CN107266628A - 一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法与应用，本发明首先采用Frens法通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金纳米颗粒；接着利用丙烯酰胺采用溶液聚合法，加入金溶胶和孔雀石绿，合成含孔雀石绿和金颗粒的分子印迹水凝胶；然后在超声辅助的条件下洗脱模板分子；最后将洗脱后的聚合物用于吸附水体、鱼、虾体中的孔雀石绿，直接利用表面增强拉曼光谱进行检测；本发明制得的分子印迹水凝胶，具有针对模板分子的专一性，并且克服了直接利用金溶胶进行溶液检测的缺点，将金颗粒固定在水凝胶中，提高了金颗粒的稳定性，增强了热点效应，并且大大降低了检出限，本发明分子印迹水凝胶还可以循环利用，降低了成本。

Description

一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法与应用
(一)技术领域
本发明涉及一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法，以及结合表面增强拉曼光谱在检测孔雀石绿中的应用。
(二)背景技术
孔雀石绿是一类合成的工业染料，因其有效的抗菌作用，以及廉价、易获得的特点，曾被广泛应用于水产业，但是因其存在潜在的致癌风险而被许多国家列为违禁添加药品，但目前在水产养殖及运输过程中孔雀石绿非法添加的现象仍有存在。孔雀石绿属于三苯甲烷型的绿色染料，是一种有毒的人工合成的有机化合物，它是由1mol的苯甲醛和2mol的二甲苯胺，在浓盐酸混和下，加热缩合而成隐色素碱后被二氧化铅氧化制得。孔雀石绿在1933年被证实具有杀菌、驱虫的作用，它能在细胞分裂时期阻碍蛋白肽的生成，从而使细胞中的氨基酸分子无法转化成为蛋白肽，因而抑制了细胞分裂，具有抗菌杀虫的作用。在水产运输过程中，使用孔雀石绿浸泡后，能够有效地延长鱼类的存活时间，达到良好的保鲜效果。但是，孔雀石绿具有高毒性，在生物体内残留时间长，难以消除，存在致突变、致畸性和致癌的“三致”危险。因此，很早就被欧盟、美国、日本等很多国家禁止在水产品的养殖中使用，我国农业部在2002年也将孔雀石绿列入食品动物禁用兽药清单中。然而，由于孔雀石绿价格低廉，具备高效的抗菌杀虫作用，目前没有找到合适的替代品，一些个体商户受利益的驱动，孔雀石绿在水产品的养殖和运输过程中屡禁不止。
当前，国内外都非常重视水产运输中的孔雀石绿的残留监控，为了保障水产的质量安全，保护人民的身体健康，打破水产品出口的贸易壁垒，我国对于水产品中孔雀石绿的残留检测要求日渐提高。目前，水产品中孔雀石绿的残留检测方法主要有理化检测法和免疫学检测法两大类。薄层色谱分析法和分光光度法灵敏度低，定量分析误差大；液相色谱设备不便携，样品需要前处理；色质联用以及酶联免疫吸附测试操作复杂繁琐，仪器设备昂贵，不便携，只能在实验室使用，不受用户商家的欢迎。
本课题组前期利用表面增强拉曼光谱技术，开发了一种能快速简单、准确无误、户外现场、经济节约地检测水产品运输过程中添加孔雀石绿的新方法。利用孔雀石绿是一种阳离子含胺染料，具有高度表面增强拉曼活性的性质，直接将孔雀石绿吸附在金纳米溶胶颗粒表面进行检测。但是此方法无法达到孔雀石绿的最低检测限，且金纳米溶胶在水溶液中容易沉降，无法长时间保存。因此，需要研制一种新型的、特异性的孔雀石绿检测基底。
分子印迹技术(MIP)是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子(通常称为模板分子)完全匹配的聚合物的实验制备技术。其工作原理一般分三个步骤：使印迹分子与功能单体相互作用形成复合物；加交联剂和聚合引发剂，发生聚合反应；除去聚合物中的印迹分子后即获得分子印迹聚合物。分子印迹聚合物具有制作简单、成本低廉、功能可设计、坚固耐用、适用范围广等优点，被誉为“万能的分子识别材料”。
目前，应用分子印迹技术和表面增强拉曼光谱结合的检测孔雀石绿的方法比较少见，尤其是发明专利较少，很多基于分子印迹技术检测孔雀石绿的专利，都没有和表面增强拉曼光谱技术相结合。如专利CN101216464B发明了一种检测孔雀石绿的分子印迹聚合物微球，将两种功能单体以一定比例混合，再将孔雀石绿模板与单体以一定比例混合，按一定顺序加入交联剂、引发剂、乳化剂和亲脂溶剂，制备分子印迹聚合物微球。该发明还进一步提供了检测样品中的孔雀石绿的方法，该方法包括对处理的水产样品进行识别、吸附和浓缩，并利用分光光度法检测其中孔雀石绿的浓度。但是其检测方法存在一定缺陷，通过微球对孔雀石绿进行富集，再进行洗脱，无法做到对富集的孔雀石绿进行完全洗脱，因此在测量洗脱液时，难免会产生一定偏差。且采用分光光度法检测，每次测量的数据误差较大。
专利CNIO4833781A发明了一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，它包括磁性分子印迹聚合物的制备和直接竞争ELISA方法的建立等实验步骤，该发明首先用乳液聚合法制备了粒径均匀的孔雀石绿磁性分子印迹聚合物(MG-MMIPS)，并考察其吸附性能，将此MG-MMIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA检测方法。该发明的检测限虽然很低，但是无法回收再利用，造成浪费，且合成复杂，成本较高，采用ELISA法容易出现假阳性的结果。
专利CN102814168A发明了一种丝瓜络表面孔雀石绿分子印迹吸附材料，其特征是：选用丝瓜络为基体材料，以孔雀石绿为模板分子，衣康酸和甲基丙烯酸作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸醋作为交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂，四氢呋喃作为溶剂制备获得聚合物后，以盐酸丙酮混合溶液除去孔雀石绿模板分子，还提供了上述的丝瓜络表面孔雀石绿分子印迹吸附材料的应用方法。该发明制备丝瓜络表面孔雀石绿分子印迹吸附材料，由于是在丝瓜络表面修饰上分子印迹聚合物，其吸附位点都在吸附剂的表面，有利于模板分子吸附和洗脱，洗脱时间短，吸附能力强、效率高，其对孔雀石绿分子最大吸附容量为312mg/g，最高吸附率可达95％。所用的支持原料丝瓜络来源广泛，可生物降解，并且是再生资源。但其只交代了最大吸附量和吸附率，未说明最低检测限问题。
(三)发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶及其制备方法，以及结合表面增强拉曼光谱在检测孔雀石绿中的应用。
本发明首先采用Frens法通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金纳米颗粒；接着利用丙烯酰胺采用溶液聚合法，加入金溶胶和孔雀石绿，合成含孔雀石绿和金颗粒的分子印迹水凝胶；然后利用蒸馏水、甲醇/乙酸混合溶液(体积比9：1)轮流清洗，在超声辅助的条件下洗脱模板分子(孔雀石绿)；最后将洗脱后的聚合物用于吸附水体、鱼、虾体中的孔雀石绿，直接利用表面增强拉曼光谱进行检测。
本发明的技术方案如下：
一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，按如下方法制备得到：
(1)金纳米颗粒的制备：
将水加热至95～101℃，加入2.5wt％～6wt％柠檬酸钠水溶液，15～25s后加入8～12mg/mL氯金酸水溶液，保温反应至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温(20～30℃，下同)，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒；
所述2.5wt％～6wt％柠檬酸钠水溶液、水、氯金酸水溶液的体积比为1：250～500：3～6；
所得金纳米颗粒分散至水中即为金溶胶，待用；
(2)含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶的制备：
将丙烯酰胺(单体)、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(交联剂)混合，再加入0.5～2mg/mL柠檬酸钠水溶液，超声(25～130KHz，下同)溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶，混合均匀后加入孔雀石绿，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入过硫酸钾(引发剂)，密封后于50～60℃下搅拌反应10～120min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶；
所述步骤(1)所得金溶胶先浓缩至其中金元素含量至0.5～2mg/mL时再投料；
所述孔雀石绿配制成0.5～20mg/mL的水溶液形式进行投料；
所述过硫酸钾配制成25～100mg/mL的水溶液形式进行投料；
所述丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、金溶胶、孔雀石绿、过硫酸钾的投料质量比为1：0.015～0.5：0.0005～0.002：0.0005～0.02：0.025～0.1，所述的金溶胶的质量以金溶胶中所含金元素的理论质量计；
所述0.5～2mg/mL柠檬酸钠水溶液的体积用量以丙烯酰胺的质量计为0.5～2mL/g；
所得含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶置于0～5℃下保存待用。
本发明所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶可结合表面增强拉曼光谱应用于孔雀石绿的检测，例如：可应用于水体中、鱼虾体中孔雀石绿样品的检测。具体的，所述应用的方法为：
(a)拉曼光谱基底的制备
取本发明制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，切割至颗粒状(通常用刀片切割至直径约2cm左右)，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱0.5～15h，调节pH至7.5～8.5，烘干(50℃真空干燥)得洗脱的分子印迹水凝胶，备用；
(b)建立孔雀石绿检测的标准工作曲线
配制浓度范围在0.2～20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存；将步骤(a)制得的洗脱的分子印迹水凝胶与孔雀石绿标准水溶液按质量体积比1：5～20(mg：mL)混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
(c)孔雀石绿样品的检测
将样品与步骤(a)制得的洗脱的分子印迹水凝胶混合，经吸附后测量其拉曼光谱图，读取1400cm-1处出现的孔雀石绿特征峰的峰强，代入步骤(b)中所得标准线性方程，计算出样品中孔雀石绿的含量。
本发明的优点：采用本发明方法，制备而得的分子印迹水凝胶，具有针对模板分子(孔雀石绿)的专一性，并且克服了直接利用金溶胶进行溶液检测的缺点，将金颗粒固定在水凝胶中，提高了金颗粒的稳定性，增强了热点效应。此外采用本发明方法检测水体中的孔雀石绿，大大降低了检出限，达到0.2ng/mL。本发明分子印迹水凝胶还可以循环利用，经过再次洗脱又可以用于吸附孔雀石绿进行检测，降低了成本。
(四)附图说明
图1：金颗粒的TEM图；
图2：实施例3中分子印迹水凝胶的中金颗粒的紫外谱图；
图3：实施例3反应后水凝胶图，洗脱孔雀石绿后的水凝胶图，吸附孔雀石绿的水凝胶图；
图4：实施例3分子印迹水凝胶的显微图；
图5：实施例3分子印迹水凝胶吸附孔雀石绿的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)球型金纳米颗粒的制备：采用Frens法
通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金溶胶。所有玻璃制品和转子均用王水(V浓盐酸：V浓硝酸＝3：1)洗涤。制备金纳米颗粒的具体操作如下：
将50mL水加热至95℃，加入0.2mL 2.5wt％柠檬酸钠水溶液，15s后加入0.75mL8mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒，分散于4mL水中即为金溶胶，待用；
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
将4g丙烯酰胺、0.06g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入0.5mg/mL柠檬酸钠水溶液2mL，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶(浓缩至其中金元素含量至0.5mg/mL时投料，投料量为4mL)，混合均匀后加入2mg孔雀石绿(配制成0.5mg/mL的水溶液形式进行投料)，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入0.1g过硫酸钾(配制成25mg/mL的水溶液形式进行投料)，密封后于50℃下搅拌反应10min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，置于0℃下保存待用；
(3)拉曼光谱基底的制备：
取步骤(2)制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，用刀片切割至直径约2cm左右的颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱0.5h，调节pH至7.5，烘干备用；
(4)孔雀石绿标准曲线的制作
配制0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL、20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存。
将经过步骤(3)洗脱烘干的分子印迹水凝胶2mg与孔雀石绿标准水溶液10mL混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
标准线性方程为：lgI1400＝0.2064lgCMG+2.9813，其中lgI1400为1400cm-1处拉曼峰强的对数，lgCMG为孔雀石绿浓度的对数，R2＝0.9646。
(5)水体中孔雀石绿含量的测定
配制0.5ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、30ng/mL、300ng/mL、3000ng/mL的孔雀石绿水溶液，避光储存。
使用分析天平分别准确称取经洗脱并烘干的分子印迹聚合物粉末5mg于5mL离心管中，于每管离心管中加入4mL上述浓度的孔雀石绿溶液，振荡并使用超声辅助混合30min，避光静置吸附12h。
10000r/min离心分离吸附有孔雀石绿的分子印迹聚合物，用吸水纸吸干聚合物表面溶液，将聚合物置载玻片上，使用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取聚合物上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值。使用标准曲线拟合的线性方程，计算得到分子印迹聚合物上的孔雀石绿含量。
实施例2
(1)球型金纳米颗粒的制备：采用Frens法
通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金溶胶。所有玻璃制品和转子均用王水(V浓盐酸：V浓硝酸＝3：1)洗涤。制备金纳米颗粒的具体操作如下：
将50mL水加热至101℃，加入0.1mL 6wt％柠檬酸钠水溶液，25s后加入0.5mL12mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒，分散于4mL水中即为金溶胶，待用；
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
将2g丙烯酰胺、1g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入2mg/mL柠檬酸钠水溶液4mL，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶(浓缩至其中金元素含量至2mg/mL时投料，投料量为2mL)，混合均匀后加入0.04g孔雀石绿(配制成20mg/mL的水溶液形式进行投料)，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入0.2g过硫酸钾(配制成100mg/mL的水溶液形式进行投料)，密封后于60℃下搅拌反应120min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，置于5℃下保存待用；
(3)拉曼光谱基底的制备：
取步骤(2)制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，用刀片切割至直径约2cm左右的颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱15h，调节pH至8.5，烘干备用；
(4)孔雀石绿标准曲线的制作
配制0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL、20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存。
将经过步骤(3)洗脱烘干的分子印迹水凝胶2mg与孔雀石绿标准水溶液10mL混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
标准线性方程为：lgI1400＝0.2959lgCMG+2.828，其中lgI1400为1400cm-1处拉曼峰强的对数，lgCMG为孔雀石绿浓度的对数，R2＝0.9832。
(5)水体中孔雀石绿含量的测定
配制0.5ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、30ng/mL、300ng/mL、3000ng/mL的孔雀石绿水溶液，避光储存。
使用分析天平分别准确称取经洗脱并烘干的分子印迹聚合物粉末5mg于5mL离心管中，于每管离心管中加入4mL上述浓度的孔雀石绿溶液，振荡并使用超声辅助混合30min，避光静置吸附12h。
10000r/min离心分离吸附有孔雀石绿的分子印迹聚合物，用吸水纸吸干聚合物表面溶液，将聚合物置载玻片上，使用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取聚合物上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值。使用标准曲线拟合的线性方程，计算得到分子印迹聚合物上的孔雀石绿含量。本方法对孔雀石绿的最低检出限为0.2ng/mL，远低于国家标准。
实施例3
(1)球型金纳米颗粒的制备：采用Frens法
通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金溶胶。所有玻璃制品和转子均用王水(V浓盐酸：V浓硝酸＝3：1)洗涤。制备金纳米颗粒的具体操作如下：
将50mL水加热至100℃，加入0.1mL 6wt％柠檬酸钠水溶液，20s后加入0.6mL10mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒，分散于4mL水中即为金溶胶，待用；
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
将2g丙烯酰胺、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入1mg/mL柠檬酸钠水溶液4mL，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶(浓缩至其中金元素含量至1mg/mL时投料，投料量为2mL)，混合均匀后加入0.02g孔雀石绿(配制成10mg/mL的水溶液形式进行投料)，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入0.02g过硫酸钾(配制成25mg/mL的水溶液形式进行投料)，密封后于60℃下搅拌反应40min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，置于4℃下保存待用；
(3)拉曼光谱基底的制备：
取步骤(2)制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，用刀片切割至直径约2cm左右的颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱6h，调节pH至7.5，烘干备用；
(4)孔雀石绿标准曲线的制作
配制0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL、20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存。
将经过步骤(3)洗脱烘干的分子印迹水凝胶2mg与孔雀石绿标准水溶液10mL混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
标准线性方程为：lgI1400＝0.2262lgCMG+2.8985，其中lgI1400为1400cm-1处拉曼峰强的对数，lgCMG为孔雀石绿浓度的对数，R2＝0.9942。(5)水体中孔雀石绿含量的测定
配制0.5ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、30ng/mL、300ng/mL、3000ng/mL的孔雀石绿水溶液，避光储存。
使用分析天平分别准确称取经洗脱并烘干的分子印迹聚合物粉末5mg于5mL离心管中，于每管离心管中加入4mL上述浓度的孔雀石绿溶液，振荡并使用超声辅助混合30min，避光静置吸附12h。
10000r/min离心分离吸附有孔雀石绿的分子印迹聚合物，用吸水纸吸干聚合物表面溶液，将聚合物置载玻片上，使用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取聚合物上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值。使用标准曲线拟合的线性方程，计算得到分子印迹聚合物上的孔雀石绿含量。
从以上表格可以看出，采用本方法对水体中的孔雀石绿进行检测，回收率在69.86～104.03％之间，标准偏差也低于7.62％。且在标准曲线浓度范围内的检测，具有良好的稳定性和精确性。
实施例4
(1)球型金纳米颗粒的制备：采用Frens法
通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金溶胶。所有玻璃制品和转子均用王水(V浓盐酸：V浓硝酸＝3：1)洗涤。制备金纳米颗粒的具体操作如下：
将50mL水加热至100℃，加入0.1mL 6wt％柠檬酸钠水溶液，20s后加入0.5mL10mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒，分散于4mL水中即为金溶胶，待用；
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
将2g丙烯酰胺、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入1mg/mL柠檬酸钠水溶液4mL，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶(浓缩至其中金元素含量至1mg/mL时投料，投料量为2mL)，混合均匀后加入0.02g孔雀石绿(配制成10mg/mL的水溶液形式进行投料)，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入0.02g过硫酸钾(配制成25mg/mL的水溶液形式进行投料)，密封后于60℃下搅拌反应40min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，置于4℃下保存待用；
(3)拉曼光谱基底的制备：
取步骤(2)制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，用刀片切割至直径约2cm左右的颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱6h，调节pH至7.5，烘干备用；
(4)孔雀石绿标准曲线的制作
配制0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL、20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存。
将经过步骤(3)洗脱烘干的分子印迹水凝胶2mg与孔雀石绿标准水溶液10mL混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
标准线性方程为：lgI1400＝0.2262lgCMG+2.8985，其中lgI1400为1400cm-1处拉曼峰强的对数，lgCMG为孔雀石绿浓度的对数，R2＝0.9942。(5)虾体中孔雀石绿含量的测定
配制0.5ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、30ng/mL、300ng/mL、3000ng/mL的孔雀石绿水溶液，避光储存。取活力相近、个体大小相似的河虾，利用上述浓度的孔雀石绿水溶液浸泡5.5h。取虾体进行研磨，取研磨物于离心管中，并加入去离子水，离心分离取上清液。使用分析天平分别准确称取经洗脱烘干的分子印迹水凝胶5mg于5mL离心管中，于每管离心管中加入4mL上述浓度的上清液，振荡并使用超声辅助混合30min，避光静置吸附12h。
10000r/min离心分离吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，用吸水纸吸干水凝胶表面溶液，将水凝胶置载玻片上，使用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值。使用标准曲线拟合的线性方程，计算得到虾体中的孔雀石绿含量。检测结果表明虾鳃，虾腹足，虾头中的孔雀石绿含量较高。
实施例5
(1)球型金纳米颗粒的制备：采用Frens法
通过柠檬酸钠还原氯金酸来制备金溶胶。所有玻璃制品和转子均用王水(V浓盐酸：V浓硝酸＝3：1)洗涤。制备金纳米颗粒的具体操作如下：
将50mL水加热至100℃，加入0.1mL 6wt％柠檬酸钠水溶液，20s后加入0.5mL10mg/mL氯金酸水溶液，保持100℃至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒，分散至4mL水中即为金溶胶，待用；
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
(2)孔雀石绿分子印迹聚合物的制备
将2g丙烯酰胺、0.05g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入1mg/mL柠檬酸钠水溶液4mL，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶(浓缩至其中金元素含量至1mg/mL时投料，投料量为2mL)，混合均匀后加入0.02g孔雀石绿(配制成10mg/mL的水溶液形式进行投料)，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入0.02g过硫酸钾(配制成25mg/mL的水溶液形式进行投料)，密封后于60℃下搅拌反应40min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，置于4℃下保存待用；
(3)拉曼光谱基底的制备：
取步骤(2)制备的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，用刀片切割至直径约2cm左右的颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱6h，调节pH至7.5，烘干备用；
(4)孔雀石绿标准曲线的制作
配制0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、20ng/mL、200ng/mL、2000ng/mL、20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存。
将经过步骤(3)洗脱烘干的分子印迹水凝胶2mg与孔雀石绿标准水溶液10mL混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
标准线性方程为：lgI1400＝0.2262lgCMG+2.8985，其中lgI1400为1400cm-1处拉曼峰强的对数，lgCMG为孔雀石绿浓度的对数，R2＝0.9942。
(5)鱼体中孔雀石绿含量的测定
配制10ng/mL、3000ng/mL的孔雀石绿水溶液，避光储存。取活力相近、个体大小相似的鲫鱼，利用上述浓度的孔雀石绿水溶液浸泡5.5h。取鱼体的鳍、尾、腮、鳞、肉进行研磨，取研磨物于离心管中，并加入去离子水，离心分离取上清液。使用分析天平分别准确称取经洗脱的分子印迹水凝胶5mg于5mL离心管中，于每管离心管中加入4mL上述浓度的上清液，振荡并使用超声辅助混合30min，避光静置吸附12h。
10000r/min离心分离吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，用吸水纸吸干水凝胶表面溶液，将水凝胶置载玻片上，使用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值。使用标准曲线拟合的线性方程，计算得到鱼体各个部位的孔雀石绿含量。检测结果表明鱼鳃，鱼尾，鱼鳍中孔雀石绿分布最高。
对比例
专利CN 106706795 A设计了一种基于磁性纳米复合物的分散固相萃取-色谱检测水样中孔雀石绿和结晶紫的方法。该方法采用Fe3O4/GO纳米复合物对样品中的目标物进行富集和在磁场下与基质分离。分离后，加入少量洗脱剂进行脱附，从而达到对样品浓缩的目的，然后采用HPLC-VIS对混合目标物进行分离和检测。该方法对MG的检出限可达到0.5ng/mL，检测水溶液中孔雀石绿的回收率为91～117％。相比于该方法，本发明的最低检出限为0.2ng/mL，检测浓度范围大，达到0.2～20000ng/mL，回收率在69.86～104.03％之间，标准偏差也低于7.62％。
采用化学沉淀法制备Fe3O4/GO纳米复合物，该制备方法与本发明的溶液聚合法相比，反应条件控制较困难。且采用该方法对水溶液中的孔雀石绿进行吸附后，还需要进一步进行洗脱，用洗脱液进行高效液相色谱检测。相比于该检测方法，本发明只需对水体中的孔雀石绿进行吸附后，直接用拉曼光谱对吸附了孔雀石绿的水凝胶进行检测，免去了许多繁杂的操作，节省了时间，为户外现场检测打下了基础。

Claims (7)

1.一种含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，其特征在于，所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶按如下方法制备得到：
(1)金纳米颗粒的制备：
将水加热至95～101℃，加入2.5wt％～6wt％柠檬酸钠水溶液，15～25s后加入8～12mg/mL氯金酸水溶液，保温反应至反应液为酒红色且颜色不再发生变化后停止加热，搅拌下自然冷却至室温，离心，收集下层颗粒，得到所述金纳米颗粒；
所述2.5wt％～6wt％柠檬酸钠水溶液、水、氯金酸水溶液的体积比为1：250～500：3～6；
所得金纳米颗粒分散至水中即为金溶胶，待用；
(2)含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶的制备：
将丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合，再加入0.5～2mg/mL柠檬酸钠水溶液，超声溶解后，加入步骤(1)准备好的金溶胶，混合均匀后加入孔雀石绿，得到反应液，对所得反应液进行通N2除氧，然后加入过硫酸钾，密封后于50～60℃下搅拌反应10～120min，即得所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶；
所述丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、金溶胶、孔雀石绿、过硫酸钾的投料质量比为1：0.015～0.5：0.0005～0.002：0.0005～0.02：0.025～0.1，所述的金溶胶的质量以金溶胶中所含金元素的理论质量计；
所述0.5～2mg/mL柠檬酸钠水溶液的体积用量以丙烯酰胺的质量计为0.5～2mL/g。
2.如权利要求1所述的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，其特征在于，步骤(2)中，所述步骤(1)所得金溶胶先浓缩至其中金元素含量至0.5～2mg/mL时再投料。
3.如权利要求1所述的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，其特征在于，步骤(2)中，所述孔雀石绿配制成0.5～20mg/mL的水溶液形式进行投料。
4.如权利要求1所述的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，其特征在于，步骤(2)中，所述过硫酸钾配制成25～100mg/mL的水溶液形式进行投料。
5.如权利要求1所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶结合表面增强拉曼光谱在孔雀石绿检测中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶结合表面增强拉曼光谱在水体中、鱼虾体中孔雀石绿的检测中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
(a)拉曼光谱基底的制备
取所述的含金纳米颗粒的分子印迹水凝胶，切割至颗粒状，依次用去离子水、体积比9：1的甲醇/乙酸混合液、去离子水分别超声洗脱0.5～15h，调节pH至7.5～8.5，烘干得洗脱的分子印迹水凝胶，备用；
(b)建立孔雀石绿检测的标准工作曲线
配制浓度范围在0.2～20000ng/mL的孔雀石绿标准水溶液，避光储存；将步骤(a)制得的洗脱的分子印迹水凝胶与孔雀石绿标准水溶液按质量体积比1：5～20混合，超声30min后，避光静置吸附12h；之后离心，收集吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶，吸干水凝胶表面溶液，置于载玻片上，利用表面增强拉曼光谱的固体激光头进行检测；选取水凝胶上的20个不同位置进行拉曼测量，记录20次位于1400cm-1处的峰高值，去除最高和最低值，计算峰高平均值；对峰高值和孔雀石绿浓度进行双对数作图，拟合得到吸附有孔雀石绿的分子印迹水凝胶的标准曲线，进而得到标准线性方程；
(c)孔雀石绿样品的检测
将样品与步骤(a)制得的洗脱的分子印迹水凝胶混合，经吸附后测量其拉曼光谱图，读取1400cm-1处出现的孔雀石绿特征峰的峰强，代入步骤(b)中所得标准线性方程，计算出样品中孔雀石绿的含量。
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