KR102122951B1 - 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물 - Google Patents

메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102122951B1
KR102122951B1 KR1020180107244A KR20180107244A KR102122951B1 KR 102122951 B1 KR102122951 B1 KR 102122951B1 KR 1020180107244 A KR1020180107244 A KR 1020180107244A KR 20180107244 A KR20180107244 A KR 20180107244A KR 102122951 B1 KR102122951 B1 KR 102122951B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dsrna
merocyanine
formula
poly
detecting
Prior art date
Application number
KR1020180107244A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200028736A (ko
Inventor
김유식
카르바쉬라이사
알리아산어세프
강민정
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020180107244A priority Critical patent/KR102122951B1/ko
Priority to US16/968,992 priority patent/US20210024981A1/en
Priority to EP19858398.1A priority patent/EP3753922A4/en
Priority to PCT/KR2019/004776 priority patent/WO2020050470A1/ko
Publication of KR20200028736A publication Critical patent/KR20200028736A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102122951B1 publication Critical patent/KR102122951B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/10—Spiro-condensed systems
    • C07D491/107—Spiro-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Abstract

본 발명은 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 메로시아닌(merocyanine) 화합물은 dsRNA 염기쌍 사이에 인터칼레이션(intercalation)함에 따라 512 nm 파장 부근에서 담색 이동(hypochromic shift)의 스펙트럼 변화를 일으키고 이러한 스펙트럼 변화는 높은 정확도와 재현성을 나타내므로 본 발명의 메로시아닌 화합물은 dsRNA 검출 및 시료 간의 발현 수준 비교에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물{Composition for detecting dsRNA comprising merocyanine, salts thereof, or isomer thereof}
본 발명은 dsRNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
레트로 바이러스에서 처음 발견된 이중 가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)는 바이러스 복제의 부산물로 여겨져 왔다. 포유류 세포에서 발현된 dsRNA는 내재 면역 반응 단백질에 의해 인식되어 인터페론을 유도하고, 단백질 번역을 억제하며 세포사멸(apoptosis)을 유도한다. dsRNA가 면역 반응과 밀접한 관련이 있음에도 불구하고, 최근 인간 세포는 다양한 세포 환경에서 항바이러스성 기계(antiviral machinery)를 조절할 수 있는 dsRNA를 자연적으로 발현한다는 증거가 증가하고 있다. 내인성으로 암호화된 dsRNA의 축적은 자가면역 및 노화 관련 황반 변성의 발병과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (Wang, YM, Swiecki, M, McCartney, SA and Colonna, M (2011) dsRNA sensors and plasmacytoid dendritic cells in host defense and autoimmunity Immunol Rev, 243, 74-90). 또한 dsRNA는 화학요법 치료에 대한 세포 반응성에 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되었다. DNA를 디메틸화시키는 약물을 처리하는 경우 내인성 dsRNA의 전사가 활성화되고 이는 항바이러스성 기계를 활성화시켜 세포사멸에 이르게 된다 (Wang, YM, Swiecki, M, McCartney, SA and Colonna, M (2011) dsRNA sensors and plasmacytoid dendritic cells in host defense and autoimmunity Immunol Rev, 243, 74-90; Kaneko, H, Dridi, S, Tarallo, V, Gelfand, BD, Fowler, BJ, Cho, WG, Kleinman, ME, Ponicsan, SL, Hauswirth, WW, Chiodo, VA et al. (2011) DICER1 deficit induces Alu RNA toxicity in age-related macular degeneration Nature, 471, 325-+).
dsRNA에 의해 매개되는 항바이러스성 신호 전달의 흥미로운 점은 면역 반응 단백질이 특정 서열이 아닌 이차 구조 같은 RNA의 특정 구조를 인식한다는 것이다. 따라서 서열 특이성 없이 모든 dsRNA의 발현량을 측정할 필요성이 있다. 최근에는 금 나노입자의 스펙트럼 특성 및 비색계 방법을 이용하여 특정 RNA의 발현을 검출하고 정량화하는 방법이 이용되고 있다. 그러나 이러한 방법은 표적 RNA와 상보적인 RNA 프로브를 사용한 것이므로, 특정 RNA 전사체 검출만 가능하다는 한계가 있다.
한편, dsRNA의 구조는 양방향 나선 형태로 DNA의 구조와 유사한 부분이 있으나 B형 나선을 형성하는 DNA와 달리 보다 밀집된(tight) 구조의 A형 나선을 형성하므로(Dickerson, RE, Drew, HR, Conner, BN, Wing, RM, Fratini, AV and Kopka, ML (1982) The Anatomy of a-DNA, B-DNA, and Z-DNA Science, 216, 475-485), DNA를 검출하는 시약이 dsRNA의 검출에 적용될 수 있는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 dsRNA 검출용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 메로시아닌 화합물을 이용하여 dsRNA의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112018089258207-pat00001
(상기 화학식 1에 있어서, R은 -CH2CH2CH2(CH3)3N+ 이다).
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 dsRNA 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물 또는 하기 화학식 2로 표시되는 스피로피란 화합물에 UV를 조사하여 생성된 이성질체인 메로시아닌 화합물을 준비하는 단계; 2) 대조군 및 실험군 검체로부터 분리된 전체 각 RNA에 RNase를 처리하여 dsRNA를 분리하는 단계; 3) 상기 단계 1)의 메로시아닌 화합물 및 상기 단계 2)의 dsRNA를 반응시키는 단계; 4) 상기 단계 3)의 반응액으로부터 dsRNA의 양을 비교하는 단계;를 포함하는 dsRNA의 검출방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112018089258207-pat00002
[화학식 2]
Figure 112018089258207-pat00003
(상기 화학식 1 및 2에 있어서, R은 -CH2CH2CH2(CH3)3N+ 이다).
본 발명의 메로시아닌(merocyanine) 화합물은 dsRNA 염기쌍 사이에 인터칼레이션(intercalation)함에 따라 512 nm 파장 부근에서 담색 이동(hypochromic shift)의 스펙트럼 변화를 일으키고 이러한 스펙트럼 변화는 높은 정확도와 재현성을 나타내므로 본 발명의 메로시아닌 화합물은 dsRNA 검출 및 시료 간의 발현 수준 비교에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 빛 파장에 따라 가역적으로 전환되는 스피로피란(SP)과 스피로피란의 이성질체인 메로시아닌(MC); 및 메로시아닌과 dsRNA가 결합하여 생성되는 양성자화된 메로시아닌(MCH+)의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 스피로피란(SP) 용액에 poly AU(A) 및 poly GC(B)를 각각 첨가하기 전과 후의 흡광도를 측정한 결과이다.
도 3은 9 mM의 나트륨 이온이 포함된 pH 7의 완충액(A 및 B) 또는 나트륨이 없는 뉴클레아제 없는 pH 7의 물(C 및 D)에서 스피로피란(SP, 12 μM)을 메로시아닌(MC)으로 전환시킨 후, poly AU(A) 및 poly GC(B)를 첨가한 후의 흡광도를 측정한 결과이다:
A: poly AU 0, 175, 300, 420, 480, 620 μM;
B: poly GC 0, 90, 200, 300, 350, 650 μM;
C: poly AU 0, 90, 140, 220, 300, 350, 440 μM;
D: poly GC 0, 90, 150, 200, 350, 440 μM.
도 4는 메로시아닌 용액에 poly GC dsRNA를 첨가하였을 때 메로시아닌의 색 변화를 나타낸 결과이다: A: 대조군(물); B: dsRNA 첨가 실험군.
도 5는 메로시아닌 용액에 RNA 단일 염기 rCTP, rGTP, rUTP 및 rATP를 각각 첨가한 후의 흡광도를 측정한 결과이다: A: rCTP 및 rGTP; B: rUTP 및 rATP.
도 6은 메로시아닌 용액에 10-, 20-, 및 100-mer의 poly AU를 각각 첨가한 후의 흡광도를 측정한 결과이다.
도 7은 9 mM의 나트륨 이온이 포함된 pH 7의 완충액(A) 또는 나트륨이 없는 뉴클레아제 없는 pH 7의 물(B)에서 스피로피란(SP, 12 μM)을 메로시아닌(MC)으로 전환시킨 후, poly AU 및 poly GC를 첨가한 후의 512 nm에서의 흡광도 변화를 정량화한 결과이다:
A: poly AU 0, 175, 300, 420, 480, 620 μM; poly GC 0, 90, 200, 300, 350, 650 μM;
B: poly AU 0, 90, 140, 220, 300, 350, 440 μM; poly GC 0, 90, 150, 200, 350, 440 μM.
도 8은 스피로피란 용액에 poly AU 및 poly GC를 각각 첨가하고 UV 및 가시광선을 번갈아 조사하였을 때의 흡광도를 측정한 결과이다: 회색 영역: UV 조사; 흰색 영역: 가시광선 조사.
도 9는 HeLa 자궁 경부암 암세포로부터 분리한 전체 RNA에 RNase T1 및 RNase A를 각각 처리한 후의 전기영동 결과이다.
도 10은 HeLa 자궁 경부암 암세포로부터 분리한 전체 RNA에 RNase T1 및 RNase A 를 각각 처리한 후의 512 nm에서의 흡광도를 측정한 결과이다:
Control: 물;
RNase A: HeLa RNA + RNase A 처리;
RNase T1: HeLa RNA + RNase T1 처리;
No RNase: HeLa RNA(30분 상온 보관) + RNase 무처리;
HeLa RNA: HeLa RNA + RNase 무처리.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112018089258207-pat00004
(상기 화학식 1에 있어서, R은 -CH2CH2CH2(CH3)3N+ 이다).
상기 메로시아닌 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 스피로피란 화합물에 UV를 조사하여 생성된 이성질체일 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112018089258207-pat00005
(상기 화학식 1에 있어서, R은 -CH2CH2CH2(CH3)3N+ 이다).
상기 스피로피란 화합물은 자외선을 받게 되면, 내부의 탄소-산소 결합이 분해되고 입체 구조가 변화하여 상기 메로시아닌 화합물로 이성질화되며, 상기 스피로피란과 메로시아닌 사이의 이성질화 현상은 가역적이므로 상기 메로시아닌 화합물에 가시광선을 조사하게 되면 다시 상기 스피로피란 화합물로 이성질화될 수 있다.
상기 메로시아닌 화합물은 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션(intercalation)될 수 있다. 상기 메로시아닌 화합물은 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션됨에 따라, 상기 메로시아닌 화합물은 양성자화(protonation)되고 자외선-가시광선 흡광도 스펙트럼에 변화를 일으킬 수 있다. 구체적으로, 상기 메로시아닌 화합물이 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션됨에 따라, 512 nm 파장에서 담색 이동(hypochromic shift)의 스펙트럼 변화가 나타날 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 dsRNA 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광 분석장치를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 단일 가닥 RNA 분해 효소, 용매(완충액 등) 및 기타 시약 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 용매는 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 또는 카코디레이트(cacodylate) 완충액일 수 있다. 또한 상기 용매는 이온을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 구체적으로, 상기 용매는 이온을 포함하지 않을 수 있다.
상기 단일 가닥 RNA 분해 효소는 RNase T1 또는 RNase I일 수 있고, 구체적으로 RNase T1일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 합성한 스피로피란에 UV를 조사하여 스피로피란의 이성질체인 메로시아닌을 생성시킨 결과, 스피로피란은 dsRNA와 결합하지 못하여 자외선-가시광선 흡광도 스펙트럼에 변화가 관찰되지 않는 반면, 메로시아닌은 dsRNA에 인터칼레이션하여 메로시아닌의 흡광도 스펙트럼이 변함을 확인하였다 (도 1 내지 도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 메로시아닌은 poly AU 보다 poly GC와 상호작용이 더 강하고, 이온이 있는 용액보다 이온이 없는 용액에서 dsRNA과 상호작용이 더 강하게 나타남을 확인하였다 (도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 poly GC의 dsRNA는 메로시아닌과 인터칼레이션함에 따라 빨간색의 메로시아닌을 무색으로 변화시킴을 확인하였다 (도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 메로시아닌은 단일 염기의 핵산과는 결합하지 않으며, 최소 20 bp 이상의 dsRNA를 검출하는 데 효과적임을 확인하였다 (도 5 및 도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 dsRNA 농도가 높을수록 메로시아닌의 흡광도 변화율이 증가함을 확인하여, 메로시아닌의 흡광도 변화를 수치화하여 시료 간의 dsRNA의 양을 비교할 수 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 메로시아닌은 합성 dsRNA 뿐만 아니라 실제 세포에서 분리한 dsRNA와도 인터칼레이션함을 확인하였다 (도 10 참조).
따라서, 본 발명의 메로시아닌 화합물은 dsRNA 염기쌍 사이에 인터칼레이션(intercalation)함에 따라 512 nm 파장 부근에서 담색 이동(hypochromic shift)의 스펙트럼 변화를 일으키고, 메로시아닌 흡광도 스펙트럼의 변화를 수치화하여 시료 간의 dsRNA의 양을 비교할 수 있으며, 이러한 흡광도 스펙트럼의 변화는 높은 정확도와 재현성을 나타내므로, 본 발명의 메로시아닌 화합물은 dsRNA 검출 및 시료 간의 발현 수준 비교에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물 또는 하기 화학식 2로 표시되는 스피로피란 화합물에 UV를 조사하여 생성된 이성질체인 메로시아닌 화합물을 준비하는 단계;
2) 대조군 및 실험군 검체로부터 분리된 전체 각 RNA에 RNase를 처리하여 dsRNA를 분리하는 단계;
3) 상기 단계 1)의 메로시아닌 화합물 및 상기 단계 2)의 dsRNA를 반응시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 반응액으로부터 dsRNA의 양을 비교하는 단계;를 포함하는 dsRNA의 검출방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112018089258207-pat00006
[화학식 2]
Figure 112018089258207-pat00007
(상기 화학식 1 및 2에 있어서, R은 -CH2CH2CH2(CH3)3N+ 이다).
상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 RNase는 RNase T1일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 단일 가닥 RNA를 분해할 수 있는 효소는 제한없이 사용될 수 있다. 상기 RNase T1은 단일 가닥의 RNA(ssRNA) 및 헤어핀 루프(hairpin loop)를 분해할 수 있다.
상기 단계 3)의 반응은 이온을 포함하거나 포함하지 않는 용액에서 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 단계 3)의 반응은 이온을 포함하지 않는 용액에서 수행될 수 있으며, 상기 메로시아닌 화합물은 양전하를 나타내므로 용액 내 이온은 메로시아닌 화합물과 dsRNA와의 인터칼레이션을 방해할 수 있다.
상기 단계 4)의 dsRNA의 양은 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광 분석법으로 측정될 수 있으며, 구체적으로 상기 단계 4)의 dsRNA의 양은 512 nm 파장에서의 흡광도 변화로 측정될 수 있다. 상기 메로시아닌 화합물은 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션됨에 따라, 상기 메로시아닌은 양성자화(protonation)되고 자외선-가시광선 흡광도 스펙트럼에 변화를 일으킬 수 있다. 구체적으로, 메로시아닌 화합물이 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션됨에 따라, 512 nm 파장에서 담색 이동(hypochromic shift)의 스펙트럼 변화가 나타날 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 스피로피란(spiropyran, SP)의 제조
단계 1: 1 -(3- 이도프로필 )-2,3,3- 트리메틸인돌리늄 아이오다이드 (1-(3-iodopropyl)-2,3,3-trimethylindolinium iodide) (I1) 의 제조
Figure 112018089258207-pat00008
무수 아세토니트릴(acetonitrile) 2 mL에 2,3,3-트리메틸인돌레닌(2,3,3-trimethylindolenine) 1 g (0.0062 mol)과 1,3-디아이오도프로판(1,3-diiodopropane) 6.5 g (0.0219 mol)을 용해시킨 후, 상기 용액을 48시간 동안 환류시켰다. 이를 실온에서 냉각시키고 침전물을 여과한 후, MeCN과 CHCl3로 세척하고 건조하여 옅은 회황색의 고체 1.5 g를 수득하였다 (수득율: 56%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.01-7.97 (1H, m), 7.88-7.83 (1H, m), 7.68-7.61 (2H, m), 4.52-4.47 (2H, t), 3.46-3.41 (2H, t), 2.87 (3H, s), 2.46-2.36 (2H, m), 1.56 (6H, s).
단계 2: 1 -(3- 이도프로필 )-3,3-디메틸-2- 메틸렌인돌린 (1-(3- Iodopropyl )-3,3-dimethyl-2-methyleneindoline) (I2) 의 제조
Figure 112018089258207-pat00009
질소 하에서, 상기 단계 1에서 제조한 1-(3-이도프로필)-2,3,3-트리메틸인돌리늄 아이오다이드 0.5 g (0.001 mol)을 탈기된 물 120 mL에 현탁시키고, 미세하게 분쇄된 NaOH 1.2 g (0.03 mol)을 첨가하였다. 상기 반응액을 80℃에서 15분 동안 가열한 다음 실온에서 냉각시킨 후, 에틸 에테르(ethyl ether) 130 mL를 첨가하였다. 상기 혼합물을 1시간 더 교반하고, 수용액 층을 분리하고 에틸 에테르 40 mL 및 디클로로메탄(dichloromethane) 40 mL로 세척하였다. 유기층을 혼합하고, 물로 세척한 다음 MgSO4로 건조하고 진공에서 농축하여 분홍색 고체 0.30 g을 수득하였다 (수득율 85%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.09-7.04 (2H, t), 6.72-6.67 (1H, t), 6.47-6.44 (1H, d), 3.48-3.44 (2H, m), 2.22-2.15 (2H, m), 1.98-1.90 (2H, m), 1.37-1.33 (2H, d), 1.31 (6H, s).
단계 3: 1 '-(3''- 이도프로필 )-3',3'-디메틸-6- 니트로스피로 [(2H)-1- 벤조피란 -2,2'-인돌린] (1'-(3''- Iodopropyl )-3',3'- dimethyl -6- nitrospiro [(2H)-1-benzopyran-2,2'-indoline]) (I3) 의 제조
Figure 112018089258207-pat00010
상기 단계 2에서 제조한 1-(3-이도프로필)-3,3-디메틸-2-메틸렌인돌린을 무수 에탄올 10 mL에 용해하고 5-니트로살리실알데히드(5-nitrosalicylaldehyde) 0.16 g (0.0009 mol)을 첨가하였다. 상기 반응액을 질소 하에서 16시간 동안 환류시켰다. 용매는 진공 하에서 제거하고 잔류물을 1:4의 헥산/디클로로메탄 용리액으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제하였다. 에탄올/클로로포름으로부터 재결정화시킨 후, 노란 고체 0.25 g을 수득하였다 (수득율 58%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.02-7.99 (2H, m), 7.21-7.17 (1H, t), 7.11-7.08 (1H, d), 6.96-6.93 (1H, d), 6.91-6.87 (1H, t), 6.75-6.72 (1H, d), 6.65-6.63 (1H, d), 5.89-5.86 (1H, d), 3.35-3.11 (4H, m), 2.28-2.17 (1H, m), 2.11-2.01 (1H, m), 1.28 (3H, s), 1.18 (3H, s).
단계 4: 1 '-(3''- 트리메틸암모니오프로필 )-3',3'-디메틸-6- 니트로스피로 [(2H)-1-벤조피란-2,2'-인돌린] 아이오다이드 (1'-(3''-Trimethylammoniopropyl)-3',3'-dimethyl-6-nitrospiro[(2H)-1-benzopyran-2,2'-indoline] iodide) (I4) 의 제조
Figure 112018089258207-pat00011
상기 단계 3에서 제조한 1'-(3''-이도프로필)-3',3'-디메틸-6-니트로스피로[(2H)-1-벤조피란-2,2'-인돌린] 0.25 g (0.0005 mol)이 담긴 플라스크를 고무 격벽(septum)으로 메우고, 에탄올에 용해된 35% 트리에틸아민 용액을 주사기로 플라스크에 첨가하였다. 반응액을 어두운 곳에서 48시간 동안 실온에서 교반하였다. 에탄올 및 과량의 트리에틸아민을 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 컬럼을 이용하여 정제하고 에틸 에테르에 생성물을 현탁시킨 후 여과하고 건조하여 0.09 g의 스피로피란인 1'-(3''-트리메틸암모니오프로필)-3',3'-디메틸-6-니트로스피로[(2H)-1-벤조피란-2,2'-인돌린] 아이오다이드를 수득하였다 (수득률 35%).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (1H, s), 8.05-8.01 (1H, d), 7.27-7.24 (1H, d), 7.20-7.14 (2H, m), 6.94-6.91 (1H, d), 6.87-6.83 (1H, t), 6.76-6.73 (1H, d), 6.12-6.08 (1H, d), 3.33-3.30 (2H, m), 3.23-3.18 (2H, m), 3.03 (9H, s), 2.08-1.92 (2H, m), 1.23 (3H, s), 1.15 (3H, s).
< 실시예 2> 메로시아닌(merocyanine, MC)의 제조
상기 실시예 1에서 제조한 스피로피란인 1'-(3''-트리메틸암모니오프로필)-3',3'-디메틸-6-니트로스피로[(2H)-1-벤조피란-2,2'-인돌린] 아이오다이드에 254 nm 파장의 UV를 조사하여 스피로피란의 이성질체인 메로시아닌으로 전환하였다 (도 1). 메로시아닌은 가시광선 조사에 의해 다시 스피로피란으로 전환된다.
< 실험예 1> 스피로피란 ( SP ) 또는 메로시아닌(MC)과 dsRNA의 결합
UV-Vis 분광기를 이용하여 스피로피란(SP) 또는 메로시아닌(MC)과 dsRNA와의 상호작용을 확인하고자 하였다.
<1-1> SP과 dsRNA의 결합
실시예 1에서 제조한 스피로피란을 12 μM 농도의 스피로피란 용액으로 준비하고, dsRNA는 20 bp의 poly GC 및 poly AU 각각을 (주)바이오니어에 주문하여 준비하였다. 상기 스피로피란 용액에 200 μM의 poly GC 및 poly AU를 각각 첨가한 후, UV-Vis 분광기를 이용하여 스펙트럼 결과를 얻었다.
그 결과, poly AU 및 poly GC dsRNA를 각각 첨가한 SP 용액에서 흡광도 스펙트럼의 변화가 관찰되지 않아, SP는 dsRNA와 결합하지 않음을 확인하였다 (도 2).
<1-2> MC와 dsRNA의 결합
실시예 1에서 제조한 스피로피란을 12 μM 농도의 스피로피란 용액으로 준비하고, dsRNA는 20 bp의 poly GC 및 poly AU을 (주)바이오니어에 주문하여 준비하였다. 상기 스피로피란 용액에 254 nm의 UV를 5분 동안 조사한 후, poly GC 및 poly AU를 각각 첨가하였다. 이를 UV-Vis 분광기를 이용하여 스펙트럼 결과를 얻었다.
UV에 노출된 SP는 SP의 열린 형태인 이성질체 메로시아닌(MC)으로 전환된다 (도 1). poly AU 및 poly GC dsRNA를 각각 첨가한 MC 용액에서 흡광도 스펙트럼의 현저한 변화가 관찰되었다 (도 3의 A 및 B). 512 nm 파장에서 담색 이동(hypochromic shift)과 적색 이동(red shift)이 관찰되었고, 432 nm 파장에서 작지만 일정한 흡광도가 증가한 것으로 나타났다. 이는 MC가 dsRNA의 염기쌍 사이에 인터칼레이션(intercalation)하여 양성자화된 MC(protonated MC, MCH+)로 전환됨을 설명한다. 또한, poly AU보다 poly GC를 첨가한 경우, 담색 이동 및 적색 이동과 같은 스펙트럼의 변화가 더 두드러지는 것으로 나타나 MC는 poly GC가 풍부한 RNA에 대한 결합력이 높음을 알 수 있다.
< 실험예 2> 이온 농도별 MC- dsRNA의 결합
용액의 이온 농도가 MC와 dsRNA의 상호작용에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
pH 7의 9 mM 나트륨 이온(Na+) 완충액 또는 pH 7의 나트륨 이온이 없는 뉴클레아제 없는 물에서 실험예 1-2와 동일한 방법으로 12 μM 농도의 SP를 MC로 전환시키고, poly AU 및 poly GC를 하기의 농도로 첨가한 후 흡광도를 측정하였다 (A: poly AU 0, 175, 300, 420, 480, 620 μM; B: poly GC 0, 90, 200, 300, 350, 650 μM; C: poly AU 0, 90, 140, 220, 300, 350, 440 μM; D: poly GC 0, 90, 150, 200, 350, 440 μM).
그 결과, 나트륨 이온 완충액(A 및 B)보다 나트륨 이온이 없는 물(C 및 D)에서 흡광도 스펙트럼의 변화가 더 크게 나타났다. 이는 나트륨 이온이 양전하를 띠는 MC와 dsRNA와의 정전기적 상호작용을 방해할 수 있음을 나타낸다 (도 3의 A 내지 D).
< 실험예 3> MC- poly GC dsRNA 결합에 따른 색 변화
MC와 poly GC dsRNA의 상호작용이 강하게 나타나 스펙트럼 변화가 두드러짐을 확인하고, MC와 poly GC dsRNA의 결합에 따른 MC 용액의 색 변화를 관찰하였다.
실험예 1-2에서 준비한 MC 용액 (50 ㎕)에 poly GC dsRNA 20 ㎕ 또는 물 20 ㎕를 첨가한 후, MC 용액의 색 변화를 관찰하였다.
그 결과, poly GC dsRNA를 첨가함으로써 MC 용액의 색은 적색에서 무색으로 변화하였으나(도 4의 B), 대조군(물 물 20 ㎕)에서는 색이 변하지 않았다. 상기 결과는 MC 용액의 색 변화를 육안으로 관찰함으로써 dsRNA를 검출할 수 있음을 나타낸다 (도 4).
< 실험예 4> MC와 단일 염기의 결합
MC와 단일 염기와의 상호작용을 확인하기 위해, 실험예 1-2에서 dsRNA를 사용한 것 대신 4종류의 RNA 단일 염기 rCTP, rGTP, rUTP 및 rATP 각각을 사용한 것을 제외하고는 실험예 1-2와 동일한 방법으로 스펙트럼 결과를 얻었다. 대조군으로 RNA 대신 물을 이용하였다.
그 결과, 단일 염기 RNA 핵산을 각각 첨가한 MC 용액에서 흡광도 스펙트럼의 변화가 없어, 단일 염기인 RNA 핵산과 MC는 결합하지 않음을 확인하였다 (도 5).
< 실험예 5> dsRNA의 길이별 MC- dsRNA의 결합
dsRNA의 길이가 MC-dsRNA의 상호작용에 영향을 미치는지 확인하기 위해, 실험예 1-2에서 20-mer의 poly AU 및 poly GC dsRNA를 사용한 것 대신 10, 20, 100-mer의 poly AU dsRNA 각각을 사용하고 염기 1쌍 당 350 μM의 농도로 처리한 것을 제외하고는 실험예 1-2와 동일한 방법으로 스펙트럼 결과를 얻었다. 대조군으로 RNA 대신 물을 이용하였다.
그 결과, 20-mer 및 10-mer의 dsRNA를 각각 첨가한 MC 용액에서는 거의 동일한 흡광도 스펙트럼의 패턴을 보였으며 반면에 10-mer의 dsRNA를 첨가한 경우, 흡광도 스펙트럼의 변화가 약하게 나타나, MC는 20 bp 이상의 dsRNA를 검출하는 데 효과적임을 확인하였다 (도 6).
< 실험예 6> dsRNA의 농도별 MC- dsRNA 결합
dsRNA에 의해 유도되는 UV-Vis 스펙트럼 변화를 비교 및 정량화하기 위해, dsRNA 농도에 따라 512 nm에서 관찰되는 흡광도 변화율을 계산하였다.
구체적으로, 실험예 1-2 및 실험예 2에서 200 μM의 dsRNA를 사용한 것 대신 하기 농도의 dsRNA를 사용한 것을 제외하고는 실험예 1-2 및 실험예 2와 동일한 방법으로 나트륨 이온 완충액과 나트륨 이온이 없는 뉴클레아제 없는 물 각각에서 반응하여 스펙트럼 결과를 얻었다 (A: poly AU 0, 175, 300, 420, 480, 620 μM; poly GC 0, 90, 200, 300, 350, 650 μM; B: poly AU 0, 90, 140, 220, 300, 350, 440 μM; poly GC 0, 90, 150, 200, 350, 440 μM.).
dsRNA의 농도가 높을수록 MC 흡광도 변화율이 증가하였으며, RNA의 농도가 고농도인 범위에서는 흡광도 변화율이 포화되는 것으로 나타났다 (도 7). 앞서 확인한 결과와 같이, poly AU dsRNA보다 poly GC ds RNA의 흡광도 변화율이 더 큰 것으로 나타났고, 나트륨 이온 완충액(도 7A)보다 나트륨 이온이 없는 뉴클레아제 없는 물(도 7B)에서의 흡광도 변화율이 더 큰 것으로 나타났다. 또한, MC-dsRNA의 결합은 스펙트럼에 매우 일정한 변화를 일으키므로, MC의 흡광도의 변화를 수치화하여 시료 간의 dsRNA의 양을 비교할 수 있다.
< 실험예 7> SP와 MC의 가역성에 미치는 dsRNA의 영향
이성질체 관계인 SP와 MC는 UV 또는 가시광선을 조사함에 따라 가역적으로 전환될 수 있다. dsRNA가 SP-MC의 가역성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 나트륨 이온 완충액에 SP 및 200 μM의 poly AU 및 poly GC를 각각 넣고, 상기 혼합물에 1분 간격으로 UV 및 420 nm의 녹색광을 5회 사이클로 교대로 조사하여 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 RNA 대신 물을 이용하였다.
그 결과, dsRNA 존재 여부와 별개로 SP-MC 간의 가역성은 지속적으로 유지됨을 확인하였다(도 8).
< 실험예 8> 세포로부터 분리된 dsRNA와 MC의 결합
세포로부터 분리된 dsRNA와 MC가 결합하는지 확인하고자 하였다. 먼저, 세포 내에 존재하는 RNA 중 약 90%를 차지하는 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA)는 헤어핀 구조를 이루는 지역이 있어 MC와 약하게 결합할 가능성이 있다. 따라서 단일 가닥의 RNA(ssRNA) 및 헤어핀 루프를 제거하기 위하여 RNase를 처리한 후, 세포로부터 분리된 dsRNA와 MC의 상호작용을 확인하였다. 대조군으로 RNA 대신 물을 이용하였다.
구체적으로, HeLa 자궁 경부암 세포에서 전체 RNA를 분리하였으며(TRIsure(Bioline)), 분리한 전체 RNA에 다른 기질 특이성을 가지는 RNase T1 및 RNase A를 각각 첨가하고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 각 RNase를 처리한 반응액을 전기영동 하여 분해된 RNA를 확인한 후, 실험예 1-2와 동일한 방법으로 스펙트럼 결과를 얻었다.
그 결과, RNase T1은 ssRNA와 헤어핀 루프를 분해하는 RNase로, rRNA의 대부분을 분해하고 단편화하여 긴 dsRNA 만을 남겼으며, RNase A는 모든 유형의 RNA를 분해하였다 (도 9). 이는 합성 dsRNA 뿐만 아니라 실제 세포로부터 분리한 RNA에서도 동일한 결과를 나타냈다. HeLa 자궁 경부암 세포에서 분리한 전체 RNA에 RNase A를 처리한 경우, 512 nm 에서의 흡광도는 대조군과 거의 유사하게 나타났고, RNase T1을 처리하여 세포의 전체 RNA로부터 dsRNA를 분리한 경우, 512 nm 에서의 흡광도 감소가 일어났다 (도 10). 상기 결과로부터 MC는 합성 dsRNA(poly AU 및 poly GC) 뿐만 아니라 실제 세포로부터 분리한 dsRNA와 인터칼레이션을 형성하여 흡광도 스펙트럼에 변화를 일으킴을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112019120777974-pat00012

    (상기 화학식 1에 있어서, R은 -CH2CH2CH2N+(CH3)3 이다).
  2. 제1항에 있어서, 상기 메로시아닌 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 스피로피란 화합물에 UV를 조사하여 생성된 이성질체인, dsRNA 검출용 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112019120777974-pat00013

    (상기 화학식 1에 있어서, R은 -CH2CH2CH2N+(CH3)3 이다).
  3. 제1항에 있어서, 상기 메로시아닌 화합물은 dsRNA 염기 사이에 인터칼레이션(intercalation)되는, dsRNA 검출용 조성물.
  4. 제1항의 조성물을 포함하는 dsRNA 검출용 키트.
  5. 1) 하기 화학식 1로 표시되는 메로시아닌 화합물 또는 하기 화학식 2로 표시되는 스피로피란 화합물에 UV를 조사하여 생성된 이성질체인 메로시아닌 화합물을 준비하는 단계;
    2) 대조군 및 실험군 검체로부터 분리된 전체 각 RNA에 RNase를 처리하여 dsRNA를 분리하는 단계;
    3) 상기 단계 1)의 메로시아닌 화합물 및 상기 단계 2)의 dsRNA를 반응시키는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 반응액으로부터 dsRNA의 양을 비교하는 단계;를 포함하는 dsRNA의 검출방법:
    [화학식 1]
    Figure 112019120777974-pat00014

    [화학식 2]
    Figure 112019120777974-pat00015

    (상기 화학식 1 및 2에 있어서, R은 -CH2CH2CH2N+(CH3)3 이다).
  6. 제5항에 있어서,
    상기 단계 2)의 RNase는 RNase T1인, dsRNA의 검출 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 단계 3)의 반응은 이온이 없는 용액에서 수행되는, dsRNA의 검출 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 단계 4)의 dsRNA의 양은 자외선-가시광선(UV-Vis) 분광 분석법으로 측정되는 것인, dsRNA의 검출 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 단계 4)의 dsRNA의 양은 512 nm 파장에서의 흡광도 변화로 측정되는 것인, dsRNA의 검출 방법.
KR1020180107244A 2018-09-07 2018-09-07 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물 KR102122951B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180107244A KR102122951B1 (ko) 2018-09-07 2018-09-07 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물
US16/968,992 US20210024981A1 (en) 2018-09-07 2019-04-19 Composition for detecting dsrnas, comprising merocyanine compound and isomer thereof, and method for providing information for diagnosing cancer, by using dsrna expression analysis
EP19858398.1A EP3753922A4 (en) 2018-09-07 2019-04-19 COMPOSITION FOR DETECTION OF BICATENARY RNA, CONSISTING OF A MEROCYANINE COMPOUND AND AN ISOMER OF THE SAME, AND METHOD OF PROVIDING INFORMATION FOR DIAGNOSING CANCER, USING BICATENARY RNA EXPRESSION ANALYSIS
PCT/KR2019/004776 WO2020050470A1 (ko) 2018-09-07 2019-04-19 메로시아닌 화합물, 이의 이성질체를 포함하는 dsrna 검출용 조성물 및 dsrna 발현 분석을 이용한 암 진단을 위한 정보 제공 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180107244A KR102122951B1 (ko) 2018-09-07 2018-09-07 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200028736A KR20200028736A (ko) 2020-03-17
KR102122951B1 true KR102122951B1 (ko) 2020-06-15

Family

ID=70004035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180107244A KR102122951B1 (ko) 2018-09-07 2018-09-07 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102122951B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070195309A1 (en) 2004-11-18 2007-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Photochromic probes
EP3235909A1 (en) * 2016-04-20 2017-10-25 SFC Co., Ltd. Merocyanine-based compounds, and dyes, kits and contrast medium compositions for labelling biomolecules comprising the same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090280060A1 (en) * 2004-11-18 2009-11-12 Marriott Gerard J D Photochromic probes
KR101880502B1 (ko) * 2016-04-20 2018-08-20 에스에프씨 주식회사 메로시아닌계 화합물, 이를 포함하는 생체분자 표지용 염료, 키트 및 조영제 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070195309A1 (en) 2004-11-18 2007-08-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Photochromic probes
EP3235909A1 (en) * 2016-04-20 2017-10-25 SFC Co., Ltd. Merocyanine-based compounds, and dyes, kits and contrast medium compositions for labelling biomolecules comprising the same

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200028736A (ko) 2020-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106753341B (zh) 一种近红外碱性磷酸酶荧光探针的制备方法和应用
US7524876B2 (en) Luciferin derivatives
EP3636653A1 (en) Asymmetrical si rhodamine and rhodol synthesis
WO2012111818A1 (ja) 蛍光プローブ
Lu et al. A two-separated-emission fluorescent probe for simultaneous discrimination of Cys/Hcy and GSH upon excitation of two different wavelengths
JP4373608B2 (ja) 一重項酸素測定用試薬
CN111518089B (zh) 一种检测pH的比率型荧光探针及其制备方法和应用
EP1314730B1 (en) Reagent for determining singlet oxygen
CN109928940B (zh) 基于碱性蓝-3的检测次氯酸的近红外荧光探针分子的制备
US6642375B2 (en) Fluorescent substances
KR102122951B1 (ko) 메로시아닌 화합물, 이의 염 또는 이의 이성질체를 포함하는 dsRNA 검출용 조성물
CN109206351A (zh) 一种基于花菁结构测钯离子的近红外荧光探针、其制备方法及应用
EP2999704B1 (en) Spiro[chroman-2,2&#39;-indole]derivatives as cyanide ion chemosensors
US20210024981A1 (en) Composition for detecting dsrnas, comprising merocyanine compound and isomer thereof, and method for providing information for diagnosing cancer, by using dsrna expression analysis
KR101946737B1 (ko) 2개의 2급 아민을 갖는 2,2&#39;-디아미노 비아릴 및 전기화학적 커플링에 의한 그의 제조
CN104845614B (zh) 一种dna标记用荧光探针及其合成方法和用途
CN113308131B (zh) 一种羧基修饰的近红外方酸染料及其制备方法与应用
JP6360345B2 (ja) キサンテン化合物及びその用途
US20160333029A1 (en) Trifluoroborate mass spectrometric tags
JP2004101389A (ja) アルミニウムイオン及び／又は第二鉄イオン測定用プローブ
Mohamed et al. A novel fluorescent probe with a pyrazolo [4, 3-c] quinoline core selectively recognizes c-MYC promoter G-quadruplexes
CN115475253B (zh) 拉帕替尼-癌细胞干性抑制剂偶联物、制法、药物组合物和应用
CN111269967B (zh) 含丁二酰胺结构的双脱氧核苷亚磷酰胺单体在错配碱基识别中的应用
JP2016135748A (ja) トリアゾール連結型オリゴリボヌクレオチドを含むオリゴリボヌクレオチド類縁体を用いるポリペプチドの製造方法
CN113429372A (zh) 一种新型3c样蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant