CN107236820A - 一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，属于微生物分离鉴定技术领域。本发明提供的诺丽内生真菌的分离鉴定方法包括以下步骤：1)对诺丽果和叶进行表面消毒；2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25±1℃黑暗条件下培养8～10天；3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。本发明提供的方法能够实现诺丽内生真菌的有效分离和鉴定，利用分离得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，为发掘内生真菌在诺丽中的药效作用奠定基础，亦为抗癌、抗炎药物的研发提供新思路。

Description

一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法

技术领域

本发明涉及微生物分离鉴定技术领域，具体涉及一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法。

背景技术

植物内生真菌(Endophytic fungi)是指那些生活在地上部分且活的植物组织体内，但不引起宿主植物患病的一类有益真菌。因此，植物内生真菌是植物体内微生态系统中的天然组成成分，其长期生活在植物体内这种特殊环境中，不会导致植物患病，反而与宿主植物协同进化，并在演化过程中逐渐形成互惠共生的关系。药用植物内生真菌的次生代谢产物十分丰富，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、杀虫、调节免疫及促进植物生长等生物活性，是筛选生物活性成分或先导化合物的有效途径之一，在工业发酵、生物制药、农业生产等领域具有潜在的应用价值。

诺丽(Morinda citrifolia Linn.)是茜草科巴戟天属的植物，在热带地区有着悠久的食用历史，最早可追溯到317世纪晚期。1943年，美国政府将诺丽果认定为可食用植物资源；2003年，欧盟委员会提名诺丽果汁为一种新资源食品；2010年5月，中国卫生部批准诺丽果浆为新资源食品。现代医学和生物学研究证明，诺丽果和果汁对某些疾病具有一定的治疗和辅助治疗作用，如抗肿瘤、提高免疫力、抗氧化、护肝、抗菌消炎、改善糖尿病、抗血脂、降血压、改善痛风等。近几年来，随着研究的不断深入和新功能的不断发现，诺丽果已经成为世界药用植物和保健饮料的新宠。

诺丽因其卓有特效的抗癌效果而屡遭砍伐及毁灭性利用，加上种群分布的局限性，使得该植物种质资源并不丰富，甚至于处于濒危灭绝的边缘。由于内生真菌具有产生和寄主植物一样的次生代谢产物和活性成分，且分离纯化的内生真菌能通过发酵技术生产相应的活性物质，内生真菌的药用价值已成为国际热点，需最大可能地保留内生真菌不被杀灭。目前内生真菌常采用组织分离法分离，其缺陷有：(1)表面过分消毒，杀死部分内生真菌；(2)表面消毒不充分，表面菌污染；(3)生长快的内生真菌覆盖一些生长缓慢的真菌；(4)所用培养基不能确保所有内生真菌都生长。诺丽内生真菌的药用潜力并没有实现较大程度的挖掘。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法。本发明提供的方法能够实现诺丽内生真菌的有效分离和鉴定，为抗癌、抗炎药物研发提供新思路。

本发明提供了一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)对诺丽果和叶进行表面消毒；

2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天；

3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；

4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。

优选的是，所述步骤1)中的诺丽果和叶为八成熟。

优选的是，所述步骤1)的表面消毒包括次氯酸钠溶液消毒和乙醇溶液消毒。

优选的是，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量浓度为2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为75％。

优选的是，次氯酸钠溶液消毒的时间为60～300s，乙醇溶液消毒的时间为30～180s。

优选的是，所述步骤1)的表面消毒后还包括：采用无菌水对诺丽果和叶清洗2～4次。

优选的是，步骤2)得到的诺丽果和叶的边缘部分采用组织印迹法进行无菌检测。

优选的是，所述步骤3)得到的诺丽内生真菌后还包括：将诺丽内生真菌在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中进行培养，所述培养条件为25±1℃，20rpm进行液体暗培养。

优选的是，所述步骤4)的ITS测序鉴定基于核糖体ITS区域的ITS1f和ITS4基因序列。

优选的是，所述ITS测序鉴定用引物如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，实现了内生真菌的有效分离、纯化和鉴定。本发明提供的植物样品表面消毒方法既能保证充分消毒，达到有效去除表面污染菌的目的，又能避免过度的表面消毒，将部分内生真菌杀死，克服了现有植物内生真菌分离方法存在的某些菌种丢失的缺陷。通过多次试验发现，25±1℃既有利于内生真菌的生长又抑制内生细菌的萌发，黑暗条件是模拟传统发酵和植物自然生长的条件，有利于内生真菌的生长，本发明采用25±1℃黑暗条件下培养8～10天。核糖体ITS rDNA区域与rDNA的其他基因区相比，具有最佳的变异度和分辨率，能将诺丽内生真菌进行分子识别并鉴别到种的水平。我国许多珍稀植物资源不断减少，甚至濒临灭绝。本发明提供的内生真菌分离方法，能够有效分离植物内生真菌，通过发酵技术生产相应的活性物质，这对植物资源的保护和可持续利用具有重要的价值。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的诺丽果和叶的内生真菌的ITS rDNA PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为本发明实施例1提供的诺丽果和叶中分离得到的内生真菌培养图片。

具体实施方式

本发明提供了一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)对诺丽果和叶进行表面消毒；

2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天；

3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；

4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。

本发明对诺丽果和叶进行表面消毒。在本发明中，优选选取健康、八成熟的诺丽果和叶。在本发明中，所述诺丽果和叶优选在用无菌水冲洗后进行保存备用，所述保存的温度优选为4℃。

在本发明中，所述表面消毒包括次氯酸钠溶液消毒和乙醇溶液消毒。在本发明中，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量浓度为2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为75％。

在本发明中，次氯酸钠溶液消毒的时间为60～300s，乙醇溶液消毒的时间为30～180s。本发明优选采用次氯酸钠溶液和乙醇溶液进行消毒，所述次氯酸钠溶液的处理时间优选独立地选自60s、120s、180s、240s或300s；所述乙醇溶液的处理时间优选独立地选自30s、60s、90s、120s、150s或180s；即本发明优选从上述30个组合中选取任意一种组合进行诺丽果和叶的消毒，具体组合方式如下：次氯酸钠溶液浸泡时间+乙醇溶液消毒时间：60s+30s、60s+60s、60s+90s、60s+120s、60s+150s、60s+180s；120s+30s、120s+60s、120s+90s、120s+120s、120s+150s、120s+180s；180s+30s、180s+60s、180s+90s、180s+120s、180s+150s、180s+180s；240s+30s、240s+60s、240s+90s、240s+120s、240s+150s、240s+180s；300s+30s、300s+60s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s。本发明优选选取次氯酸钠溶液浸泡时间+乙醇溶液消毒时间120s+30s、120s+60s、180s+30s、180s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60s进行消毒，最优选采用次氯酸钠溶液浸泡时间+乙醇溶液消毒时间80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s进行消毒。

在本发明中，所述表面消毒后，优选采用无菌水对诺丽果和叶清洗2～4次，更优选为3次。本发明在清洗后，优选吸干水分，本发明对所述吸干的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规水分吸干方法即可，如采用无菌滤纸吸干水分。

得到表面消毒后的诺丽果和叶，本发明将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天。本发明优选通过去除诺丽果和叶的边缘部分以获得诺丽果和叶的内部组织，本发明对所述去除的方法没有特殊的限定，具体的，本发明优选采用灭菌手术刀去除诺丽果和叶的边缘部分0.5～0.8cm。本发明得到诺丽果和叶的边缘部分后，优选对边缘部分进行无菌检测。在本发明中，所述无菌检测的方法优选采用组织印迹法：将诺丽果和叶的边缘部分置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上，轻轻滚动或紧贴培养基放置2min，接着移去诺丽果和叶的边缘部分，在25±1℃、黑暗条件下恒温培养8～10天，无杂菌长出即说明消毒后的果块或叶块表面无菌，验证表面无菌后，本发明将无菌的内部组织进行后续的处理。本发明采用组织块印记法作对照，确保分离鉴定的是诺丽果和叶的内生真菌，具有操作简单快捷、成本较低的优势。

本发明得到诺丽果和叶的内部组织后，优选将果内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，叶内部或中心部分切分成0.5cm×0.5cm大小的组织块，本发明将组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃黑暗条件下培养8～10天。本发明对所述PDA培养基的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PDA培养基即可，具体的，所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基的成分为：马铃薯浸粉3g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、氯霉素0.1g，每1000ml蒸馏水中加PDA38g；使用前PDA固体培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

本发明将上述培养得到的菌株分别传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌。在本发明中，所述诺丽内生真菌在马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中进行传代培养，所述传代培养条件为25±1℃，20rpm进行液体暗培养。本发明对所述PDB培养基的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PDB培养基即可，具体的，所述马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基的成分为：马铃薯浸粉5g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化钠5g，每1000ml蒸馏水中加PDB 35g；使用前PDB液体培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

得到诺丽内生真菌后，本发明对诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。本发明的测序鉴定为对诺丽内生真菌进行进一步分类。在本发明中，所述ITS测序鉴定基于核糖体ITS区域的ITS1f和ITS4基因序列。在本发明中，所述ITS测序鉴定用引物如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示。所述引物的具体序列为ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO：1)；ITS1f：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’(SEQ ID NO：2)。本发明所述引物扩增得到的序列片段大小分别为700bp和500～700bp，条带需单一明亮。本发明引物扩增出的序列经测序后语NCBI数据库进行Blast比对，进行菌种的鉴定。本发明对所述PCR的扩增条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基因扩增方法条件即可。本发明优选选取诺丽内生真菌的基因组DNA为模板进行扩增，本发明对所述基因组的提取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售真菌基因组DNA提取试剂盒进行提取即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

本发明在2016年3月至2016年12月从中国海南省海口市(北纬20°03′35"，东经110°19′44"，海拔9m)、万宁市(北纬18°45′24"，东经110°72′06"，海拔33m)、琼海市(北纬19°16′56"，东经110°37′46"，海拔10m)、三亚市(北纬18°20′38"，东经109°34′41"，海拔35m)、临高市(北纬19°54′58"，东经109°38′46"，海拔76m)、儋州市(北纬19°30′38"，东经109°34′21"，海拔158m)六个市县获得。

本发明诺丽(Morinda citrifolia Linn.)内生真菌的具体分离纯化操作步骤如下：

(1)诺丽果和叶的准备：采集诺丽健康、八成熟的果和叶，无菌水冲洗后,即得待分离内生真菌的植物样品,将其存放无菌袋中于4℃保存。

(2)植物样品的表面消毒与无菌检测：将所述植物样品用纯净水洗净,分别依次以2.6％-3.5％次氯酸钠+75％酒精按照不同的消毒时间做30个组合进行表面消毒，具体方案如下：次氯酸钠浸泡时间+酒精消毒时间60s+30s、60s+60s、60s+90s、60s+120s、60s+150s、60s+180s；120s+30s、120s+60s、120s+90s、120s+120s、120s+150s、120s+180s；180s+30s、180s+60s、180s+90s、180s+120s、180s+150s、180s+180s；240s+30s、240s+60s、240s+90s、240s+120s、240s+150s、240s+180s；300s+30s、300s+60s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s。然后无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干水分。用灭过菌的手术刀将果和叶边缘部分去除，果内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，叶内部或中心部分切分成0.5cm×0.5cm大小的组织块。部分果块或叶块放在灭过菌的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上，25±1℃、黑暗条件下恒温培养8～10天。

将另一部分果块和叶块进行无菌检测：采用组织印迹法，将果块或叶块置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上，轻轻滚动或紧贴培养基放置2min，接着移去果块或叶块，在25±1℃、黑暗条件下恒温培养8-10天，无杂菌长出即说明消毒后的果块或叶块表面无菌。

所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基的成分为：马铃薯浸粉3g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、氯霉素0.1g，每1000ml蒸馏水中加PDA38g；使用前PDA固体培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

(3)内生真菌的分离纯化培养：当步骤(2)的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基平板上的诺丽果块或叶块周围长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，把培养得到的菌丝尖端部分，移至新的PDA平板培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8-10天长出完整菌落；重复上述步骤4-5次直至得到纯菌落，即得植物内生真菌，挑取纯菌落内生真菌的尖端部分移至PDA斜面培养基上，25±1℃、黑暗条件下培养8-10天，于4℃保存；

真菌基因组DNA提取：将保存的诺丽果和叶内生真菌活化培养后，接种到马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基中，放入恒温摇床在25±1℃、50rpm/min、黑暗条件下液体培养5天。根据其形态特征将其初步分为酵母菌和霉菌，采用真菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法，提取内生真菌的DNA。

具体步骤如下：1.对于酵母菌，取1～2ml培养好的菌液，离心收集，弃上液。加入200μL溶液A，加入20μL RNaseA，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5-10min。

1.霉菌(孢子也可相同处理)：取1-2ml培养好的菌液，离心收集，弃上液加200μL溶液A，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加入200μL溶液A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡约30min。

2.加入20μL的蛋白酶K(10mg/mL)，充分混匀，55℃水浴消化30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次。12000rpm离心2min。将上清液转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。

3.在上清液中加入200μL溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还可能导致上柱后堵塞柱子，增加消化时间。

4.再加入200μL无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱，放置2min。

5. 12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

6.向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中，重复一次。

7. 12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃恒温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验，如酶切、PCR扩增等。

8.将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μL经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。

9.离心所得的洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。

以上真菌基因组DNA的提取步骤均在室温下进行。

所述马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基的成分为：马铃薯浸粉5g、葡萄糖15g、蛋白胨10g、氯化钠5g，每1000ml蒸馏水中加PDB 35g，使用前PDB液体培养基在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

对上述提取的基因组DNA，采用通用引物对ITS4和ITS1f进行PCR扩增。

PCR扩增体系：无菌水9.5μL、2·PCRMix 12.5μL、引物Ⅰ(ITS4)1.0μL，引物Ⅱ(ITS1f)1.0μL，DNA模板1.0μL，共25μL。(ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；ITS1f；5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)。

PCR反应程序：94℃预变形5min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸55s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存，引物序列由海南光威科技有限公司合成。

对PCR产物进行检测：扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，并拍照保存。

序列测定：将PCR扩增产物送至北京六合华大基因科技有限公司广州分公司进行测序，并将序列在NCBI数据库中进行Blast比对。

本发明在2016年3月-2016年12月采集海南省六个市(县)的诺丽果和叶，在时间和地理位置上均丰富了内生真菌的种类。

本发明对诺丽果和叶采用不同的表面消毒处理，既能确保充分消毒，达到有效去除表面污染菌的目的，又能避免过度的表面消毒，将部分内生真菌杀死，克服了现有植物内生真菌分离方法存在的某些菌种丢失的缺陷。试验结果表明：1、2.6％次氯酸钠+75％酒精在以下8组合消毒时间处理中除菌效果良好(120s+30s、120s+60s、180s+30s、180s+60s、240s+30s、240s+60s、300s+30s、300s+60s)；2、2.6％次氯酸钠+75％酒精在以下7组合消毒时间中没有菌落长出(80s+180s、240s+150s、240s+180s、300s+90s、300s+120s、300s+150s、300s+180s)。

本发明所描述的分离得到诺丽内生真菌共有41株，经分子生物学ITS基因序列分析。PCR扩增得到ITS rDNA的序列片段条带大小分别为700bp和500-700bp，条带均单一明亮(图1)。登录NCBI数据库将诺丽内生真菌已扩增的DNA序列用Blast进行序列比对，分别属于担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)两个类群，包括刺盘孢属(Colletotrichum)、间座壳属(Diaporthe)、炭团菌属(Hypoxylon)、枝孢属(Cladosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、叶点霉属(Phyllosticta)、赤霉属(Gibberella)、金担子菌属(Aureobasidium)、蔷薇色酵母属(Rhodotorula)、隐球菌属(Cryptococcus)、曲霉属(Aspergillus)11个属，26种(如表1所示)。上述26种诺丽内生真菌ITS rRNA测序结果序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.28所示。

本发明从诺丽(Morinda citrifolia Linn.)果和叶中分离得到的内生真菌特征如下：

M22.菌体黑色，质地湿润，有色素产生，渗透到培养基中，表面有突起，边缘不整齐。

M30.菌体黑色，质地湿润，表面平整，边缘整齐。

M45.淡褐色菌丝，质地湿润，产生褐色色素，表面平整，边缘整齐。

M53.白色菌丝，质地湿润，表面有液体生成，产生黑色色素，渗透到培养基中，边缘呈羽毛状。

M44.白色菌丝，质地干燥，表面平整，边缘不整齐。

M18.棕色孢子，质地干燥，白色菌丝，表面平整，边缘整齐。

M49.菌体褐色，质地湿润，有色素产生，渗透到培养基中，表面有突起，边缘不整齐。

M52.白色菌丝，质地湿润，表面有液体生成，产生黑色色素，渗透到培养基中，边缘不整齐。

M48.菌体黑色，质地干燥，有色素产生，渗透到培养基中，表面有突起，边缘不整齐。

M51.白色菌丝，质地湿润，菌丝呈放射状，渗透到培养基中，表面平整，边缘不整齐。

M1.白色菌丝，质地干燥，呈蓬松状，表面有黑色孢子，表面凸起，边缘不整齐。

M2.褐色孢子，质地干燥，白色菌丝，背面有褶皱，表面凸起，边缘不整齐。

M4.白色菌丝，质地干燥，呈蓬松状，表面有褐色孢子，表面凸起，边缘不整齐。

M8.白色菌丝，质地干燥，呈蓬松状，表面有黑色孢子，背面有褶皱，边缘不整齐。

M17.白色菌丝上，黑色孢子，质地干燥，表面凸起，边缘不整齐。

M12.褐色孢子，白色菌丝，质地干燥，表面凸起，边缘不整齐。

M15.棕色孢子，白色菌丝，质地干燥，表面平整，边缘整齐。

M16.黑色孢子，白色菌丝，质地干燥，表面平整，边缘不整齐，干燥。

M40.黑色孢子，菌丝淡黄色，质地干燥，表面平整，边缘整齐。

M37.杆状褐色孢子，白色菌丝，质地干燥，背面有褶皱，边缘不整齐。

J24.菌体透明色，质地湿润，表面平整，边缘整齐。

J22.菌体乳白色，质地粘稠，不透明，表面凸起，边缘不整齐。

J12.菌体红色，质地粘稠，不透明，表面凸起，边缘整齐。

J13.菌体粉红色，质地粘稠，不透明，表面平整，边缘整齐。

J26.菌体粉红色，质地粘稠，不透明，表面凸起，边缘整齐。

J32.菌体淡黄色，质地湿润，不透明，表面平整，边缘整齐。

表1：诺丽(Morinda citrifolia Linn.)果和叶中分离得到的内生真菌

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 2017

海南大学

<120> 一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法

<130> 2017

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 3

<211> 552

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggggtttcg agtaccgctc ttataccctt tgtgacatac cccaaacgtt gcctcggcgg 60

gcagccggag cccagctccg tcgcccggag ccgccgtctc ggcgcgcccc acccgccggc 120

ggaccaccaa actctattta aacgacgtct cttctgagtg gcacaagcaa ataatcaaaa 180

cttttaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag 240

taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca 300

gcattctggc gggcatgcct gttcgagcgt catttcaacc ctcaagcacc gcttggcgtt 360

ggggccctac ggcttccgta ggccccgaaa tacagtggcg gaccctcccg gagcctcctt 420

tgcgtagtaa cataccacct cgcactggga tccggaggga ctcctgccgt aaaacccccc 480

aattttccaa aggttgacct cggatcaggt aggaataccc gctgaactta agcatatcaa 540

taagcggagg aa 552

<210> 4

<211> 595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttattaattg ggtaccgctc cttataaccc tttgtgacat accccaaacg ttgcctcggc 60

gggcagccgg agcccagctc cgtcgcccgg agccgccgtc tcggcgcgcc ccacccgccg 120

gcggaccacc aaactctatt taaacgacgt ctcttctgag tggcacaagc aaataatcaa 180

aacttttaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 240

agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccgc 300

cagcattctg gcgggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa ccctcaagca ccgcttggcg 360

ttggggccct acggcttccg taggccccga aattcagtgg cggaccctcc cggatcctcc 420

tttgcgtaga aacatagcac ctcgcactgg gatccggatg gactcctgcc gtaaaaccct 480

ccaattgggc aaaggaagaa ctcgtatcag gtagcaatac ccgttgaact tagccttacc 540

tcggaaccgg aagaaaaacc cggttaaatt ttttctttct tttaagtgga ggaag 595

<210> 5

<211> 592

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattggcat ctacctgatc cgaggtcaat tttcagaagt tgggggttta acggcagggc 60

accgccaggg ccttccagaa cgagatataa ctactacgct cggggtccta gcgagctcgc 120

cactagattt cagggcctgc cctcgctaga aggcagtgcc ccatcaccaa gccaggcttg 180

agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc cctccggaat accagagggc gcaatgtgcg 240

ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat tacttatcgc atttcgctgc 300

gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc cgttgttgaa agttttgatt catttatgtt 360

ttttactcca agattcacta aagaaacgag atgttaattg gccactggct tcctgctccc 420

tgtttcccgg aaatctttgg gccagatcgc taggacgccg agagtaaaaa taatatctcg 480

atctggaagg cggtgtcggg gccctgccga taaacctcca acttctgaaa ctttgaccgc 540

tgatcaagtg ggaaccccgg cgaactttaa cttctccata tggaggagga aa 592

<210> 6

<211> 604

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaggaagta aaagtcgtaa caaggtctcc gttggtgaac cagcggaggg atcattgctg 60

gaacgcgctt cggcgcaccc agaaaccctt tgtgaactta tacctattgt tgcctcggcg 120

caggccggcc tcttcactga ggccccctgg aaacagggag cagcccgccg gcggccaacc 180

aaactcttgt ttctatagtg aatctctgag taaaaaaaca taaatgaatc aaaactttca 240

acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt 300

gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc tctggtattc 360

cggagggcat gcctgttcga gcgtcatttc aaccctcaag cctggcttgg tgatggggca 420

ctgcctgtaa tagggcaggc cctgaaatct agtggcgagc tcgccaggac cccgagcgta 480

gtagttatat ctcgctctgg aaggccctgg cggtgccctg ccgttaaacc cccaacttct 540

gaaaatttga cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg 600

agga 604

<210> 7

<211> 591

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgaccggcat gctacctaat ccgaggtcac cattaaaata gggggtgttt tatggctagc 60

aactataacc actacaagaa gcgagagaga gttactacgc ttagagtgtg ctataactcc 120

gccactaact ttaaggaact acgctataat aggtcgtaga gtcccaacgc taaacaaccg 180

aggcttaagg gttgaaatga cgctcgaata ggcatgccca ctagaatact aatgggcgca 240

atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300

tcgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttaacttat 360

ttagttataa agttcagaga tacagtataa aacagagttg gtaggtcctc tggcgagctt 420

ggaatgtgtt cccgggtagc tacagggtag ctatagggta gcataactcg ccgaggcaac 480

agtggtaagt tcacaaaggg ttgggagttt tggataactc agtaatgatc cctccgctgg 540

ttcaccaacg gagaccttgt tacgactttt acttcctcta aatgaccaag a 591

<210> 8

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtcagcgac ccgtagtgac cggtttcacc gggatgttct aaccctttgt tgtccgactc 60

tgttgcctcc ggggcgaccc tgccttcggg cgggggctcc gggtggacac ttcaaactct 120

tgcgtaactt tgcagtctga gtaaacttaa ttaataaatt aaaactttta acaacggatc 180

tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga 240

attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat 300

gcctgttcga gcgtcatttc accactcaag cctcgcttgg tattgggcaa cgcggtccgc 360

cgcgtgcctc aaatcgaccg gctgggtctt ctgtccccta agcgttgtgg aaactattcg 420

ctaaagggtg ctcgggaggc tacgccgtaa aacaacccca tttctaaggt tgacctcgga 480

tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcataagg ggggaagaac t 531

<210> 9

<211> 561

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaccgggctc ctacctgatc cgaggtcacc ttagaaatgg ggttgtttta cggcgtagcc 60

tcccgagcac cctttagcga atagtttcca caacgcttag gggacagaag acccagccgg 120

tcgatttgag gcacgcggcg gaccgcgttg cccaatacca agcgaggctt gagtggtgaa 180

atgacgctcg aacaggcatg ccccccggaa taccaggggg cgcaatgtgc gttcaaagat 240

tcgatgattc actgaattct gcaattcaca ttacttatcg catttcgctg cgttcttcat 300

cgatgccaga accaagagat ccgttgttaa aagttttaat ttattaatta agtttactca 360

gactgcaaag ttacgcaaga gtttgaagtg tccacccgga gcccccgccc gaaggcaggg 420

tcgccccgga ggcaacagag tcggacaaca aagggttatg aacatcccgg tggtaaaccg 480

gggtcacttg taatgatccc tccgcaggtt cacctacgga gaccttgtta cgacttttac 540

ttcctctaat ttgacccaag a 561

<210> 10

<211> 550

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcggggattt ctactgatcc gaggtcacat tcagaagttg ggggtttaac ggcttggccg 60

cgccgcgtac cagttgcgag ggttttacta ctacgcaatg gaagctgcag cgagaccgcc 120

actagatttc ggggccggct tgccgcaagg gctcgccgat ccccaacacc aaacccgagg 180

gcttgagggt tgaaatgacg ctcgaacagg catgcccgcc agaatactgg cgggcgcaat 240

gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt cacattactt atcgaatttt 300

gctgcgttct tcatcaatgc cagaaccaaa agatccgttg ttgaaaggtt taatttattt 360

atggttttac tcagaagata catatagaaa ccgagtgaag ggggcctctg gctgcttatt 420

ccgttccccg ggagcgggat gctttcccaa gccctttttt gccactttcc ctcgcaccct 480

gccttggggg gtctgcacag ggagcataca gtgggctttg gagtcggatg gattgttcga 540

ttttaacttt 550

<210> 11

<211> 635

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agtgggcttc tacctgatcc gaggtcacct tggaaaatag accgaaggtc gattgtccgg 60

cggccgtcgc ccagcactcc aaagcgagat attttactac tacgctcgag gctaggacgc 120

cgtcgccgag gtcttcaagg cacgtccggc agcggacgtt gcccaatacc aagcagagct 180

tgagggttga aatgacgctc gaacaggcat gccctccgga ataccagagg gcgcaatgtg 240

cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc gcatttcgct 300

gcgttcttca tcgatgccag aaccaagaga tccgttgttg aaagttttaa tcaattaaat 360

gatatatcag gacttcacaa aatgaattct tgagttttgt atactggcgg gcacttagcc 420

aggcgtcctg gccagttaag gctgggggcg ccggccgcct gggtcggaac caggtcgacc 480

cgccaaagca acatagtgag tacacaaggg tgagaaggtc atttcggcgt tgtagcgcct 540

actctggaac ctttcaatag aagttattac atttcagtaa tgatccttcc gcaggttcac 600

ctacggaaac cttgttacga cttttacttc ctcaa 635

<210> 12

<211> 568

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcccgggctt tctacctgat ccgaggtcac attcagaagt tgggggttta acggcttggc 60

cgcgccgcgt accagttgcg agggttttac tactacgcaa tggaagctgc agcgagaccg 120

ccactagatt tcggggccgg cttgccgcaa gggctcgccg atccccaaca ccaaacccga 180

gggcttgagg gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca 240

atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300

ttgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgatttat 360

ttatggtttt actcagaagt tacatataga aacagagttt aggggtcctc tggcgggccg 420

tcccgtttta ccgggagcgg gctgatccgc cgaggcaaca attggtatgt tcacaggggt 480

ttgggagttg taaactcggt aatgatccct ccgctggttc accaacggag accttgttac 540

gacttttact tcctctaaat gaccaaga 568

<210> 13

<211> 575

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cggctacgag tcggggtctt tgggccaacc tcccatccgt gtctattata ccctgttgct 60

tcggcgggcc cgccgcttgt cggccgccgg gggggcgcct ttgccccccg ggcccgtgcc 120

cgccggagac cccaacacga acactgtctg aaagcgtgca gtctgagttg attgaatgca 180

atcagttaaa actttcaaca atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga 240

aatgcgataa ctaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat 300

tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcattgctgc cctcaagccc 360

ggcttgtgtg ttgggtcgcc gtccccctct ccggggggac gggcccgaaa ggcagcggcg 420

gcaccgcgtc cgatcctcga gcgtatgggg ctttgtcaca tgctctgtaa gattggccgg 480

cgcctgccga cgttttccaa ccattttttc caggttgacc tcggatcagg tagggatacc 540

cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaatc 575

<210> 14

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaccgagt 60

gctgggtcct tcggggccca acctcccacc cgtgcttacc gtaccctgtt gcttcggcgg 120

gcccgccttc gggcggcccg gggcctgccc ccgggaccgc gcccgccgga gaccccaatg 180

gaacactgtc tgaaagcgtg cagtctgagt cgattgatac caatcagtca aaactttcaa 240

caatggatct cttggttccg gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aactaatgtg 300

aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc ctggtattcc 360

ggggggcatg cctgtccgag cgtcatttct cccctccagc cccgctggtt gttgggccgc 420

gcccccccgg gggcgggcct cgagagaaac ggcggcaccg tccggtcctc gagcgtatgg 480

ggctctgtca cccgctctat gggcccggcc ggggcttgcc tcgaccccca atcttctcag 540

attgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata 590

<210> 15

<211> 618

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtttc cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattacc 60

gagtgcgggt cctttgggcc caacctccca tccgtgtcta ttataccctg ttgcttcggc 120

gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgcctttgcc ccccgggccc gtgcccgccg 180

gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg agttgattga atgcaatcag 240

ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 300

gataactaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgag tctttgaacg cacattgcgc 360

cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc gagcgtcatt gctgccctca agcccggctt 420

gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc 480

gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacatgctc tgtaggattg gccggcgcct 540

gccgacgttt tccaaccatt ttttccaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg 600

aacttaagca tatcaata 618

<210> 16

<211> 626

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaggaagtaa aagtcgtaac aaggtttccg taggtgaacc tgcggaagga tcattaccga 60

gtgcgggtcc tttgggccca acctcccatc cgtgtctatt gtaccctgtt gcttcggcgg 120

gcccgccgct tgtcggccgc cgggggggcg cctctgcccc ccgggcccgt gcccgccgga 180

gaccccaaca cgaacactgt ctgaaagcgt gcagtctgag ttgattgaat gcaatcagtt 240

aaaactttca acaatggatc tcttggttcc ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga 300

taactaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc tttgaacgca cattgcgccc 360

cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc tgccctcaag cccggcttgt 420

gtgttgggtc gccgtccccc tctccggggg gacgggcccg aaaggcagcg gcggcaccgc 480

gtccgatcct cgagcgtatg gggctttgtc acatgctctg taggattggc cggcgcctgc 540

cgacgttttc caaccattct ttccaggttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa 600

cttaagcata tcaataaggc ggagga 626

<210> 17

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc attaccgagt 60

gcgggtcctt tgggcccaac ctcccatccg tgtctattat accctgttgc ttcggcgggc 120

ccgccgcttg tcggccgccg ggggggcgcc tttgcccccc gggcccgtgc ccgccggaga 180

ccccaacacg aacactgtct gaaagcgtgc agtctgagtt gattgaatgc aatcagttaa 240

aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata 300

actaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt tgaacgcaca ttgcgccccc 360

tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg ccctcaagcc cggcttgtgt 420

gttgggtcgc cgtccccctc tccgggggga cgggcccgaa aggcagcggc ggcaccgcgt 480

ccgatcctcg agcgtatggg gctttgtcac atgctctgta ggattggccg gcgcctgccg 540

acgttttcca accatttttt ccaggttgac ctcggatcag gtagggatac ccgctgaact 600

taagcatatc aataaggcgg agga 624

<210> 18

<211> 584

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aatgggcagc tacctgatcc gaggtcatct gagaagattg ggggtcgagg caagccccgg 60

ccgggcccat agagcgggtg acagagcccc atacgctcga ggaccggacg gtgccgccgt 120

ttctctcgag gcccgccccc gggggggcgc ggcccaacaa ccagcggggc tggaggggag 180

aaatgacgct cggacaggca tgccccccgg aataccaggg ggcgcaatgt gcgttcaaag 240

actcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattagttat cgcatttcgc tgcgttcttc 300

atcgatgccg gaaccaagag atccattgtt gaaagttttg actgattggt atcaatcgac 360

tcagactgca cgctttcaga cagtgttcca ttggggtctc cggcgggcgc ggtcccgggg 420

gcaggccccg ggccgcccga aggcgggccc gccgaagcaa cagggtacgg taagcacggg 480

tgggaggttg ggccccgaag gacccagcac tcggtaatga tccttccgca ggttcaccta 540

cggaaacctt gttacgactt ttacttcctc taaaatgacc aaga 584

<210> 19

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gggatttctt gtgctgtacg atctggtctt cggggccacc tcccacccgt gcttaccgta 60

ccctgttgct tcggcgggcc cgccttcggg cggcccgggg cctgcccccg ggaccgcgcc 120

cgccggagac cccaatggaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagtcga ttgataccaa 180

tcagtcaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa 240

atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt 300

gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt catttctccc ctccagcccc 360

gctggttgtt gggccgcgcc cccccggggg cgggcctcga gagaaacggc ggcaccgtcc 420

ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcaccc gctctatggg cccggccggg gcttgcctcg 480

acccccaatc ttctcagatt gacctcggat caggtaggga tacccgctga acttaagcat 540

atcaataagc ggaggaa 557

<210> 20

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggggtacga ttgcggtctt tgggccacct cccatccgtg tctattatac cctgttgctt 60

cggcgggccc gccgcttgtc ggccgccggg ggggcgcctt tgccccccgg gcccgtgccc 120

gccggagacc ccaacacgaa cactgtctga aagcgtgcag tctgagttga ttgaatgcaa 180

tcagttaaaa ctttcaacaa tggatctctt ggttccggca tcgatgaaga acgcagcgaa 240

atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt 300

gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg 360

gcttgtgtgt tgggtcgccg tccccctctc cggggggacg ggcccgaaag gcagcggcgg 420

caccgcgtcc gatcctcgag cgtatggggc tttgtcacat gctctgtagg attggccggc 480

gcctgccgac gttttccaac cattttttcc aggttgacct cggatcaggt agggataccc 540

gctgaactta agcatatcaa taagccggag gaa 573

<210> 21

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctgcggcgag tgctggtctt cggggccaac ctcccacccg tgcttaccgt accctgttgc 60

ttcggcgggc ccgccttcgg gcggcccggg gcctgccccc gggaccgcgc ccgccggaga 120

ccccaatgga acactgtctg aaagcgtgca gtctgagtcg attgatacca atcagtcaaa 180

actttcaaca atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa 240

ctaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat tgcgccccct 300

ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcatttctcc cctccagccc cgctggttgt 360

tgggccgcgc ccccccgggg gcgggcctcg agagaaacgg cggcaccgtc cggtcctcga 420

gcgtatgggg ctctgtcacc cgctctatgg gcccggccgg ggcttgcctc gacccccaat 480

cttctcagat tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatcaataag 540

cgggaggaa 549

<210> 22

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcgaatgcga gtgcggttga tcggtctttg ggcccacctc ccatccgtgt ctattatacc 60

ctgttgcttc ggcgggcccg ccgcttgtcg gccgccgggg gggcgccttt gccccccggg 120

cccgtgcccg ccggagaccc caacacgaac actgtctgaa agcgtgcagt ctgagttgat 180

tgaatgcaat cagttaaaac tttcaacaat ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa 240

cgcagcgaaa tgcgataact aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gagtctttga 300

acgcacattg cgccccctgg tattccgggg ggcatgcctg tccgagcgtc attgctgccc 360

tcaagcccgg cttgtgtgtt gggtcgccgt ccccctctcc ggggggacgg gcccgaaagg 420

cagcggcggc accgcgtccg atcctcgagc gtatggggct ttgtcacatg ctctgtagga 480

ttggccggcg cctgccgacg ttttccaacc attttttcca ggttgacctc ggatcaggta 540

gggatacccg ctgaacttaa gcatatcata agccggaaga aa 582

<210> 23

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cggggatcta cctgatccga ggtcacctag aaaaataaag gtttcagtcg gcagaagtcc 60

tctcctttga cagacgttcg aataaattct actacgccta aagccggtga ggcctcgccg 120

aggtctttaa ggcgcgccca actaaggacg gcacccaata ccaagcatag cttgagtggt 180

gtaatgacgc tcgaacaggc atgcccctcg gaataccaag gggcgcaatg tgcgttcaaa 240

gattcgatga ttcactgaat tctgcaattc acattactta tcgcatttcg ctgcgttctt 300

catcgatgcg agaaccaaga gatccgttgt tgaaagtttt gatttattca aaattttaac 360

tcagacgacc ggtttaataa caagagtttg gtttaactct ggcgggcgct cgcctgggac 420

gaatccccag cggctcgaga ccgagcggtc ccgccaaagc aacaaggtag ttttaacaac 480

aaagggttgg aggtcgggcg ctgagcaccc ttactcttta atgatccttc cgcaggttca 540

cctacggaaa ccttgttacg acttttactt cctcaatttg acccaaga 588

<210> 24

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tcttggtcat ttagaggaag taaaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa 60

ggatcattat tgattggtcg aaagacctta tcagattcta ccacctctgt gaaccgttga 120

cctccgggtt aataatcaaa catcagtgta acgaacgtaa gagtatctta acgaaacaaa 180

actttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa 240

gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacct tgcgcctttt 300

ggtattccga aaggcatgcc tgtttcagtg tcatgaaatc tcaatctaat atgttttctg 360

aacatgttag gcttggactt gggcgtctgc cagtgatggc tcgcctcaaa tgacttagtg 420

gaacatccca catcagtgtt agacgtaata agtttcgtct ctccttgtgg tgatgactgc 480

tcagaacctg ccatcgcgca tcttttgact ttgacctgaa atcaggtagg gctacccgct 540

gaacttaagc atatcaataa gcggagg 567

<210> 25

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ccggacctcc tggatttgag gtcaaatctt aaatgtggac ttctgattag aaacttcctt 60

taacctaacc cggatctagt ccgaagacta gaattcctca acgaatagac tattacgcca 120

agtcaatcct aaagttcgat tgcggatgct aatgcattac gaacgagcta gaacgtaaag 180

gccagcagcg ctcacaatcc aaacacctct tcgatcacta agaaagagga gggttgaagt 240

attcctgaca ctcacacagg catgctccac ggaataccat ggagcgcaag gtgcgttcaa 300

agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt cacattactt atcgcatttc gctgcgttct 360

tcatcgatgc gagagccaag agatccgttg ttgaaagttt tgttttgtta taaaattaaa 420

tacattcata gactttgtgt ttataagtga ataggaattc gctcttgcga gctactatcc 480

caaacaaatg cacaggggta gaaagtgaga gttcggactc caagttaaat tggacgccct 540

atgttctcta atgatgctta tgaaggttga gctacccata ccatgttacg actattactt 600

gctctcattg atcaagagga ggatggt 627

<210> 26

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cacggtgtcc ttcctggatt ttaagatcta atcttaaatg tagacattct gattagaagc 60

ttcctttaac ctaacccggc tctaatccga agactagaat tcctcagcga atagtctatt 120

acgccaagtc aatccgaaag ttcgattgcg gatgctaatg cattacgaac gagctagacc 180

gtaaaggcca gcagcgctca gaatccaaac acctcttcga tcactaagaa agaggagggt 240

tgaagtattc atgacactca aacaggcatg ctccacggaa taccatggag cgcaaggtgc 300

gttcaaagat tcgatgattc actgaattct gcaattcaca ttacttatcg catttcgctg 360

cgttcttcat cgatgcgaga gccaagagat ccgttgttga aagttttgtt ttgttataaa 420

attaaataca ttcatagact ttgtgtttat aagtgaatag gaattcgctc ttgcgagcta 480

ctatcccaaa caaatgcaca gggttagaaa gtgagagttc ggactccaag ttaaattgga 540

cgtcctatgt tcactaatga tccttccgca ggttcaccta cggagacctt gttacgactt 600

ttacttcctc ctaatgacga gggggaggga aa 632

<210> 27

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tactggctcc cctacctgat cctgaggtct actcttaaat gtggacgatg actagattgg 60

aagcttcctt tagtccgacc cggctctagt aatagtacta gcaattcctc aaccgaatag 120

actattagcc ctgattttcc gaaagttcga ttgcggatgc taatgcatta cgaacgagct 180

aatagaggaa cggccgacag cgctcaaaat ccgcacacct cttcactcaa gggaaagagg 240

agggttgaag attcatgaca ctctgaaggc atgctccacg gaataccatg gatttcaagg 300

tgcgttcaaa gattcgatga ttcactgaat tctgctgttc acattactta tcgcatttcg 360

ctgcgttctt catcaatgcg agagccaaga gatccgttgt tgaaagtttt attttgttat 420

aaaattaaat acattcatag actttgtgtt tataagtgaa taggagttcg acgactaggt 480

cgactactat cccaaacgag tgcacagggt tagaaagtga gagttcggac tccaagttaa 540

gttggacgtc ctatgttcac taatgatcct tccgcaggtt cacctacgga aaccttgtta 600

cgacttttac ttcctctaaa tgaccaagag gg 632

<210> 28

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gatgggttct actgatttga ggtctaatcg taaatgtgga cttctgatta gaacttcctt 60

tacctaaccc ggctctagtc cgaagactag aattcctcaa cgaatagact attacgccca 120

gtcaatccga aagttcgatt gcggatgcta atgcattacg aacgagctag aacgtatagg 180

cggacggcgc tctcaaaccc cacacctctc tgctccctag aataaagagg gggggaaaga 240

ttcttgacac actcaaagat gcgcgcacct cggaacctcg tgtagcgcgg ggcgcgttca 300

tacattctga tactctgtga tctccgctac acattttgtt tatcgttttt ctgtgttctc 360

ttcctccacg ccagaccgca gatatcctgt tgagagtttt gttttgtgat ataattatat 420

atattctcag actttgtgtg tatatatgtg aaggaaatct ctcttgcgag ctacactact 480

atcccaatgc actgggttag gttataaggt gacagactcc actccaaatt ggacggcaca 540

tgttatgtac tgatccttcc cttcgttcag ctacggaaac cttgttacga cttttacttc 600

ctctcatcga actgaccaag a 621

Claims (10)

1.一种诺丽内生真菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：

1)对诺丽果和叶进行表面消毒；

2)将诺丽果和叶的内部组织置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25±1℃黑暗条件下培养8～10天；

3)将步骤2)培养得到的菌株进行传代培养，通过4～5次连续的菌丝尖端转移进行纯化，得到诺丽内生真菌；

4)对步骤3)得到的诺丽内生真菌进行ITS测序鉴定。

2.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)中的诺丽果和叶为八成熟。

3.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)的表面消毒包括次氯酸钠溶液消毒和乙醇溶液消毒。

4.根据权利要求3所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠的质量浓度为2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为75％。

5.根据权利要求3或4所述的分离鉴定方法，其特征在于，次氯酸钠溶液消毒的时间为60～300s，乙醇溶液消毒的时间为30～180s。

6.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤1)的表面消毒后还包括：采用无菌水对诺丽果和叶清洗2～4次。

7.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，步骤2)得到的诺丽果和叶的边缘部分采用组织印迹法进行无菌检测。

8.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)得到的诺丽内生真菌后还包括：将诺丽内生真菌在马铃薯葡萄糖肉汤培养基中进行培养，所述培养条件为25±1℃，20rpm进行液体暗培养。

9.根据权利要求1所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)的ITS测序鉴定基于核糖体ITS区域的ITS1f和ITS4基因序列。

10.根据权利要求9所述的分离鉴定方法，其特征在于，所述ITS测序鉴定用引物如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。