54(m，2H)，7.30 -7.34(m，2H)，7.27(t，J＝7.2Hz，2H)，7.08-7.10(m，2H)，5. 11-5.17(m，2H)，4.60-4.63(m，2H)，4.44-4.53(m，4H)，4.05 -4.08(m，2H`)，3.56-3.59(m，4H)，3.50-3.53(m，4H)，3.45 (t，J＝6.0Hz，4H)，3.20(t，J＝6.8Hz，4H)，2.82-2.84(m，2H)， 2.44-2.49(m，2H)，2.19(t，J＝6.4Hz，4H)，1.90-1.97(m，4H)， 1.63-1.72(m，8H)，1.40-1.65(m，4H)
检测从上述制备例1至制备例4中获得的化合物1至化合物8和 销售中的safe的吸收光谱(λabs)、发射光谱(λem)、摩尔吸 收系数(ε)及量子效率，并示出在下述表1。
表1
从上述制备例1制备例4获得的化合物1至化合物8呈现与 safe类似或优秀的摩尔吸收系数，尤其，可在量子效率方面确认到 非常优秀。
制备例5.化合物9至化合物20的合成
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺分别替换成1，6-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、1，10-二氨 基癸烷、1，12-二氨基十二烷、3，3-二氨基-N-甲基二丙胺来合成化合 物9至化合物13。
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺替换成由下述化学式表示的胺桥来合成化合物14。
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺替换成哌嗪、2，6-二氨基吡啶、对苯胺、1，4-二氨基萘来合 成化合物15至化合物18。
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺替换成由下述化学式表示的胺桥来合成化合物19。
在利用制备例1的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺替换成由下述化学式表示的胺桥来合成化合物20。
制备例6.化合物36的合成
(1)中间体1及中间体2的合成
向1L的1口反应器投入四氢呋喃，即，2-溴乙基-1，3-二氧戊环 (52.6g，0.290mol)、碘化钾(64.3g，0.387mol)、乙腈(320mL)， 并在50℃的温度下搅拌1小时。然后，向反应器中投入2-甲硫基苯并 恶唑(2-(methylthio)benzoxazole)(32.0g，0.193mol)，并在环流 的条件下搅拌20小时后，进行冷却，然后通过浓缩及柱纯化来获得中 间体1(30.2g，0.120mol，62％)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ7. 40-7.28(m，4H)，4.93(t，J＝4.4Hz，1H)，4.33(t，J＝6.8Hz，2H)， 4.10-3.90(m，2H)，3.84-3.78(m，2H)，2.22-2.00(m，2H)
然后，向50mL的1口反应器中投入中间体1(1.0g，3.979mmol)、 对甲苯磺酸甲酯(methyl tosylate，MeOTs)(0.9mL，5.968mmol)、 二甲基甲酰胺(2mL)，并在120℃的温度下搅拌1小时后，进行冷却， 然后向反应器中投入乙酸乙酯，并在常温下进行搅拌。然后，去除上 清液，并进行真空干燥来获得中间体2(0.9g，2.057mmol，52％)。1 H-NMR(300MHz，MeOD)δ7.95-7.89(m，2H)，7.73-7.66(m，4 H)，7.22(d，J＝7.8Hz，2H)，4.96(t，J＝3.6Hz，1H)，4.54(t，J ＝6.6Hz，2H)，3.93-3.77(m，4H)，3.19(s，3H)，2.44-2.35(m，5H)
(2)中间体3的合成
向50mL的1口反应器中投入4-甲基喹啉-5-醇(2g，0.0125mol)、 乙基6-碘己酸酯(10g，0.0375mol)、二甲基甲酰胺(4mL)，并在1 20℃的温度下搅拌12小时后，进行冷却，然后通过浓缩及柱纯化来获 得中间体3(3.6g，0.00828mol，67％)。1H-NMR(400MHz，DMSO- d6)δ9.19(d，J＝6.4Hz，1H)，7.952(t，J＝8.0Hz，1H)，7.73-7.77 (m，2H)，7.22(d，J＝7.6Hz，1H)，4.85(t，J＝6.8Hz，2H)，4. 01(q，J＝7.6Hz，2H)，3.09(s，3H)，2.35(t，J＝7.6Hz，2H)，1. 89-1.93(m，2H)，1.55-1.61(m，4H)，1.12(t，J＝6.8Hz，3H)
(3)中间体4的合成
向100mL的1口反应器中投入中间体2(1.87g，4.292mmol)、 中间体3(1.45g，4.292mmol)及二氯甲烷(20mL)，并在常温下搅 拌5分钟。然后，向反应器中投入三乙胺(triethyl amine，TEA)(0. 868g，8.584mmol))，在常温下搅拌12小时后，通过浓缩及柱纯化 来获得中间体4。
(4)中间体5合成
向500mL的1口反应器中投入中间体4(8.6g，0.0133mmol)、5 0％的硫酸水溶液(50mL)、氯仿(250mL)，并在常温下进行搅拌。 然后，向反应器中投入水(10mL)，并用二氯甲烷(2×50mL)进行 提取，对有机层进行浓缩及柱纯化来合成中间体5(0.37g，0.665mmo l，5％)。1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.35(d，J＝7.2Hz，1H)， 7.91(d，J＝8.0Hz，1H)，7.82(t，J＝8.0Hz，1H)，7.62-7.65(m，2 H)，7.54(d，J＝8.8Hz，1H)，7.42-7.44(m，1H)，7.36(d，J＝7.2Hz，1H)，7.11(d，J＝8.0Hz，1H)，5.21-5.25(m，1H)，4.70-4. 75(m，1H)，4.45-4.60(m，2H)，4.13-4.20(m，1H)，2.87-2.92 (m，1H)，2.52-2.56(m，1H)，2.33(t，J＝7.6Hz，2H)，1.94-2.02(m，2H)，1.66-1.73(m，2H)，1.46-1.52(m，2H)
(5)化合物36的合成
向250mL的1口反应器中投入中间体5(123mg，0.220mmol)、 TBTU(106mg，0.330mmol)、二甲基甲酰胺(2mL)，并在常温下搅 拌5分钟后，向反应器中投入三乙胺(92μl，0.660mmol)、2，2'-氧 基二乙胺(23μl，0.220mmol)，并在常温下搅拌12小时。然后，向乙酸乙酯(40mL)中投入反应液来析出固体。对所析出的固体进行过滤 及柱纯化来获得化合物36(30mg，0.0906mmol，11％)。1H-NMR(4 00MHz，MeOD)δ8.21(d，J＝7.2Hz，2H)，7.77-7.72(m，2H)， 7.66(d，J＝8.0Hz，2H)，7.60(t，J＝6.8Hz，2H)，7.49-7.44(m，6 H)，7.41-7.37(m，2H)，7.06-7.03(m，2H)，5.24-2.18(m，2H)， 4.54-4.49(m，2H)，4.44-4.37(m，4H)，4.14-4.07(m，2H)，3. 49-3.47(m，4H)，3.32(m，4H)，2.84-2.81(m，2H)，2.52-2.39 (m，2H)，2.23(t，J＝7.2Hz，4H)，1.94-1.91(m，4H)，1.70-1. 65(m，4H)，1.49-1.40(m，4H)
制备例7.化合物37至化合物39的合成
在利用制备例6的中间体5合成化合物1的例子中，将2，2'-氧 基二乙胺分别替换成1，2-双(2-氨基乙氧基)乙烷、1，11-二氨基-3， 6，9-三氧杂癸烷、4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺来合成化合物 37、化合物38及化合物39。
化合物37-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.20(d，J＝7.2，2H)，7.76-7.70(m，2H)，7.65(d，J＝8.0Hz，2H)，7.61-7.57(m，2H)， 7.48-7.42(m，6H)，7.39-7.35(m，2H)，7.04-7.01(m，2H)，5. 23-5.17(m，2H)，4.52-4.47(m，2H)，4.44-4.34(m，4H)，4.12 -4.06(m，2H)，3.57(s，4H)，3.51-3.48(m，4H)，3.36-3.30(m， 4H)，2.83-2.80(m，2H)，2.48-2.40(m，2H)，2.25-2.21(m，4 H)，1.93-1.89(m，4H)，1.68-1.64(m，4H)，1.46-1.39(m，4H)
化合物38-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.20(d，J＝7.2Hz，2H)， 7.77-7.72(m，2H)，7.66(d，J＝8.0Hz，2H)，7.62-7.59(m，2H)， 7.47-7.44(m，6H)，7.41-7.36(m，2H)，7.03(d，J＝8.0Hz，2H)， 5.25-5.19(m，2H)，4.52-4.48(m，2H)，4.44-4.39(m，4H)，4. 13-4.07(m，2H)，3.59-3.58(m，8H)，3.50-3.48(m，4H)，3.33 -3.30(m，4H)，2.84-2.81(m，2H)，2.49-2.40(m，2H)，2.21(t， J＝7.2Hz，4H)，1.94-1.89(m，4H)，1.69-1.65(m，4H)，1.44-1. 43(m，4H)
化合物39-1H-NMR(400MHz，MeOD)δ8.22-8.21(m，2H)， 7.78-7.72(m，2H)，7.67(d，J＝8.0Hz，2H)，7.63-7.60(m，2H)， 7.51-7.44(m，6H)，7.41-7.37(m，2H)，7.05-7.03(m，2H)，5. 26-4.20(m，2H)，4.53-4.49(m，2H)，4.47-4.37(m，4H)，4.15 -4.07(m，2H)，3.60-3.58(m，4H)，3.54-3.53(m，4H)，3.48-3. 45(m，4H)，3.23-3.20(m，4H)，2.85-2.82(m，2H)，2.50-2.42 (m，2H)，2.20(t，J＝7.2Hz，4H)，1.97-1.89(m，4H)，1.73-1. 68(m，8H)，1.46-1.40(m，4H)
检测从上述制备例6及制备例7获得的化合物36至化合物39和 销售中的safe的吸收光谱(λabs)、发射光谱(λem)、摩尔吸 收系数(ε)及量子效率，并示出在下述表2。
表2
从上述制备例6及制备例7获得的化合物36至化合物39呈现与 safe类似或优秀的摩尔吸收系数，尤其，可在量子效率方面确 认到非常优秀。
实验例
实验例1.核酸标记实验
为了比较根据制备例制备的化合物1至化合物8、化合物38和作 为销售中的染料的safe的核酸标记特性，而向1％的琼脂糖浆 料(40ml 1X TAE缓冲液+0.4g琼脂糖)中分别混合4μl来准备9个琼 脂糖浆料。
safe：
向1X TAE缓冲液以完全淹没的方式投入已准备的9个琼脂糖浆 料后，向5个孔分别加载10μl、5μl、2.5μl、1μl、0.5μl的脱氧核糖核 酸样品。电泳可在100V的电源进行30分钟。上述电泳结果示出在图 1及图2至图10。
图2至图10为分别示出化合物1至化合物8、化合物38的电泳 结果的图。
参照图1至图10，与safe相比，当将本发明多种实施例 的部花青类化合物作为染料使用时，可确认背景信号(background sig nal)是均匀的，并且由于整个带的亮度大于safe，因此可确 认提高了标记结果的解读性。
并且，在safe的情况下，即使照射0.5秒的紫外线，整 个带的亮度也昏暗，相反地，参照图6至图10，可知即使照射与 safe较短时间的紫外线，也可观察到更亮的带。
图11为示出作为普遍使用的染料的safe的吸收及发射光 谱结果的图，图12及图13为分别示出化合物3及化合物6的吸收及 发射光谱结果的图。
可确认到，随着safe、化合物3及化合物6均嵌入于脱 氧核糖核酸，使吸收波长移动(red shift)至长波长，并增加荧光强度， 但与safe的荧光强度相比，完成red shift的化合物3及化合 物6的荧光强度提高相当多。
检测化合物1至化合物8、化合物36至化合物39和销售中的SY safe的脱氧核糖核酸存在下检测出的吸收光谱(λabs)、发射光谱 (λem)及量子效率，并示出在下述表3。
表3
可确认到，在脱氧核糖核酸存在下，化合物1至化合物8、化合 物36至化合物39在与销售中的safe类似的波长领域产生荧 光信号，并且与safe相比，呈现相当优秀的量子效率。
实验例2.细胞渗透性实验
为了确认safe和本发明一实施例的化合物1、化合物4 及化合物6的细胞渗透性，而利用海拉细胞检测。
在准备CO2的湿润(humidified)的条件下，在包含10％的牛胎 儿血清(Fetalbovine serum：FBS)及1％的青霉素/链霉素(100单位 的青霉素(units penicillin)及100μg/mL的链霉素(streptomycin)， 英杰公司)的极限必需培养基(MEM)中以37℃的温度培养海拉细胞 (Hela Cell)。在以介质清洗3次海拉细胞后，将1μM的浓度的 safe和化合物6分别对海拉细胞进行处理，并以37℃的温度培养3 0分钟。与上述相同地，在用介质清洗3次后，通过显微镜观察图像， 并将其结果示出在图14至图17。
图14为示出作为普遍使用的染料的safe的细胞渗透性实 验结果的图像，图15为示出化合物1的细胞渗透性实验结果的图像， 图16为示出化合物4细胞渗透性实验结果的图像，图17为示出化合 物6的细胞渗透性实验结果的图像。
参照图14，safe呈现细胞渗透性。于此相反地，参照图1 5至图17可知，本发明多种实施例的化合物并不渗透细胞。
实验例3.细胞周期(cell cycle)分析实验
在对以5×105～1×106倾注于6-孔板的各孔的细胞以赋形剂(ve hicle)及肿瘤坏死因子-α(TNFα，tumor necrosis factor alpha)进 行处理后，以胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)进行回收，然后移到流 式细胞仪(FACS)检测管，并以1ml的磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲盐水 (PBS，phosphate-buffered saline)(4℃)进行清洗。然后向管内投 入300μl的磷酸盐缓冲盐水(4℃)使细胞漂浮。
对盛有漂浮的细胞的管进行vortex，并在逐滴加入700μl的100％ 的Et-OH后，在4℃的温度下反应1小时以上来实现细胞固定(cell fi xation)后，用磷酸盐缓冲盐水清洗Et-OH，然后向化合物6(2μM) 或10μl的碘化丙啶(PI，propidium iodide)(50mg/ml)和1μl的1m g/ml浓度的核糖核酸酶(RNase)中分别添加用1ml的磷酸盐缓冲盐水 悬浮的细胞，在暗室中反应30分钟，并利用流式细胞仪来进行分析。
即，利用FSC-A、SSC-A对核进行划分(gating)，以电压(volt age)调节FITC-A、FITC-Wplot来区分单重态(singlet)。区分成单重 如下，即，重新观看FITC-A柱状图(histogram)并调节电压来指定成 为2N、4N的脱氧核糖核酸的峰值(peak)，由此区分G0/G1、S及G 2/M基，将其结果示出在图18及图19。
图18为示出利用作为普遍使用的细胞循环分析染料的碘化丙啶 的细胞循环分析结果的图表，图19为示出利用化合物6的细胞循环分 析结果的图表。
参照图18和图19可知，与图18相比，图19的细胞循环分析结 果的各步骤之间的区分更明确，信号的可见度也有所提高。
实验例4.回复突变实验(Amestest)
以评价本发明一实施例的化合物6的遗传毒性为目的，进行利用 细菌菌株的回复突变实验(Amestest)。
在对鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium TA98菌株)处 理作为代谢活性酶的S9混合物的测试系统中观察根据化合物6、EtBr 及safe处理的试验菌株的繁育程度，上述鼠伤寒沙门氏杆菌 为作为试验菌株而冷冻保存的组氨酸(Histidine)要求性变异株。
从冷藏器(Deep freezer)提取保管中的试验菌株来接种于完成灭 菌的液体介质(2.5％的胰蛋白胨营养液体培养基(Oxoid Nutrient Br oth)No.2)，并在温控摇床(shaking incubator)(37℃，200rpm)中 培养10小时。基本培养基(Minimal GlucoseAgarplate)使用向陪替 氏培养皿(petridish)(90×15mm)分别倾注20ml的1.5％的细菌培养用琼脂(BactoagarDifco)和包含Vogel-Bonner medium E和2％的 葡萄糖(glucose)。顶层琼脂(top agar)由0.6％的琼脂和0.5％的N aCl制备，向鼠伤寒沙门氏杆菌菌株用顶层琼脂添加组氨酸生物素(hi stidine-biotin)，使得浓度为0.05mM。
向插入于以45℃预热的加热器(heating block)的灭菌管(12×7 5mm)中分别倾注2ml的高压灭菌的顶层琼脂后，分别投入0.1ml的化 合物6、EtBr、safe和0.1ml的S9混合物、试验菌株培养液， 并立即以涡旋混合器(vortex-mixer)震荡2～3秒后，倒入最小限量葡 糖琼脂板(minimal glucose agar plate)，并向多种方向倾斜后，进行 固化。若顶层琼脂完成固化，则颠翻板，并在37℃的温度下培养48小 时后，计算集落数。
化合物6、EtBr及safe的处理浓度(μg/plate)和每个板 中计算出的集落数如下。
表4
参照上述表4的结果可知，与被公知为用于表示现有遗传毒性的 EtBr的集落数相比，化合物6在S9代谢活性TA98菌株中的集落数并 未显著地增加。即，作为非遗传毒性染料，化合物6可充分代替EtBr。
表5
参照上述表5的结果，目前销售中的safe染料在进一步 低于化合物6的处理浓度(8μg/plate)的浓度(1.6μg/plate)下也计算 出高于化合物6的集落数。
考虑到通常进行电泳时的浆料的染色浓度为1μg/ml至3μg/ml(3 μg/plate至8μg/plate)，因此在上述浓度范围内，化合物6可呈现小于 safe的遗传毒性。
实验例5.实时定量聚合酶链反应实验
(1)实时定量聚合酶链反应在包含10μl的2X实时聚合酶链反应 混合物(Real-Time PCR Master Mix)(Cellsafe)、各种浓度的海拉 互补脱氧核糖核酸、1μl的10pmol正向引物，1μl的10pmol反向引物 及1μl的化合物38的20μl的反应溶液中进行。利用引物(GAPDH) 来扩增互补脱氧核糖核酸内的片段。反复进行40次的在95℃的温度下 进行5分钟的循环、在95℃的温度下进行10秒的循环、在60℃的温 度下进行20秒的循环及在72℃的温度下进行15秒的循环，并在72℃ 的步骤中检测荧光。实时定量聚合酶链反应结果如下述表6。
表6
其中，阈值循环数(Ct)通常是指荧光信号达到任一阈值的循环 数，例如，在实时定量聚合酶链反应扩增图表中是指荧光信号在开始 超过基准线的地点中的循环数。
当作为荧光染料而使用化合物38来进行实时定量聚合酶链反应 时，扩增效率为97.44％，因此即使在反应溶液中包含有化合物38，也 可确认并不降低实时定量聚合酶链反应的扩增效率。
并且，参照表6可知，即使使用1pg等的相当低的浓度的互补脱 氧核糖核酸样品，考虑到能够生成聚合酶链反应产物的方面，也可提 高针对实时定量聚合酶链反应的化合物38的敏感度。
(2)实时定量聚合酶链反应在包含10μl的TOPrealTM实时定量聚 合酶链反应2X预混合料(TOPrealTM qPCR 2X PreMIX)(TagMan 探针，Enzynomics公司产品)、各种浓度的海拉互补脱氧核糖核酸、1 μl的0.5μM正向引物、1μl的0.5μM反向引物及greenⅠ(0.45X)或化合物38(1X)的20μl的反应溶液中使用CFX96来进行。利 用0.5μM的正向引物5'-GTATGACAACAGCCTCAAGAT-3'、0.5μM的 反向引物5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'来扩增海拉互补脱氧 核糖核酸内的片段。反复进行40次的在95℃的温度下进行10分钟的 循环、在95℃的温度下进行10秒的循环、在60℃的温度下进行15秒 的循环及在72℃的温度下进行15秒的循环，并且在72℃的步骤下检 测荧光。总共反复进行3次的实时定量聚合酶链反应，实时定量聚合 酶链反应结果如图32、图33及下述表7所示。
表7
当作为荧光染料而使用化合物38来进行实时定量聚合酶链反应 时，可知，与greenⅠ相比，Ct值最大小0.5左右，RFU值 呈现约5倍以上。
(3)实时定量聚合酶链反应在包含10μl的2X实时聚合酶链反应 混合物(DQ372，BIOFACT公司产品)、2μl的HgDNA(25ng/μl)、 1μl的引物(HSP98)及各种浓度(稀释倍数)的荧光染料(化合物38、 greenⅠ(英杰公司产品)或EvaGreenTM(美国Biotium公司 产品))的20μl的反应溶液中使用ABI7500FAST来进行。反复进行4 0次的在95℃的温度下进行15分钟的循环、在95℃的温度下进行10 秒的循环、在60℃的温度下进行10秒的循环及在72℃的温度下进行3 0秒的循环，并在72℃的步骤中检测荧光。总共反复进行3次的实时 定量聚合酶链反应，实时定量聚合酶链反应结果如图34至图36及下 述表8。
表8
可知，与使用相同的稀释倍数的greenⅠ或EvaGreenTM的情况相比，作为荧光染料而使用化合物38来进行实时定量聚合酶链 反应时的Ct值更小。并且，可知，与使用相同的稀释倍数的 greenⅠ或EvaGreenTM的情况相比，荧光强度也高约2倍以上。
并且，通过表8的结果可知，也能够以不抑制实时定量聚合酶链 反应的方式使用具有大于greenⅠ的浓度的化合物38。
图20为示出作为荧光染料而使用化合物38的实时定量聚合酶链 反应的熔点曲线的图表，图21为示出作为荧光染料而使用gr eenⅠ的实时定量聚合酶链反应的熔点曲线的图表，图22为示出作为 荧光染料而使用EvaGreenTM的实时定量聚合酶链反应的熔点曲线的图 表。
参照图20至图22，在使用化合物38及EvaGreenTM的实时定量聚 合酶链反应的情况下，呈现单一的特异性峰值，在使用green Ⅰ的实时定量聚合酶链反应的情况下，呈现特别的引物-二聚物峰值。
(4)实时定量聚合酶链反应在包含10μl的2X实时聚合酶链反应 混合物(Cellsafe)、各种浓度(稀释倍数)的荧光染料(化合物36、 化合物38、化合物39、greenⅠ(英杰公司产品)或EvaGre enTM(美国Biotium公司产品))、4μl的海拉互补脱氧核糖核酸(0.5 ng/μl)及1μl的引物(GAPDH)组的20μl的反应溶液中使用CFX96 来进行。反复进行46次的在95℃温度下进行10分钟的循环、在95℃ 的温度下进行10秒的循环及在60℃的温度下进行1分钟的循环，在6 0℃的步骤中检测荧光。实时定量聚合酶链反应结果如图37至图42及 下述表9所示。
表9
可知，与使用相同的稀释倍数的EvaGreenTM的情况相比，在相对 高浓度(2X，1X)的荧光染料浓度中使用化合物38及化合物39的情 况的Ct值小，而且荧光强度也高。可知，与使用相同的稀释倍数的 greenⅠ或EvaGreenTM的情况相比，在相对低浓度(0.5X)的荧光染料浓度中使用化合物36的情况的Ct值也小，而且荧光强度也 高。
实验例6.热稳定性实验
为了确认聚合酶链反应时的荧光染料的稳定性，而准备分别包含 1μl的化合物38和1μl的EvaGreenTM(美国Biotium公司产品)的20 μl的聚合酶链反应缓冲液。将各个聚合酶链反应缓冲液加热至95℃， 并检测根据95℃中的放置时间而变换的吸光度。
参照记载于下述表10的吸光度检测结果可知，根据95℃中的放 置时间的吸光度偏差为化合物38小于EvaGreenTM。即，化合物38的 高温稳定性大于EvaGreenTM。
表10
实验例7.光衰(photobleaching)实验
在仅包含各种浓度(稀释倍数)的5μl的荧光染料(化合物38、 greenⅠ(英杰公司产品)或EvaGreenTM(美国Biotium公司 产品))的20μl的反应溶液中进行实时聚合酶链反应。反复进行60 次的在25℃的温度下进行30秒的循环及在25℃的温度下进行30秒的循环，在每个循环(1分钟)检测荧光强度来观察针对各种浓度(稀释 倍数)的荧光染料的光衰。
根据上述的方法检测的化合物38的光衰实验结果示出于图23至 图25、greenⅠ(英杰公司产品)的光衰实验结果示出于图2 6至图28以及EvaGreenTM(美国Biotium公司产品)的光衰实验结果 示出于图29至图31。
图26为示出以0.5X的稀释倍率使用greenⅠ时的检测 出的荧光强度的变化的图，图27为示出以0.25X的稀释倍率使用 greenⅠ时的检测出的荧光强度的变化的图，图28为示出以0.12 5X的稀释倍率使用greenⅠ时的检测出的荧光强度的变化的 图，可知，在greenⅠ的情况下，低浓度中的半衰期只不过为 5.5小时。
图23和图29为示出以0.5X的稀释倍率使用化合物38或EvaGre enTM时的检测出的荧光强度的变化的图，图24和图30为示出以0.5X 的稀释倍率使用化合物38或EvaGreenTM时的检测出的荧光强度的变化 的图，图25和图31为示出以0.25X的稀释倍率使用化合物38或Eva GreenTM时的检测出的荧光强度的变化的图，当使用化合物38时，与 相同浓度的EvaGreenTM类似或呈现高的水准的半衰期。
以上，对本发明一实施例进行了说明，本技术领域的普通技术 人员可在不脱离记载于权利保护范围的本发明的思想的范围内，通过 结构要素的附加、变更、删除或添加来对本发明进行多种修改及变更， 这些修改及变更也包含在本发明的权利范围内。

Claims (16)

1.一种部花青类化合物，其特征在于，具有由下述化学式1表示的结构：
化学式1：
在上述化学式1中，
Ar为取代或未取代的芳香族环，
Y1及Y2分别独立地选自硫、氧、硒、NR8及-CR8＝CR9-，
R1至R9分别独立地选自氢、氘、取代或未取代的C1-C10烷基、包含至少一种杂原子的取代或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C1-C10烷氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的C1-C10卤代烷基、卤素、氰基、羟基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的酰胺基、氨基甲酸酯、巯基、硝基、羧基、羧酸盐、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的芳烷基、季铵、磷酸、磷酸盐、膦酸酯、酮、醛、酯、酰氯、磺酸、磺酸盐、聚亚烷基氧化物以及-L-Z官能团，
当Ra为酮基或酯基时，R10选自取代或未取代的C1-C10烷基、包含至少一种杂原子的取代或未取代的C2-C10杂烷基、取代或未取代的C2-C10烯基、取代或未取代的C2-C10炔基、取代或未取代的C2-C10烷氧基、取代或未取代的C1-C10卤代烷基以及取代或未取代的C1-C10氨基烷基，在上述Ra中，a为选自1至9中的整数，
当Rb被取代时，上述官能团内的任意碳或末端碳能够被选自磺酸、磺酸盐、酮、醛、羧酸、羧酸盐、磷酸、磷酸盐、酰氯、聚亚烷基氧化物、季铵盐、酯以及酰胺中的至少一种取代，在上述Rb中，b为选自1至10中的整数，
m为1至3的整数，
L为包含3个至150个的非氢原子的连接子，
Z具有能够产生荧光信号的荧光团或由化学式1表示的结构，
由化学式1表示的结构具有一个或两个-L-Z官能团。
2.根据权利要求1所述的部花青类化合物，其特征在于，Z选自菲啶、香豆素、青色素、氟硼荧、荧光素、若丹明、芘、碳派若因、噁嗪、呫吨、噻吨以及吖啶。
3.根据权利要求1所述的部花青类化合物，其特征在于，
-L-Z官能团为由下述化学式2表示的部花青类化合物：
化学式2：-L1-[A1-(CH2)x1-]y1[A2-(CH2)x2-]y2[A3-(CH2)x3-]y3[A4-(CH2)x4-]y4[A5-(CH2)x5-]y5[A6-(CH2)x6-]y6[A7-(CH2)x7-]y7[A8-(CH2)x8-]y8[A9-(CH2)x9-]y9-A10-L2-Z
在上述化学式2中，
L1以及L2分别独立地为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基，
A1至A10分别独立地为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支型烷基或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元环或6元环，
x1至x9分别独立地为0或1至20的整数，
y1至y9分别独立地为0或1至20的整数，
Z选自菲啶、香豆素、青色素、氟硼荧、荧光素、若丹明、芘、碳派若因、噁嗪、呫吨、噻吨以及吖啶。
4.根据权利要求3所述的部花青类化合物，其特征在于，A1至A10中的一个为由下述化学式3表示的部花青类化合物：
化学式3：
在上述化学式3中，
R11为选择性地包含选自碳、氮中的至少一种杂原子或者选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基，
R12由下述化学式4表示：
化学式4：-[A11-(CH2)x11-]y11[A12-(CH2)x12-]y12[A13-(CH2)x13-]y13-A14-L3-Z
在上述化学式4中，
L3为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的C1-C12聚亚甲基单位或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的芳基，
A11至A14分别独立地为选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的链型烷基或分支型烷基或者选择性地包含选自氮、氧及硫中的至少一种杂原子的5元环或6元环，
x11至x13分别独立地为0或1至20的整数，
y11至y13分别独立地为0或1至20的整数。
5.一种生物分子标记用染料，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物。
6.根据权利要求5所述的生物分子标记用染料，其特征在于，上述部花青类化合物嵌入于作为生物分子的核酸的内部。
7.根据权利要求6所述的生物分子标记用染料，其特征在于，上述生物分子为选自单链核糖核酸、双链核糖核酸、单链脱氧核糖核酸以及双链脱氧核糖核酸中的至少一种核酸。
8.一种生物分子标记用试剂盒，其特征在于，包含：
权利要求5所述的生物分子标记用染料；或者
权利要求5所述的生物分子标记用染料以及缓冲液。
9.一种电泳试剂盒，其特征在于，
包含：
权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物；
缓冲液、凝胶基质、用于形成凝胶基质的至少一种物质、表面或用于形成表面的至少一种物质；以及
使用说明书，
当核酸存在于样品内时，上述电泳试剂盒用于确定固定于上述基质或上述表面的样品内核酸的存在与否。
10.一种确定样品内核酸的存在与否的方法，其特征在于，当核酸存在于样品内时，上述确定样品内核酸的存在与否的方法包括：
将核酸暴露于权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物来使上述部花青类化合物嵌入于核酸的内部，由此形成复合物的步骤；以及
确定上述部花青类化合物的荧光或其的不存在的步骤。
11.一种确定扩增的目标核酸的存在与否的方法，用于执行核酸扩增反应，上述确定扩增的目标核酸的存在与否的方法的特征在于，包括：
提供包含目标核酸、为了扩增上述目标核酸而所需的试剂以及权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物的反应混合物的步骤；
在适合形成完成扩增的的目标核酸的条件下，使上述反应混合物发生聚合反应的步骤；
用光对上述反应混合物进行照明的步骤；以及
对从上述反应混合物发射的荧光进行检测的步骤。
12.一种对样品内的核酸进行定量的方法，其特征在于，包括：
混合包含权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物的混合物和包含核酸的样品的步骤；
使上述部花青类化合物与上述样品内的核酸发生嵌入来形成复合物，并且为了产生荧光信号而对上述样品和上述混合物进行充分时间的培养的步骤；以及
通过对所感应的荧光信号和规定的核酸量的荧光标准特性进行比较来对样品内的核酸进行定量的步骤。
13.一种对样品内的细胞的存活率进行定量的方法，其特征在于，包括：
混合包含权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物的混合物和包含凋亡细胞的样品的步骤；
使上述部花青类化合物与上述样品内的凋亡细胞发生嵌入来形成复合物，并且为了产生荧光信号而对上述样品和上述混合物进行充分时间的培养的步骤；以及
通过对所感应的荧光信号和规定的凋亡细胞量的荧光标准特性进行比较来对样品内的凋亡细胞进行定量的步骤。
14.一种分析样品内的细胞的存活率的方法，其特征在于，包括：
混合与凋亡细胞发生嵌入的权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物、包含除了能够与细胞发生嵌入的上述部花青类化合物以外的化合物的水溶液以及包含细胞的样品的步骤；
用光对包含上述部花青类化合物以及与除了上述部花青类化合物以外的上述化合物发生嵌入的细胞的样品进行照明的步骤；以及
对从上述样品发射的荧光进行检测的步骤，
使上述部花青类化合物以及除上述部花青类化合物以外的上述化合物一同与样品内的细胞发生嵌入，并在细胞之间通过荧光反应来产生从上述样品发射的上述荧光，
所发射的上述荧光与仅通过上述部花青类化合物的荧光反应而产生的荧光不同。
15.一种分析样品内的细胞的存活率的试剂盒，其特征在于，
包含：
权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物；以及
使用说明书，
当凋亡细胞存在于样品内时，上述凋亡细胞与上述部花青类化合物发生嵌入来检测荧光。
16.一种造影剂组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一项所述的部花青类化合物。
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