CN107287332A - 利用smrt测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法，该方法是以16sRNA基因为标记基因，基于SMRT测序技术对16sRNA基因进行分型，从而实现对液体酵素中微生物在种水平的鉴定和丰度分析；具体步骤包括：液体酵素DNA的提取，PCR扩增，构建2K文库，生物信息学分析，菌种鉴定和丰度分析。本发明的方法适用于对液体酵素中菌种进行鉴定分析，实现了液体酵素中微生物在种水平的鉴定和丰度分析，与现有技术相比，该方法不仅能应对相对复杂的样本，并且鉴定的结果可靠性更高。
Description
技术领域：
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法。
背景技术：
液体酵素是一种利用植物等生物材料在一定的发酵工艺条件下，以特定微生物为菌种发酵而成的一种生物制品，其中包含酶、有机酸、微量元素、氨基酸、维生素多种成分。酵素在人类的美容，健康等领域已经得到了广泛的应用。液体酵素的制作过程中，微生物的种类和数量变化对最终的酵素成品中的成分有着重要的影响，而且作为食用的酵素要严格控制有害微生物的掺入，因此，对酵素中的微生物进行种类和丰度的鉴定，对酵素的品质改进、发酵工艺改进和安全性评价有着极为重要的影响。
微生物的鉴定方法多种多样，传统的微生物分类和鉴定方法主要以微生物的形态结构和培养特性观察、生理生化实验结果作为鉴定依据，鉴定过程较为繁琐、复杂，需花费大量的人力劳动。随着基因检测技术的快速发展，利用基因检测技术来进行微生物鉴定已经成为该领域的金标准。基因检测进行微生物物种鉴定方法有一代测序，二代测序、定量PCR等等，其中定量PCR多用于特定病原的鉴定；一代测序主要用于微生物种类本身多样性水平不高的样本；二代测序在微生物菌种鉴定方面取得了巨大的进步，但是二代测序由于其本身的技术局限性，测序范围仅仅针对局部高变区进行测序，测序范围一般300bp以内，这种局限性对结果的精确性产生了不小的影响，而且对于二代测序对高GC 含量、重复序列多的DNA模板难以进行正常的测序反应，不仅在测序结果的拷贝数以及碱基读取准确性上都比较差。
单分子测序技术(SMRT测序技术)，即第三代测序技术现已获得广泛应用。 SMRT测序技术是在DNA测序时不需要经过PCR扩增，实现对每一条DNA分子的单独测序，具有读长长、速度快、精度高等特点，主要被应用于基因组测序、DNA甲基化研究、SNP检测等方面。目前，基于SMRT测序技术的PacBio RSⅡ测序仪平均读长超过14Kb，且没有GC偏好，可以轻松应对重复序列。 16SrRNA基因是原核生物所特有的核酸序列，该片段被用于细菌的鉴定已经有大量应用。鉴于此，针对液体酵素在菌种鉴定方面的需要，有必要提供一种相对于二代测序可以应对复杂样本，鉴定的结果具有更高的可靠性的液体酵素菌种鉴定的新方法。
发明内容：
本发明的目的旨在针对现有技术存在的不足，提供一种以16sRNA基因为标记基因，基于SMRT测序技术对16sRNA基因进行分型，实现对液体酵素中微生物在种水平的鉴定和丰度分析的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法，具体包括以下步骤：
1)采集液体酵素DNA样本，针对细菌16sRNA进行引物设计，然后进行 PCR扩增，得到PCR产物；
2)将得到的PCR产物构建2K文库，然后在PacBio RS II测序仪上进行测序，得到原始序列；
3)对测序得到的原始序列采用SMRT ananlysisV2.3软件进行校正，然后导出序列，以备生物信息学分析；
4)利用MothurV1.35.1软件对原始序列进行去嵌合体、去除碎片DNA等操作，然后进行菌种鉴定和丰度分析。
本发明的方法适用于对液体酵素中菌种进行鉴定分析，通过基于SMRT测序技术对16sRNA基因进行分型，实现了对液体酵素中微生物在种水平的鉴定和丰度分析，与现有技术相比，该方法不仅能应对相对复杂的样本，并且鉴定的结果可靠性更高。
附图说明：
图1是本发明实施例1中测序结果的原始状况图；
图2是本发明实施例1中酵素优势菌种种水平分类学鉴定结果图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例以及附图对本发明作进一步说明，而并非对本发明的限定。
实施例1
利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法，具体包括以下步骤：
1.液体酵素DNA的提取：
1)以液体枸杞酵素为样本，当液体酵素至OD600＝1.0时，取1mL液体酵素离心收集菌体，弃掉上清液保，留约25μL；
2)将上述25μL菌液漩涡振荡10s至完全悬浮菌体；
3)将上述悬浮菌液添加300μL细胞溶解液(已添加蛋白酶K)，充分混匀；
4)将上述混合液在65℃水浴15min，每隔5min漩涡振荡混匀一次；
5)放置37℃水浴锅冷却后，添加60μL浓度为3mg/mL的Lysozyme溶解酵素，并在室温下放置15min；
6)添加1μL浓度为10μg/μL的RNaseA酶，充分混匀；
7)在37℃水浴30min；
8)冰激5min；
9)添加150μLMPC蛋白溶剂到上述细胞溶液中，漩涡振荡10s；
10)在12000r/min转速下离心10min，收集上清液至新的离心管中；
11)添加500μL异丙醇，上下颠倒混匀30次(避免剧烈振荡)；
12)在4℃、10000r/min转速下离心10min，收集DNA沉淀；
13)弃掉上清液后，使用1mL75％的酒精冲洗DNA沉淀2次，4000r/min 离心30s，在80℃下烘干3～5min；
14)使用35μLTE缓冲液重悬DNA沉淀，室温放置10min，期间用手轻轻弹离心管数次，使DNA充分溶解后，并使用ND-2000微量核酸/蛋白质分析仪测定其含量，-20℃保存备用。
2.PCR扩增：
DNA扩增采用细菌16S通用引物：
正向引物序列为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
反向引物为1492R(5'-ACCTTGTTACGACTT-3')；
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Taq酶(DR001C)购自宝生物工程(大连)有限公司提供。
PCR扩增程序为：94℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃2min，72℃10mi n。PCR反应体系如下：
3.2K文库的构建:
将一份液体酵素16sRNA基因的PCR产物按照PacBio RSⅡ的标准流程构建2K文库，并进行测序，如图1所示，为测序结果的原始状况，其中：Reads Of Insert是完成测序的拷贝数，Read Bases of Insert是测序的总碱基数，Mean Read Length of Insert是平均插入读长，Mean Read Quality of Insert是插入片段平均测序精度，Mean Number of Pass是测序深度。
4.生物信息学分析：
对测序所得到的原始序列用SMRT ananlysisV2.3软件进行校正，然后导出进行生物信息学分析，具体步骤如下：
1)在Mothur1.35.1软件中运行summary命令；
2)运行screen，uchime命令对短的碎片DNA和PCR扩增中的嵌合体进行清除。
5.液体酵素菌种鉴定和丰度分析：
菌种鉴定中设定同源性为97％时划为同一运筹分类单位。如图2所示，为种水平的鉴定结果和菌种丰度，图中展示的仅为序列条数达100以上的结果。所有序列中仅仅有922条序列没有分类鉴定结果，占序列总数的2.48％。
如下表1所示，为序列条数在100以上的分类结果：
表1：序列条数在100以上的分类结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：在液体酵素的发酵过程中，对本领域相关技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以利用本方法对液体酵素发酵工艺中的参数进行优化从而实现对酵素中微生物种类和丰度的调控，也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法，其特征在于：所述方法是以16sRNA基因为标记基因，基于SMRT测序技术对16sRNA基因进行分型，然后实现对液体酵素中微生物在种水平鉴定和丰度分析的方法。
2.根据权利要求1所述的利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)采集液体酵素DNA样本，针对细菌16sRNA进行引物设计，然后进行PCR扩增，得到PCR产物；
2)将得到的PCR产物构建2K文库，然后在PacBio RS II测序仪上进行测序，得到原始序列；
3)对测序得到的原始序列采用SMRT ananlysisV2.3软件进行校正，然后导出序列，以备生物信息学分析；
4)利用MothurV1.35.1软件对原始序列进行去嵌合体、去除碎片DNA操作，然后进行菌种鉴定和丰度分析。
3.如权利要求1或2所述的利用SMRT测序技术进行液体酵素菌种鉴定的方法的应用，通过该方法可对液体酵素发酵工艺中的参数进行优化，实现对酵素中微生物种类和丰度的调控。
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| CN104039982A (zh) * | 2012-08-01 | 2014-09-10 | 深圳华大基因研究院 | 一种分析微生物群落组成的方法和装置 |
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