CN112525963A - 一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器及其进行葡萄糖浓度检测的方法 - Google Patents

一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器及其进行葡萄糖浓度检测的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于ZnO纳米材料的葡萄糖电化学生物传感器及其进行葡萄糖检测的方法，首先将ZnO纳米材料与葡萄糖氧化酶共同修饰到玻碳电极表面得到葡萄糖电化学生物传感器；采用该葡萄糖电化学生物传感器进行葡萄糖浓度的电化学检测，方法为：在检测池中以PBS缓冲溶液为基液，以上述葡萄糖电化学生物传感器为工作电极，连续滴加不同浓度的葡萄糖溶液得到电流–时间曲线；再拟合上述检测条件下葡萄糖浓度与电流的标准曲线；再按上述电流–时间曲线法，在检测池，同样的检测池中加入一定体积的葡萄糖待检测溶液，读取工作电极的响应电流A值；最后根据上述标准曲线上描点确定检测池中葡萄糖的浓度，再换算得到第三步中葡萄糖待检测溶液的浓度。

Description

一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器及其进行葡萄糖 浓度检测的方法
技术领域
本发明涉及电化学分析检测技术领域，特别涉及一种基于ZnO纳米材料的葡萄糖电化学生物传感器及其进行葡萄糖检测的方法。
背景技术
糖尿病可引起身体多种并发症产生，对身体危害很大，目前没有针对糖尿病彻底治愈的方法或者药物，所以糖尿病的早期诊断和人体血糖日常监测尤为重要。通过检测人体血液中葡萄糖的浓度可以间接得知人们的身体健康状况，为糖尿病的诊断提供一种手段。
目前，检测葡萄糖浓度的方法有电化学传感器法、光化学法（即生化分析仪）、光声谱检测法、拉曼光谱检测法等。光化学法测量条件苛刻、耗时、所需血液量多；光声谱检测法灵敏度高但是对环境条件要求高从而影响测定结果；拉曼光谱检测法测量缺点：因检测部位为眼前房，无法增大光强、检测信号弱、信号处理难；而使用电化学生物传感器法具有检测准确度高，操作简单，分析速度快，体积小便于携带以及仪价格低廉等优点。
目前，采用电化学分析技术进行葡萄糖浓度时，研究者不断的向检测的高灵敏度，高精度方向努力。
发明内容
本发明针对现有技术中葡萄糖浓度检测技术中存生的问题，提供一种检测基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，实现葡萄糖浓度的高灵敏度检测。
本发明的目的是这样实现的，一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，将ZnO纳米材料与葡萄糖氧化酶共同修饰到玻碳电极表面得到葡萄糖电化学生物传感器。
本发明的葡萄糖电化学生物传感器的纳米ZnO微粒，因纳米ZnO微粒具有层叠包裹的花朵结构，可以为葡萄糖氧化酶提供一个较好的生物相容性微环境，利用其固定葡萄糖氧化酶，有利于保持酶的生物活性，拓宽检测的线性范围，提高检测时的电子传递速率，从而提高检测灵敏度；并利用ZnO微粒表面修饰的葡萄糖氧化酶，实现对葡萄糖的定量检测，具有良好的光化学稳定性、电子通信性能、吸附能力强、表面活性好、催化效率高的特点。
进一步的，本发明的电化学生物传感器通过如下方法制备：
第1步，将ZnO纳米材料分散于去离子水中，超声震荡混合均匀制成分散浓度为1 -2mg/mL的分散液，再加入葡萄糖氧化酶使溶液中葡萄糖氧化酶的质量是ZnO质量的5倍；超声震荡至完全溶解混合均匀，使葡萄糖氧化酶均匀负载于ZnO纳米材料的表面；
第2步，取玻碳电极依次用0.3µm和0.5 µm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极后，对玻碳电极进行低温干燥或氮气吹干；
第3步，将第1步所得的混合溶液滴涂于第2步处理后干燥的玻碳电极表面，然后，将玻碳电极进行低温干燥；
第4步，将第3步干燥后的玻碳电极表面修饰一层萘酚膜后，得到基于ZnO纳米材料的葡萄糖电化学生物传感器，于4℃的恒温条件下存放。
进一步地，第4步中，玻碳电极表面修饰一层萘酚膜的方法为：将玻碳电极表面滴涂质量浓度为0.5% 的萘酚水溶液，再将玻碳电极进行低温干燥。
进一步地，玻碳电极进行低温干燥的方法为在4℃的恒温条件下干燥10-16小时。
进一步地，所述ZnO纳米材料的制备方法为：将摩尔比为0.02～0.06：2的二氯化锌和尿素与去离子水混合于聚四氟乙烯内衬的容器中，使混合液中二氯化锌的混合浓度为0.02～0.06 mol L−1，尿素的混合浓度为2 mol L−1，将混合液搅拌均匀后用稀盐酸调节pH为3.5～4.5，然后将混合液连同容器转入高压反应釜中，于80～90℃下加热10～12 h，待反应体系于反应釜内自然冷却至室温，将反应体系过滤得到的白色沉淀物分别用无水乙醇和水各洗涤5次，在真空干燥箱中60℃下干燥10～12 h，研磨至粒径10～20nm以下，再将研磨后的粉料在300～350℃煅烧30 ～40min得到ZnO纳米材料。
本发明还提供一种采用上述基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器进行葡萄糖浓度检测的方法：
第一步，制作葡萄糖溶液的电流–时间曲线：在检测池中，以连续搅拌、空气饱和、0.1 M pH 7.0的PBS溶液为测试基液，电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测池中依次定体积量加入已知浓度的葡萄糖测试液，检测工作电极的电化学信号，同时输出每次定量加入已知浓度的葡萄糖测试液的电流响应值及整体的电流响应曲线；
第二步，以第一步中每次定体积量添加葡萄糖后检测池中葡萄糖的浓度值为横坐标，以对应的电流响应值为纵坐标，描点拟合葡萄糖浓度与响应电流的标准曲线；
第三步，按第一步的制作电流–时间曲线法，在检测池，以连续搅拌、空气饱和pH值为7.0的PBS溶液为测试基液，电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测池中加入一定体积的葡萄糖待检测溶液，读取工作电极的响应电流A值；
第四步，将第三步读取的响应电流A值，在第二步的标准曲线上描点确定检测池中葡萄糖的浓度，再换算得到第三步中葡萄糖待检测溶液的浓度。
通过本发明的上述方法，可以进行葡萄糖浓度的检测，为人体血糖的检测和糖尿病的早期诊断提供了一种新的电化学检测方法，并且基于本发明的电化学生物传感器的优良特性，上述检测方法具有操作简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好。
第一步中，PBS溶液的浓度为0.1mol/L。
附图说明
图1a和1b分别实施例1中制备的ZnO纳米材料和负载葡萄糖氧化酶的ZnO的扫描电镜图。
图2为氧化锌的XRD图。
图3为实施例2中的GOx/ZnO/Nafion/GCE电化学生物传感器进行葡萄糖浓度的检测方法的电流响应曲线a和GOx/Nafion/GCE单纯采用葡萄糖氧化酶修饰的电化学生物传感器进行葡萄糖浓度的检测方法的电流响应曲线b的对比图。
图4为本发明的葡萄糖浓度检测的方法中描点拟合得到的葡萄糖浓度与平稳响应电流的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
（1）首先制备花状ZnO纳米材料：
取0.2726 g（0.05 mol L−1）二氯化锌(ZnCl2，AR)、4.8048 g（2 mol L−1）尿素(CON2H4，AR)和35 ml去离子水于聚四氟乙烯内杯中，搅拌5 min后用稀盐酸调节pH为4，再搅拌10 min，将聚四氟乙烯内杯转入不锈钢高压反应釜中并密封，置于烘箱中在90 °C下加热12 h，待体系自然冷却至室温，分离获得反应体系中的白色沉淀离心，分别用无水乙醇和水各洗涤5次，在真空干燥箱中60 °C下干燥12 h，将物料取出研磨成粒度小于10～20nm的粒料，再将研磨后的粒料在300 °C条件煅烧30 min得到ZnO纳米材料；该ZnO纳米材料的扫描电镜图如图1a所示，其形貌如层层包裹的花朵状结构，粒径约为12微米左右,也就是由纳米级的片状氧化锌组成,其厚度约为20纳米，其层层包裹的花朵结构具有较大的比表面积，为后序葡萄糖氧化酶的大量负载提供了可靠的表面积；
（2）在超声下，将上步中制得的花状ZnO纳米材料均匀分散于去离子水中，形成ZnO含量为2 mg/mL的水溶液；
（3）将玻碳电极GCE依次用0.3和0.5 µm的Al2O3打磨处理，再用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水反复清洗玻碳电极表面2次，完成玻碳电极的清洁预处理；
（4）向第(2)步的水溶液中按10mg/mL质量体积比例加入葡萄糖氧化酶（Gox），使其混合均匀后，将混合溶液滴涂于第（3）清洁预处理后玻碳电极表面，再将电极放置在4 ℃恒温冰箱干燥16小时，之后在电极表面再滴涂质量浓度为0.5% 的萘酚，制得葡萄糖氧化酶电化学生物传感器（GOx/ZnO/Nafion/GCE），将其置于4 ℃冰箱中储存待用。
同时按上述的步骤（3）和（4）制备不含ZnO纳米材料的电化学生物传感器（GOx/Nafion/GCE）作为后续对比实验的传感器。
如图1b所示为ZnO表面修饰葡萄糖氧化酶后的扫描电镜图，可以看到葡萄糖氧化酶成功的负载到了花状氧化锌表面，与图1a对比，呈现出明显不同的结构形貌，ZnO的花瓣表面均匀负载了大量的葡萄糖氧化酶。
如图2所示为氧化锌的XRD图，图中纯氧化锌的X射线衍射峰和标准的六方纤锌矿ZnO结构的衍射峰是一致的。图中所合成产物的衍射峰对应于六方纤锌矿ZnO结构的衍射峰,无其它杂质峰出现，根据XRD图可知产物为纯的氧化锌。
实施例2
本实施例中采用上述实施例1制备的GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器和GOx/Nafion/GCE传感器进行葡萄糖浓度的检测。具体的检测方法为：
首先，采用GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器进行葡萄糖浓度检测的方法，
第一步，在电化学工作站通过循环伏安法，在检测池中加入10ml连续搅拌、空气饱和、浓度为0.1 M， pH 为7.0的PBS溶液为测试基液，GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测池中按表1的体积依次加入摩尔体积浓度为0.1mol/L的葡萄糖溶液，检测工作电极的电流响应值，并输出每次定量加入已知浓度的葡萄糖测试液的电流响时间曲线如图3的曲线a；
表1
Figure 906689DEST_PATH_IMAGE001
；
第二步，以第一步中每次定体积量添加葡萄糖后检测池中葡萄糖的浓度值为横坐标，以对应的电流响应值为纵坐标，描点拟合葡萄糖浓度与响应电流的标准曲线如图4的曲线a’；
第三步，进行未知浓度的葡萄糖溶液的浓度检测时，按第一步的循环伏安法，在检测池，加入10ml连续搅拌、空气饱和、浓度为0.1 M， pH 为7.0的PBS溶液为测试基液，以GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测中加入一定体积的葡萄糖待检测溶液，读取工作电极的响应电流A值；
第四步，将第三步读取的响应电流A值，在第二步的标准曲线a上描点确定检测池中葡萄糖的浓度，再根据第三步中加入的葡萄糖溶液的体积及PBS溶液的体积，换算得到第三步中葡萄糖待检测溶液的浓度。
同时进行一比较例检测：以不含ZnO 的上述GOx/Nafion/GCE传感器为工作电极，按上述第一步和第二步的方法，同样按表1中体积量依次添加同样浓度的葡萄糖溶液，依次检测工作电极的电流响应，并最终输出如图3的响应曲线b；再进一步描点拟合如图4所示的曲线b’标准曲线。
从图4中的标准曲线可以看出，其工作电极的电流响应随着葡萄糖浓度成线性增加，GOx/ZnO/Nafion/GCE的线性响应范围比GOx/Nafion/GCE的线性响应范围宽。这些结果表明，ZnO固定的葡萄糖氧化酶GOx对葡萄糖有很高的亲和力，并且GOx/ZnO/Nafion/GCE固定的GOx仍有较高的活性且对葡萄糖有较好的线性响应范围。
也就是通过本实施例中采用GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器为工作电极的葡萄糖电化学检测方法，为临床上人体血糖的检测和糖尿病的早期诊断提供了一种检测范围更广，精度和灵敏度更高的电化学检测方法，并且操作简单、快速、成本低。重现性和稳定性好。
实施例3
本实施例中，按实施例2第一步的电化学检测方法，以GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器为工作电极，以检测池内连续平行加入10微升浓度为0.1mol/L葡萄糖溶液进行平6次行检测，得出工作电极的电流响应值相对标准偏差为3.5%，表明该传感器测定的精密度高。
同时再另取3个GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器，3个相同条件的检测池，分别按实施例2第步1步的电化学检测方法，分别加入加10微升浓度为0.1mol/L葡萄糖溶液进行6次重复测定，得出电流相对标准偏差为6.5%，表明该传感器检测结果有较好的重现性。3个传感器通过6次连续测定后，电流响应信号均能达到原始响应值的93%以，说明Nafion/GOx/ZnO/GCE能够有效地保持葡萄糖氧化酶的活性，并能防止酶脱落。
另外，检测结束后，将 Nafion/GOx/ZnO/GCE传感器用去离子水清洗后自然干燥，存放于4 oC的冰箱中保存，两个星期后重复检测没有观察到酶电极对葡萄糖的电流响应降低。
可见，本发明采用上述GOx/ZnO/Nafion/GCE传感器的进行葡萄糖浓度的电化学分析法简单、快速、成本低、灵敏度高、重现性和稳定性好。

Claims (7)

1.一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，将ZnO纳米材料与葡萄糖氧化酶共同修饰到玻碳电极表面得到葡萄糖电化学生物传感器。
2.根据权利要求1所述的基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，通过如下方法制备：
第1步，将ZnO纳米材料分散于去离子水中，超声震荡混合均匀制成分散浓度为1 -2mg/mL的分散液，再加入葡萄糖氧化酶使溶液中葡萄糖氧化酶的质量是ZnO质量的5倍；超声震荡至完全溶解混合均匀，使葡萄糖氧化酶均匀负载于ZnO纳米材料的表面；
第2步，取玻碳电极依次用0.3µm和0.5 µm的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗玻碳电极后，对玻碳电极进行低温干燥或氮气吹干；
第3步，将第1步所得的混合溶液滴涂于第2步处理后干燥的玻碳电极表面，然后，将玻碳电极进行低温干燥；
第4步，将第3步干燥后的玻碳电极表面修饰一层萘酚膜后，得到基于ZnO纳米材料的葡萄糖电化学生物传感器，于4℃的恒温条件下存放。
3.根据权利要求1所述的基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，第4步中，玻碳电极表面修饰一层萘酚膜的方法为：将玻碳电极表面滴涂质量浓度为0.5% 的萘酚水溶液，再将玻碳电极进行低温干燥。
4.根据权利要求2或3所述的基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，玻碳电极进行低温干燥的方法为在4℃的恒温条件下干燥10-16小时。
5.根据权利要求1所述的基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器，其特征在于，所述ZnO纳米材料的制备方法为：将摩尔比为0.02～0.06：2的二氯化锌和尿素与去离子水混合于聚四氟乙烯内衬的容器中，使混合液中二氯化锌的混合浓度为0.02～0.06 mol L−1，尿素的混合浓度为2 mol L−1，将混合液搅拌均匀后用稀盐酸调节pH为3.5～4.5，然后将混合液连同容器转入高压反应釜中，于80～90℃下加热10～12 h，待反应体系于反应釜内自然冷却至室温，将反应体系过滤得到的白色沉淀物分别用无水乙醇和水各洗涤5次，在真空干燥箱中60℃下干燥10～12 h，研磨至粒径10～20nm以下，再将研磨后的粉料在300～350℃煅烧30～40min得到ZnO纳米材料。
6.一种采用权利要求1～4任一项所述的电化学生物传感器进行葡萄糖浓度检测的方法，其特征在于，
第一步，制作葡萄糖溶液的电流–时间曲线：在检测池中，以连续搅拌、空气饱和、0.1 MpH 7.0的PBS溶液为测试基液，电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测池中依次定体积量加入已知浓度的葡萄糖测试液，检测工作电极的电化学信号，同时输出每次定量加入已知浓度的葡萄糖测试液的电流响应值及整体的电流响应曲线；
第二步，以第一步中每次定体积量添加葡萄糖后检测池中葡萄糖的浓度值为横坐标，以对应的电流响应值为纵坐标，描点拟合葡萄糖浓度与响应电流的标准曲线；
第三步，按第一步的制作电流–时间曲线法，在检测池，以连续搅拌、空气饱和pH值为7.0的PBS溶液为测试基液，电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，向检测池中加入一定体积的葡萄糖待检测溶液，读取工作电极的响应电流A值；
第四步，将第三步读取的响应电流A值，在第二步的标准曲线上描点确定检测池中葡萄糖的浓度，再换算得到第三步中葡萄糖待检测溶液的浓度。
7.根据权利要求5所述的葡萄糖浓度检测的方法，其特征在于，第一步中，PBS溶液的浓度为0.1mol/L。
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