CN107233301B - 一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法，以聚γ‑谷氨酸、壳寡糖、透明质酸、纳米颗粒、鼠李糖脂、交联剂EDC/NHS制备凝胶，在交联剂催化的作用下，进行分子间交联反应。本发明提供的方法将透明质酸作为催化剂，配合鼠李糖脂、交联剂EDC/NHS，能够有效降低凝胶形成的时间，并使凝胶具有更多的优异地凝胶性能，具有较高的生物活性性能和良好的生物相容性，溶胀性能良好，原料廉价易得，生产工艺简单。

Description

一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法。
背景技术
近几年，随着科技水平的提高，人们逐渐增加对药物的负载体系的研究，进而扩展药物本身的应用范围，针对载药系统的研究，尤其是纳米凝胶载药体系的研究，已经成为研究的热点。
目前，纳米颗粒水凝胶的制备方法，多是采用化学交联剂或者物理辐射等方式将高分子聚合物制备成水凝胶敷料，其吸水度、抗菌性能、生物相容性、负载药物的能力等各种性能方面具有很大的差异性，存在制备方法复杂，成胶时间长、成本较高等诸多问题。
发明内容
为了解决现有技术中在制备纳米颗粒凝胶载药体系的过程中，制备方法复杂，成胶时间过久等问题，本发明提供一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法。本发明方法在原料体系中加入透明质酸后，不但明显缩短纳米颗粒凝胶载药体系形成的时间，并大大提高了提高纳米颗粒凝胶载药体系的保水性以及粘稠性。
本发明技术方案为：
一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法，步骤包括：
1）将纳米颗粒加入到灭菌去离子水中，超声20min，混合均匀，配制为0.15mg/mL的纳米颗粒溶液；
2）将聚γ-谷氨酸加入到灭菌去离子水中，搅拌溶解，配制为浓度0.07g/mL的透明聚γ-谷氨酸溶液，然后向其中加入步骤1）制备的纳米颗粒溶液，使溶液中纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1:30～50，搅拌均匀，得到纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液；
3）将透明质酸加入到步骤2）制备的纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中，透明质酸加入浓度为0.002～0.006 g/mL，搅拌均匀，然后再加入壳寡糖，壳寡糖的加入浓度为0.003～0.007g/mL，搅拌均匀，形成均一溶液；
4）将步骤3）制备的均一溶液，微波加热9～15s后，再继续搅拌30～60s，形成澄清透明溶液，冷却至室温后，向其中加入负载药物，加入量为每0.15mg纳米颗粒负载0.003～0.008g药物，搅拌20～30s，形成混合溶液；
5）向步骤4）制备的混合溶液中，加入鼠李糖脂粉末，搅拌20～30 s，形成稳定均一的混合溶液，加入交联剂EDC/NHS，搅拌3～20min直至形成凝胶，即纳米颗粒凝胶载药系统。
优选地，步骤1）中，所述的纳米颗粒为纳米银、纳米铜、纳米金或纳米铂；纳米颗粒为10～100nm。
优选地，步骤2）中，所述的纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1:46.7。
优选地，步骤3）中，所述的透明质酸，其分子量大小为2500～3000KD。
优选地，步骤3）中，透明质酸加入浓度为0.004g/mL；壳寡糖加入浓度为0.005 g/mL。
优选地，步骤4）中，药物负载量为每0.15mg纳米颗粒负载0.005g药物；所述的负载药物优选为顺铂（CDDP）或紫杉醇。
优选地，步骤4）中，微波加热，功率为1200W，频率为2450MHz，温度200～300℃。
优选地，步骤5）中，鼠李糖脂用量为每mL原料总体积加入鼠李糖脂7～15mg。
优选地，步骤5）中，EDC/NHS交联剂为 EDC和NHS溶于去离子水中配制成的0.5M交联剂溶液， EDC与NHS在水中的摩尔比为2:1，EDC/NHS交联剂用量为250μL/0.15mg纳米颗粒。
所述快速制备方法，制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率为5.25～8.75%，药物包裹率为34.67～65.23%，纳米颗粒包含率为97.58～99.69%，凝胶交联度43.78%以上，吸水度为38.7～44.9 g/g。
优选地，上述纳米颗粒凝胶载药系统，使用前在恒温培养箱中37℃温育24h。
上述方法制备的纳米颗粒凝胶载药系统，可用于制备医药产品、护肤产品以及药物负载；尤其适用于创伤、烧伤等伤口中做伤口敷料，促进伤口的快速愈合，抑制伤口处细菌的繁殖；或者做成面膜、护手霜等。
本发明快速制备方法，在纳米颗粒凝胶载药系统原料中引入生物活性表面剂鼠李糖脂，促进纳米颗粒及其他药用物质的溶解及均匀分散，使纳米颗粒在水凝胶中分散更加均匀，更好的被水凝胶包埋，具有更好的包封率，以及抑菌效果。然后以透明质酸作为交联剂和催化剂，配合鼠李糖脂与聚γ-谷氨酸凝胶特异性结合，在本发明制备条件下，与交联剂EDC/NHS共同作用，快速发生分子内交联反应以及不同原料的分子间交联反应，可在极短时间内形成交联，显著缩短纳米颗粒凝胶载药系统的凝胶形成时间，并且使凝胶具有更优异的性能，同时解决了现有制备技术中普遍存在的纳米粒子极易团聚，在凝胶液中不容易均匀分散的问题。
本发明快速制备方法，成胶时间短，原料廉价易得，生产工艺简单。得到的凝胶载药体系，具有较高的生物相容性，可降解性，具有较高的保水性，失水率很低，对细胞无毒性。溶胀性能良好，药物包裹率高，载药量高。
附图说明
图1为透明质酸浓度对凝胶形成时间的影响；
图2为透明质酸浓度对凝胶载药量的影响；
图3为透明质酸浓度对凝胶保水率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方案，来进一步阐述本发明。并认为，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1 0.002g/mL透明质酸对纳米颗粒凝胶载药体系形成时间的影响
一种采用透明质酸制备纳米颗粒凝胶载药体系的方法，步骤为：
1）将纳米颗粒（纳米银，10～100nm）加入到灭过菌的去离子水中，超声20min，混合均匀，配制0.15mg/mL纳米颗粒溶液；
2）将聚γ-谷氨酸加入到灭菌去离子水中，搅拌溶解，配制为浓度0.07g/mL的透明聚γ-谷氨酸溶液，然后向其中加入步骤1）制备的纳米颗粒溶液，使溶液中纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1: 46.7，搅拌均匀，得到纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液；
3）将透明质酸（分子量2500～3000KD）加入到步骤2）制备的纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中，透明质酸加入浓度为0.002g/mL，搅拌均匀，然后再加入壳寡糖，壳寡糖的加入浓度为0.005 g/mL，搅拌均匀，形成均一溶液；
4）将步骤3）制备的均一溶液，微波（功率1200W、频率2450MHz、温度250℃）加热10s后，再继续搅拌30s，形成澄清透明溶液，冷却至室温后，向其中加入负载药物（顺铂），加入量为每0.15mg纳米颗粒负载0.005g药物，搅拌25s，形成混合溶液；
5）向步骤4）制备混合溶液中，加入鼠李糖脂粉末，鼠李糖脂用量为每mL原料总体积加入鼠李糖脂10mg，搅拌25s，形成稳定均一的混合溶液，加入交联剂EDC/NHS（EDC和NHS溶于去离子水中配制成的0.5M交联剂溶液， EDC与NHS在水中的摩尔比为2:1），EDC/NHS交联剂用量为250μL/0.15mg纳米颗粒，搅拌20min，形成凝胶，即成纳米颗粒凝胶载药系统。
对于实施例1得到的水凝胶，通过添加不同透明质酸，对凝胶形成时间的时间进行测定，对采用称重法对实施例1得到的水凝胶进行保水性的测试，并且研究其载药量的变化程度。
从图1可以看出，透明质酸量为0.002g/mL时，相比较未加透明质酸时，凝胶形成的时间已经明显缩短到半个小时以内，从图2和图3可以看出，凝胶的载药量和保水率也逐渐得到提高。
实施例1制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率为5.75%，药物包裹率为34.67%，纳米颗粒包含率为97.58%，凝胶交联度43.78 %以上，吸水度为38.7g/g。
实施例2 0.004g/mL透明质酸对纳米颗粒凝胶载药体系形成时间的影响
一种采用透明质酸制备纳米颗粒凝胶载药体系的方法，步骤为：
1）将纳米颗粒（纳米铜，10～100nm）加入到灭过菌的去离子水中，超声20min，混合均匀，配制0.15mg/mL纳米颗粒溶液；
2）将聚γ-谷氨酸加入到灭菌去离子水中，搅拌溶解，配制为浓度0.07g/mL的透明聚γ-谷氨酸溶液，然后向其中加入步骤1）制备的纳米颗粒溶液，使溶液中纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1: 46.7，搅拌均匀，得到纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液；
3）将透明质酸（分子量2500～3000KD）加入到步骤2）制备的纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中，透明质酸加入浓度为0.004 g/mL，搅拌均匀，然后再加入壳寡糖，壳寡糖的加入浓度为0.005 g/mL，搅拌均匀，形成均一溶液；
4）将步骤3）制备的均一溶液，微波（ 功率1200W，频率2450MHz，温度300℃）加热10s后，再继续搅拌50s，形成澄清透明溶液，冷却至室温后，向其中加入负载药物（紫杉醇），加入量为每0.15mg纳米颗粒负载0.005g药物，搅拌25s，形成混合溶液；
5）向步骤4）制备混合液中，加入鼠李糖脂粉末，鼠李糖脂用量为每mL原料总体积加入鼠李糖脂15mg，搅拌25s，形成稳定均一混合溶液，加入交联剂EDC/NHS（EDC和NHS溶于去离子水中配制成的0.5M交联剂溶液， EDC与NHS在水中的摩尔比为2:1），EDC/NHS交联剂用量为250μL/0.15mg纳米颗粒，搅拌5min，形成凝胶，即成纳米颗粒凝胶载药系统。
对于实施例2得到的水凝胶，通过添加 不同浓度的透明质酸，对凝胶形成时间的时间进行测定，对采用称重法对实施例2得到的水凝胶进行保水性的测试，并且研究其载药量的变化程度。
从图1可以看出，透明质酸量为0.004g/mL时，相比较未加透明质酸时，凝胶形成的时间已经明显缩短到半个小时以内，并且时间最短为0.8h，也即为5min。从图2和图3可以看出，载药量和保水率都得到明显的提高，此时的载药量达到8.75%，保水率达到98.94%。
实施例2制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率为8.75%，药物包裹率为60.54%，纳米颗粒包含率为 98.74%，凝胶交联度 43.78 %以上，吸水度为 42.6g/g。
实施例3 0.006g/mL透明质酸对纳米颗粒凝胶载药体系形成时间的影响
一种采用透明质酸制备纳米颗粒凝胶载药体系的方法，步骤为：
1）将纳米颗粒（纳米银，10～100nm）加入到灭过菌的去离子水中，超声20min，混合均匀，配制0.15mg/mL纳米颗粒溶液；
2）将聚γ-谷氨酸，加入到灭过菌的去离子水中，搅拌溶解，配制0.07g/mL的透明溶液，然后向透明溶液中加入步骤1）制备好的纳米颗粒溶液，使溶液中纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1: 46.7，搅拌均匀，得到富含纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液；
3）将透明质酸（分子量2500～3000KD）加入到步骤2）制备的纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液当中，搅拌均匀，透明质酸浓度为0.006g/mL，然后再加入壳寡糖，壳寡糖的浓度为0.005g/mL，搅拌均匀，形成混合的均一溶液；
4）将步骤3）制备的均一溶液，微波（功率1200W，频率2450MHz，温度250 ℃）加热10s后，再继续搅拌60s，形成澄清透明溶液，冷却至室温后，向其中加入负载药物（紫杉醇），加入量为每0.15mg纳米颗粒负载0.005g药物，搅拌25s，形成混合溶液；
5）向步骤4）制备混合溶液中，加入鼠李糖脂粉末，鼠李糖脂用量为每mL原料总体积加入鼠李糖脂7mg，搅拌25s，形成稳定均一的混合溶液，加入交联剂EDC/NHS（EDC和NHS溶于去离子水中配制成的0.5M交联剂溶液， EDC与NHS在水中的摩尔比为2:1），EDC/NHS交联剂用量为250μL/0.15mg纳米颗粒，搅拌5min，形成凝胶，即成纳米颗粒凝胶载药系统。
对于实施例3得到的水凝胶，通过添加不同透明质酸，对凝胶形成时间的时间进行测定，对采用称重法对实施例3得到的水凝胶进行保水性的测试，并且研究其载药量的变化程度。
从图1可以看出，透明质酸量为0.006g/mL时，相比较未加透明质酸的凝胶时，凝胶形成的时间已经明显缩短，但是与浓度为0.004g/mL和0.005g/mL的透明质酸相比，其凝胶形成的时间已经变化不大，大约都为0.9h左右；从图2和图3可以看出，载药量和保水率仍呈现上升趋势，但是变化比较平缓，此时的载药量达到8.76%，保水率达到99.32%。
实施例3制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率为8.76%，药物包裹率为59.72%，纳米颗粒包含率为 98.93%，凝胶交联度 45.28 %以上，吸水度为 44.8g/g。
对比例1
与实施例2不同之处在于步骤3）中不添加透明质酸。
对比例1的步骤 6）搅拌形成凝胶时间需至少5h；而实施例2加入0.004g/mL的透明质酸， 5min内即可形成凝胶。凝胶的载药量和保水率都得到明显的提高，并逐渐呈现上升的趋势，此时的载药量已经达到8.75%，保水率达到98.94%。
对比例2
与实施例2不同之处在于步骤3）中透明质酸替换为羧酸纤维素，即添加相同量的0.004g/mL羧酸纤维素。
对比例2添加相同量的羧酸纤维素，分子量接近透明质酸分子量，性质也相近，但是添加后，凝胶在5h左右时缓慢形成，说明羧酸纤维素并不能降低凝胶形成的时间，对纳米颗粒凝胶载药体系无影响。
对比例3
与实施例2不同之处在于步骤3）中透明质酸替换为聚乙二醇，即添加相同量的0.004g/mL PEG6000（聚乙二醇）
对比例2添加相同量的PEG6000，性质接近透明质酸，是一种高分子聚合物，保水性及溶解性接近透明质酸的性质，添加后，至少需5h后缓慢形成凝胶，说明聚乙二醇并不能降低凝胶形成的时间，对纳米颗粒凝胶载药体系无影响。
对比例4
与实施例2不同之处在于，步骤5）中，不添加鼠李糖脂。
对比例4得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率3.23%，药物包裹率18.74%，纳米颗粒包含率为75.41%，凝胶交联度38.84%以上，吸水度40.78g/g，凝胶大约在5min内形成。可以看出，与实施例2得到的纳米颗粒凝胶载药相比，未加鼠李糖脂时，药物的负载率，包裹率以及纳米颗粒的包含率，明显下降，说明鼠李糖脂作为生物活性表面剂，对纳米颗粒和药物的均匀分散及结合到凝胶体系中，有着重要的作用。
对比例5
与实施例2不同之处在于，步骤5）中不添加交联剂EDC/NHS。
对比例5得到的纳米颗粒凝胶载药系统，呈现浑浊的胶状液体现象，搅拌5h后，仍呈现此现象。说明，无毒交联剂EDC/NHS对凝胶的形成，具有重要的作用，能够促进原料间分子间和分子内交联反应，促进凝胶的形成。
对比例6
与实施例2不同之处在于，步骤3）中不添加透明质酸、步骤5）中不添加鼠李糖脂，步骤5）中交联剂EDC/NHS替换为相同量的二乙烯基砜。
对比例6得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率2.52%，药物包裹率15.56%，纳米颗粒包含率为67.32%，凝胶交联度25.74%以上，吸水度33.76g/g，凝胶至少5h后开始形成。可以看出，与实施例2得到的纳米颗粒凝胶载药相比，药物的负载率，包裹率，纳米颗粒的包含率以及凝胶的吸水度和保水率，明显下降，尤其是凝胶形成的时间，至少要5h之后才开始形成，说明本发明透明质酸与交联剂EDC/NHS配合使用，不仅能影响到凝胶的吸水度和保水率，对凝胶的形成时间，有着至关重要的作用；再与规定量的生物活性表面剂鼠李糖脂协同作用，共同决定着凝胶体系的形成时间、纳米颗粒和药物在凝胶体系中的均匀分散及结合效果。
对比例7
与实施例2不同之处在于，步骤4）未经微波加热。
对比例7得到的纳米颗粒凝胶载药系统，加入壳寡糖后，未经微波炉加热，壳寡糖溶解不彻底，在纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中呈现固体颗粒状态，加入鼠李糖脂后，溶液也不能均匀分散，仍有絮状沉淀存在；加入交联剂后，经过很长时间的搅拌，最终未形成稳定额果冻状凝胶，加热的温度，对凝胶的形成，具有重要的作用。
对比例8
与实施例2不同之处在于，步骤4经过100℃水浴加热。
对比例8得到的纳米颗粒凝胶载药系统，加入壳寡糖后，经过100℃水浴加热，加热过程中一直不间断的搅拌，经过1h的水浴加热和搅拌后，壳寡糖充分溶解在纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中，加入交联剂后，经过2h的搅拌，最终形成纳米颗粒凝胶载药系统；对比例8得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率2.78%，药物包裹率15.85%，纳米颗粒包含率为72.56%，凝胶交联度30.72%以上，吸水度35.63g/g。与实施例2相比，较之微波加热10s的时间，其凝胶形成的时间比较久，加热的过程长达1h左右，所以微波加热，明显缩短凝胶形成的时间，明显提高凝胶形成的效率，降低凝胶形成的成本和操作步骤。

Claims (6)

1.一种纳米颗粒凝胶载药系统的快速制备方法，其特征在于，步骤包括：
1）将纳米颗粒加入到灭菌去离子水中，超声20min，混合均匀，配制为0.15mg/mL的纳米颗粒溶液；
2）将聚γ-谷氨酸加入到灭菌去离子水中，搅拌溶解，配制为浓度0.07g/mL的透明聚γ-谷氨酸溶液，然后向其中加入步骤1）制备的纳米颗粒溶液，使溶液中纳米颗粒与聚γ-谷氨酸质量比为0.1:46.7，搅拌均匀，得到纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液；
3）将透明质酸加入到步骤2）制备的纳米颗粒的聚γ-谷氨酸溶液中，透明质酸加入浓度为0.002～0.006 g/mL，搅拌均匀，然后再加入壳寡糖，壳寡糖的加入浓度为0.005g/mL，搅拌均匀，形成均一溶液；
4）将步骤3）制备的均一溶液，微波加热9～15s后，再继续搅拌30～60s，形成澄清透明溶液，冷却至室温后，向其中加入负载药物，加入量为每0.15mg纳米颗粒负载0.003～0.008g药物，搅拌20～30s，形成混合溶液；
5）向步骤4）制备混合溶液中，加入鼠李糖脂粉末，搅拌20～30 s，形成稳定均一的混合溶液，加入交联剂EDC/NHS，搅拌3～20min直至形成凝胶，即纳米颗粒凝胶载药系统；
所述的纳米颗粒为纳米银、纳米铜、纳米金或纳米铂；纳米颗粒为10～100nm；
所述的透明质酸分子量大小为2500～3000KD；
步骤4）中，微波加热，功率为1200W，频率为2450MHz，温度200～300℃；
步骤5）中，鼠李糖脂用量为每mL原料总体积加入鼠李糖脂7～15mg；EDC/NHS交联剂为EDC和NHS溶于去离子水中配制成的0.5M交联剂溶液， EDC与NHS在水中的摩尔比为2:1，EDC/NHS交联剂用量为250μL/0.15mg纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的快速制备方法，其特征在于：步骤3）中，透明质酸加入浓度为0.004g/mL。
3.根据权利要求1所述的快速制备方法，其特征在于：步骤4）中，药物负载量为每0.15mg纳米颗粒负载0.005g药物；所述的负载药物为顺铂或紫杉醇。
4.根据权利要求1～3任一项所述的快速制备方法，其特征在于：制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，药物负载率为5.25～8.75%，药物包裹率为34.67～65.23%，纳米颗粒包含率为97.58～99.69%，凝胶交联度43.78%以上，吸水度为38.7～44.9g/g。
5.根据权利要求1所述的快速制备方法，其特征在于：制备得到的纳米颗粒凝胶载药系统，使用前在恒温培养箱中37℃温育24h。
6.根据权利要求1所述的快速制备方法，其特征在于：制备的纳米颗粒凝胶载药系统用于药物负载，适用于创伤、烧伤伤口中做伤口敷料。
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