CN107267581A - 一种用于生产替考拉宁的发酵培养基 - Google Patents

一种用于生产替考拉宁的发酵培养基 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，该发酵培养基的组分为：可溶性淀粉20‑45g·L‑1，葡萄糖5‑15g·L‑1，黄豆粉30‑55g·L‑1，蛋白腖3‑10g·L‑1，磷酸氢二钾0.2‑1.0g·L‑1，氯化镁0.2‑0.5g·L‑1，硫酸铵0.2‑0.5g·L‑1，碳酸钙3‑5g·L‑1，植物油10‑30g·L‑1，pH 7.0‑8.0。利用本发明发酵培养基发酵生产替考拉宁时，能够具有较高的发酵效价，在提高了替考拉宁的产率的同时，能够有效降低生产成本。

Description

一种用于生产替考拉宁的发酵培养基
【技术领域】
本发明涉及用于生产抗生素的发酵培养基，具体涉及一种用于生产替考拉宁的发酵培养基。
【背景技术】
替考拉宁(teicoplanin)是继万古霉素之后开发的另一种抗耐药菌的糖肽类抗生素，其主要对革兰阳性需氧菌和厌氧菌具有较强的抗菌活性，特别是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)所致感染有很好的疗效，是目前临床上为数不多的对多重耐药性金葡菌和肠球菌仍有抗菌活性的药物之一。
现有生产方法中，一般采用微生物发酵生产替考拉宁为主，并对发酵获得的替考拉宁粗品进行纯化。发酵液中替考拉宁，包括TAl～TA2，其中TA2是替考拉宁的主要活性成分，主要由5个化学结构十分相似的化合物(TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5)组成；其粗品及精制品中还含有一个活性组分TA3-1，该化合物是TA2的去酰基葡萄糖胺产物。
文献[Parenti等，J Antibiot，1978，3l(4)：276]报道生产替考拉宁采用的发酵培养基为：葡萄糖10g/L、棉子粉10g/L、麦芽浸膏10g/L、酵母浸膏4g/L，获得的替考拉宁产量仅为900ug/ml；徐波等研究了不同来源的蛋白胨和鱼油对替考拉宁产量及组分的影响，结果发现，不同来源的蛋白胨对替考拉宁的产量及组分影响不同，其中Polypepton和海浦鱼蛋白胨能够明显增加替考拉宁的产量，增加幅度分别为17.3％和15.8％。另外，上述2种蛋白胨对组分也有相似的影响，即使A2-2组分分别提高了7.6％与7.0％；且使A2-5组分分别增加了2.9％f～2.1％。但经研究发现，在发酵培养基中分别添加0.5％的黄豆油和鱼油可使替考拉宁的产量分别增加16.3％～21.3％；鱼油基本不改变各组分的相对含量，而黄豆油则明显增加A2-1组分的含量，同时降低主组分A2-2含量，从而使替考拉宁品质下降，导致产品不合格。
因此，本领域迫切需要提供一种发酵产物替考拉宁产率高的发酵培养基。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于生产替考拉宁的发酵培养基。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，该发酵培养基的组分为：可溶性淀粉20-45g·L-1，葡萄糖5-15g·L-1，黄豆粉30-55g·L-1，蛋白腖3-10g·L-1，磷酸氢二钾0.2-1.0g·L-1，氯化镁0.2-0.5g·L-1，硫酸铵0.2-0.5g·L-1，碳酸钙3-5g·L-1，植物油10-30g·L-1，pH 7.0-8.0。
进一步地，所述植物油为玉米油、茶籽油、花生油中的任一种。
本发明的有益效果在于：提供了一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，利用其发酵生产替考拉宁时，能够具有较高的发酵效价，在提高了替考拉宁的产率的同时，能够有效降低生产成本。
【具体实施方式】
本发明一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，该发酵培养基的组分为：可溶性淀粉20-45g·L-1，葡萄糖5-15g·L-1，黄豆粉30-55g·L-1，蛋白胨3-10g·L-1，磷酸氢二钾0.2-1.0g·L-1，氯化镁0.2-0.5g·L-1，硫酸铵0.2-0.5g·L-1，碳酸钙3-5g·L-1，植物油10-30g·L-1，pH 7.0-8.0。其中，植物油可选用玉米油、茶籽油、花生油中的任一种，且优选玉米油。
需要说明的是，本发明发酵培养基中的植物油在发酵过程中主要发挥碳源、消沫剂、氧载体等多重作用，能够有效提高替考拉宁产量，植物油在微生物代谢的不同阶段发挥不同作用，不仅降低抗生素生产成本，而且能有效提高替考拉宁产量；本发明培养基中葡萄糖在发酵前期发挥作用，植物油是在发酵中后期作为缓效碳源提供能量，此外植物油还起到消泡作用，其解决了现有技术中淀粉发酵液粘度大，产泡沫等负面影响。
且植物油提高替考拉宁效价的原理是：一是油脂系作为缓慢利用碳源可避免迅速利用碳源引起的分解代谢物的阻遏作用；二是油脂是短链脂肪酸产物的主要来源，可为聚酮体途径抗生素合成提供大量前体物质。具体来说，油脂作为碳源被利用，主要是脂肪酸发挥作用，油脂中的长链脂肪酸先被乙酰辅酶A硫酯活化，进入β-氧化途径，每循环一次脂肪酸链掉下两个碳碎片为乙酰辅酶A，剩余的脂酰辅酶A化合物重新进入降解循环，降解产物乙酰辅酶A可以作为产物合成的前体。
为了对本发明进行详细阐述说明，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，且各实施例中的替考游动放线菌均为现有的，是能够从市面或行业内购买的。
实施例1
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉30g、葡萄糖10g、黄豆粉45g、蛋白胨5g、磷酸氢二钾0.2g、氯化镁0.5g、硫酸铵0.2g、碳酸钙3g、玉米油10g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为
4291U·mL-1。
实施例2
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉45g、葡萄糖10g、黄豆粉30g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾0.2g、氯化镁0.5g、硫酸铵0.5g、碳酸钙4g、玉米油15g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为4387U·mL-1。
实施例3
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉20g、葡萄糖15g、黄豆粉30g、蛋白胨3g、磷酸氢二钾1.0g、氯化镁0.3g、硫酸铵0.2g、碳酸钙4g、玉米油20g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为5081U·mL-1。
实施例4
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉30g、葡萄糖15g、黄豆粉50g、蛋白胨8g、磷酸氢二钾0.5g、氯化镁0.3g、硫酸铵0.2g、碳酸钙4g、玉米油25g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为5346U·mL-1。
实施例5
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉30g、葡萄糖10g、黄豆粉45g、蛋白胨5g、磷酸氢二钾1.0g、氯化镁0.3g、硫酸铵0.2g、碳酸钙5g、玉米油30g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为5148U·mL-1。
实施例6
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉30g、葡萄糖10g、黄豆粉45g、蛋白胨5g、磷酸氢二钾0.2g、氯化镁0.5g、硫酸铵0.2g、碳酸钙3g、花生油15g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为4206U·mL-1。
实施例7
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉45g、葡萄糖10g、黄豆粉55g、蛋白胨3g、磷酸氢二钾0.5g、氯化镁0.2g、硫酸铵0.3g、碳酸钙4g、花生油25g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为4887U·mL-1。
实施例8
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉20g、葡萄糖15g、黄豆粉30g、蛋白胨8g、磷酸氢二钾0.3g、氯化镁0.2g、硫酸铵0.5g、碳酸钙5g、菜籽油20g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
在替考拉宁的发酵培养过程中，按5％的接种量向本实施例制备的发酵培养基中接入替考游动放线菌的种子液，接着置于30℃、230rpm摇床培养120小时，然后取发酵液适量，并加入等体积的无水乙醇，充分振荡、静置、离心，取上清液过滤后进行HPLC检测，且以替考拉宁标准品(中国食品药品检定研究院)为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积×标准液浓度×稀释倍数计算效价，发酵效价为3次平均值，则计算得本实施例的发酵效价为4557U·mL-1。
实施例9
制备发酵培养基：称取可溶性淀粉40g、葡萄糖5g、黄豆粉45g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾0.5g、氯化镁0.5g、硫酸铵0.3g、碳酸钙3g、菜籽油30g至烧杯中，加入蒸馏水定容至1000mL，调节pH7.0-8.0，之后于121℃蒸汽条件下灭菌30min，冷却至室温即得所需发酵培养基，并将所得发酵培养基按每份50mL进行分装，在无菌环境下密封备用；
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综上可知，将本发明发酵培养基用于生产替考拉宁的发酵培养时，具有较高的发酵效价，即能够提高发酵生产替考拉宁的产率。

Claims (2)

1.一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，其特征在于：该发酵培养基的组分为：可溶性淀粉20-45g·L-1，葡萄糖5-15g·L-1，黄豆粉30-55g·L-1，蛋白腖3-10g·L-1，磷酸氢二钾0.2-1.0g·L-1，氯化镁0.2-0.5g·L-1，硫酸铵0.2-0.5g·L-1，碳酸钙3-5g·L-1，植物油10-30g·L-1，pH 7.0-8.0。
2.根据权利要求1所述一种用于生产替考拉宁的发酵培养基，其特征在于：所述植物油为玉米油、茶籽油、花生油中的任一种。
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