CN107249618A - 在经历辅助生殖技术的女性中植入和怀孕的黄体期中的催产素受体拮抗剂治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在经历作为辅助生殖技术的一部分的胚胎移植的雌性中使用催产素受体拮抗剂。特别地，提供用于在经历胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率和/或增加活产率的方法。具体地，当子宫内膜接受胚胎植入时和/或当胚胎达到囊胚阶段时，拮抗剂在黄体期释放。

Description

在经历辅助生殖技术的女性中植入和怀孕的黄体期中的催产 素受体拮抗剂治疗

相关申请的引证

本申请要求于2014年12月22日提交的欧洲申请第14199709.8号及2015年3月10日提交的美国申请第14/643307号的优先权，其内容以其整体通过引证并入本文。

技术领域

本发明涉及在经历作为辅助生殖技术的一部分的胚胎移植(embryo transfer，胚胎转移)的雌性中使用催产素受体拮抗剂。特别地，提供用于在经历胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率(ongoing implantation rate，持续着床率)、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率和/或增加活产率的方法。具体地，当子宫内膜接受胚胎植入时和/或当胚胎达到囊胚阶段(blastocyst-stage，囊胚期，胚泡阶段)时，拮抗剂在黄体期释放。

背景技术

体外受精(IVF)是用于在雌性受试者中建立怀孕的方法。步骤通常涉及利用一种或多种激素的卵巢刺激，主要为滤泡刺激激素(FSH)，且通常给予人绒毛膜促性腺激素(hCG)以触发最终的滤泡成熟。取卵(oocyte retrieval)通常发生在hCG给予后的2天(约36小时)。然后卵母细胞在体外受精，培养几天，并且移植到子宫。IVF也包括将源自第一雌性(供体)的卵的胚胎移植至第二雌性(怀孕代理)。胚胎可置于冷冻保存且在几个月或甚至几年后移植(即，冷冻胚胎移植)。

改良移植的胚胎的植入率为辅助生殖技术(ART)治疗中的主要挑战之一。对于IVF/卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)，仅约移植的胚胎的三分之一植入经历调控卵巢刺激的女性。植入率及怀孕率受到关于患者年龄及其他特征、对于卵巢刺激的响应的量级、所获得胚胎的质量、子宫内膜接受性以及实际的移植步骤的多种因素所影响。

子宫收缩被认为是在IVF/ICSI周期中影响植入和怀孕率的潜在重要因素(Fanchin et al.1998；Schoolcraft et al.2001；Bulleti and de Ziegler 2005)。在移植时的高频率的子宫收缩似乎对于结果具有负面影响，可能通过排除子宫腔中的胚胎或通过置换胚胎而因此降低植入率和怀孕率。

观察数据显示在hCG+4天(即，hCG给予后四天，对应于取卵后第2天)在卵裂阶段(cleavage-stage，分裂阶段)胚胎移植时，随着收缩频率增加，临床怀孕率降低(Fanchinet al.1998)。前瞻性对照研究也观察到在卵裂阶段胚胎移植的当天(取卵后第3天)具有较高频率子宫收缩的患者，与在移植时具有较低频率子宫收缩的患者相比，具有较低的怀孕率(Zhu et al.2014)。

受控卵巢刺激周期中的子宫收缩与正常月经周期相比较(Ayoubi et al.2003)。发现受控卵巢刺激周期中的hCG给予时间点与自然周期中促黄体激素(LH)激增(surge)的时间之间的子宫收缩频率相似。在黄体期中，与自然周期中的LH+4天(即LH激增后四天)相比，子宫收缩频率在受控卵巢刺激周期中的hCG+4天(对应于取卵后第2天)较高(Ayoubi etal.2003)。然而，在LH+6天与hCG+6天(对应于取卵后第4天)的子宫收缩频率没有差异且在两种情况下都是低的，表明在受控卵巢刺激周期与自然周期的那个时间点的子宫静止水平相同(Ayoubi et al.2003)。在另一研究中，子宫收缩在经历受控卵巢刺激周期的女性中在hCG给予当天、hCG+4天(对应于取卵后第2天)及hCG+7天(对应于取卵后第5天)评估(Fanchin et al.2001)。子宫收缩频率在hCG给予当天最高，在早黄体期过程中稍微降低如在hCG+4天所评估，且在hCG+7天(对应于取卵后第5天)几乎达到静止状态。另一研究报导在早黄体期自第2天至第3天以及至取卵后第4天的卵母细胞供体中的结合带收缩数目的降低(Lesny et al.1999)。类似地，在经历受控卵巢刺激且接受外源性孕酮黄体期补充的卵母细胞供体中的子宫收缩评估表明，自取卵后第2天至取卵后第5天子宫收缩频率显著降低(Blockeel et al.2009)。

子宫收缩的最高水平在受控卵巢刺激结束时(hCG给予当天)且归因于该时间点的高血清雌二醇浓度以及低血清孕酮浓度。黄体期过程中子宫收缩的降低被认为是暴露于由响应于hCG给予的黄体功能所引起的内源性孕酮以及暴露于用于IVF/ICSI周期的外源性孕酮黄体补充的结果。虽然孕酮补充在IVF/ICSI患者中用于黄体期支持(luteal phasesupport)且可降低子宫收缩，当进行卵裂阶段胚胎移植时，在早期黄体期(取卵后第2或3天)过程中仍有升高的子宫活性。

由于当进行卵裂阶段胚胎移植时，早期黄体期过程中(取卵后第2或3天)子宫收缩升高，评估用以改善植入的不同干预对子宫收缩的影响的研究在早期黄体期(取卵移植后第2和3天；hCG+4天)进行。随机对照试验(Moon et al.2004；Bernabeu et al 2006；Kim etal.2008；Ng et al.2014)、准随机对照试验(Moraloglu et al.2010)、在新鲜且冷冻胚胎置换周期中的推定研究(Chou et al.2011；Lan et al.2012)、或在新鲜且冷冻胚胎置换周期中的案例研究(Pierzynski et al.2007；Liang et al 2009)报导降低子宫收缩的化合物的发现，例如阿托西班(Kim et al 2008；Moraloglu et al.2010；Ng et al.2014)、吲哚美辛(Bernabeu et al.2006)及吡罗昔康(Moon et al.2004)均在取卵后第2或3天进行，即在卵裂阶段胚胎移植时。

近期的随机对照试验(Ng et al.2014)比较了IVF/ICSI患者中给予阿托西班或安慰剂后接着在取卵后第2天或3天的卵裂阶段胚胎移植的治疗结果。此大型研究设计为测定先前较小研究中可见的轶事证据(anecodal evidence)是否可以确认。此设计充分、大型(N＝800)、双盲、随机、对照试验发现，与安慰剂相比，采用阿托西班在植入率或活产率中并没有显著增加，如活产率分别为39.8％相对于38.0％所示出的(Ng et al.2014)。因此，在取卵后第2天或3天的阿托西班给予并不显著增加植入率或活产率。

因此，改善移植胚胎的植入在辅助生殖技术(ART)治疗中仍是主要挑战之一。本公开的目的是改善植入率，从而增加怀孕率及活产率。

发明内容

本公开的一个方面提供催产素受体拮抗剂，其用于在经历作为辅助生殖技术的一部分的胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率，其中，向雌性提供拮抗剂使得当雌性在(或重叠于)接受性子宫内膜阶段(receptive endometrium stage)时和/或当拮抗剂的作用与胚胎达到囊胚阶段一致时，存在拮抗剂作用。优选地，提供拮抗剂使得其在接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎达到囊胚阶段时释放。优选地，当雌性在接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎达到囊胚阶段时给予拮抗剂。在某些实施方式中，拮抗剂配制用于立即释放。在其他实施方式中，拮抗剂配制为持续释放或延迟释放制剂，如仓库(depot)，且在接受性子宫内膜阶段前给予和/或当胚胎仍处于卵裂阶段，使得一旦达到接受性子宫内膜阶段和/或胚胎达到囊胚阶段，拮抗剂释放或持续释放。优选地，提供拮抗剂使得当雌性在(或重叠于)接受性子宫内膜阶段和/或当拮抗剂的作用与胚胎达到囊胚阶段一致时，存在治疗有效量的拮抗剂。

在优选的实施方式中，接受性子宫内膜阶段系对应于：

a)在自然排卵周期的LH+6天至LH+9天之间，优选地在LH+6天至LH+8天之间，最优选地在LH+7当天；

b)在诱导排卵周期的hCG+6天至hCG+9天，优选地在hCG+6天至hCG+8天，最优选地在hCG+7当天；

c)在黄体期支持的第4天至第7天之间，优选地在第4天至第6天之间，更优选地在第5天或第6天，最优选地在第5天，其中黄体期支持在IVF周期中取卵之后那天开始，优选地其中雌性经历卵巢刺激；或

d)在黄体期支持的第4天至第9天之间，优选地在第5天至第7天之间，更优选地在第5天或第6天，优选地在制备用于冷冻胚胎移植或第三方IVF，以及优选地其中黄体支持在子宫内膜利用外源性雌激素引发至少6天后开始。

优选地，黄体期支持包含补充孕酮、、人绒毛膜促性腺激素、雌二醇与孕酮、孕激素和/或促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂。

因此，本公开提供催产素受体拮抗剂，其可用于制备药物用于在经历作为辅助生殖技术的一部分的胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率。本公开还包含的是催产素受体拮抗剂用于制备用于经历囊胚阶段胚胎的移植的雌性的药物中的用途。优选地，给予药物使得其作用与接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎达到囊胚阶段时重叠。优选地，当雌性在接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎达到囊胚阶段时，药物中的拮抗剂在雌性中释放。优选地，提供拮抗剂使得当雌性在(或重叠于)接受性子宫内膜阶段和/或当拮抗剂的作用与胚胎达到囊胚阶段一致时，存在治疗有效量的拮抗剂。

本公开进一步包括用于在经历胚胎移植作为辅助生殖技术的一部分的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率的方法，包括向雌性给予催产素受体拮抗剂，使得拮抗剂的作用与接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎(例如，移植的胚胎)达到囊胚阶段时重叠。优选地，提供用于在雌性中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率的方法，所述方法包括在胚胎移植前和/或后向雌性给予催产素受体拮抗剂，使得在雌性的接受性子宫内膜阶段的至少一部分期间和/或雌性中移植的胚胎的囊胚阶段的至少一部分期间存在治疗有效量的拮抗剂，从而相对于对照增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率。在优选实施方式中，方法进一步包括移植胚胎至雌性的子宫、子宫腔或输卵管，优选地其中移植囊胚阶段胚胎。

本公开进一步提供在雌性受试者中植入胚胎的方法，包括移植胚胎至雌性的子宫、子宫腔或输卵管，以及向雌性给予催产素受体拮抗剂，使得拮抗剂的作用与胚胎的囊胚阶段重叠和/或雌性处于接受性子宫内膜阶段。优选地，提供拮抗剂使得当雌性处于(或重叠于)接受性子宫内膜阶段和/或当拮抗剂的作用与达到囊胚段的胚胎一致时，存在治疗有效量的拮抗剂。

还提供用于在雌性受试者中植入胚胎的方法，所述方法包括移植胚胎至雌性的子宫、子宫腔或输卵管以及向雌性给予催产素受体拮抗剂，使得在雌性的接受性子宫内膜阶段的至少一部分期间和/或雌性中移植的胚胎的囊胚阶段的至少一部分期间存在治疗有效量的拮抗剂。

在优选实施方式中，雌性经历囊胚阶段胚胎的移植以及向雌性给予拮抗剂，使得拮抗剂在胚胎移植同一天释放至雌性。优选地，拮抗剂在胚胎移植前2小时和后2小时之间给予(例如，在立即释放制剂中)，优选地，其中拮抗剂被给予两次，优选地其中第一次给予在胚胎移植前约45分钟发生以及第二次给予在第一次给予后约60分钟发生。优选地，囊胚阶段胚胎具有3、4、5或6的扩张及孵化状态，更优选地其中囊胚阶段胚胎是授精后第5天胚胎。

在优选实施方式中，雌性经历卵裂阶段胚胎的移植以及向雌性给予拮抗剂，使得拮抗剂在胚胎移植后二或三天释放。优选地，卵裂阶段胚胎具有至少6个分裂球(blastomere，胚叶细胞，卵裂球)以及20％或更少的碎片(fragmentation)，优选其中卵裂阶段胚胎是受精后第2天或3天胚胎。

在优选实施方式中，拮抗剂是选择性催产素受体拮抗剂或加压素/催产素受体拮抗剂。更优选地，拮抗剂是选择性催产素受体拮抗剂。

优选地，拮抗剂为巴芦西班。优选地，皮下提供巴芦西班。优选地，给予在30-80mg、更优选50mg的巴芦西班。在一些实施方式中，雌性经历囊胚阶段胚胎的移植以及巴芦西班在胚胎移植的那天前做为仓库给药至雌性。优选地，雌性经历囊胚阶段胚胎的移植以及巴芦西班在胚胎移植的同一天给予至雌性。优选地，40mg巴芦西班在囊胚阶段胚胎移植前约15、30、45、60或75分钟(例如，45分钟)皮下给予以及10mg巴芦西班在第一次给予后约15、30、45、60或75分钟(例如，60分钟)后皮下给予。

附图说明

图1A及1B描述催产素受体拮抗剂的实例。

图2描述对于(BASIC)临床试验由移植日的持续植入率的胜算比(odds ratio)。

图3为对于(BASIC)临床试验由移植日的持续植入率的图。

具体实施方式

如本文使用，“包括”以及其连接语用于其非限制性意义以指包含下术词语的项，但不排除未具体提及的项。此外，动词“组成”可由“基本上由…组成”置换，意指如本文所定义的化合物或附带化合物，可包括除具体确定的那些之外的额外的组分，所述额外的组份不改变本发明的独特特征。

冠词“一个”及“一种”用于本文意指冠词的文法目标中的一个或多于一个(即，至少一个)。作为实例，“要素”意指一个要素或多于一个要素。

词语“大约”或“约”当与数值组合使用时(大约10、约10)，优选地意指该值可为给定值10大于或小于该值的1％。

当本文提及范围时，例如，如天数的范围，该范围包含两端点。例如，LH+6天至LH+9天涵括LH+6天、LH+7天、LH+8天及LH+9天。

如本文使用，术语“胚胎”意指受精后长达8周的受精卵。“胚胎移植”为其中一个或多个胚胎放置于雌体性的子宫、子宫腔或输卵管的步骤。

如本文使用，雌性受试者为哺乳动物，其包含人类；陪伴动物例如犬及猫；家畜动物，如猪、马、驴、羊、绵羊、骆马；以及稀有及濒危物种。优选地，受试者为人类。

辅助生殖技术(ART)意指使用人工手段用以达成怀孕的方法。优选地，ART意指其中体外受精胚胎移植至雌性受试者的方法，例如使用IVF/ICSI。

“新鲜胚胎移植”意指胚胎移植而不存在先冷冻胚胎。

一般而言，自然排卵周期范围自21至35天，平均长度为28天。周期的第一部分指滤泡期，其中卵巢滤泡成熟。排卵之后为成熟卵释放至输卵管。黄体期指以在LH+1的黄体的形成开始且结束在月经第一天之前一天的排卵周期的期间。

如本文使用，“持续植入率”指移植10-11周后子宫内存活胎儿的数目除以移植的胚胎/囊胚的数目。优选地，给予如本文公开的催产素受体拮抗剂将持续植入率增加了至少5％，更优选至少10％且最优选至少20％。

如本文使用，“持续怀孕率”指移植10-11周后至少一个子宫内存活胎儿的怀孕除以移植的胚胎/囊胚的数目。优选地，给予本文公开的催产素受体拮抗剂将持续怀孕率增加了至少5％，更优选至少10％且最优选至少20％。

如本文使用，“植入率”指移植5-6周后具有胎儿心脏的子宫内妊娠囊的数目除以移植的胚胎/囊胚的数目。优选地，给予本文公开的催产素受体拮抗剂将持续植入率增加了至少5％，更优选至少10％且最优选至少20％。

如本文使用，“临床怀孕率”指移植5-6周后至少一个具有胎儿心脏的子宫内妊娠囊的怀孕除以移植的胚胎/囊胚的数目。优选地，给予本文公开的催产素受体拮抗剂将临床怀孕率增加了至少5％，更优选至少10％且最优选至少20％。

“活产率”指治疗的每个女性的活产数目。优选地，给予如本文公开的催产素受体拮抗剂将活产率增加了至少5％，更优选至少10％且最优选至少20％。

如本文使用，“治疗有效量”指对于其被给予的产生所期望的作用的量。在某些实施方式中，术语指当根据治疗给药方案给予至经历胚胎移植的雌性受试者，足以增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率的量。本领域普通技术人员将理解术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可为当给予需要这种治疗的雌性受试者时，在显著的受试者数中提供特定所期望的药理响应的量。本领域普通技术人员将理解，在某些实施方式中，特定药剂或疗法的治疗有效量系可以单一剂量配制和/或给予。在某些实施方式中，治疗有效药剂可以以多剂量配制和/或给予，例如，作为给药方案的一部分。

本公开的一个方面提供在经历胚胎移植的雌性中，相对于对照，用于增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率的催产素受体拮抗剂。优选地，相对于对照，持续植入率是增加的。

本领域之前的大型研究报导，当子宫收缩频率高时，在早期黄体期(对应于取卵后第2天或第3天)给予催产素受体拮抗剂。期望降低子宫收缩的这些化合物改善胚胎植入。然而，当在早期黄体期提供时，催产素受体拮抗剂对于植入未显现改善的作用(Ng etal.2014)。因此，在某些实施方式中，本发明排除在早期黄体期(即，接受性子宫内膜阶段之前)给予的催产素受体拮抗剂的立即释放或基本上立即释放制剂。

本公开表明当在早期黄体期后提供，或者在接受性子宫内膜阶段和/或当胚胎达到囊胚阶段(参照实施例1)时，催产素受体拮抗剂对胚胎植入的有效性。由于在此阶段子宫收缩频率恢复至或接近恢复至基线，令人惊讶且意想不到的是催产素受体拮抗剂对植入率具有影响。

植入是其中胚胎并列(appose，摄取)、附着及侵入子宫内膜的关键过程。子宫仅在描述为“植入窗口”或“接受窗口”的有限期间接受植入胚胎(Makrigiannakis and Minas2006；Strowitzki et al.,2006)。植入窗口是几天的时间，其中子宫内膜获得允许胚胎附着及侵入的接受阶段(Koot and Macklon 2013)。此阶段在本文称为“接受性子宫内膜阶段”。

成功植入不仅取决于接受性子宫内膜，也取决于功能性胚胎及胚胎与母体组织之间的同步交流。因此，在植入的接受窗口期间，胚胎也需要处于合适阶段。植入发生在囊胚自透明带(zona pellucida)孵化后。因此，众所周知，如果ART领域，如果移植囊胚阶段胚胎，女性应理想地处于接受性子宫内膜阶段，使得子宫内膜及胚胎同步植入。如果移植卵裂阶段胚胎，则女性应处于预接受阶段。子宫内膜及胚胎将进一步发育，使得胚胎达到囊胚阶段时，子宫内膜将达到接受性阶段。

因此，给予本文公开的拮抗剂使得拮抗剂的作用与接受性子宫内膜阶段和/或达到囊胚阶段的胚胎重叠。优选地，提供拮抗剂使得拮抗剂在接受性子宫内膜阶段和/或达囊胚阶段的胚胎中释放或持续释放。如本文进一步公开的，拮抗剂通常配制为立即释放组合物使得它们在接受性子宫内膜阶段被给予。然而，本公开还包括配制为控制或延迟释放制剂的拮抗剂，例如，作为仓库，使得它们在预接受阶段期间给予，但在接受阶段释放。优选地，拮抗剂的治疗有效量存在于雌性的接受性子宫内膜阶段的至少一部分期间。

许多细胞及形态上的变化与预接受子宫内膜至接受性子宫内膜的转化相关。还鉴定了可用于评估子宫内膜是否处于接受性阶段的生物标记物。例如，来自Ignomix^TM的子宫内膜接受性阵列分析238个表现基因以测定子宫内膜是否处于接受性阶段(参照WO2010010201以及WO2010010213)。优选地，接受性子宫内膜阶段定义为基于子宫内膜接受性阵列(ERA)的238个基因中的一个或多个(例如，全部)的表现图形而具有正常接受性图形。

接受性子宫内膜阶段也可以根据正常排卵周期的阶段来表征。排卵发生在促黄体激素(LH)激增后，其通常发生在正常排卵周期的约14天。排卵周期的精确阶段可根据LH激增的时间表征。LH激增可在女性周期的各种天数取样血液样品来测定。LH激增的那天被视为LH 0天。那么LH+1通常对应于周期的第15天且LH+7通常为第21天。在自然周期的约LH+7天，子宫内膜接受植入且保留接受性通常持续约4天(Bergh and Navot 1992)，尽管此时间对于各女性不同。在优选实施方式中，接受性子宫内膜阶段对应于自然排卵周期的LH+6天和LH+9天之间，更优选在LH+6和LH+8之间。每个排卵周期，接受窗口通常仅持续2-3天。然而，如本领域众所周知，在女性之间在窗口的长度以及其何时发生存在变化。

在经历取卵用于新鲜胚胎移植的女性中，接受窗口可基于取卵后的天数、取卵后黄体期支持的天数和/或hCG给予后的天数来表征。

在典型的IVF步骤中，卵巢刺激用于刺激卵巢以产生多个卵。可给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂及GnRH拮抗剂以防止过早排卵，同时可给予人类绝经促性腺激素(hMG)、滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)以及克罗米酚柠檬酸盐以刺激产生多个卵。典型地，在卵巢滤泡充分发育前需要8至14天的刺激。然后通常给予人绒毛膜促性腺激素(hCG)以确保成熟的最后阶段且卵在排卵前取回，通常为hCG给予后约36小时。hCG给予的那天定义为hCG+0且取卵在hCG+2进行。

在优选实施方式中，接受性子宫内膜阶段对应在hCG+6天和hCG+9天之间(或者，取卵后4至7天)，优选地在hCG+6天和hCG+8天之间。

取卵为小型手术步骤，其可使用例如阴道超生波穿刺术进行。卵可进行显微镜检及诊断以观察其形态特征。然后进行体外授精，例如通过将卵母细胞与精子一起培养或通过卵母细胞胞浆内单精子注射(ICSI)其中精子以显微注射针注射至卵子。“受精”指精子渗入卵子，并将其遗传物质合并导致形成受精卵。

受精后，体外培养胚胎。用于培养及分期胚胎的方法为本领域众所周知的，并且例如US 20140134632、US 20140017717、US 20120252119及US 20120252119中描述的，其全部内容通过引证并入本文。本领域已知的适合用于体外支持细胞发育及生长的培养基包含人类输卵管液(HTF)(Irvine Scientic)、N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷(HEPES)培养基(Irvine Scientific)、IVF-50(Scandanavian IVF Science)、S2(Scandanavian IVFScience)、G1及G2(Scandanavian IVF Science)、UnilVF、ISM-1、BlastAssist、UTM培养基(由Origio A/S以培养基出售)、改性的Whittens培养基、Wittinghams T6培养基、Ham's F-10培养基、以及Earle's溶液。G1及G2培养基具体地配制为符合卵裂阶段胚胎及经由发展囊胚阶段的8个细胞中的胚胎的生理需求。美国专利第6,605,468号公开用于早期阶段胚胎增殖至囊胚阶段的培养基。

胚胎也可经受形态学、动力学和/或遗传学测试。优选地，通过显微镜视觉观察胚胎以测定是否存在异常的物理或形态特征(参照，例如WO2013078312)。通常进行植入前遗传诊断以筛选遗传疾病。对于此方法，自胚胎移出一或两个细胞以测试遗传疾病。

胚胎移植的方法为本领域众所周知的。可穿刺一个或多个胚胎至导管中且插入至子宫、子宫腔或输卵管。

在某些实施方式中，移植卵裂阶段胚胎。“卵裂阶段”胚胎范围由2个细胞至16个细胞且可根据例如碎片、分裂对称性、及多核化的缺乏来表征(参照综述Prados et al.HumanReproduction 2012 27:50-71)。碎片通常通过由碎片所置换的胚胎体积的百分比表征。优选地，卵裂阶段胚胎表征为在授精后2天具有4个分裂球以及在授精后3天具有6-8个分裂球。优选地，卵裂阶段胚胎具有至少6个分裂球及20％或更少的碎片。

优选地，移植第2天或第3天的卵裂阶段胚胎。在新鲜胚胎移植中，其中雌性经历取卵，然后通常在取卵后2或3天分别移植第2天或第3天的卵裂阶段胚胎。理想地同时在移植后几天，达到胚胎的囊胚阶段及接受性子宫内膜阶段。

优选地，移植囊胚阶段胚胎。“囊胚阶段”胚胎具有内细胞质量、称为滋养外胚层的外细胞层以及含有胚胎的整体衍生自其的内细胞质量的充满流体的囊胚腔。胚胎一般在取卵后5天或6天达到此阶段。囊胚阶段胚胎可基于其扩张及孵化状态表征。扩张涉及增加腔(即，囊胚腔)的体积，且孵化指囊胚自其膜(即，透明带)的脱出或脱离。扩张及孵化状态如下述表征：

1.早期囊胚、囊胚为小于胚胎的体积的一半体积

2.具有囊胚腔的囊胚，其体积为胚胎的体积的一半或大于一半

3.具有囊胚腔的囊胚，完全填充胚胎

4.扩张的囊胚具有大于早期胚胎的体积的囊胚腔体积，具有薄带

5.具有滋养外胚层的孵化囊胚开始脱出该带

6.孵化囊胚，其中囊胚完全自该带脱离。

在优选实施方式中，用于移植的囊胚阶段胚胎具有3、4、5或6的扩张及孵化状态。

在其中雌性经历取卵的新鲜胚胎移植中，囊胚阶段胚胎通常取卵后5或6天移植至雌性，优选为取卵后5天。

对于经历取卵后新鲜胚胎移植的女性，子宫内膜于取卵后第2天或第3天典型地为预接受阶段且并不有利于植入。在优选实施方式中，接受性子宫内膜阶段对应在取卵后第4天和第7天之间，优选地在第5天和第6天之间。如果使用hCG诱导排卵或触发最终成熟，取卵后4至7天通常对应于hCG+6至hCG+9。

利用生育药物的卵巢刺激通常导致黄体期缺乏。因此，对于黄体期支持的标准操作通常用于取卵后女性。黄体期支持指在黄体期过程中的治疗干预，旨在补充黄体功能用以改良胚胎植入以及早期怀孕发育。黄体期支持是本领域已知的且通常包括补充孕酮、雌二醇与孕酮、孕激素、hCG和/或GnRH激动剂，或给予外源性孕酮、雌二醇与孕酮、孕激素、hCG和/或GnRH激动剂。孕酮通常以肌肉内或阴道给予，而hCG通常以肌内或皮下给予。优选地，黄体期支持开始于取卵后第一天，即取卵后第1天。

优选地，接受性子宫内膜阶段对应在经历取卵的女性的黄体期支持的第4天和第7天之间，优选在第4天和第6天之间。在优选的实施方式中，雌性经历用于取卵制备中的卵巢刺激。

本公开包括在授精后几天内移植胚胎至雌性(即，新鲜胚胎移植)，以及使用冷冻胚胎。冷冻胚胎移植(FET)为已知步骤，其利用来自体外授精或ICSI的之前的周期的冻存胚胎。将冻存胚胎解冻且经由导管移植至子宫腔。本公开也包括使用冻存卵子用于受精。在这些实施方式中，可如本文所述稍后解冻卵子、受精及培养和移植。

快速冷冻可用于这些目的，例如，与冻存剂一起。传统的冻存剂包含二醇类如乙二醇、丙二醇及甘油；2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)；二甲基亚砜(DMSO)及蔗糖。可替换地，玻璃化也可用于冷冻卵子或胚胎。

FET，以及“第三方IVF”(妊娠代孕、卵子捐赠、胚胎捐赠)，可于自然排卵周期过程中进行。对于这些女性的接受窗口可基于本文所述的自然排卵周期测定。在某些实施方式中，排卵以例如hCG给予来诱导。优选地，在这些女性中，接受性窗口对应在hCG+6及hCG+9之间，优选地在hCG+6和hCG+8之间。

在某些实施方式中，经历FET或第三方IVF的女性也接受上文所述的黄体支持。优选地，在这些女性中，接受窗口对应在黄体期支持的第4天和第9天之间，优选在第5天和第7天之间。当FET或第三方IVF在“人造周期”期间进行时，通常使用黄体期支持。在这些情况中，子宫内膜使用本领域已知的方法通过给予雌激素和/或孕酮来制备。优选地，黄体期支持开始于子宫内膜以外源性雌激素引发至少6天后以诱发人造周期。

在FET或第三方IVF的示例性实施方式中，雌激素经口或经阴道提供每天剂量4-8mg持续约10天，此时黄体期支持以阴道孕酮给予开始且囊胚移植发生在开始孕酮后6天。

在本公开的一个实施方式中，催产素受体拮抗剂的作用与胚胎的囊胚阶段重叠。优选地，当胚胎达到囊胚阶段时释放拮抗剂。优选地，移植囊胚阶段胚胎至所述雌性且在胚胎移植同天给予拮抗剂。优选地，在移植胚胎的囊胚阶段的至少一部分期间存在治疗有效量的拮抗剂。

本公开也包括卵裂阶段胚胎的移植。在这些实施方式中，可提供拮抗剂作为持续释放或受控释放制剂用以在移植后几天释放。可替换地，拮抗剂可以以立即释放制剂在移植后几天给予。如实施例所示，当胚胎处于囊胚阶段时，给予巴芦西班(催产素受体拮抗剂)造成持续植入率由27％增加至45％，显著增加。

催产素受体拮抗剂为本领域已知，且任何催产素受体拮抗剂可用于本公开的方法中。优选地，从选择性催产素拮抗剂以及混合加压素/催产素受体拮抗剂中选择催产素受体拮抗剂。选择性催产素拮抗剂具有对于催产素受体的Ki比对于加压素受体的Ki高至少一个数量级。

受体拮抗剂包括降低催产素受体的表现和/或活性的化合物。优选的加压素/催产素受体拮抗剂为阿托西班(1-(3-巯基丙酸)-2-(O-乙基-D-酪胺酸)-4-L-苏胺酸-8-L-鸟胺酸-催产素)。

催产素受体拮抗剂还包含直接对抗所述受体的RNA干扰分子或RNA反义分子。

优选地，拮抗剂结合至受体且防止受体活性。这种拮抗剂包含例如直接对抗受体的抗体(例如，“中和抗体”)以及小分子。优选地，拮抗剂作为竞争性拮抗剂且与用于结合催产素受体的催产素竞争。优选地，拮抗剂为结合至受体的小分子且拮抗受体活性。优选选择性催产素拮抗剂为巴芦西班。

合适的催产素受体拮抗剂为技术人员众所周知的且可容易地基于例如使用受体活化和/或受体结合作为读出的已知筛选方法鉴定。合适的拮抗剂包含公开于US6143722中的那些，其全部内容通过引证并文本文。US6143722公开七肽类似物，或其药学上可接受的盐，具有催产素拮抗剂活性且由六肽部分S及通过酰胺键结合至部分S的C-末端β-胺基醇残基Z组成，其中β-胺基醇Z为：

其中，Q为(CH2)n-NH-A，n为1-6，且A为H或-C(＝NH)NH2，

以及其中R为CH3或C2H5；

以及部分S为

其中，Mpa、Ile、Asn及Abu具有下述含义：

Mpa 3 巯基丙酸残基

Ile 异白胺酸残基

Asn 天冬酰胺残基

Abu α-胺基丁酸残基；

以及其中X为D-芳香族α-氨基酸；以及Y为脂肪族α-氨基酸。优选的催产素拮抗剂列于图1。

进一步的拮抗剂包含OBE001/AS-602305(特别为其口服制剂)、TT-235(Northwestern University)、选择性催产素受体拮抗剂亚泊西班(Epelsiban)((3R,6R)-3-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-1-[(1R)-1-(2,6-二甲基吡啶-3-基)-2-(吗啉-4-基)-2-氧基乙基]-6-[(1S)-1-甲基丙基]吡嗪-2,5-二酮)；里托西班(Retosiban)((3R,6R)-6-[(2S)-丁烷-2-基]-3-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-1-[(1R)-1-(2-甲基-1,3-噁唑-4-基)-2-(吗啉-4-基)-2-氧基乙基]吡嗪-2,5-二酮)；PF-3274167(5-(3-(3-(2-氯-4-氟苯氧基)氮杂环丁烷-1-基)-5-(甲氧基甲基)-4H-1,2,4-三唑-4-基)-2-甲氧基吡啶)；及L-368,899盐酸盐(CAS 148927-60-0)；L-371,257(1-[1-[4-(1-乙酰基哌啶-4-基)氧基-2-甲氧基苯甲酰基]哌啶-4-基]-4H-3,1-苯并噁嗪-2-酮)。另外的催产素拮抗剂也描述于，例如WO2004020414及WO2005/028452，其全部内容通过引证并入本文。优选地，拮抗剂选自巴芦西班、阿托西班、OBE001/AS-602305、PF-3274167、亚泊西班及里托西班。

优选地，催产素受体拮抗剂配制在药物组合物中。组合物也可包含药学上可接受的添加剂如防腐剂、稀释剂、分散剂、促进黏膜吸收剂(例如由Merkus,F.W.H.M.et al.,J.Controlled Release 24,201-208,1993所公开的，且其包含表面活性剂、胆酸、夫西地酸、磷脂及环糊精)、缓冲剂及调味剂。这种组合物可配制为固体(例如，呈片剂、胶囊或粉末)或液体(例如呈溶液或悬浮液)，其于本文包含霜剂及乳剂，用于口服给予或肠胃外给予。经口(包含舌下剂及颊剂)、经鼻、肺部、穿皮、直肠、阴道、皮下、肌肉内及静脉内给予可为给药的适合途径。

在某些实施方式中，药物组合物可于持续释放或延迟释放系统中递送。例如，拮抗剂可使用穿皮贴片或配制在亲脂性仓库(例如，脂肪酸、蜡、油)中给予。如本文使用，持续释放或延迟释放系统确保拮抗剂在给予后的时间点也存在于受试者中，例如给予后几小时或甚至几天。这种持续释放或延迟释放系统允许在雌性处于接受性子宫内膜阶段之前给予受体拮抗剂。然而，持续释放或延迟释放确保当雌性进入接受性子宫内膜阶段时和/或当胚胎达到囊胚阶段时，仍然存在充足量(或者治疗有效量)的拮抗剂。

在雌性经历卵裂阶段胚胎移植的实施方式中，拮抗剂应在当该卵裂阶段胚胎已发展为囊胚阶段胚胎时和/或当雌性达到接受性子宫内膜阶段时释放。如果使用立即释放制剂，则拮抗剂应在胚胎移植后几天给予，优选为胚胎移植后两或三天，此对应当卵裂阶段胚胎发展为囊胚阶段胚胎和/或当雌性达到接受性子宫内膜阶段的时间。如果使用持续释放或延迟释放制剂，这些可为早期给予，例如在胚胎移植当天，条件是当卵裂阶段胚胎发展为囊胚阶段胚胎时和/或当雌性达到接受性子宫内膜阶段时，拮抗剂释放。

在雌性经历囊胚阶段胚胎移植的实施方式中，拮抗剂应在胚胎移植同一天释放(例如，于同一24小时期间)，此对应当胚胎达到囊胚阶段且雌性已达接受性子宫内膜阶段的时间。优选地，拮抗剂在胚胎移植前2小时及后2小时之间给予。更优选地，拮抗剂给予两次。在使用巴芦西班的示例性实施方式中，第一次给予可在胚胎移植前约45分钟发生以及第二次给予可在第一次给予后约60分钟发生。

如技术人员众所周知的，给予时间取决于所使用的特定拮抗剂，特别是拮抗剂的半衰期。具有相对短半衰期的拮抗剂可能需要给予多次以确保其作用与囊胚阶段和/或接受性子宫内膜阶段重叠。

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在本说明书中所引用的所有专利及文献参考其全部内容通过引证并入本文。

本发明进一步以下述实施例详细说明。这些实施例不限制本发明的范畴，而仅作为说明本发明。

实施例

实施例1：随机、安慰剂-控制、双盲、平行组、多国、多中心试验评估皮下给予巴芦西班对IVF/ICSI患者中在移植当天的植入率及怀孕率的影响。

方法

BASIC是随机、双盲、安慰剂-控制、平行组、多国、多中心试验。其经设计以评估卵裂阶段胚胎移植天给予或囊胚移植当天给予巴芦西班对于IVF/ICSI患者中的持续植入率的影响。在长GnRH激动剂或GnRH拮抗剂方案中经历受控卵巢刺激的患者，接受hCG用以触发最终滤泡成熟，经历取卵，且具有在取卵后第1天开始通过利用阴道孕酮补充每天黄体期支持，且在取卵后第3或5天移植。患者以1:1的比例随机分为巴芦西班组或安慰剂组，根据移植日(取卵后第3天或5天)及待移植的胚胎/囊胚的数目(1或2)分层。总计，255位IVF/ICSI患者随机分配在此试验中且捐献440个胚胎/囊胚。

研究药品产物，即，根据随机的巴芦西班或安慰剂，以皮下注射在两个时间点给予：第1次给予40mg的巴芦西班或安慰剂在移植前45分钟以及第2次给予10mg的巴芦西班或安慰剂在第1次给予后60分钟。

移植在取卵后第3天(卵裂阶段胚胎)或第5天(囊胚)进行。在第3天，仅有定义为≥6个分裂球以及≤20％碎片的优良质量的胚胎被移植。在第5天，具有扩张及孵化状态3、4、5或6的囊胚被移植。对于每个个体患者移植的胚胎/囊胚的实际数目，取决于对于患者年龄的所需形态质量、局部调节以及临床方案的胚胎/囊胚的可利用性，但极大数为2。

关于移植步骤的关键方面已被标准化。将阴道开大器插入阴道且根据当地实践但以最低限度的操作与干扰完成阴道及子宫颈的清洁。使用软导管或超软导管。导管的外鞘插入刚好延伸至子宫颈内口(即，保持外鞘在子宫颈管)。胚胎/囊胚装载至内鞘，其之后经由外鞘插入。使用腹腔超音波导引，将胚胎/囊胚放置于自子宫底为1.5-2.0cm。自装载内侧导管至放置胚胎/囊胚的时间不应超过1分钟。放置后，撤出内侧导管及外侧导管且确认滞留的胚胎/囊胚、黏膜及血液。确认没有胚胎/囊胚留在导管中后，接着移除阴道开大器；此发生在胚胎/囊胚放置后约2分钟内。记录在移植步骤期间发生的任何困难/事件。

患者在取卵当天后每天两次接受阴道孕酮片剂100mg直到临床怀孕访视当天。在移植当天，患者应在移植前至少3小时与移植后至少3小时插入孕酮片剂。持续植入率(主要终点)定义为在转移后10-11周的子宫内存活胎儿的数目除以所移植的胚胎/囊胚的数目。

相对于统计学方法，主要假设以持续植入(是/否)作为结果且以治疗与随机分层作为因素使用逻辑回归模式测试。治疗效果呈现在胜算比标度，此代表逻辑回归分析的结果；分析允许包括因素及共变量。必须强调的是根据逻辑回归模式的胜算比，提供表现数据的最适方法以及用于评估治疗效果的基准。

几种因素影响胚胎移植的成功结果的机率，包括移植日、所移植的胚胎/囊胚的数目以及所移植的胚胎/囊胚的质量。随机经分层用于确保可比较组的这些因素的前两者。然而，由于胚胎发展为连续的，对于所移植的胚胎/囊胚的质量的分层不容易。替代地，对于胚胎/囊胚的质量调整也包括在主要分析中。

结果

治疗在卵裂阶段的胚胎与囊胚的不同接受性阶段以及植入潜力的影响为明显的，如通过取卵移植后第3天的总持续植入率为19％以及取卵移植后第5天为38％所说明。相同的模式见于巴芦西班及安慰剂组两者。

试验中所观察的整体(第3天+第5天)持续植入率，对于巴芦西班为27.1％及28.2％¹，对应于胜算比²为1.1(95％置信区间0.7-1.8；p＝0.6960)，即，有利于巴芦西班但不显著。因此，对于整体试验组的主要终点并不符合，但如下文所述，这是因为移植当天具有交互作用。卵裂阶段胚胎的移植在取卵后第3天产生胜算比0.3(0.3-1.2；p＝0.1509)(图2)。取卵分层后第5天的分析结果为胜算比2.3(1.1-4.7；p＝0.0270)且此显示巴芦西班对于用于囊胚移植的持续植入率的显著治疗效果(图2)。胜算比2.3对应于用于囊胚移植的持续植入率的调整手段，对于巴芦西班为45％，相对于安慰剂的27％(相对Δ为67％)(图3)。

由BASIC试验的结果显示催产素拮抗剂对于植入率的效果的解释受到移植日、卵裂阶段胚胎移植(取卵后第3天)或囊胚移植(取卵后第5天)的影响。当卵裂阶段胚胎移植在第3天(预接受性阶段)完成时，对于巴芦西班建立对于持续植入率没有影响。然而，当囊胚转移在第5天(接受性阶段)完成时，观察到巴芦西班对于改良持续植入率的显著(p＝0.0270)效果。

BASIC试验鉴定巴芦西班、或一般催产素拮抗剂以及混合催产素/加压素拮抗剂对于植入的临床相关影响的时间窗，其不会在试验前预测。当催产素拮抗剂在取卵后第5天(或更晚)在植入时给予，可观察到对于植入率的影响，但在取卵后第2-3天的早期黄体期则没有。

在取卵后第3天卵裂阶段胚胎移植与取卵后第5天囊胚移植之间的一致性功效缺乏，对于相关于子宫收缩与后续周期结果的机制的假设重要。对这两天，药理学协调的给予的剂量与方法以及移植步骤为相同的。因此，推定的机制如起因于早期黄体期的子宫收缩或起因于胚胎/囊胚移植步骤的胚胎/囊胚的排除或分散应不再被认为潜在说明对于利用子宫松弛剂的植入率的改良，该子宫松弛剂包括催产素拮抗剂或混合催产素/加压素拮抗剂。在这些机制最为相关的情况下，对于取卵后第3天及第5天的观察发现应该相同。

Claims (15)

1.一种催产素受体拮抗剂，其用于在经历作为辅助生殖技术的一部分的胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率，其中，向雌性提供所述拮抗剂使得在所述雌性中所述拮抗剂的作用与接受性子宫内膜阶段重叠。

2.根据权利要求1所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述接受性子宫内膜阶段对应于：

a)在自然排卵周期的LH+6至LH+9之间，优选地在LH+6至LH+8之间；

b)在诱导排卵周期的hCG+6至hCG+9之间，优选地在hCG+6至hCG+8之间；

c)在取卵后黄体期支持的第4天至第7天之间，优选地在第4天至第6天之间，优选地其中，所述雌性经历卵巢刺激；

d)在黄体期支持的第4天至第9天之间，优选地在第5天至第7天之间，优选地其中，黄体支持在所述子宫内膜利用外源性雌激素引发至少6天后开始。

3.根据权利要求2所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述黄体期支持包含补充孕酮、雌二醇和孕酮、人绒毛膜促性腺激素、孕激素和/或促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂。

4.一种催产素受体拮抗剂，其用于在经历胚胎移植的雌性受试者中增加持续植入率、增加持续怀孕率、增加临床怀孕率、和/或增加活产率，其中，向雌性提供所述拮抗剂使得当胚胎达到囊胚阶段时，存在所述拮抗剂的作用。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述雌性经历囊胚阶段胚胎的移植并且向所述雌性提供所述拮抗剂使得所述拮抗剂在胚胎移植当天释放，优选地其中，将所述拮抗剂在胚胎移植当天给予所述雌性。

6.根据权利要求5所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述拮抗剂在胚胎移植之前2小时和之后2小时之间给予，优选地其中，所述拮抗剂被给予两次，优选地其中，第一次给予在胚胎移植之前约45分钟发生并且第二次给予在所述第一次给予之后约60分钟发生。

7.根据权利要求5或6所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述囊胚阶段胚胎具有3、4、5或6的扩张和孵化状态，优选地其中，所述囊胚阶段胚胎为受精后第5天胚胎。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述雌性经历卵裂阶段胚胎的移植并且向所述雌性提供所述拮抗剂使得所述拮抗剂在胚胎移植之后两天或三天释放，优选地其中，在胚胎移植之后两天或三天将所述拮抗剂给予所述雌性。

9.根据权利要求8所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述卵裂阶段胚胎具有至少6个分裂球以及20％或更少的碎片，优选地其中，所述卵裂阶段胚胎为受精后第2天或第3天胚胎。

10.根据前述权利要求中任一项所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述拮抗剂是选择性催产素受体拮抗剂或加压素/催产素受体拮抗剂。

11.根据权利要求10所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述拮抗剂为巴芦西班。

12.根据权利要求11所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，皮下提供巴芦西班。

13.根据权利要求11或12所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，给予在30-80mg之间、优选50mg的巴芦西班。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，所述雌性经历囊胚阶段胚胎的移植并且在与胚胎移植同一天将巴芦西班给予所述雌性。

15.根据权利要求14所述的用于使用的催产素受体拮抗剂，其中，在胚胎移植之前45分钟皮下给予40mg巴芦西班并且在第一次给予之后60分钟皮下给予10mg巴芦西班。