CN107266297B - 异戊烯化羟基二苯乙烯、包含其的药物组合物、用途及其制备方法 - Google Patents

异戊烯化羟基二苯乙烯、包含其的药物组合物、用途及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及异戊烯化羟基二苯乙烯、包含其的药物组合物、用途及其制备方法。异戊烯化二苯乙烯化合物及此类化合物在治疗疾病和医学病症中的应用，所述疾病和医学病症为，例如，癌症、皮肤衰老、炎症、细菌或真菌感染、和免疫抑制。

Description

异戊烯化羟基二苯乙烯、包含其的药物组合物、用途及其制备 方法
本申请是申请日为2012年05月04日的题为“异戊烯化羟基二苯乙烯”的中国专利申请No.201280033556.X的分案申请。
相关申请的引用
本发明要求AU2011901663的优先权，其内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及新型异戊烯化二苯乙烯化合物和此类化合物在治疗疾病和医学病症(例如癌症和皮肤衰老)中的应用。
背景技术
蜂巢蜡胶或所谓的蜂胶是由工蜂(西方蜜蜂(Apis mellifera))从某些树木和灌木的嫩枝和芽的渗出物和分泌物中采集的复杂树脂状物质。蜜蜂将其用于封接蜂巢中的裂缝和孔洞并防止微生物感染。
蜂巢蜡胶是生物活性物质的丰富来源，并且蜂巢蜡胶的药用用途可以追溯到古代文明。目前，蜂巢蜡胶被广泛用作天然保健产品，并且广泛应用于化妆品中。然而，其在药物中的现代应用是有限的，这主要是归因于其化学组成有很大不同，这种不同是由于蜜蜂从不同的植物来源或植物来源的混合物进行采集所造成的。蜂胶的组成取决于蜜蜂接触的周边植物群，并且同样地，植物群的这种差异会导致蜂胶组成的差异。例如，已知类黄酮是欧洲蜂胶中的主要药理活性化合物，聚异戊烯化二苯甲酮是古巴蜂胶和委内瑞拉蜂胶中的主要物质，并且异戊烯化肉桂酸衍生物在巴西蜂胶中占主要地位。
对由蜜蜂产生的蜂胶的植物来源的识别能够将巢箱放置在有利的位置，以便从单一植物来源生产蜂胶，从而能够制造高品质和高疗效的药物。
蜂胶的药用唯一性是由蜜蜂的选择性采集能力所决定的，因为它们能够识别相对非极性的并具有抗菌性能的天然材料。据报道，蜂胶的常见来源是叶和花芽的渗出物，其具有高抗生素特性，从而保护柔弱的生长中的植物组织免受微生物的攻击。也已经报道了蜜蜂从受伤或患病的植物组织中采集渗出物。此种来源潜在地富含抗生素物质，这是由植物响应创伤或来自昆虫、微生物和病毒的攻击而产生的。
从以往的研究中，尚不清楚蜜蜂是简单地采集已知为蜂胶的植物材料还是是否存在蜜蜂的代谢修饰或添加。但是，似乎没有蜜蜂添加了大量材料的证据或代谢转化的强有力证据。
因此，需要更好地了解关于在特定的地理位置的蜂胶的组成，以能够利用它来充分发挥其益处。
在涉及本发明的工作中，本发明人对分离自袋鼠岛(南澳大利亚)的蜂胶样品进行了调查，并且出乎意料地发现与通常含有类黄酮作为活性组分的其它蜂胶不同，袋鼠岛蜂胶含有二苯乙烯，更具体地是新的异戊烯化多羟基二苯乙烯(pPHOS)，它们的核心结构类似于白藜芦醇(如下图所示)。
Figure BDA0001316762380000021
白藜芦醇是红葡萄酒中的成分，尽管高消耗非常丰富的食物，但是法国人认为红葡萄酒对心脏病发作的低发病率做出了贡献。事实上，已经证明了白藜芦醇抑制LDL氧化，这种LDL氧化会导致动脉粥样硬化和冠状动脉心脏病。白藜芦醇也是预防性抗衰老药物中的主要化合物，并且已经发现其具有抗癌和抗氧化活性。
然而，除了其治疗性能，白藜芦醇显示出非常差的口服生物利用度并且在肠和肝脏中快速地代谢为葡萄糖醛酸盐/酯和磺酸盐/酯的偶联物。只在高浓度(可达5g)下或在直接给予的情况下(例如静脉注射或局部应用)观察到了白藜芦醇的体内效力。
最近，葛兰素史克(GSK)药业进行了其白藜芦醇(3-5g)的专利制剂SRT501在治疗多发性骨髓瘤中的IIa期临床试验；但是，该试验由于制剂仅提供极小的疗效并且试验中的几个病人患上了肾衰竭而中止。
已经报道在主要来自桑科(桑树科，包括桑(Morus alba，桑树)，和各种菠萝蜜物种)和蝶形花科(豆科，包括花生(Arachis hypogaea))的植物中有异戊烯化羟基二苯乙烯。据报道该分离的化合物示出了抗炎症、抗菌和抗氧化活性，从而暗示异戊烯基不会不利地影响羟基二苯乙烯的生物活性。
实际上，异戊烯化羟基二苯乙烯基于其亲脂性而能够规避羟基二苯乙烯(例如白藜芦醇)的生物利用度低的问题。由于存在一个或多个异戊烯基，所述化合物也许能够更容易穿过细胞膜并避免形成葡萄糖醛酸盐/酯和磺酸盐/酯的偶联物，从而改善该化合物的生物利用度，并且更普遍地提供用于开发新治疗剂的优异候选药物。先前已经证明白藜芦醇的四甲氧基衍生物能够比白藜芦醇更容易地穿过大鼠的血-脑屏障。
因此，从袋鼠岛的蜂胶样品中分离出的新型pPHOS衍生物是用于开发在治疗疾病(如癌症)中使用的新治疗剂的强有力候选物。
包括于本说明书中的对文献、步骤、材料、装置、物品等的任何论述都不能被视为承认：任一或所有这些事项为现有技术基础的组成部分或为本申请各项权利要求的优先权日之前存在的本发明相关领域的普通常识。
发明内容
在涉及本发明的工作中，本发明人已经分离和合成了多种新型异戊烯化多羟基二苯乙烯(pPHOS)衍生物并且进行了体外实验，其中这些新型化合物在癌细胞系的组中示出了高的效力和选择性，特别是在白血病和黑色素瘤细胞系中。在其它初步实验中，发现了许多所述新型pPHOS衍生物调节SIRT1酶的活性，这表明本发明的该新型pPHOS化合物可以是治疗一系列疾病的主要治疗剂。
因此，本发明的第一方面，提供了一种治疗癌症的方法，其包括向需要其的患者给予治疗有效量的式(I)的化合物、或者药用盐、溶剂化物或包含所述化合物的药物组合物：
Figure BDA0001316762380000041
其中：
R1独立地为H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2，其中至少一个R1为CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R2选自OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R3选自H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或苄基；
n是选自由1、2、3或4组成的组中的整数；
并且A----B选自CH＝CH、CH2-CH2、CH＝CHX或CH2-CH2X，其中X＝(CH2)pCH2，并且p为选自由0、1、2或3组成的组中的整数；条件是当R2为OH时，R3为H或OH，A----B为CH＝CH，n为3且两个R1基团为OH，则第三个R1基团不是CH＝CHCH(CH3)2。
在本发明的第二方面，提供了一种治疗癌症的方法，包括向需要其的患者给予治疗有效量的式(I)的化合物、或者药用盐、溶剂化物或包括所述化合物的药物组合物，
Figure BDA0001316762380000051
其中：
R1独立地为H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2，其中至少一个R1为CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R2选自OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R3选自H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHCH(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或苄基；
n是选自由1、2、3或4组成的组中的整数；
并且A----B选自CH＝CH、CH2-CH2、CH＝CHX或CH2-CH2X，其中X＝(CH2)pCH2，并且p为选自由0、1、2或3组成的组中的整数。
在第三方面，提供了一种根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物作为药物的应用。
在第四方面，提供了一种根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在治疗中的应用。
在本发明的第五方面，提供了一种根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在治疗癌症中的应用。
在本发明的第六方面，提供了一种治疗免疫抑制的方法，包括向需要其的患者给予治疗有效量的根据第一或第二方面的式(I)的化合物或包括所述化合物的药物组合物。
在本发明的第七方面，提供了一种治疗炎症的方法，包含向需要治疗的患者给予治疗有效量的根据第一或第二方面的式(I)的化合物或包括所述化合物的药物组合物。
在本发明的第八方面，提供了一种治疗细菌或真菌感染的方法，包括向需要其的患者给予治疗有效量的根据第一或第二方面的式(I)的化合物或包括所述化合物的药物组合物。
在本发明的第九方面，提供了一种治疗皮肤老化的方法，包括向需要其的患者给予治疗有效量的根据第一或第二方面的式(I)的化合物或包括所述化合物的药物组合物。
在本发明的第十方面，提供了根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
在本发明的第十一方面，提供了根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗免疫抑制的药物中的应用。
在本发明的第十二方面，提供了根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗炎症的药物中的应用。
在本发明的第十三方面，提供了根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗细菌或真菌感染的药物中的应用。
在本发明的第十四方面，提供了根据第一或第二方面的式(I)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗皮肤老化的药物中的应用。
在本发明的进一步方面，提供了包含如上定义的化合物或药物组合物、和至少一种用于本文所述的方法和应用的其它治疗剂的组合。
根据本发明的第十五方面，提供了一种式(Ia)的化合物或者其药用盐或溶剂化物：
Figure BDA0001316762380000071
其中：
R1a、R1b、R1c和R1d各自独立地为H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2，其中R1a-1d中的至少一个为CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R2选自OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R3选自H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或苄基；
并且A----B选自CH＝CH、CH2-CH2、CH＝CHX或CH2-CH2X，其中X＝(CH2)pCH2，并且p为选自由0、1、2或3组成的组中的整数；条件是：
(i)当R3为H且R2为OH或OCH2CH＝C(CH3)2时，R1b和R1d各自独立地不是OH或OCH2CH＝C(CH3)2；
(ii)当R3为H、R1a-1d中的一个是H并且R1a-1d中的至少一个是CH2CH＝C(CH3)2时，A----B不是CH＝CH。
本发明的第十六方面，提供了一种式(Ia)的化合物或者其药用盐或溶剂化物：
Figure BDA0001316762380000081
其中：
R1a、R1b、R1c和R1d各自独立地为H、OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2，其中R1a-1d中的至少一个为CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R2和R3各自独立地选自OH、OR4、CH2CH＝C(CH3)2、OCH2CH＝C(CH3)2、CH＝CHC(CH3)＝CH2、OCH＝CHCH(CH3)2或OCH＝CHC(CH3)＝CH2；
R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或苄基；
并且A----B选自CH＝CH、CH2-CH2、CH＝CHX或-CH2-CH2X，其中X＝(CH2)pCH2且p为选自由0、l、2或3组成的组中的整数。
在本发明的第十七方面，提供了一种药物组合物，其包含根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物或者其药用盐或溶剂化物，以及药用赋形剂。
根据第十八方面，提供了一种治疗癌症、免疫抑制、炎症、细菌感染、真菌感染或皮肤老化的方法，包括向需要其的患者给予治疗有效量的根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物或包括所述化合物的药物组合物。
根据本发明的第十九方面，提供了根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物或其药物组合物在制备用于治疗癌症、免疫抑制、炎症、细菌感染、真菌感染或皮肤老化的药物中的应用。
根据本发明的第二十方面，提供了一种制备通式(Ib)的化合物的方法，其包括下列步骤：
(i)如下，用适合的试剂处理羧酸以提供酰氯；
Figure BDA0001316762380000091
(ii)如下，使该相应的酰氯与芳基烯烃缩聚；
Figure BDA0001316762380000092
(iii)如下，脱保护乙酸酯基团并烷基化；
Figure BDA0001316762380000093
其中，R4、R5和R6各自独立地选自基团OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu、OBn。
在一个实施方式中，所述方法包含如下另外的步骤：
(iv)如下的氢化反应：
Figure BDA0001316762380000094
其中R4、R5和R6如前述定义，条件是R4、R5或R6中的至少一个为OBn；
R7、R8和R9各自独立地选自基团OH、OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu。
在另一个实施方式中，该方法包括如下的两个另外的步骤：
(v)异戊烯基的重排，如下：
Figure BDA0001316762380000101
(vi)以及如下所示的氢化反应：
Figure BDA0001316762380000102
其中，R4、R5和R6如前述的定义，条件是R4、R5或R6中的至少一个为OBn；
R7、R8和R9各自独立地选自基团OH、OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu。
在本发明的第二十一方面，提供了一种如下表示的USYDS 15的化合物：
Figure BDA0001316762380000103
还提供了一种药物组合物，其包含根据第二十一方面的化合物USYDS 15或者其药用盐或溶剂化物以及药用赋形剂。
在本发明的第二十三方面，提供了根据第二十一方面的化合物或第二十二方面的组合物在制备用于治疗癌症、免疫抑制、炎症、细菌或真菌感染、或用于治疗皮肤老化的药物中的应用。
本发明的优选实施方式的说明
在本说明书的自始至终，词语“包含”或其变形如“包括”或“含有”应该理解为是指包含所述的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但是不排除任何其它要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。
虽然可以在治疗中使用治疗有效量的本文中定义的化合物或者其药用盐或溶剂化物，但是其可以作为主要产品给予；在本发明的一个方面，所述活性成分提供为药物组合物。因此，在本发明的进一步实施方式中，提供了一种药物组合物，其包含根据第一、第二、第十五和第十六方面的式(I)或(Ia)的化合物或者它们的药用盐或溶剂化物，并混合有一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。在与制剂的其它成分的相容性以及不对其接受者造成损害的意义上来说，所述载体、稀释剂或赋形剂必需是可用的。
当适用时，本发明的化合物(包括式(I)或(Ia)的化合物)可以为药用盐的形式和/或可以作为药用盐给予。
本文所使用的术语“药用盐”是指用于毒理学上安全于全身给予的盐。该药用盐可以选自碱金属或碱土金属盐(包括钠、锂、钾、钙、镁等)以及无毒的铵、季铵和胺阳离子(包括，但不限于，铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺、三乙醇胺等)。
本文中所使用的术语“药用赋形剂”是指可安全用于全身给予的固体或液体填料、稀释剂或封装物质。取决于具体的给予途径，也可以使用本领域中公知的各种载体。这些载体或赋形剂可以选自包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水的组。
本文中所使用的术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中，式(I)或(Ia)的化合物或者其盐或其生理功能衍生物)与溶剂形成的可变化学计量的复合物。用于本发明目的的此种溶剂可以不干扰所述溶质的生物活性。适合的溶剂的实例包括，但不限于，水、甲醇、乙醇和乙酸。特别地，所使用的溶剂是药用溶剂。适合的药用溶剂的实例包括，但不限于，水、乙醇、乙酸、甘油、液体聚乙二醇及它们的混合物。特别的溶剂是水。
式(I)或(Ia)的化合物可以以“前药”的形式给予。前药为无活性形式的化合物，其在体内转化为活性形式。适合的前药包括活性形式化合物的酯类、膦酸酯类等。
应理解的是除了以上特别提及的成分之外，制剂还包括本领域中考虑到所讨论的制剂类型的其它试剂。
本发明的化合物可以适合于治疗人类或动物患者的疾病。在一个实施方式中，患者是哺乳动物包括人、马、狗、猫、羊、牛或灵长类动物。在一个实施方式中，患者是人类。在进一步的实施方式中，患者不是人类。
本文中所使用的术语“有效量”是指研究人员或临床医师所寻求的能够引起组织、系统、动物或人的生物学或医学响应的药物或药剂的量。另外，术语“治疗有效量”是指任何量，与未接受该量的相应受试者相比，其引起疾病、病症、或副作用的改善的治疗、治愈、预防或改善，或者其降低疾病或病症的恶化进度。该术语也包括在其范围内能有效地增强正常生理功能的量。
本文中所使用的术语“治疗”是指与未给予包含本发明的化合物的药物组合物相比，预防或抑制症状、治疗症状、延迟症状的显现、降低症状恶化的严重程度、和/或减少个体患有的症状的数量和类型。术语治疗涵盖姑息性设置中的应用。
本领域技术人员能够理解在本发明的化合物的制备中，可以需要和/或期望保护分子中的一个或多个敏感性基团以防止不希望的副反应。适合用于本发明的保护基为本领域技术人员熟知，并且可以以常规方法来使用。例如参见，T.W.Greene和P.G.M.Wuts的"Protective groups in organic synthesis"(John Wiley&sons 1991)或PJ.Kocienski的"Protecting Groups"(Georg Thieme Verlag 1994)。合适的氨基保护基的实例包括酰基型保护(例如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳族尿烷型保护基(例如，苄氧基羰基(Cbz)和取代的Cbz)、脂肪族尿烷型保护基(例如，9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、异丙氧基羰基、环己氧基羰基)和烷基型保护基(例如，苄基、三苯甲基、氯代三苯甲基)。
根据本发明的第一、第二或第十八方面，待治疗的癌症是白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌或乳腺癌。最优选地，待治疗的癌症是白血病或黑色素瘤。
在第一至第九方面的优选实施方式中，根据式(I)的化合物具有式(Ia)。
根据本发明的第十或第十九方面，优选地该药物用于治疗以下癌症：白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌或乳腺癌。最优选地，该药物用于治疗白血病或黑色素瘤。
在第十至第十四方面的优选实施方式中，根据式(I)的化合物具有式(Ia)。
本发明的化合物的抗肿瘤效果可以应用为唯一的治疗或可以包括除此之外的一种或多种其它物质和/或治疗剂。此种联合治疗(conjoint treatment)可以通过同时、顺序或单独给予所述治疗的单个组分。在肿瘤医学领域，正常的做法是使用不同形式的治疗剂的组合来治疗患有癌症的各患者，例如手术、放射疗法和/或化学疗法的组合。特别地，已知放射或利用抗血管生成和/或血管渗透性降低剂的治疗可以提高肿瘤内的缺氧组织的量。因此，本发明的化合物的效果可以通过与放射疗法和/或利用抗血管生成剂的联合治疗来提高。
此类组合的个体组分可以在疗程的不同时间单独地给予或同时地以分开或单一组合的形式给予。因此，本发明可以理解为包括所有此种同时或交替治疗的方式，并且术语“给予”也进行相应的解释。应理解的是本发明的化合物与其它抗肿瘤剂的组合的范围原则上包括与任何有用于治疗癌症的药物组合物的组合。
当组合于同一制剂时，应理解所述两种化合物必需是稳定的并且彼此相容，与制剂中的其它组分相容，并且可以配制用于给予。当单独配制时，它们可以提供为任何方便的制剂，方便地以本领域中公知的用于该化合物的方式。
本发明的药物组合物可以配制用于通过任何适合的途径给予，例如通过口腔(包括颊或舌下)、直肠、鼻、局部(包括颊、舌下或透皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。因此，本发明的药物组合物可以配制为例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、乳膏剂或液体制剂，如口服或无菌非肠道溶液剂或悬浮液。此类药物制剂可以通过制药领域已知的任何方法来制备，例如使活性成分与载体或赋形剂联合。此类药物制剂可以制备为肠溶包衣的颗粒剂、片剂或胶囊剂，以适合于口服和延迟释放制剂。
当化合物与针对相同疾病具有活性的第二治疗剂组合使用时，各组分的剂量可以不同于当化合物单独使用时的量。合适的剂量是本领域技术人员容易理解的。
在根据第十五方面的本发明的一个实施方式中，提供了一种式(Ia)的化合物，其中R1a-R1d、R2、R3、R4和A----B如上文中的定义，条件是：
(i)当R3为H时，R1b和R1d各自独立地不是OH或OCH2CH＝C(CH3)2；以及
(ii)当R3为H、R1a-ld中的一个为H且R1a-1d中的至少一个为CH2CH＝C(CH3)2时，A----B不是CH＝CH。
根据第十五或十六方面，在本发明的优选实施方式中，R1a-1d的两个为H。在其它优选实施方式中，R1a-1d中的一个为H，且在其它实施方式中，R1a-1d都不为H。
在优选的实施方式中，R1a-1d中的至少一个为CH2CH＝C(CH3)2，并且在另一个优选的实施方式中，R1a-1d中的至少一个为OCH2CH＝C(CH3)2。
在某些实施方式中，R1a-1d中的至少一个为羟基，并且在某些其它实施方式中，R1a -1d中的至少两个为羟基。在另一个实施方式中，R1a-1d中的至少一个为OR4且R4为甲基，并且在又一个实施方式中，R4为苄基。
在根据第十五或十六方面的本发明的优选实施方式中，R2或R3中的至少一个为羟基。在另一个优选的实施方式中，R2和R3都为羟基。
在另一个实施方式中，R2或R3中的至少一个为OR4且R4为甲基，并且在又一个实施方式中，R4为苄基。
在本发明的优选实施方式中，式(Ia)中的基团A----B为CH＝CH或CH＝CHX-，其中X＝(CH2)pCH2，并且p为选自由0、1、2或3组成的组中的整数。
在本发明的其它实施方式中，式(Ia)中的基团A----B为CH2-CH2或CH2-CH2X，其中X＝(CH2)pCH2，并且p独立地为选自由0、1、2或3组成的组中的整数。
在优选的实施方式中，根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物具有通式(Ib)：
Figure BDA0001316762380000151
其中R4、R5和R6各自独立地选自基团OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu、OBn。
在另一个优选的实施方式中，根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物具有式(Ic)或(Id)：
Figure BDA0001316762380000152
其中R7、R8和R9各自独立地选自基团OH、OMe、-OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu。
在又一个优选的实施方式中，根据第十五或十六方面的式(Ia)的化合物具有通式(Ie)或(If)：
Figure BDA0001316762380000153
其中R7、R8和R9各自独立地选自基团OH、OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu。
优选地，根据第十五或十六方面的化合物或者其药用盐或溶剂化物选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001316762380000161
Figure BDA0001316762380000171
更优选地，根据第十五或十六方面的化合物或者其药用盐或溶剂化物选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001316762380000181
在一个实施方式中，根据十五或十六方面的化合物或者其药用盐或溶剂化物选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001316762380000191
在另一个优选的实施方式中，该化合物是USYDS18：
Figure BDA0001316762380000192
在另一个优选的实施方式中，根据第十五方面的化合物或者其药用盐或溶剂化物选自由以下各项组成的组：
Figure BDA0001316762380000201
在研究异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的初步体外试验中，本发明人观察到所有衍生物USYDS1至USYDS7对癌细胞生长的结构依赖性抑制。这些化合物的大多数表现出强效抑制几乎所有的白血病细胞系(CCRF-CEM、HL-60(TB)、K-562、MOLT-4、RPMI-8226、SR)。在一些细胞系中，生长在纳米摩尔浓度下受到抑制。在抑制癌细胞的生长上，USYDS1表现出最有效的活性，然后是USYDS10、USYDS9、USYDS2，再就是USYDS14。也观察到衍生物USYDS10和14对癌细胞生长的结构依赖性抑制。结构-活性研究显示在3-位具有甲氧基且在2-位的C-异戊烯化表现出抑制癌症细胞的最高效力。
大多数本研究中的pTHOS具有基于已知天然存在的化合物白皮杉醇结构的结构，其示出广谱的生物活性。由于其抑制各种肿瘤细胞(包括白血病、淋巴瘤；乳癌、前列腺癌、结肠癌和黑素瘤)的增殖的能力，其当前因其抗癌特性而倍受关注。认为其抗癌作用通过细胞周期停滞介导；上调Bid、Bax、Bik、Bok、Fas；P21WAF1下调Bcl-xL；BCL-2、cIAP、活化半胱天冬蛋白酶(caspase)、损耗线粒体膜电位和释放细胞色素c。已经证明白皮杉醇抑制一些转录因子的激活，这些转录因子包括NF-κΒ(其在响应由自由基、紫外线照射、细胞因子、或微生物抗原引起的细胞应激中起着核心作用)、JAK-1(在控制响应细胞外因子的细胞活性的STAT路径中的关键转录物)。
已经观察到在本研究中描述的pTHOS显示的生物活性谱类似于由白皮杉醇所显示的生物活性谱。另外，pTHOS(即USYDS1，GI50值：0.02μΜ-5μΜ)在抑制几乎所有类型的肿瘤细胞的增殖上与白皮杉醇(IC50值：5μΜ-100μΜ)相比，显示出大约250倍以上的有效性。因此，本申请中提出的pTHOS将会是药物研究和开发的极具吸引力的导向并作为进一步了解癌症的病理生理的生物工具。
化合物USYDS1和化合物USYDS2的强效细胞毒性可以用它们的增加的疏水性来解释，通过它们的计算得出的Log分配系数(Log P)值来表示。USYDS1和USYDS2具有的Log P值几乎是羟基二苯乙烯白藜芦醇的两倍。Log P值对治疗化合物的作用主要涉及组织穿透和分布。较高的Log P值将使得化合物能够更容易地穿过细胞膜和进入细胞。
在其它初步实验中，发现特定实例的O-异戊烯化羟基二苯乙烯衍生物和C-异戊烯化羟基二苯乙烯衍生物显示出对SIRT1酶的浓度依赖性抑制，该SIRT1酶为Sirtuin蛋白家族(沉默信息调节子2蛋白，Sir 2)的成员。
Sirtuin已经成为模型生物体中用于衰老和长寿的关键调节子。对sirtuin的遗传学和生理学的研究证明这种酶家族在各种细胞过程中发挥了作用，包括基因沉默、细胞死亡、脂肪酸代谢、神经元的保护和寿命延长。
为了不受任何特定的理论的约束，提出SIRT1活性的调节可以致使治疗疾病(包括癌症、代谢综合征、肥胖、神经退行性疾病和衰老-相关性疾病)用治疗剂的开发。
在优选的实施方式中，根据第十五或十六方面，式(Ia)的化合物是化学合成的。在另一个优选的实施方式中，式(Ia)的化合物分离自蜂胶，其中所述蜂胶来源于鳞籽莎属(Lepidosperma genus)的植物。在又一个实施方式中，式(Ia)的化合物分离自鳞籽莎属的树脂、树胶或渗出物。
根据本发明的第二十方面，在式(Ib)、(Ic)、(Id)、(Ie)或(If)的化合物的制备中，优选地步骤(ii)中的缩聚反应是在钯催化剂的存在下进行的。优选地，钯催化剂是乙酸钯(II)。
优选地，步骤(iii)中的烷基化反应是在金属氢化物和卤代异戊烯基试剂的存在下进行的。优选地，所述金属氢化物是氢化钠；但是本领域技术人员能够理解其它已知的金属氢化物也可以使用。最优选的卤代异戊烯基试剂是BrCH2CH＝C(CH3)2。
在优选的实施方式中，步骤(iv)或(vi)中的氢化反应是在钯催化剂的存在下在溶剂的混合物中进行的。最优选地，钯催化剂是碳载钯(palladium on carbon)，且溶剂的混合物包含1,4-环己二烯和乙醇。但是，本领域技术人员能够理解任何其它适合的试剂和溶剂也可以使用。
在优选的实施方式中，步骤(v)中的重排反应是在硅酸镁颗粒
Figure BDA0001316762380000211
二氧化硅或氧化铝颗粒的存在下进行的。在另一个优选的实施方式中，所述重排反应可以在微波辐射或光的存在下进行。在又一个实施方式中，步骤(v)中的重排反应是在硅酸镁颗粒
Figure BDA0001316762380000221
二氧化硅或氧化铝颗粒的存在下和在微波辐射或光的存在下进行的。
附图说明
图1为一些分离的和合成的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的总结。
图2为概述新型O-异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物和C-异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的合成的流程图。
图3显示了对于各种细胞系，化合物USYDS1对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图4显示了对于各种细胞系，化合物USYDS2对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图5显示了对于各种细胞系，化合物USYDS3对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图6显示了对于各种细胞系，化合物USYDS4对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图7显示了对于各种细胞系，化合物USYDS9对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图8显示了对于各种细胞系，化合物USYDS6对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图9显示了对于各种细胞系，化合物USYDS7对人类癌细胞生长的抑制的剂量响应曲线。
图10用图表示出了二苯乙烯化合物对自由基清除的效果。
图11用图表示出了二苯乙烯化合物对NAD-依赖性脱乙酰基酶sirtuin-2(SIRT1)的浓度依赖性抑制。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的本质，现在将描述如下的若干实施例：
材料
将从莎草(鳞籽莎属粘质(Lepidosperma viscidum))收集的观察的蜜蜂捕获在塑料管中，盖上盖子并冷冻。剪下并汇集带有蜂胶的蜜蜂后腿的部分。收集来自植物的树脂并存贮在-20℃直到分析。得到植物样品并在40℃下在通风烘箱(Thermoline,NSWAustralia)中干燥过夜以提供植物学者鉴定用的凭证标本，A/Prof Murray Henwood,JohnRay Museum,University of Sydney,Sydney,Australia，并且登记为鳞籽莎属粘质(Lepidosperma viscidum)化学型la，凭单号Duke 100222-42和鳞籽莎属粘质化学型2a，凭单号Duke 100221-21。
使用76个由3个10-框架盒制成的蜂箱(每个蜂箱在蜂箱罩盖下配有蜂胶垫)来收集蜂胶样品。在位于袋鼠岛中南部地区的蜂房场所的位置上使用独立编号的蜂箱。
正相短柱色谱(NPSCC)用的预涂有硅胶60F254和硅胶60H的薄层层析板购自Merck。用UVGL-58矿物光灯Multiband UV-2544/366目测TLC板。
在分离和合成中使用的所有化学品都购自Sigma-Aldrich Pty Ltd(CastleHill,NSW,Australia)，包括氘化的NMR溶剂(例如氯仿-d和甲醇-d4)、氘化的二甲基亚砜(d6-二甲基亚砜)。溶剂包括己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、乙醇、甲醇和乙酸，都是分析纯的并且购自Ajax FineChem,Taren Point,NSW,Australia或Asia Pacific SpecialtyChemical Ltd(APS)。
使用Rotavapor型R-114旋转蒸发器以40-60℃范围的水浴温度来蒸发溶剂馏分。真空泵V-700或1684930_1.doc。
使用具有真空控制器V-800或V-850的Vacuubrand MD 4C NT隔膜泵(VacuubrandGMBH,Wertheim,Germany)。使用DirectTorr真空泵(Sargent-Welch,Buffalo,USA)通过Napco 5831真空烘箱(NAPCO,Salt Lake City,USA)进行最终的干燥。
制备性HPLC是在反相柱(Grace,Alltima C18 5μΜ22mm ID×250mm)上的Shimadzu制备梯度LC-8A系统上进行的，注射体积500μL，用甲醇(75％)和水以10mL/min进行洗脱，并且使用紫外-可见光检测器(Shimadzu SPD-20A)在280nm下进行检测。分析HPLC是在Shimadzu UFLC、LC-20AD泵、SIL-20A HT自动进样器上利用Hewlett-Packard柱(NUCLEOSIL 100C18,5μm,4mm×125mm)来进行的，注射体积20μL，用甲醇-水-乙酸(70:29.8:0.2)在1mL/min下进行洗脱，并且用紫外-可见光检测器(Shimadzu SPD-20A)在230nm下进行检测。
1H和13C核磁共振(NMR)分析是在具有SMS自动进样器的Varian 400MHz系统(PaloAlto,California,USA)上进行的。NMR光谱以四甲基硅烷(TMS)为参照物。质谱是从ThermoFinnigan TSQ 7000(LC-MS/MS系统)和Finnigan Polaris Ion Trap MS/MS系统(Finnigan,San Jose,USA)使用Xcalibur 1.2数据系统来获得的。
植物和蜂胶样本的1H-NMR化学概况(profile)的测定
在室温下将来自茎基部(0.1g)、蜜蜂后腿(0.1g)和蜂箱蜂胶(1.0g)的树脂样品用乙酸乙酯萃取15min。过滤萃取液，在减压下干燥并通过1H-NMR和HPLC分析。发现来自莎草-1型的样品含有作为主要成分的异戊烯化羟基二苯乙烯和肉桂酸酯，而来自莎草-2型的那些样品显示只有异戊烯化二苯乙烯作为主要成分，如上所述。然后选择蜂胶样品以分离出所述组分。
来自袋鼠岛的蜂胶的异戊烯化多羟基二苯乙烯的分离和鉴定。
一般方法
在室温下用二氯甲烷以搅拌1小时来萃取蜂胶(10g)。使用正相短柱色谱(NPSCC)纯化萃取物。采用由二氯甲烷(DCM)和乙酸乙酯(EtOAc)组成的以0、1、2、4、8、10、15、20、50和100％组成的逐步梯度流动相(2x 100mL)来洗脱各组分，然后通过TLC和NMR分析。如果需要，随后在相同的NPSCC上以不同的由乙烷和EtOAc或由己烷和异丙醇组成的流动相进一步纯化化合物。当需要进一步纯化化合物时，也采用正相制备HPLC(Shimadzu LC-8A)。在室温下，以含2％异丙醇的己烷为流动相，以10mL/min的流速使化合物洗脱通过硅胶柱(
Figure BDA0001316762380000241
silica 10μm,10cm x 250cm)。用UV检测器(UV/Vis SPD-20A)在280nm下监控化合物的洗脱。通过1H-和13C-NMR和质谱(包括高分辨质谱)来表征这些纯化合物的结构和特性。当需要时，也使用梯度异核多重键的相干性(GHMBC)通过2D-NMR来进行分离的化合物的详细结构分析。
分离的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物：
(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-4',5-二羟基-3,3'-二甲氧基二苯乙烯(USYDS1)。
Figure BDA0001316762380000251
浅黄色液体。C21H24O4 1H NMR(甲醇-d4 400MHz):Rt 14.64min.δ7.16(d,J＝16Hz,H),7.07(d,J＝4Hz,H),6.94(dd,J＝8,4Hz,H),6.86(d,J＝19Hz,H),6.78(d,J＝8Hz,H),6.63(d,J＝4Hz,H),6.34(d,J＝4Hz,H),5.06(m,H),3.89(s,3H),3.77(s,3H),3.39(m,2H),1.80(bs,3H),1.66(bs,3H).13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ158.5,154.4,146.7,145.6,138.1,130.6,130.4,130.3,124.3,123.7,120.7,120.6,114.5,108.2,103.9,98.2,55.9,55.7,25.8,24.5,18.0；CI-MS:m/z 339(M-1)-,HRESIMS:m/z 341.1749(M+H)+,C21H25O4的计算值341.1747.
(E)-3-(-3-甲基-2-丁烯基氧基)-4’,5-二羟基-3’-甲氧基二苯乙烯(USYDS2)。
Figure BDA0001316762380000252
浅黄色液体。C20H22O4 1H NMR(甲醇-d4,400MHz):Rt 15.46min.δ7.12(d,J＝4Hz,1H),7.01(d,J＝16Hz,1H),6.97(dd,J＝8,4Hz,1H),6.88(d,J＝16Hz,1H),6.78(d,J＝8Hz,2H,6.56(m,1H),6.24(m,1H),5.46(m,1H),4.52(d,J＝4Hz,2H),3.90(s,3H),1.79(bs,3H),1.76(bs,3H).13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ160.2,156.9,146.7,145.5,139.9,138.6,129.9,129.2,126.2,120.6,119.4,114.7,108.4,105.9,105.4,101.5,65.0,55.9,25.8,18.2；CI-MS m/z 325(Μ-1)-,HRESIMS m/z 327.15938(M+H)+,C20H23O4的计算值327.1591.
(E)-4-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,3’,5-三羟基-4’-甲氧基二苯乙烯(USYDS3)。
Figure BDA0001316762380000253
浅黄色液体。C20H22O4 1H NMR(甲醇-d4,400MHz):Rt 11.46min.δ7.08(d,J＝4Hz,1H),6.93(dd,J＝8,4Hz,1H),6.91(d,J＝16Hz,1H),6.78(d,J＝16Hz,1H),6.77(d,J＝8Hz,1H),6.46(s,2H),5.23(m,1H),3.89(s,3H),3.28(m,2H),1.76(bs,3H),1.65(bs,3H)；CI-MS:m/z 325(M-l)-；HRMS:325.14453[M-1]-,(C20H21O4的计算值325.14398).
(E)-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-3',4',5-三羟基二苯乙烯(USYDS4)。
Figure BDA0001316762380000261
浅黄色液体。C19H20O4 1H NMR(甲醇-d4,400MHz):Rt 18.62min.δ6.98(d,J＝4Hz,1H),6.94(d,J＝16Hz,1H),6.85(dd,J＝8,4Hz,1H),6.80(d,J＝16Hz,1H),6.74(d,J＝8Hz,1H),6.53(m,2H),6.23(m,1H),5.46(m,1H),4.51(d,J＝4Hz,2H),1.79(bs,3H),1.76(bs,3H)；13C NMR(甲醇-d4,100MHz):δ160.2,158.2,145.2,145.1,139.8,136.9,129.5,128.5,125.5,119.9,118.8,114.9,112.4,105.2,103.8,100.7,64.4,24.4,16.8；CI-MS:m/z 311(M-l)-；HREIMS:m/z 335.1252(M+Na)+,C19H20O4Na的计算值335.1259.
(E)-2,4-二(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,4',5-三羟基二苯乙烯(USYDS6)。
Figure BDA0001316762380000262
灰白色固体。C24H28O3 1H NMR(甲醇-d4,400MHz):Rt 9.35min.δ7.30(d,J＝8Hz,2H),7.11(d,J＝16Hz,1H),6.80(d,J＝16Hz,1H),6.76(d,J＝8Hz,2H),6.63(s,1H),5.21(m,1H),5.10(m,1H),3.41(m,2H),3.35(m,2H),1.81(bs,3H),1.78(bs,3H),1.68(bs,6H)；CI-MS:m/z 363(M-1)-.
(E)-2,4-二(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,3',4',5-四羟基二苯乙烯(USYDS7)。
Figure BDA0001316762380000263
灰白色固体。C24H28O4 1H NMR(甲醇-d4,400MHz):Rt 10.46min.δ7.07(d,J＝16Hz,1H),6.94(d,J＝4Hz,1H),6.79(dd,J＝8,4Hz,1H),6.73(d,J＝16Hz,1H),6.71(d,J＝8Hz,1H),6.62(s,1H),5.21(m,1H),5.10(m,1H),3.41(m,2H),3.35(m,2H),1.81(bs,3H),1.78(bs,3H),1.68(bs,6H)；CI-MS:m/z 379(M-l)-；HRMS:379.19148[M-1]-,(C24H27O4的计算值379.19092).
(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,3',4',5-四羟基二苯乙烯(USYDS8)。
Figure BDA0001316762380000271
C19H20O4 1H NMR(丙酮-d6,400MHz):δ7.07(d,J＝2Hz,1H),7.15(d,J＝16Hz,1H),6.89(dd,J＝8,2Hz,1H),6.81(d,J＝8Hz,1H),6.80(d,J＝16Hz,1H),6.63(d,J＝2Hz,1H),6.35(d,J＝2Hz,1H),5.15(t,J＝7Hz,1H),3.42(d,J＝7Hz,2H),1.81(s,3H),1.65(s,3H).13C NMR(丙酮-d6,100MHz):δ155.9,155.8,145.4,145.3,138,4,130.1,129.7,129.4,124.5,123.9,117.4,119.0,115.4,112.9,103.4,101.6,24.0,25.0,17.2.HRESIMS:(m/z)313.1434(M+H)+,C19H21O4的计算值313.1440.
(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3',4',5-三羟基-3-甲氧基二苯乙烯(USYDS9)。
Figure BDA0001316762380000272
C20H22O4 1H NMR(丙酮-d6,400MHz):δ7.16(d,J＝16Hz,1H),7.07(d,J＝2Hz,1H),6.90(dd,J＝8,2Hz,1H),6.85(d,J＝16Hz,1H),6.82(d,J＝8Hz,1H),6.71(d,J＝2Hz,1H),6.39(d,J＝2.3Hz,1H),5.09(1H,t,J＝7Hz,1H),3.78(s,3H),3.40(d,J＝7Hz,2H),1.80(s,3H),1.64(s,3H).13C NMR(丙酮-d6,100MHz):δ158.5,156.3,145.3(2C),138.0,130.1,130.0,129.6,123.7,124.2,119.1,118.9,115.3,112.9,103.7,98.1,55.0,25.0,23.9,17.2.HRESIMS:m/z 327.1592(M+H)+,C20H23O4的计算值327.1596.
(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,4',5-三羟基-3'-甲氧基二苯乙烯(USYDS10)。
Figure BDA0001316762380000281
C20H22O4 1H NMR(丙酮-d6,400MHz):δ7.13(d,J＝16Hz,1H)7.02(dd,J＝8,2Hz,1H),7.00(s,1H),6.92(d,J＝8Hz,1H),6.85(d,J＝16Hz,1H),6.66(d,J＝2Hz,1H),6.30(d,J＝2Hz,1H),5.20(t,＝7Hz,1H),3.95(s,3H),3.43(d,J＝7Hz,2H),1.84(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(丙酮-d6,100MHz):δ155.4,154.4,146.7,145.7,138.8,133.6,131.2,130.1,124.2,122.5,120.5,117.7,114.6,108.4,105.3,102.5,55.9,25.8,25.1,18.0.HRESIMS:m/z349.1411(M+Na)+,C20H22O4Na的计算值349.1416.
(E)-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-4',5-二羟基二苯乙烯(USYDS11)。
Figure BDA0001316762380000282
C19H22O3 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.38(dd,J＝7,2Hz,2H),7.00(d,J＝16Hz,1H),6.84(d,J＝16Hz,1H),6.82(dd,J＝7,2Hz,2H),6.64(t,J＝2Hz,1H),6.56(t,J＝2Hz,1H),6.33(t,J＝2Hz,1H),5.50(t,J＝7Hz,1H),4.51(d,J＝7Hz,2H),1.81(s,3H),1.76(s,3H).13C NMR(CDCl3,100MHz):δ160.4,156.7,155.4,139.9,138.4,130.1,128.8,128.0(2C),126.3,119.5,115.6(2C),105.6,105.5,101.3,64.9,25.8,18.2.
4-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,4',5-三羟基二氢二苯乙烯(USYDS12)。
Figure BDA0001316762380000283
C19H22O4 1H NMR(CD3OD,400MHz)δ6.97(d,J＝8Hz,2H),6.66(d,J＝8Hz,2H),6.13(s,2H),5.22(t,J＝7Hz,1H),3.24[d,J＝7Hz,2H),2.72(m,2H),2.64(m,2H),1.74(s,3H),1.64(s,3H).13C NMR(CD3OD,100MHz):δ155.5(2C),154.9,140.3,132.9,129.4,128.9(2C),123.6,114.6(2C),112.3,106.5(2C),38.0,36.8,24.5,21.7,16.5.
(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-3',4',5-三羟基二苯乙烯(USYDS14)。
Figure BDA0001316762380000291
无色固体，产量12mg。ESI-MS:m/z 379[M-1]-,1H-NMR(甲醇-d4,400MHz):δ7.07(d,J＝16Hz,1H),6.96(d,J＝4Hz,1H),6.80(dd,J＝8,4Hz,1H),6.79(d,J＝16Hz,1H),6.74(d,J＝8Hz,1H),6.61(d,J＝4Hz,1H),6.32(d,J＝4Hz,1H),5.47(m,1H),5.06(m,1H),4.48(m,2H),3.37(m,2H),1.78(m,6H),1.75(m,3H),1.66(m,3H).13C-NMR(100MHz,CD3OD):δ16.75,16.80,23.84,24.45,24.54,64.86,99.04,103.41,112.39,114.96,118.71,119.14,120.14,123.54,123.97,129.51,129.70,130.01,136.78,137.95,145.08,145.09,155.59,157.47.HRMS:379.19148[M-1]-,(C24H27O4的计算值379.19092).
(E)-2,6-二(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,3',5,5'-四羟基二苯乙烯USYDS15
Figure BDA0001316762380000292
无色固体，产量9mg。ESI-MS:m/z 379[M-1]-,1H NMR(400MHz,CD3OD):δ6.91(s,1H),6.82(d,J＝16Hz,1H),6.73(s,1H),6.72(s,1H),6.28(s,1H),6.27(d,J＝16Hz,1H),5.12(m,1H),3.26(m,2H),1.65(m,6H),1.59(m,6H).13C-NMR(100MHz,CD3OD):δ16.75(2C),24.53(2C),25.60(2C),100.93,112.27,114.86,117.66(2C),118.24,124.06,124.63(2C),128.93(2C),130.20,133.33,139.41,144.73,144.97,153.04(2C).HRMS:379.19149[M–1]-,(C24H27O4的计算值379.19092).
(E)-2,6-二(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,4',5-三羟基-3'-甲氧基二苯乙烯USYDS18
Figure BDA0001316762380000301
产量5mg。ESI-MS:m/z 393[M-1]-.1H NMR:(CD3OD,400MHz)δ7.03(d,J＝2Hz,1H),6.87(d,J＝17Hz,1H),6.85(dd,J＝8,2Hz,1H),6.77(d,J＝8Hz,1H),6.33(d,J＝17Hz,1H),6.30(s,1H),5.14(br t,J＝6Hz,2H),3.88(s,3H),3.26{br d,J＝6Hz,4H),1.66{br s,6H),1.60(br s,6H).13C NMR(CD3OD,100MHz):δ18.37.(2C),26.12(2C),27.20(2C),56.53,102.58,110.27,116.42,119.23(2C),121.03,126.02(2C),126.31,130.41(2C),131.7,134.87,140.95,147.51,149.26,154.65(2C).HRMS:417.20363[M+23]+,(C25H30O4Na的计算值417.20418).
异戊烯化多羟基二苯乙烯的化学改性及合成
A.O-异戊烯基多羟基二苯乙烯至C-异戊烯基多羟基二苯乙烯的重排
在微波反应器(CEM Discover Microwave)中于120℃将USYDS2(5mg)和Florisil(5mg)在二甲苯(2ml)中的混合物加热30min。在减压下干燥产物并使用NPSCC纯化。检测到两种重排产物，组合产率为约30％。
检测到的主产物为(E)-4-(3-甲基-2-丁烯-l-基)-3,4',5-三羟基-3'-甲氧基二苯乙烯(USDYS13)：
Figure BDA0001316762380000302
检测到的次产物为(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-l-基)-3,4',5-三羟基-3'-甲氧基二苯乙烯(USYDS 10)。
B.异戊烯化多羟基二苯乙烯的合成
1. 3,5-二羟基苯甲酸甲酯(1)的制备
向3,5-二羟基苯甲酸(10g,64.9mmol)的无水甲醇(150mL)溶液中滴加乙酰氯(2mL,28.1mmol)。在N2下将混合物加热回流17小时。蒸去溶剂并将残留物溶解于乙酸乙酯(100mL)中，然后用饱和碳酸氢钠(3x 100mL)洗涤。用水(2x 100mL)洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩得到作为无色固体的2(9.80g,90％)：mp 167-168℃(lit.1mp168-169℃)；1H NMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.66(s,2H),7.00(d,J＝2.4Hz,2H),6.59(t,J＝2.4Hz,2H),3.83(s,3H)。
2. 3-羟基-5-苄氧基苯甲酸甲酯(2)的制备
在0℃在N2下，向NaH(60％分散于矿物油中，3.3g，137.3mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(100mL)的悬浮液中加入2(10g，59.5mmol)的无水DMF(30mL)溶液，然后滴加苄基溴(6.4mL，53.8mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，用冷水(50mL)冷激，用冷的1MHC1(20mL)酸化并且使用二乙醚(3x 50mL)萃取。用水(2x 50mL)洗涤合并的有机萃取物，用硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。使用NPSCC使用由氯仿/乙醇组成的逐步梯度纯化产物得到灰白色固体的2(4.5g，60％)2：mp 97-98℃(lit.3mp 98℃)；C15H14O4 1′HNMR(400MHz,CDC13)δ8.01(s,1H),7.43-7.33(m,5H),7.24(dd,J＝2.0,1.2Hz,1H),7.20(dd,J＝2.0,1.2Hz,1H),6.70(t,J＝2.0Hz,1H),5.07(s,2H),3.90(s,3H)。
3. 3-羟基-5-苄氧基苯甲酸(3)的制备
向2(4.5g，16.7mmol)的甲醇(30mL)溶液中加入1M NaOH(60mL 60mmol)。在45℃在N2下，将所得到的反应混合物搅拌4小时，然后加入1M HC1(50mL)以酸化该溶液，然后用乙酸乙酯(3x 40mL)萃取。用水(2x 30mL)洗涤合并的有机萃取液并用硫酸钠干燥。在真空下蒸发出溶剂得到作为灰白色固体的3(4.02g，94％)：mp 196-198℃；C14H12O4 1′HNMR(400MHz,丙酮-d6)δ7.42-7.33(m,5H),7.21(dd，J＝2.4,1.2Hz,1H),7.11(dd,J＝2.4,1.2Hz,1H),6.68(t,J＝2.4Hz,1H),5.07(s,2H)。
4. 3-羟基-5-甲氧基苯甲酸(4)的制备
使用甲基碘代替苄基溴如上所述来制备标题化合物，得到作为灰白色固体的4，mp199-200℃(lit.4mp.199-200℃)；C8H8O4 1HNMR(400MHz,丙酮-d6)δ8.01(s,2H),7.16(t,J＝1.2Hz,1H),7.13(t,J＝1.2Hz,1H),6.15(t,J＝2.4Hz,1H),3.82(s,3H)。
5. 3-乙酰氧基-5-苄氧基苯甲酸(5)的制备
向3(4.02g，17.6mmol)的乙酸酐(20mL，21.6mmol)溶液中加入吡啶(10％，0.15mL，1.76mmol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，用水(30mL)冷激，通过0.1M HCl(10mL)酸化并且使用乙酸乙酯(3x 40mL)萃取。用水(2x 30mL)洗涤合并的有机萃取液，用硫酸钠干燥并且过滤。真空蒸去溶剂并且在己烷/乙酸乙酯的(1:1)混合物中重结晶得到作为粉红色晶体的5(3.86g，96％)5：mp 133-134℃；C16H14O5 1H NMR(400MHz,CDC13)δ7.59(dd,J＝2.4,1.2Hz,1H),7.45(dd,J＝2.4,1.2Hz,1H),7.43-7.34(m,5H),6.99(t,J＝2.4Hz,1H),5.1(s,2H),2.32(s,3H)。
6. 3-乙酰氧基-5-甲氧基苯甲酸(6)的制备
如5中所述的制备标题化合物，得到作为灰白色固体的6：mp151-153℃；C10H10O5 1HNMR(400MHz,CDC13)δ7.50(dd,J＝2.0,1.4Hz,1H),7.43(dd,J＝2.0,1.4Hz,1H),6.90(t,J＝2.0Hz,1H),3.86(s,3H),2.32(s,3H)。
7. 3-甲氧基-4-苄氧基苯甲醛(7)的制备
在0℃在N2下，通过注射器向NaH(60％分散于矿物油中，1.6g，66.6mmol)的无水DMF(50mL)的悬浮液中缓慢加入香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，4g，26.3mmol)的无水DMF(20mL)溶液，然后逐滴加入苄基溴(3mL，25.2mmol)。将该混合物在室温下搅拌4小时，用冷水(30mL)冷激，用冷的1M HCl(15mL)酸化并且使用二乙醚(3x 40mL)萃取。用水(2x 30mL)洗涤合并的有机萃取液，用硫酸钠干燥并且减压干燥得到作为无色固体的7(6g,92％)：mp60-62℃(lit.6mp 61-62℃)；C15H14O3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.84(s,1H)),7.43-7.31(m,7H)),7.00(d,J＝8.4Hz,1H)),5.25(s,2H)),3.95(s,3H))。
8. 4-甲氧基-3-苄氧基苯甲醛(8)的制备
如7中所述的制备标题化合物，得到作为无色固体的8：mp 61-63℃(lit.7mp 61-63℃)；CI5H14O3 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.80(s,1H)),7.49-7.31(m,7H))，7.00(d,J＝8.1Hz,1H)),5.20(s,2H)),3.97(s,3H))。
9. 4-乙烯基-2-甲氧基-1-苄氧基苯(9)的制备
在0℃在N2下，向甲基三苯基溴化膦(6.5g，18.2mmol)的无水四氢呋喃(THF)(15mL)的悬浮液中加入叔丁醇钾(2.3g，20.5mmol)，并且将反应混合物温热至室温。逐滴地加入苄基香草醛(7)(4g，16.5mmol)的无水THF(15mL)溶液并搅拌2小时，然后用冷水(20mL)冷激，用0.1M HCl(20mL)酸化，并且使用乙酸乙酯(3x 40mL)萃取。用20％氯化钠水溶液(20mL)洗涤合并的有机萃取液，然后减压干燥。使用NPSCC使用由己烷/乙酸乙酯组成的逐步梯度流动相纯化产物，得到作为无色固体的9(3.37g，85％)；mp 53-54℃(lit.8mp 50-51℃)；C16H16O2 1H NMR(400MHz,CDC13)δ7.45-7.28(m,5H),6.99(d,J＝2Hz,1H),6.90(dd,J＝4,1Hz,1H),6.83(d,J＝4Hz,1H),6.68(dd,J＝17,1Hz,1H),5.64(dd,J＝17,1Hz,1H),5.17(s,2H),5.14(d,J＝1Hz,1H),3.92(s,3H)。
10. 5-乙烯基-2-甲氧基-1-苄氧基苯(10)的制备
如9中所述的制备标题化合物，得到作为灰白色固体的10；mp68-69℃(lit.9mp68-69℃)；C16H16O2 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.48-7.31(m,5H),7.01(d,J＝2Hz,1H),6.97(dd,J＝8,2Hz,1H),6.85(d,J＝8Hz,1H),6.64(dd,J＝17,1Hz,1H),5.56(dd,J＝17,1Hz,1H),5.17(s,2H),5.12(d,J＝1Hz,1H),3.92(s,3H)。
11.E-1-[3-乙酰氧基-5-苄氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(11)的制备:
在N2下在室温下，向N,N-二(2,6-二异丙基)二氢氯化咪唑(0.093g，10％，0.217mmol)和Pd(OAc)2(0.048g，10％，0.217mmol)的二甲苯(3mL)溶液中加入5的酰氯(0.7g，2.17mmol)的二甲苯溶液2mL，随后加入4-乙基吗啉(0.04mL，0.316mmol)和试剂9(0.627g，2.61mmol)的二甲苯(3mL)溶液。将该混合物在130℃加热18-22小时。真空蒸去溶剂并且使用NPSCC(己烷/乙酸乙酯3:1作为流动相)纯化该产物得到作为黄色油状物的11(0.33g，31.6％)；C31H28O5 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.28(m,13H),7.06(d,J＝2.0Hz,1H),7.02(d,J＝17Hz,1H),6.97(dd,J＝6,2Hz,1H),6.89(m,1H),6.62(t,J＝2Hz,1H),5.18(s,2H),5.07(s,2H),3.94(s,3H),2.30(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.39,159.78,151.81,149.79,148.32,139.82,137.00,136.57,130.48,129.78,128.63(2C),128.58(2C),128.10,127.88,127.55(2C),127.24(2C),126.02,119.98,113.95,1 12.02,110.50,109.48,107.28,71.0,70.27,56.02,21.19；CI-MS m/z(％):481(M+1)+,503(M+Na)+；HRMS:m/z 503.1828(M+Na)+,C31H28O5Na的计算值503.1834。
12.E-1-[3-乙酰基-5-苄氧基苯基]-2-[3-苄氧基-4-甲氧基苯基]乙烯(12)的制备
如11中所述的将5的酰氯与试剂10缩聚来制备标题化合物。从己烷/甲苯的混合物(2:1)中对产物进行重结晶得到微黄色针状结晶；C31H28O5mp 133-134℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49-7.29(m,10H),7.07(d,J＝2Hz,1H),7.05(dd,J＝8,2Hz,1H),6.97(d,J＝16Hz,1H),6.95(t,J＝2Hz,1H),6.89(d,J＝8Hz,1H),6.84(t,J＝2Hz,1H),6.82(d,J＝16Hz,1H),6.62(t,J＝2Hz,1H),5.18(s,2H),5.07(s,2H),3.94(s,3H),2.30(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.39,159.76,151.80,149.90,148.34,139.83,137.05,136.58,129.94,129.78,128.64(2C),128.60(2C),128.11,127.94,127.58(2C),127.38(2C),125.88,120.59,112.00,1 11.91,1 1 1.81,110.52,107.22,71.16,70.27,56.06,21.18(CH3CO)；CI-MS m/z 481(M+1)+,503(M+Na)+；HRMSm/z 503.1832(M+Na)+,C31H28O5Na的计算值503.1834。
13.E-1-[3-乙酰氧基-5-甲氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(13)的制备
如11中所述的将6的酰氯与试剂9缩聚来制备标题化合物，得到作为灰白色固体的标题化合物；mp 104-106℃；C25H24O5 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.30(m,8H),7.07(d,J＝2Hz,1H),7.03(d,J＝16Hz,1H),6.98(dd,J＝8,2Hz,1H),6.90(d,J＝16Hz,1H),6.88(m,1H),5.18(s,2H),3.95(s,3H),3.83(s,3H),2.31(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.41,160.58,151.83,149.78,148.31,139.76,137.00,130.49,129.72,128.58(2C),127.88,127.24(2C),126.07,119.97,113.94,111.73,109.67,109.46,106.54,71.01,56.02,55.50,21.18；CI-MS m/z 405[M+1]+；HRMS m/z 405.1695(M+H)+,C25H25O5的计算值405.1702。
14.E-1-[3-羟基-5-苄氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(14)的制备
在0℃在N2下，向二苯乙烯11(0.04g，0.083mmol)在混合溶剂(MeOH/THF/H2O，3/3/3mL)的溶液中加入NaOH(0.02g，0.35mmol)。将反应混合物温热至室温并且搅拌3小时。用0.1M HCl(5mL)将溶液酸化并且使用乙酸乙酯(3x 20mL)萃取。用20％氯化钠水溶液(10mL)洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥和真空蒸发。使用NPSCC(己烷/乙酸乙酯的流动相)纯化产物，然后重结晶得到作为无色固体的14(0.016g，44.5％)；mp 114-115℃；C29H26O4 1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.28(m,10H),7.06(d,J＝2Hz,1H),7.00(d,J＝16Hz,1H),6.98(dd,J＝8,2Hz,1H),6.87(d,J＝8Hz,1H),6.86(d,J＝16Hz,1H),6.71(t,J＝2.0Hz,1H),6.59(t,J＝2Hz,1H),6.38(t,J＝2Hz,1H),5.18(s,2H),5.07(s,2H),3.95(s,3H)；13CNMR(100MHz,甲醇-d4)δ160.29,156.78,149.76,148.19,139.92,136.98,136.84,130.65,129.20,128.61(2C),128.57(2C),128.02,127.88,127.49(2C),127.26(2C),126.54,119.94,113.96,109.45,105.97,105.69,101.54,71.02,70.01,56.03；CI-MS:461(M+Na)+,439(M+1)+；HRMS m/z 439.1908(M+H)+,C29H27O4的计算值439.1909。
15.E-1-[3-羟基-5-苄氧基苯基]-2-[3-苄氧基-4-甲氧基苯基]乙烯(15)的制备
如对化合物14所述的对12进行碱性水解得到作为无色固体的标题化合物；mp117-119℃；C29H26O4 1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.49-7.30(m,10H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H),7.06(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.96(d,J＝16.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.0Hz,1H),6.79(d,J＝16.4Hz,1H),6.99(t,J＝1.6Hz,1H),6.57(t,J＝2.0Hz,1H),6.38(t,J＝2.4Hz,1H),5.19(s,2H),5.07(s,2H),3.90(s,3H)。13C NMR(100MHz,甲醇-d4)δ160.20,158.30,149.68,148.25,139.70,137.41,137.31,130.62,128.16,128.07(2C),128.05(2C),127.52,127.41(3C),127.15(2C),126.62,120.35,111.95(2C),105.67,104.09,101.11,70.88,69.56,55.10；CI-MS:m/z 461(M+Na)+,439(M+1)+；HRMS m/z439.1907(M+H)+,C29H27O4的计算值439.1909。
16.E-1-[3-羟基-5-甲氧基苯基)-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(16)的制备
如对化合物14所述的对13进行碱性水解得到作为淡黄色固体的标题化合物；mp110-112℃；C23H22O4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45-7.28(m,5H),7.07(d,J＝2Hz,1H),7.00(d,J＝16Hz,1H),6.98(dd,J＝8,2Hz,1H),6.87(d,J＝17Hz,1H),6.85(d,J＝8Hz,1H),6.62(t,J＝2Hz,1H),6.57(t,J＝2Hz,1H),6.31(t,J＝2Hz,1H),5.17(s,2H),3.94(s,3H),3.81(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ161.08,156.86,149.73,148.16,139.85,136.96,130.69,129.11,128.57(2C),127.90,127.29(2C),126.61,119.95,113.97,109.47,105.72,104.73,100.72,71.03,56.03,55.36；CI-MS,m/z 384(M+Na)+,363(M+1)+；HRMS m/z363.1592(M+H)+,C23H23O4的计算值363.1596。
17.E-1-[3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-5-苄氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(17)的制备
Figure BDA0001316762380000361
在0℃在N2下，向NaH(60％分散于矿物油中，0.0051g，0.213mmol)的无水DMF(5mL)悬浮液中逐滴加入二苯乙烯14(0.04g，0.091mmol)的DMF(3mL)溶液，然后逐滴加入3,3-二甲基烯丙基溴(0.011mL，0.091mmol)2。将该混合物在室温下搅拌2-3小时，然后用冷水(5mL)冷激，用冷的0.1M HCl(5mL)酸化并且使用二乙醚(3x 10mL)萃取。用水(2x 10mL)洗涤合并的有机萃取液并且减压干燥。使用NPSCC(己烷/乙酸乙酯作为流动相)对产物进行纯化得到作为淡黄色油状物的17(0.02g，43.3％)；C34H34O4 1H NMR(400MHz,CDC13)δ7.46-7.28(m,10H),7.07(d,J＝2Hz,1H),7.01(d,J＝16Hz,1H),6.96(d,J＝2Hz,1H),6.90(d,J＝16Hz,1H),6.87(d,J＝8Hz,1H),6.73(t,J＝2Hz,1H),6.68(t,J＝2Hz,1H),6.48(t,J＝2Hz,1H),5.52(m,1H),5.17(s,2H),5.07(s,2H),4.52(d,J＝7Hz,2H),3.95(s,3H),1.80(d,J＝1Hz,3H),1.76(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.21,160.12,149.78,148.14,139.49,138.35,137.03,136.94,130.76,128.94,128.59(2C),128.56(2C),127.94,127.86,127.54(2C),127.24(2C),126.97,119.87,119.53,1 13.98,109.43,105.38,105.32,101.14,71.01,70.09,64.84,56.03,25.85,18.22；CI-MS:m/z 529(M+Na)+,507(M+1)+；HRMS m/z 507.2528(M+H)+,C34H35O4的计算值507.2535。
18.E-l-[3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-5-苄氧基苯基]-2-[3-苄氧基-4-甲氧基苯基]乙烯(18)的制备
Figure BDA0001316762380000362
如对化合物17所述的对15进行异戊烯化得到作为灰白色固体的标题化合物；mp88-90℃；C34H34O4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49-7.32(m,10H),7.08(d,J＝2Hz,1H),7.06(dd,J＝8,2Hz,1H),6.97(d,J＝16Hz,1H),6.89(d,J＝8Hz,1H),6.82(d,J＝16Hz,1H),6.71(t,J＝2Hz,1H),6.66(t,5J＝2Hz,1H),6.47(t,J＝2Hz,1H),5.53(m,1H),5.20(s,2H),5.07(s,2H),4.52(d,J＝6Hz,2H),3.91(s,3H),1.80(d,J＝1Hz,3H),1.75(d,J＝1Hz,3H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ161.04,160.95,150.51,149.11,140.24,139.03,137.81,137.67,130.91,129.57,129.27(4C),128.66,128.58,128.22(2C),128.05(2C),127.50,121.10,120.20,112.48,112.40,105.95,105.86,101.60,71.55,70.47,65.18,56.36,0 26.00,18.33；CI-MS:m/z 529(M+Na)+,507(M+1)+；HRMS m/z 507.2530(M+H)+,C34H35O4的计算值507.2535。
19.E-1-[3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-5-甲氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(19)的制备
Figure BDA0001316762380000371
如对化合物17所述的对16进行异戊烯化得到作为灰白色晶体的标题化合物；mp66-69℃；C28H30Ο4 1H NMR(400MHz,CDCl3)5 7.45-7.28(m,5H),7.08(d,J＝2Hz,1H),7.02(d,J＝16Hz,1H),6.98(d,J＝2Hz,0 1H),6.90(d,J＝16Hz,1H),6.87(d,J＝8Hz,1H),6.67(t,J＝2Hz,1H),6.64(t,J＝2Hz,1H),6.40(t,J＝2Hz,1H),5.53(m,1H),5.17(s,2H),4.53(d,J＝7Hz,2H),3.96(s,3H),3.81(s,3H),1.81(d,J＝1Hz,3H),1.76(d,J＝1Hz,3H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ160.91,160.23,149.76,148.14,139.46,138.35,137.04,130.78,128.90,128.56(2C),127.87,127.25(2C),127.02,119.86,119.56,113.98,109.44,5104.96,104.49,100.37,71.02,64.82,56.04,55.36,25.86,18.22；CI-MS:m/z 453(M+Na)+；HRMS m/z 453.2036(M+Na)+,C28H30O4Na的计算值453.2042。
20.(E)-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-4',5-二羟基-3'-甲氧基二苯乙烯(20，相当于USYDS2)的制备
向17(0.02g，0.035mmol)的无水乙醇(8mL)溶液中加入1,4-环己二烯(3mL，0.030mmol)和Pd-C(10％，0.002g)。在N2下搅拌该混合物并且在80℃下回流4小时。将溶液过滤并且在减压下干燥得到油状残留物，将其通过高效液相色谱法(HPLC)进行纯化得到作为淡黄色油状物的20；C20H22O4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.02(d,J＝2Hz,1H),7.00(d,J＝16Hz,1H),6.99(d,J＝2Hz,1H),6.91(dd,J＝8,1Hz,1H),6.85(d,J＝16Hz,1H),6.64(t,J＝2Hz,1H),6.56(t,J＝2Hz,1H),6.33(t,J＝2Hz,1H),5.53(m,1H),4.52(d,J＝7Hz,2H),3.95(s,3H),1.82(d,J＝1Hz,3H),1.76(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.38,156.70,146.67,145.69,139.87,138.37,129.73,129.29,126.15,120.63,119.49,114.54,108.24,105.58,105.38,101.29,64.85,55.92,25.85,18.22；CI-MS:m/z325(M-l)-；HRMSm/z 327.1588(M+H)+,C20H23O4的计算值327.1596。
21. 3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-4',5-二羟基-3'-甲氧基二氢二苯乙烯(21)的制备
Figure BDA0001316762380000381
在脱除化合物20上的苄基的过程中，通过氢化桥连C＝C获得标题化合物。得到的标题化合物为浅黄色油状物；C20H24O4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.84(d,J＝8Hz,1H),6.69(dd,J＝8,2Hz,1H),6.62(d,J＝2Hz,1H),6.34(t,J＝2Hz,1H),6.26(t,J＝2.0Hz,1H),6.24(t,J＝2Hz,1H),),5.46(m,lH),5.46(s,1H),4.68(s,1H),4.53(d,J＝7Hz,2H),3.84(s,3H),2.85(m,4H),1.80(d,J-0.4Hz,3H),1.73(d,J＝0.5Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ160.11,156.44,146.22,144.46,143.73,138.23,133.61,120.95,119.55,114.15,111.10,107.89,107.58,99.62,64.72,55.84,38.29,37.23,25.84,18.18；CI-MS:m/z 351(M+Na)+；HRMS m/z 351.1566(M+Na)+,C20H24O4Na的计算值351.1572。
22.(E)-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-3’,5-二羟基-4’-甲氧基二苯乙烯(22)的制备
Figure BDA0001316762380000382
如对化合物20所述的脱除18的苄基得到作为浅黄色油状物的标题化合物；C20H22O4 1NMR(400MHz,CDC13)δ7.13(d,J＝2Hz,1H),6.98(d,J＝16Hz,1H),6.97(dd,J＝8,2Hz,1H),6.86(d,J＝8Hz,1H),6.86(d,J＝16Hz,1H),6.64(t,J＝2Hz,1H),6.57(t,J＝2Hz,1H),6.33(t,J＝2Hz,1H),5.60(s,lH),5.52(m,1H),4.77(s,1H),4.52(d,J＝9Hz,2H),3.91(s,3H),1.82(d,J＝1Hz,3H),1.76(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDC13)δ160.37,156.69,146.51,145.75,139.83,138.36,130.87,128.92,126.78,119.51,119.40,111.84,110.62,105.66,105.48,101.33,65.18,56.36,26.00,18.33；CI-MS:m/z 349.1408(M+Na)+,C20H22O4Na的计算值349.1416。
23. 3-(3-甲基-2-丁烯氧基)-3',5-二羟基-4'-甲氧基二氢二苯乙烯(23)的制备
Figure BDA0001316762380000391
在脱除化合物18上的苄基的过程中，通过氢化侧链上的双键获得标题化合物。所获得的标题化合物为浅黄色油状物；C20H24O4 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.79(d,J＝2Hz,1H),6.77(d,J＝4Hz,1H),6.66(dd,J＝8,2Hz,1H),6.35(t,J＝2Hz,1H),6.27(m,1H),5.56(s,1H),5.50(m,1H),4.74(s,1H),4.46(d,J＝7Hz,2H),3.88(s,3H),2.80(m,4H),1.80(d,J＝1Hz,3H),1.74(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDC13)δ160.11,156.42,145.41,144.80,144.51,138.18,135.07,119.73,119.59,114.59,110.55,107.81,107.49,99.64,64.73,55.00,38.05,36.89,25.83,18.18；CI-MS:m/z 351(M+Na)+；HRMS m/z 351.1566(M+Na)+,C20H24O4Na的计算值351.1572。
24.E-l-[2-(3-甲基-2-丁烯基)-5-羟基-3-苄氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(24)的制备
Figure BDA0001316762380000392
向17(0.024g，0.061mmol)的甲苯(30mL)溶液中加入100-200目Florisil(0.24g，10x)并且在110℃在N2下加热4小时。将反应混合物过滤，真空蒸发并且使用NPSCC(己烷/乙酸乙酯作为流动相)对红棕色残留物进行纯化得到微褐色固体(0.014g，58.3％)。在己烷/乙酸乙酯(3:1)混合物中对产物进行重结晶得到作为灰白色固体的24；mp145-150℃；C34H34O4 1H NMR(400MHz,CDC13)δ7.46-7.28(m,10H),7.20(d,J＝16Hz,1H),7.06(d,J＝2Hz,1H),6.97(dd,J＝8,2Hz,1H),6.88(d,J＝16Hz,1H),6.87(d,J＝8Hz,1H),6.68(d,J＝2Hz,1H),6.40(d,J＝2Hz,1H),5.18(s,2H),5.17(m,1H),5.05(s,2H),4.69(s,1H),3.94(s,3H),3.48(d,J＝7Hz,2H),1.73(d,J＝1Hz,3H),1.67(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ157.60,154.27,149.76,148.08,138.31,137.14,137.04,131.18,130.59,130.35,128.56(2C),128.49(2C),127.86,127.78,127.23(2C),127.21(2C),124.74,123.63,121.13,1 19.85,1 13.99,109.47,104.31,99.53,71.03,70.29,55.98,25.77,24.69,18.01。
25.E-1-[2-(3-甲基-2-丁烯基)-5-羟基-3-甲氧基苯基]-2-[3-甲氧基-4-苄氧基苯基]乙烯(25)的制备
Figure BDA0001316762380000401
如对化合物24所述的对19进行重排得到粉红色固体：mp 161-162℃；C28H30O4 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.46-7.28(m,5H),7.19(d,J＝16Hz,1H),7.06(d,J＝2Hz,1H),6.97(dd,J＝8,2Hz,1H),6.88(d,J＝16Hz,1H),6.87(d,J＝8Hz,1H),6.66(t,J＝2Hz,1H),6.40(t,J＝2Hz,1H),5.18(s,2H),5.13(m,1H),4.64(s,1H),3.94(s,3H),3.80(s,3H),3.42(d,J＝6Hz,2H),1.80(d,J＝1Hz,3H),1.68(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ158.56,154.35,149.76,148.07,138.11,137.04,131.21,130.63,130.24,128.56(2C),127.86,127.22(2C),124.73,123.61,120.78,119.84,113.99,109.42,103.88,98.21,71.03,55.97,55.68,25.77,24.46,17.98；CI-MS:m/z 453(M+Na)+,431(M+l)+；HRMS m/z 431.2217(M+l)+,C28H31O4的计算值431.2222。
26.(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-3,4',5-三羟基-3'-甲氧基二苯乙烯(26，相当于USYDS10)的制备
向24(0.02g，0.035mmol)的纯乙醇(6mL)的溶液中加入1,4-环己二烯(3mL)和Pd-C(10％，0.0035mmol)。在N2下搅拌该混合物并且在80℃下加热4小时。将溶液过滤并真空蒸发得到油状残留物，使用NPSCC(己烷/乙酸乙酯作为流动相)对其进行纯化，然后用正相HPLC(2:1己烷/异丙醇为流动相)进行纯化得到浅黄色油状的标题化合物：数据类似于USYDS10。
27.(E)-2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-5,4'-二羟基-3',3-二甲氧基二苯乙烯(27，相当于USYDS1)的制备
使用如对化合物25所述的程序制备标题化合物，得到作为浅黄色油状物的27；C21H24O4 1H NMR(400MHz,CDC13)δ7.17(d,J＝16Hz,1H),7.01(dd,J＝12,2Hz,1H),7.0(d,J＝2Hz,1H),6.91(d,J＝8Hz,1H),6.87(d,J＝16Hz,1H),6.66(t,J＝2Hz,1H),6.36(t,J＝2Hz,1H),5.15(m,1H),4.64(s,1H),3.94(s,3H),3.80(s,3H),3.42(d,J＝7Hz,2H),1.81(d,J＝1Hz,3H),1.68(d,J＝1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDC13)δ158.57,154.37,146.68,145.60,138.18,130.61,130.44,130.27,124.28,123.67,120.73,120.58,114.55,108.26,103.88,98.18,55.88,55.71,25.79,24.48,17.98；CI-MS:m/z 339(M-l)-；HRMS m/z363.1566(M+Na)+,C21H24O4Na的计算值363.1572。
28. 2-(3-甲基-2-丁烯-1-基)-5,4'-二羟基-3',3-二甲氧基二氢二苯乙烯(28)的制备
Figure BDA0001316762380000411
在脱除化合物27上的苄基的过程中，通过氢化侧链上的双键获得标题化合物。所获得的标题化合物为浅黄色油状物；C21H26O4 1H NMR(400MHz,CDC13)δ6.86(d,J＝8Hz,1H),6.70(dd,J＝8,2Hz,1H),6.64(d,J＝2Hz,1H),6.30(d,J＝2Hz,1H),6.24(d,J＝2Hz,1H),5.48(s,1H),5.07(m,1H),4.67(s,1H),3.85(s,3H),3.78(s,3H),3.28(d,J-6Hz,2H),2.82(m,4H),1.74(d,J＝1Hz,3H),1.66(d,J＝1Hz,3H)；,3C NMR(100MHz,CDC13)δ158.63,154.23,146.23,143.73,142.01,133.93,130.59,123.87,120.92,120.67,114.21,111.02,107.96,96.90,55.84,55.60,37.19,35.49,25.76,24.38,17.95；CI-MS:m/z 365(M+Na)+；HRMS m/z 365.1723(M+Na)+,C21H26O4Na的计算值365.1729。
异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的生物学评价
1.异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的抗癌活性
A)在美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)中，针对60种细胞系，评价七种异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物(即，USYDS1至USYDS7)在一系列浓度(1x 10-8-1x l0-4M)浓度下对细胞生长的抑制，如下表1中所示。
体外癌症筛选的方法：NCI所采用的一般方法
将人类肿瘤细胞系生长于含有5％牛胎血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。对于典型实验，取决于个体细胞系的倍增时间，以5000-40000细胞/孔范围内的接种密度，以100μL将细胞接种到96孔微量滴定板中。在细胞接种后，将该微量滴定板在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度的条件下温育24小时，然后加入药物。
24h后，用三氯乙酸(TCA)原位固定两个板的各细胞系，以表示在加入药物时各细胞系的细胞群的测量。以400倍于所需的最终最大测试浓度将实验药物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并且在使用前冷冻保存。在药物添加时，解冻等分试样的冷冻浓缩物，并且用含有50μg/mL庆大霉素的完全培养基将其稀释至两倍于所需的最终最大测试浓度。将100μL等分试样的药物加入到已经含有100μL培养基的适合微滴板孔中，得到所需的最终药物浓度。
在加入药物后，将板在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度的条件下再温育48h。对于贴壁细胞，通过添加冷的TCA来终止实验。通过温和添加50μL冷的50％(w/v)TCA(最终浓度，10％TCA)来原位固定细胞，并且在4℃下温育60分钟。弃去上清液，用自来水将板洗涤五次并风干。向每个孔中加入0.4％(w/v)处于1％乙酸中的磺基罗丹明B(SRB)溶液(100μL)，并且将板在室温下温育10分钟。染色后，用1％的乙酸洗涤五次去除未结合的染料，并且将板风干。随后用10mM trizma碱溶解结合的染剂，并且在自动酶标仪上在515nm的波长下读取吸光度。对于悬浮细胞，方法是一样的，除了实验是通过温和地添加50μL 80％的TCA(最终浓度，16％TCA)而将沉降的细胞固定在孔的底部来终止的，并在在自动酶标仪上在515nm的波长下读取吸光度。计算USYDS1-USYDS7各自的GI50值(细胞生长的50％抑制所需的浓度)、TGI值(细胞生长的完全抑制所需的浓度)和LC50值(50％细胞致死率或死亡所需的浓度)，结果如以下表1-3所示。
表1：pPHOS USYDS1、USYDS2、和USYDS3对人类癌症细胞生长的影响
Figure BDA0001316762380000431
Figure BDA0001316762380000441
表2：pPHOS USYDS4至USYDS6对人类癌症细胞生长的影响
Figure BDA0001316762380000442
Figure BDA0001316762380000451
Figure BDA0001316762380000461
表3：pPHOS USYDS7对人类癌症细胞生长的影响
Figure BDA0001316762380000462
Figure BDA0001316762380000471
概括来说，所有的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物USYDS1至USYDS7都示出了对癌细胞生长的结构依赖性抑制。在一些细胞系中，生长在纳摩尔浓度下受到抑制。在抑制癌细胞生长方面，USYDS1表现出了最有效的活性，然后是USYDS5，再是USYDS2。测试的其它pPHOS化合物被证明是中度的抑制剂。图3-图9所示为对于上表中所示的各细胞系，化合物USYDS1至USYDS7对人类癌细胞生长的剂量响应曲线。
值得注意的是，相对于抑制细胞生长所需的浓度(GI50值)，这些pPHOS需要至少10倍的过量浓度才能导致细胞死亡(LC50值)或导致坏死。这表明所述pPHOS可能会引起癌细胞经受程序性细胞死亡(凋亡)或细胞周期停滞。
B)美国国家癌症研究所(NCI)，针对所述细胞系在一系列浓度(1x10-8-1x 10-4M)下，评价了两种异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物(即USYDS10和USYDS14)对细胞生长的抑制，如下表4A和4B所示。
表4A：USYDS10对癌细胞生长的抑制效果
Figure BDA0001316762380000472
Figure BDA0001316762380000481
Figure BDA0001316762380000491
表4B：USYDS14对癌生长的抑制效果
Figure BDA0001316762380000492
Figure BDA0001316762380000501
概括来说，所有的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物USYDS10和USYDS14都显示出了对癌细胞生长的结构依赖性抑制。
2.各种羟基二苯乙烯的计算的Log分配系数(Log P)值
USYDS1和USYDS2以及已知的羟基二苯乙烯的计算的Log P值如下表5所示。
表5.各种羟基二苯乙烯的计算的Log P
Figure BDA0001316762380000502
pPHOS化合物(例如USYDS1和USYDS2)的有效抑制可以依据它们增加的疏水性来说明，通过它们的计算的Log分配系数(Log P)值来表示。USYDS1和USYDS2具有的Log P值几乎是羟基二苯乙烯白藜芦醇的两倍。Log P对治疗化合物的作用主要涉及组织穿透和分布。较高的LogP值将使得化合物能够更加容易地穿过细胞膜并进入细胞。
3.异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物对经UV-辐射的人类皮肤细胞的影响
在12-孔培养板中将正常成年人类角质细胞(NHK)(Invitrogen,Vic,Australia)培养于角质细胞生长培养基Epilife中直到达到亚汇合状态，所述培养基补充钙和人类角质细胞生长增补物(HKGS，含有0.2ng EGF每mL，5mg胰岛素每mL，5mg铁传递蛋白每mL，0.18mg氢化可的松每mL和0.2％牛垂体提取物)(Invitrogen,Vic,Australia)。在37℃下在具有5％二氧化碳的增湿培养箱中，在24-孔板中将细胞培养24h至密度为5x103细胞每mL/孔，并且根据以下所述的方法来测试：
UV辐射的最佳剂量的测定
使用PBS(磷酸盐缓冲液)将如上所述的密度接种的细胞洗涤两次，然后使用一系列公知为MED(最小红斑量，1MED＝25.43/光强度)的UVA和UVB剂量进行辐射。将细胞更换生长培养基并且在37℃于具有5％二氧化碳的增湿培养箱中温育约24h。使用MTS检测((CellTiter
Figure BDA0001316762380000511
AQueous单溶液细胞增殖检测)(Promega,Vic Australia)测量细胞活力。
救援(rescue)检测
用PBS将细胞洗涤两次，用PBS薄层进行更换，然后用如所确定的最佳剂量的UVA和UVB进行辐射。在辐射后，立即地用含有一系列浓度的测试样品的新鲜培养基对细胞进行更换，并且在增湿的CO2培养箱中在37℃下再温育24小时。收集上清液并且保持在-80℃直到使用ELISA试剂盒测量PGE2和细胞因子(IL1、IL6、IL8、IL10和IL12)的浓度。
防护检测
用PBS将细胞洗涤两次，用含有不同浓度的测试化合物的PBS薄层进行更换，然后使用如上所确定的最佳剂量的UVA和UVB进行辐射。在辐射后，立即用新鲜培养基对细胞进行更换，并且在增湿的CO2培养箱中在37℃下再温育24小时。收集上清液并且保持在-80℃直到使用ELISA试剂盒测量PGE2和细胞因子(IL1、IL6、IL8、IL10和IL12)的浓度。
同样的对假处理的对照培养物进行处理，但是不进行UV辐射。二苯乙烯化合物包括USYDS1、USYDS2、USYDS3、USYDS5和USYDS7并且蜂胶在0.1、1和10μΜ或μg/mL进行测试。
测量最佳剂量的UV辐射的结果显示在1MED的UVA和UVB辐射下，对细胞活力没有显著影响。因此，选择该条件用于研究二苯乙烯和蜂胶提取物对救援测试中细胞因子的水平的影响。
在对UV辐射的人类表皮角质细胞(HEK)中细胞因子生产的调节的初步研究中，观察到USYDS1和USYDS2的混合物适度地抑制IL-6、TGFα、G-CSF和GM-CSF的生产(2-3倍)。然而，发现该异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物显著地增加UV辐射的细胞对IL-8和IL-1rα的生产(4-5倍)。已知IL-8在免疫响应的发病中发挥作用。另一方面，IL-1rα(天然存在的细胞因子受体拮抗剂)在抑制炎症过程中IL-1的有毒效应中发挥作用。因此，这些初步结果表明本发明的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物可以是用于治疗与免疫抑制和炎症相关的病症的优良候选物。
4.二苯乙烯和蜂胶提取物的抗氧化活性
1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)清除活性检测
(l,l-二苯基-2-苦肼基)DPPH检测通常用于测试化合物或天然产物的提取物的自由基清除能力，其在517nm下测量DPPH*自由基的减少。以其自由基形式的DPPH*由于其奇电子而在517nm下显示出强大的吸收。一旦被抗氧化剂或自由基清除剂减少，该吸收即消失并且通过清除自由基所产生的脱色与吸收的电子数量成化学计量关系(DPPH*+AH→DPPH:H+A*)。该DPPH检测是以如下所述的程序逐步进行的。
在室温下在暗容器中将DPPH(0.1mM)的甲醇溶液搅拌20min。在400-750nm之间扫描该溶液以获得最大波长(λmax，约510nm)。用甲醇调节DPPH溶液的浓度以得到约1.0的最大吸光度。将不同浓度的测试样品和标准抗氧化剂溶液(0.05mL)加入到比色杯中的0.95mL甲醇DPPH溶液中。所述测试样品的最终浓度为0.1、1、10、50、100和200μΜ。剧烈振摇所述混合物并且在室温下将其在暗处静置30min。在最大波长(约510nm)下测量所得溶液的吸光度。吸光度的降低指示所述测试样品的自由基清除效果。建立所述测试样品的剂量响应曲线以研究它们的IC50值(显示UV吸光度减少50％的浓度)。
结果
除了USYDS7显示出了强烈的效果外，本研究中的pPHOS化合物显示出中度至微弱的自由基清除效果。这些结果显示在图10中。
5.二苯乙烯衍生物对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)-依赖性脱乙酰酶sirtuin-2(SIRT1)的影响
SIRT1是Sir2家族(III类)的成员，其是NAD-依赖性组蛋白脱乙酰酶。SIRT1酶的脱乙酰基作用可以靶向许多底物，包括组蛋白、肿瘤抑制因子p53、叉头转录因子(FOXO)、过氧化物酶体增殖物-激活受体-γ(PPARγ)和共-活化因子-1α(PGA-1α)。10已经证明SIRT1参与许多病理生理过程的调控，如炎症、细胞衰老、细胞凋亡/增殖、代谢和细胞周期调控(Chung,Yao et al.2010)。因此，调节SIRT1的活性可能是靶向控制许多疾病如癌症、代谢综合征、肥胖、神经退行性疾病、骨骼肌功能障碍和与衰老相关的疾病的潜在治疗11。
SIRT1检测试剂盒(Cayman Chemical,Ann Arbor,Michigan,USA)提供了一种基于荧光的用于筛选SIRT1抑制剂或活化剂的方法。该检测是根据来自制造商的说明进行的。简单地说，该检测由两步组成，该两步都是在相同的板中进行的。在第一步中，用人类重组体SIRT1和其辅助底物NAD+一起温育包含p53序列Arg-His-Lys-Lys(ε-乙酰基)-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的底物。脱乙酰基作用敏化底物以使在第二步中使用显影剂的处理能够释放出荧光产物，使用荧光酶标仪在350-360nm的激发波长和450-165nm的发射波长下分析该荧光产物。在三个浓度(1、10和100μΜ)下检测了二苯乙烯。数据表示两个独立的实验，每个实验重复进行三次。
结果
除了白藜芦醇，所有的二苯乙烯都显示出了对SIRT1的浓度依赖性抑制，如图11中的A和图11中的B中所示。对SIRT1活性的调节能够使得对用于治疗疾病包括癌症、代谢综合症、肥胖、神经退行性疾病、和衰老相关性疾病的治疗剂的开发。
6.USYDS1、USYDS2和莎草1型蜂胶的乙醇提取物的抗菌活性
概要
使用14种菌株和4种化合物进行最小抑制浓度(MIC)筛选。根据临床和实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南的肉汤稀释法测定MIC。在含有64-0.06μg/ml的2倍稀释系列的化合物的96-孔板上进行MIC筛选。使用来自适当的琼脂平板上培养菌在阳离子调节的Mueller Hinton培养基肉汤中制备细菌接种，所述琼脂平板每周都新制。在每个检测板中都包括生长对照和无菌对照。在环境空气的培养箱中在35±2℃将所述检测板温育16-20小时(对于MRSA温育24小时)，观察并记录细胞的生长。MIC筛选中的参照化合物左氧氟沙星的所有MIC都处于CLSI S100-A20中描述的标准范围内。3个测试样品的效力的顺序为USYDS1>USYDS2>乙醇蜂胶提取物。
1.材料
1.1.菌株
用于MIC筛选的细菌组
Figure BDA0001316762380000541
Figure BDA0001316762380000551
1公知的抗药性；2公知存在质粒
缩写：TSA，胰酶大豆琼脂；CAMHB，阳离子调节的Mueller Hinton肉汤；HTM，嗜血杆菌试验培养基；AMP，氨苄西林；AZT，氨曲南；CFX，头孢西丁；CPD，头孢泊肟；CAZ，头孢他啶；CHL，氯霉素；PIP，哌拉西林；TET，四环素；IMI，亚胺培南；VAN，万古霉素；PEN，青霉素；ERY，红霉素；MET，甲氧西林；OXA，苯唑西林；LEV，左氧氟沙星；CLI，克林霉素。
1.2.培养基和试剂
胰酶大豆琼脂(BD 211043)，阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(BD212322)，嗜血杆菌试验培养基(Fluka 51295)，氯化血红素(Fluka 51280)，β-NAD(Fluka 43410)，左氧氟沙星(Sigma 28266)，羊血(Quad Five630-500)，溶解的马血(Quad Five 205-500)，0.5McFarland硫酸钡标准，无菌0.85％NaCl(w/v)。
2.方法
2.1制备细菌菌株
A.在进行MIC筛选的两天前从冷冻保存(-80℃)中将细菌菌株复活。划线至适合琼脂平板的表示上，并且将板在35±2℃于合适的气氛中温育20-24小时。
链球菌属：TSA II，5％CO2
肠球菌：TSA II，环境空气
流感嗜血杆菌：巧克力琼脂，5％CO2
组中的其它菌株：TSA，环境空气
B.使用无菌环选择5-10孔形态相似的孤立菌落并且重新划线至新鲜的琼脂平板上。如上所述将板在35±2℃于合适的气氛中温育20-24小时。
2.2.制备化合物板
在进行MIC筛选的当天在100％DMSO中制备化合物的储备液，并且立即使用。化合物储备浓度＝[(最高测试浓度)x 103μl/3μl](例如，如果在测试板中所需的最高测试浓度为64μg/ml，则储备浓度＝64x103/3＝2.2mg/ml)。除非另有说明，否则将测试化合物的效力设为100％，而根据制造商的分析数据来计算参照化合物的效力。
每种化合物制备11个2倍稀释，然后转移3μl至测试板的各孔中。DMSO在MIC筛选中的最终浓度为约3％。
2.3.制备细菌接种物
A.从4℃冰箱中取出培养基肉汤并使其湿热至室温。
B.用无菌环从新鲜培养板中将菌落转移至5ml盐水中并且混合均匀。使用浊度计测量并调节其浊度至0.5McFarland硫酸钡标准。或者，转移1-2个菌落至500μl盐水中并且使用酶标仪调节OD625至约0.1。
C.对革兰氏阳性和偏好性菌株以1:280且对于革兰氏阴性菌株以1:400将细菌接种物稀释至相应的培养基肉汤(CAMHB，CAMHB+3％溶解的马血，HTM)中(例如35.6μl接种物至10ml的CAMHB或25μl接种物至10ml的CAMHB)。
流感嗜血杆菌：HTM
链球菌属：CAMHB+3％溶解的马血
组中的其它菌株：CAMHB
2.4.制备检测板
A.除了孔B12、D12、F12和H12之外，各所述化合物板的每个孔中加入100μl的细菌接种物。
B.向所述化合物板的孔B12、D12、F12和H12中加入100μl的培养基肉汤。
C.将四个板堆叠在一起并盖上无菌板盖。在环境空气培养箱中在35±2℃下温育16-20小时(对于MRSA温育24小时)。
2.5.进行菌落计数
A.在盐水溶液中将细菌接种物(0.5McFarland)稀释至10-1至10-7的系列(例如，100μl细胞接种物+900μl盐水)。
B.将100μl各稀释液(10-4、10-5、10-6和10-7)散布在CAMHA板上，每个稀释液各三份，使液体渗入至琼酯中10分钟，反转该琼脂平板并在35±2℃下温育24小时。
2.6.记录MIC并计算CFU
A.打开化合物板，定位在化合物管理系统中，并且检查检测板的条形码。
B.将所述检测板放置在MIC读数器的上部，并且调节放大倍率镜以读取各孔，记录生长状态作为原始数据。(可选的)使用高速高分辨率扫描仪记录各测试板的图像。
C.根据CLSI指南确定MIC折点。
D.计数菌落并计算细菌接种物的CFU。
3.结果
3.1.MIC汇总表
使用14个细菌菌株(11个ATCC菌株和3个临床分离株)和4种化合物(USYDS1、USYDS2和蜂胶的乙醇提取物和参照化合物左氧氟沙星)进行MIC筛选。所述MIC汇总于以下表6中。在本研究中获得的参照化合物左氧氟沙星的MIC值处于S100-A20[2]中描述的标准范围内。DMSO在MIC筛选中的最终浓度为约3％，并且不会抑制大多数微生物的生长。
表6.USYDS1、USYDS2和蜂胶的乙醇提取物针对14种细菌菌株的MIC(μg/ml)。左氧氟沙星是参照化合物。
Figure BDA0001316762380000571
Figure BDA0001316762380000581
4.讨论
异戊烯化四羟基二苯乙烯USYDS1和USYDS2显示出中度的抗菌活性，其效力等级为USYDS1>USYDS2>蜂胶的乙醇提取物。
7.USYDS1、USYDS2和USYDS10化合物对激酶活性的影响
以下为该研究中的激酶列表。
Figure BDA0001316762380000582
实验
材料
·激酶-Glo(Plus)/ADP-Glo检测缓冲液
25mM HEPES，10mM MgCl2，0.01％Triton X-100，100μg/mL BSA，2.5mM DTT，pH7.4。
·Caliper检测缓冲液
100mM HEPES，10mM MgCl2，100μΙ/L Brij35(30％)，1mM DTT，pH7.4。
检测底物
·MBP蛋白、未活化的MEKl、Rb蛋白均购自SignalChem。聚(glu:tyr)(4:l)购自Sigma。PIP2购自Cayman。肽底物是在HD Biosciences,China合成的。
ATP购自Sigma。激酶GloPlus试剂、激酶Glo试剂和ADP Glo试剂均购自Promega。
检测工序—Caliper形式
在96-孔检测板中混合激酶、底物、ATP和化合物，总体积为50μL。在30℃下将所述检测板温育1小时。加入20μL的35mM EDTA停止反应并且转移26μL停止的反应物至384-孔检测板中。在酶标仪上读取该检测板。
检测工序—ADP-Glo形式
在384-孔检测板中混合激酶、底物、ATP和化合物，总体积为10μL。在30℃下将所述检测板温育1小时。向检测板中加入10μl/孔的ADP Glo试剂，在27℃下温育40min。
向所述检测板中加入20μl/孔的检测试剂，在27℃下温育30min。在酶标仪上读取该检测板。
检测工序—激酶-Glo(Plus)形式
在384-孔检测板中混合激酶、底物、ATP和化合物，总体积为10μL。在30℃下将所述检测板温育1小时。向反应混合物中加入10μl/孔的激酶Glo(Plus)试剂，然后在27℃下温育20min。在酶标仪上读取该检测板。
·在没有化合物和酶但含有ATP和底物的条件下，产生了100％的效果。
·在没有化合物但含有ATP、底物和酶的条件下，产生了0％的效果。
·SB202190为激酶p38β的参照化合物；十字孢碱(STSP)为其余激酶的参照化合物。
结果
被抑制多于60％的激酶汇总于下表中。有趣的是注意到所有这三个化合物都抑制激酶TrKA和PI3Kδ和ΡΙ3Kγ。针对所述激酶，USYDS1和USYDS10似乎表现出类似的抑制活性。
Figure BDA0001316762380000601
8.USYDS1的急性毒性研究
方法
给单个的小鼠进行400mg/kg的单一IP注射；第二只小鼠接受200mg/kg IP的剂量且第三只小鼠接受100mg/kg IP的单一剂量。观察小鼠2周。如果它们失去多于20％的体重或者如果有其它显著毒性的体征，就将它们杀死。如果所有3只小鼠都必须杀死，则以类似的方式进行下一个3剂量水平(50、25、12.5mg/kg)。重复该过程直到找到耐受剂量。则该剂量标示为最大耐受剂量(MTD)，并且将其用于计算抗肿瘤测试期间给予实验小鼠的材料的量。可以使小鼠自由采食喂食和水。将药物以200mg/mL的浓度溶解于100％DMSO中。
结果
组 剂量(mg/kg/剂量) 途径 死亡天数 存活/总天数15 注射体积
1 100 IP 无 1/1 0.5μL/gm体重
2 200 IP 1 0/1 1μL/gm体重
3 400 IP 1 0/1 2μL/gm体重
USYDS1的MTD被确定为100mg/kg。这个浓度表示对哺乳动物毒性低，并且用于进一步的抗肿瘤测试。USYDS1的中空纤维检测(BEC/C)正在进行中。该中空纤维检测是它们在小鼠异种移植模型中的评价之前，用于评价新颖推测的化疗化合物针对一系列癌症细胞系的初步快速筛选。与常规异种移植模型相比，中空纤维模型具有更短的评价时间和减少的化合物需求。该模型还使得在异种移植中能够有效选择癌症细胞的类型。
产生作为异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物的来源的树脂的植物的化学型
通过定量1H-NMR(q-NMR)分析从来自不同位置的鳞籽莎属的植物中获得的树脂、树胶和渗出物以分析异戊烯化多羟基二苯乙烯含量，其包括C-异戊烯化的和O-异戊烯化的、O-甲基化的和非O-甲基化的衍生物。来自树脂的这些异戊烯化多羟基二苯乙烯的不同比例相应地形成对植物分类的基础。
迄今已经鉴定出鳞籽莎属植物至少有3个不同的化学型，并且这些植物的每一种又显示为若干亚化学型。类型1是最常见的植物，其含有大约相等比例的C-异戊烯化的和O-异戊烯化的衍生物。类型2植物仅含有C-异戊烯化的衍生物。而类型3植物不含有O-甲基化的异戊烯化多羟基二苯乙烯衍生物。
本领域技术人员能够理解，在不脱离概括描述的本发明的范围的条件下，可以对如具体实施方式中所示的发明进行多种变化和/或改变。因此，本发明的实施方式在所有方面都应被认为是示例性的而不是限制性的。
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Claims (20)

1.一种式(Ia)的化合物或其药用盐：
Figure FDA0002564582860000011
其中：
R1a是CH2CH＝C(CH3)2；
R1b是OH或OR4；
R1c是H；
R1d是OH；
R2是OH；
R3是OR4；
A----B是CH＝CH；
R4选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基或苄基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中所述化合物选自由以下各项组成的组：
Figure FDA0002564582860000012
3.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中所述化合物是USYDS1：
Figure FDA0002564582860000021
4.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药用盐，以及药用赋形剂。
5.权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药用盐或者权利要求4所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症是白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌或乳腺癌。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述癌症是白血病。
8.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述癌症是黑色素瘤。
9.一种制备化合物(1e)的方法，
Figure FDA0002564582860000022
其中R8、R9和R10各自独立地选自基团OH、OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu；
所述方法包括以下步骤：
(i)如下，使用适合的试剂处理羧酸以提供酰氯：
Figure FDA0002564582860000031
(ii)如下，使相应的酰氯与芳基烯烃缩聚：
Figure FDA0002564582860000032
(iii)如下，对乙酸酯基脱保护并烷基化：
Figure FDA0002564582860000033
其中，
R5选自基团OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu、OBn；并且R6和R7各自独立地选自基团OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu、OtBu、OBn；
(iv)如下的异戊烯基重排：
Figure FDA0002564582860000034
(v)以及如下的氢化反应：
Figure FDA0002564582860000041
其中，
R5、R6和R7如上定义，条件是R5、R6或R7中的至少一个为OBn；
R8、R9和R10各自独立地选自基团OH、OMe、OEt、OPr、OiPr、OBu、OiBu或OtBu。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的缩聚反应是在钯催化剂存在下进行的。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述钯催化剂是乙酸钯(II)。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中的烷基化反应是在金属氢化物和卤代异戊烯基试剂存在下进行的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述金属氢化物是氢化钠。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述卤代异戊烯基试剂是BrCH2CH＝C(CH3)2。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述卤代异戊烯基试剂是BrCH2CH＝C(CH3)2。
16.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(v)中的氢化是在钯催化剂存在下在溶剂的混合物中进行的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述钯催化剂是碳载钯。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述溶剂的混合物包含1,4-环己二烯和乙醇。
19.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iv)中的重排是在硅酸镁颗粒、二氧化硅或氧化铝颗粒存在下进行的。
20.根据权利要求9或19所述的方法，其中步骤(iv)中的重排是在微波辐射或光存在下进行的。
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