CN107219210A - 利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法 - Google Patents

利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括：步骤一、配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液，具体为：将水溶性橙色荧光碳量子点和PBS缓冲溶液混合均匀，置于只能透过橙色光的透明容器中密封，反复冷冻与水浴，并置于0℃的冰水浴中紫外线照射，静置至常温即可，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度的关系，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。本发明具有检测灵敏、抗干扰能力强、检测准确度高的有益效果。

Description

利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法
技术领域
本发明涉及血红蛋白检测领域。更具体地说，本发明涉及一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法。
背景技术
血红蛋白是人体不可缺少的蛋白，多数被储存在红细胞中，它是一种由2条α与2条β多肽链组合成的四聚物蛋白质，其中每条肽链又与一个血红素辅基(亚铁卟啉辅基)结合。研究表明，生物体内诸多和氧、能量以及代谢相关的重要活动都有血红蛋白的参与。而且血红蛋白既是一种氧化还原蛋白，又是一种别构蛋白，血红蛋白的别构效应和氧化还原性受到了广大科学研究者的热情关注。而且血红蛋白在血液中的浓度与诸多与血液、心脏等相关的疾病有紧密的联系，所以人体血液中血红蛋白浓度的测量相当重要。
科技的迅速发展使得纳米材料的应用和研究发展迅猛，其中荧光纳米材料因具有普通纳米材料的通性以及出色的荧光性能而在生物、化学、医学等领域得到广泛的应用。常见的荧光纳米材料有量子点(Quantum dots,QDs)、金属掺杂的荧光纳米材料、金属纳米簇、有机-无机复合材料等。量子点又因其具有窄的发射峰形、宽且连续的吸收光谱、易于控制的发射波长等优点，使其在生物化学、生物学、药物学等领域得到广泛的应用。但由于自身含重金属离子，对环境以及人体都会造成不可忽视的伤害，限制了其在各领域的应用。2004年，一种荧光材料被发现，其后，经过一系列的研究，碳点(Carbon dots)正式成为这种新的荧光纳米材料的名称。相对于其它同类型的材料，碳点以原料廉价易得、低毒性、生物相容性、良好的水溶性、化学性质稳定等优点而在生物化学、生物医药、分析化学等领域得到广泛应用。近期，以碳点荧光的性质为依据的对重金属离子以及生物分子进行测定的研究日益增多。碳点已在离子和分子的检测、细胞成像等方面得到应用，在生物、化学、材料等领域有良好的发展前景和广阔的发展空间。
常规检测血红蛋白的方法多采用比色法，但是比色法检测血红蛋白的浓度时，灵敏度不高，准确性也不够高，抗干扰能力有待加强。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，可以灵敏的检测出血红蛋白，准确可靠的检测出溶液中血红蛋白的浓度，抗干扰能力强。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备水溶性橙色荧光碳量子点，配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；
步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度的关系，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
优选的是，步骤一中建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系具体为：检测每份血红蛋白标准溶液对应的荧光光谱，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算方程；
步骤二具体为：将含有血红蛋白的待测溶液加入到一份水溶性橙色荧光碳量子点溶液中，照射激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
优选的是，激发光的波长为480nm。
优选的是，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液和血红蛋白标准溶液，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液将待测溶液的pH值调节至7.4。
优选的是，水溶性橙色荧光碳量子点标准溶液的浓度为0.5mg/mL。
优选的是，水溶性橙色荧光碳量子点的制备方法具体为：
S1、2.5g葡萄糖、0.8g谷胱甘肽、以及0.5gβ-环糊精溶于20mL的去离子水中，加入1.2g硅胶溶液超声处理，冷却至室温后，加入1.5g水滑石粉在反应釜中于165℃下反应5h，冷却至室温，取上清液，于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，干燥得粉末；
S2、取0.2g步骤S1中的粉末、5mL乙醇、5mL乙二醇胺、0.1g氧化锌超声处理40min，在200r/min搅拌和通入氮气的条件下加入1.5mL磷酸溶液，持续1h后即得混合物；
S3、将步骤S2中的混合物在真空条件下加热到650℃，真空煅烧4.5h，冷却至室温，再置于质量分数为40％的盐酸溶液中，在氮气保护下搅拌4.5h，离心得上清液，干燥即得水溶性橙色荧光碳量子点。
优选的是，配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液具体为：将水溶性橙色荧光碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为0.5mg:1mL混合均匀，置于只能透过橙色光的透明容器中密封，冷冻30min，置于90℃条件下水浴15min，然后冷冻25min，再置于60℃条件下水浴25min，然后冷冻15min，并置于0℃的冰水浴中紫外线照射1min，静置直至恢复常温即可。
优选的是，血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃；
含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃即配制好待测溶液。
优选的是，步骤一中的多份不同浓度的血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-8mol/L、3×10-8mol/L、6×10-8mol/L、1×10-7mol/L、3×10-7mol/L、5×10-7mol/L、7×10- 7mol/L、1.2×10-6mol/L、2×10-6mol/L、3×10-6mol/L、4×10-6mol/L、6×10-6mol/L、7×10- 6mol/L、8×10-6mol/L、以及1×10-5mol/L。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明的检测方法可以灵敏的检测出血红蛋白，准确可靠的检测出溶液中血红蛋白的浓度，抗干扰能力强；
第二、从荧光光谱图中可得知，血红蛋白浓度为0对应的560nm的荧光强度与其它浓度的溶液中对应的560nm的荧光强度随血红蛋白的浓度的增加而增大，且荧光强度比值与血红蛋白的浓度有良好的线性关系；
第三、葡萄糖、谷胱甘肽、β-环糊精以及去离子水混合，加入硅胶溶液超声处理，使葡萄糖碳源融合在β-环糊精和硅胶溶液胶态溶液中，加入水滑石粉在反应釜中于165℃下反应5h，促使葡萄糖结构变化，即碳原子之间的距离发生变化，激活碳原子的光学特性，冷却至室温，取上清液，过滤，取滤液，干燥得到可溶性粉末，再与乙醇、乙二醇胺、氧化锌超声处理，使激活的碳原子结构在氧化锌表面轻微摩擦，通入氮气的条件下加入磷酸溶液，与氧化锌中和，释放出激活碳原子结构，真空煅烧，将有机物去除，置于盐酸溶液中，在氮气保护下搅拌，离心得上清液，提取出激活的碳原子结构，此时激活的碳原子之间形成了特异的凹形结构，可以更好的吸收光能并转化光能发射荧光；
第四、将水溶性橙色荧光碳量子点和PBS缓冲溶液混合均匀，置于只能透过橙色光的透明容器中密封，冷冻与高温水浴反复多次，在反复多次急变中，筛选出稳定，结构恢复快的水溶性橙色荧光碳量子点，并破坏掉能吸收光能及转化光能发射荧光的不稳定的碳原子结构，再置于0℃的冰水浴中紫外线照射1min，静置直至恢复常温，使不稳定的碳原子结构彻底不能发射荧光，只保留结构恢复快且稳定的水溶性橙色荧光碳量子点；
第五、将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射，同时进行超声处理，使血红蛋白形成类球形结构，无论是哪一面与水溶性橙色荧光碳量子点接触，都易挤入其凹形结构内，阻挡凹形结构变形，影响荧光发射。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的血红蛋白标准溶液的荧光光谱图；
图2为本发明的荧光强度比值与血红蛋白浓度的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，包括以下步骤：
步骤一、采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制浓度为0.5mg/mL水溶性橙色荧光碳量子点溶液，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液多份不同浓度的血红蛋白标准溶液，血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-8mol/L、3×10-8mol/L、6×10-8mol/L、1×10-7mol/L、3×10-7mol/L、5×10-7mol/L、7×10-7mol/L、1.2×10-6mol/L、2×10-6mol/L、3×10-6mol/L、4×10-6mol/L、6×10-6mol/L、7×10-6mol/L、8×10-6mol/L、以及1×10-5mol/L，分别量取16份体积为3ml的水溶性橙色荧光碳量子点溶液，一份水溶性橙色荧光碳量子点溶液中分别添加一份血红蛋白标准溶液，照射波长为480nm的激发光，得到如图1示出的发射光的荧光光谱图，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的560nm的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的560nm的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的560nm的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，如图2示出的，绘制标准曲线并计算方程；
步骤二、采用pH为7.4的PBS缓冲溶液将含有血红蛋白的待测溶液的pH值调节到7.4，将待测溶液加入到一份体积为3ml的水溶性橙色荧光碳量子点溶液中，照射波长为480nm的激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的560nm的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
<实施例2>
测定步骤同实施例1，其中，不同的是步骤一中水溶性橙色荧光碳量子点的制备方法、水溶性橙色荧光碳量子点溶液的配制方法、血红蛋白标准溶液的配制方法、以及含有血红蛋白的待测溶液的预处理不同，具体如下所述：
水溶性橙色荧光碳量子点的制备方法具体为：
S1、2.5g葡萄糖、0.8g谷胱甘肽、以及0.5gβ-环糊精溶于20mL的去离子水中，加入1.2g硅胶溶液超声处理，冷却至室温后，加入1.5g水滑石粉在反应釜中于165℃下反应5h，冷却至室温，取上清液，于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，干燥得粉末；
S2、取0.2g步骤S1中的粉末、5mL乙醇、5mL乙二醇胺、0.1g氧化锌超声处理40min，在200r/min搅拌和通入氮气的条件下加入1.5mL磷酸溶液，持续1h后即得混合物；
S3、将步骤S2中的混合物在真空条件下加热到650℃，真空煅烧4.5h，冷却至室温，再置于质量分数为40％的盐酸溶液中，在氮气保护下搅拌4.5h，离心得上清液，干燥即得水溶性橙色荧光碳量子点。
配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液具体为：将水溶性橙色荧光碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为0.5mg:1mL混合均匀，置于只能透过橙色光的透明容器中密封，冷冻30min，置于90℃条件下水浴15min，然后冷冻25min，再置于60℃条件下水浴25min，然后冷冻15min，并置于0℃的冰水浴中紫外线照射1min，静置直至恢复常温即可。
血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃；
含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃即配制好待测溶液。
<对比例1>
采用比色法检测待测溶液中血红蛋白的浓度，其中，配制16份含有血红蛋白的待测溶液，含有血红蛋白的待测溶液中血红蛋白的浓度分别为2×10-8mol/L、4×10-7mol/L、8×10-7mol/L以及9×10-6mol/L，分成A、B、C、以及D共4组，每组4份，向B组待测溶液中加入芳基钌，使待测溶液中芳基钌的浓度最终为2×10-7mol/L，得到4份含有血红蛋白和芳基钌的待测溶液，向C组待测溶液中加入六价铬，使待测溶液中浓度六价铬的浓度最终为1.5×10- 5mol/L，得到4份含有血红蛋白和六价铬的待测溶液，向D组待测溶液中加入芳基钌和六价铬，使待测溶液中芳基钌和六价铬的浓度分别为2×10-7mol/L和1.5×10-5mol/L，得到含有血红蛋白、芳基钌和六价铬的待测溶液。
<对比例2>
测定步骤同实施例1，其中，含有血红蛋白的待测溶液不同，待测溶液的配制方法同对比例1。
<对比例3>
测定步骤同实施例2，其中，含有血红蛋白的待测溶液不同，待测溶液的配制方法同对比例1。
<检测结果>
如表1所示为血红蛋白检测结果：
从表1中可以看出实施例1和实施例2的血红蛋白检出限明显低于对比例1，说明采用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法比常规比色法的检出限低，检测更灵敏，实施例1和实施例2的A组血红蛋白的检测准确率明显高于对比例1，说明采用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法的准确度高于常规比色法；
对比例3的B组、C组、以及D组的血红蛋白检测准确率均显著高于对比例1和对比例2的，说明对比例3的方法可以避免芳基钌和六价铬对血红蛋白的检测的干扰，提高准确率；
对比例2的B组、C组、以及D组的血红蛋白检测准确率均低于对比例1的方法，说明当有待测溶液中含有芳基钌或六价铬时，会降低对比例2的方法的准确度，反而没有常规方法准确。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备水溶性橙色荧光碳量子点，配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液，向其中添加不同浓度的血红蛋白标准溶液，照射激发光，建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系；
步骤二、照射激发光，检测含有血红蛋白的待测溶液对应的荧光强度，根据步骤一中检测的血红蛋白浓度与荧光强度的关系，读取待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
2.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，步骤一中建立血红蛋白浓度与荧光强度的关系具体为：检测每份血红蛋白标准溶液对应的荧光光谱，并记录每份血红蛋白标准溶液对应的荧光强度，以浓度为0的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度与任一份其它浓度的血红蛋白标准溶液对应的荧光强度的比值为纵坐标，每份血红蛋白标准溶液的浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算方程；
步骤二具体为：将含有血红蛋白的待测溶液加入到一份水溶性橙色荧光碳量子点溶液中，照射激发光，检测待测溶液对应的荧光光谱，并记录待测溶液对应的荧光强度，代入所述方程得到待测溶液中对应的血红蛋白的浓度。
3.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，激发光的波长为480nm。
4.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液和血红蛋白标准溶液，采用pH为7.4的PBS缓冲溶液将待测溶液的pH值调节至7.4。
5.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，水溶性橙色荧光碳量子点标准溶液的浓度为0.5mg/mL。
6.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，水溶性橙色荧光碳量子点的制备方法具体为：
S1、2.5g葡萄糖、0.8g谷胱甘肽、以及0.5gβ-环糊精溶于20mL的去离子水中，加入1.2g硅胶溶液超声处理，冷却至室温后，加入1.5g水滑石粉在反应釜中于165℃下反应5h，冷却至室温，取上清液，于0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液，干燥得粉末；
S2、取0.2g步骤S1中的粉末、5mL乙醇、5mL乙二醇胺、0.1g氧化锌超声处理40min，在200r/min搅拌和通入氮气的条件下加入1.5mL磷酸溶液，持续1h后即得混合物；
S3、将步骤S2中的混合物在真空条件下加热到650℃，真空煅烧4.5h，冷却至室温，再置于质量分数为40％的盐酸溶液中，在氮气保护下搅拌4.5h，离心得上清液，干燥即得水溶性橙色荧光碳量子点。
7.如权利要求4所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，配制水溶性橙色荧光碳量子点溶液具体为：将水溶性橙色荧光碳量子点和PBS缓冲溶液按质量体积比为0.5mg:1mL混合均匀，置于只能透过橙色光的透明容器中密封，冷冻30min，置于90℃条件下水浴15min，然后冷冻25min，再置于60℃条件下水浴25min，然后冷冻15min，并置于0℃的冰水浴中紫外线照射1min，静置直至恢复常温即可。
8.如权利要求4所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，血红蛋白标准溶液的配制方法具体为：将血红蛋白与PBS缓冲溶液混合，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃；
含有血红蛋白的待测溶液还进行了预处理，具体为：将待测溶液用PBS缓冲溶液调节pH值为7.4，依次置于只能透过红色光、黄色光、以及蓝色光的透明容器中，并分别置于日光灯下照射1h，同时进行超声处理，超声频率为20kHz，超声温度为35℃即配制好待测溶液。
9.如权利要求1所述的利用水溶性橙色荧光碳量子点探针检测血红蛋白的方法，其特征在于，步骤一中的多份不同浓度的血红蛋白标准溶液的浓度依次为：0、1×10-8mol/L、3×10-8mol/L、6×10-8mol/L、1×10-7mol/L、3×10-7mol/L、5×10-7mol/L、7×10-7mol/L、1.2×10-6mol/L、2×10-6mol/L、3×10-6mol/L、4×10-6mol/L、6×10-6mol/L、7×10-6mol/L、8×10- 6mol/L、以及1×10-5mol/L。
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