CN107206003B - 用于眼的交联治疗的系统、方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

系统、方法和组合物产生用于治疗眼病症的交联活性。多种药剂、添加剂、缓冲剂等可以用于具有交联剂的制剂以增强治疗。例如，用于向眼的角膜施加治疗的组合物包含交联剂，其响应于对光活化光的暴露而在所述角膜中产生交联活性。所述组合物还包含铁添加剂和柠檬酸盐缓冲液。在一些情况下，所述交联剂可以包括核黄素。在其他情况下，所述铁添加剂可以包括FeSO4。在进一步的情况下，所述铁添加剂可以溶于所述柠檬盐缓冲液。

Description

用于眼的交联治疗的系统、方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年12月2日提交的美国临时专利申请第62/086,572号的优先权，其内容整体援引加入本文。
发明背景
发明领域
本公开涉及用于治疗眼病症(disorder)的系统和方法，并且更特别地，涉及用于眼的交联治疗的系统和方法。
相关技术的描述
交联治疗可以用来治疗患有病症如圆锥角膜的眼。特别地，圆锥角膜是眼的退行性病症，其中角膜内的结构变化使其减弱并变为异常的圆锥形。交联治疗可以增强和稳定圆锥角膜减弱的区域并防止不期望的形状改变。
还可以在外科手术(如激光辅助的原位角膜磨镶术(LASIK)手术)之后采用交联治疗。例如，称作LASIK后扩张的并发症可能由于LASIK手术引起的角膜变薄和减弱而发生。在LASIK后扩张中，角膜经历逐渐变陡(凸出)。因此，交联治疗可以在LASIK手术之后增强和稳定角膜结构并防止LASIK后扩张。
附图简要说明
图1显示根据本公开的方面，将交联剂和光活化光递送至眼的角膜以产生角膜胶原交联的示例性系统。
图2A-B显示根据本公开的方面，涉及角膜交联治疗期间施用的核黄素和光活化光(例如，紫外线A(UVA)光)的光化学动力学反应的图。
图3显示采用根据本公开的方面的光化学动力学反应模型的示例性系统。
图4显示涉及通过电子转移反应形成氧化剂以及通过夺氢可能引发聚合的图。
图5显示与未经交联的对照相比(F/Fo)，具有在交联过程中施用的不同浓度的铁(II)溶液的角膜消化物在450nm下的荧光。
图6显示用(1)dH2O、(2)H2O2以及(3)H2O2和0.1％铁(II)处理的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣的荧光计数。
图7显示在450nm记录的(1)0.1％核黄素(连续波(CW))、(2)0.1％核黄素+0.5mMFeSO4(CW)、(3)0.1％核黄素(脉冲波(PW)+O2)以及(4)0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(PW+O2)的荧光(与未处理的对照相比)。
图8显示与对照(1)相比，对于0.1％核黄素(CW)(2)和0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(CW)(3)，通过张力测量法测得的各角膜瓣的平均力vs.移位(displacement)。
图9-10显示对于重复实验，与对照(1)相比，对于0.1％核黄素(PW+O2)(2)和0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(PW+O2)(3)，通过张力测量法测得的各角膜瓣的平均力vs.移位。
图11显示由核黄素和单线态氧形成2,3-丁二酮的机制。
图12显示在没有紫外(UV)光(左侧图)和有UV光(右侧图)(365nm,30mW持续4min)的情况下，用2,3-丁二酮(BD)在dH2O中的1％溶液处理的角膜瓣的移位-力图。
图13显示在450nm记录的，来自在有和没有UV光的情况下用1％的BD溶液处理的经木瓜蛋白酶消化的200μm厚的角膜瓣的荧光(与未处理的对照Fo相比)。
图14显示与对照(1)相比，用UV光(365nm,30mW持续4min)和在dH2O中的0.1％核黄素溶液(1)、在dH2O中的0.1％BD(4)、以及在dH2O中的0.1％核黄素和0.1％BD的混合物(3)处理的角膜瓣的移位-力图。
图15显示在450nm记录的，来自用持续4min的30mW UVA和在dH2O中的0.1％核黄素溶液、在dH2O中的0.1％BD、以及在dH2O中的0.1％核黄素以及0.1％BD的混合物处理的经木瓜蛋白酶消化的200μm厚的角膜瓣的荧光(与未处理的对照Fo相比)。
图16显示叶酸(FA)。
图17显示FA的光化产物蝶呤(pterine)-6-羧酸(PCA)。
图18显示在PBS中的0.001％FA的吸收光谱。
图19显示在PBS中的0.001％FA的荧光光谱(360nm激发)。
图20显示磷酸盐缓冲液中的FA在360nm的吸收。
图21显示以下角膜样品的移位vs.力曲线：(1)未暴露于UV光；(2)0.1％核黄素，暴露于UV光；(3)0.1％FA，暴露于UV光；以及(4)0.1％核黄素和0.1％FA的混合物，暴露于UV光；其中UV暴露为365nm,30mW/cm2,1秒开:1秒关脉冲，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
图22显示用木瓜蛋白酶消化后，以下角膜样品的荧光(360nm激发)：(1)未暴露于UV光；(2)0.1％核黄素，暴露于UV光；(3)0.1％FA，暴露于UV光；以及(4)0.1％核黄素和0.1％FA的混合物，暴露于UV光；其中UV暴露为365nm,30mW/cm2，脉冲1秒开:1秒关，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
图23显示以下角膜样品(厚度300um，每组3个样品)的移位vs.力曲线：(1)未暴露于UV光的对照；(2)在缓冲液中的0.1％FA，暴露于UV光；(3)在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素，暴露于UV光；以及(4)在缓冲盐水溶液中的0.1％FA和0.1％核黄素的混合物，暴露于UV光；其中UV暴露为365nm,30mW/cm2,脉冲1秒开:1秒关，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
图24显示与对照(1)相比，在以30mW/cm2辐射4min(CW)(2)下以及在以30mW/cm2的脉冲UVA光辐射8分钟和O2(3)的情况下，用在PBS中的0.4％奥喹多司浸泡的200um厚的角膜瓣的双向拉伸测量。
图25显示在450nm记录的用在PBS中的0.4％奥喹多司处理的交联瓣相对荧光：(1)未辐射的对照；(2)以30mW/cm2连续辐射4min(CW)；和(3)以30mW/cm2的脉冲UVA光辐射8分钟(1秒开:1秒关)和O2。
图26显示核黄素(A)碱性降解为1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸(B)。
图27显示保持在120℃的在BBBS中的0.1％核黄素-5-磷酸酯在不同时间量的UV/Vis光谱。
图28显示核黄素在120℃于BBBS中的水解速率，通过在450nm的吸光度来测量(0.1％溶液和0.5％溶液，A0是加热前的吸光度)。
图29显示通过减去剩余核黄素的吸光度而由图27得到的UV/Vis光谱。
图30显示在120℃于90min后水解溶液的光谱分析(从分析的光谱减去剩余核黄素的吸光度)。
图31显示在水解时间过程中不同峰的吸光度的改变。
图32显示核黄素的早期碱性降解产物1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐2的合成。
图33显示所合成的核黄素降解产物2的NMR谱。
图34显示在不进行热处理的情况下，在缓冲血库盐水中的单磷酸化核黄素(5-FMN)。
图35显示1小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。
图36显示2小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。
图37显示3小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。
图38显示4小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。
图39显示所合成的核黄素降解产物2的HPLC微量(HPLC trace)。
图40显示加热的(红线)和未加热的(蓝线)核黄素溶液的吸收光谱(以200μm光程在石英比色皿中记录)。
图41显示图34中的两个光谱的区别。
图42显示经消化的角膜的荧光：未经交联的对照(黑线)，用未加热的0.1％核黄素交联(蓝线)，用热处理的核黄素溶液交联(红线)。
图43显示交联的角膜样品的相对荧光：红色-使用经热处理的核黄素溶液，蓝色-使用未加热的0.1％核黄素溶液。
图44显示1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐。
图45显示1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐在BBBS中的0.001％溶液的吸收光谱(石英，1cm光程)。
图46显示1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐在360nm的UV吸光度(在BBBS中的溶液，石英比色皿，1cm光程)。
图47显示在BBBS溶液中的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐的荧光(360nm激发)。
图48显示经消化的角膜的荧光：未经交联的对照(黑色)，用在BBBS中的0.1％核黄素交联(红线)，用0.1％的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联(蓝线)。
图49显示经消化的角膜瓣的荧光：未经交联的对照(黑色)，用在BBBS中的0.1％核黄素交联(红线)，用0.1％的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联(蓝线)。
图50显示3-羟基-2-喹喔啉羧酸。
图51显示3-羟基-2-喹喔啉羧酸的吸收光谱。
图52显示在BBBS中不同浓度的3-羟基-2-喹喔啉羧酸溶液的荧光，在360nm激发下记录。
图53显示与未经交联的对照(黑线)相比，用3-羟基-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.17％溶液(红线)和0.017％溶液(蓝线)溶液交联的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣(200μm厚)(无上皮，20min的浸泡时间，30mW/cm2持续4min)的荧光。
图54显示与未经交联的对照(黑线)相比，用0.17％的核黄素(红线)和0.17％的3-羟基-2-喹喔啉羧酸(3H2QXCA，绿线)预饱和20min，以30mW/cm2辐射4min的200μm厚的角膜瓣的张力测量曲线。
图55显示用0.1％的核黄素(蓝色柱，溶液2)和包含3-羟基-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.02％溶液的0.1％核黄素(红色柱，溶液1)交联的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣(200μm厚)(无上皮，20min的浸泡时间，30mW/cm2持续4min)的相对荧光，其中F0–未经交联的瓣的荧光。
图56显示4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸。
图57显示4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.01mg/ml溶液的吸收光谱(石英，1cm光程)。
图58显示4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的溶液的荧光(360nm激发)。
图59显示经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣的荧光：未经交联的对照(黑线)，用4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.1mg/ml溶液(红线)和1mg/ml溶液(绿线)交联，其中将角膜去上皮，用交联剂的溶液浸泡20min，然后以30mW/cm2UVA光(360nm)辐射4min。
图60显示喹喔啉(又称作苯并吡嗪)，其为包含由苯环和吡嗪环构成的环复合体的杂环化合物。
图61显示喹喔啉-2,3-二硫酮环状二硫代碳酸酯(灭螨猛)和三硫代碳酸酯(Eradox)。
图62显示甲氨蝶呤。
图63显示甲萘醌(维生素K3)。
图64显示用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相较于0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.25mM铁+0.5mM柠檬酸盐的交联瓣的相对荧光。
图65显示用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相较于0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.5mM铁+0.25mM柠檬酸盐的交联瓣的相对荧光。
虽然本申请易于做出各种修改和替代形式，但是其具体实施方案已通过附图中的实例而表明并会在本文中详细描述。然而，应理解，不意在将本申请限于所公开的特定形式，而是相反，其意图为覆盖落入本公开的精神范围内的所有修改、等同和替代。
发明概述
本公开的方面提供产生用于治疗眼病症的交联活性的系统、方法和组合物。例如，在本文公开的研究中鉴定了多种用于交联治疗的药剂、添加剂、缓冲剂等。所述多种药剂、添加剂、缓冲剂等的特征可以用于具有交联剂的制剂以增强交联治疗。
在示例性实施方案中，用于向眼的角膜施加治疗的组合物包含交联剂，其响应于对光活化光的暴露而在所述角膜中产生交联活性。所述组合物还包含铁添加剂和柠檬酸盐缓冲液。在一些情况下，所述交联剂可以包括核黄素。在其他情况下，所述铁添加剂可以包括FeSO4。在进一步的情况下，所述铁添加剂可以溶于所述柠檬盐缓冲液。在其他情况下，所述光活化光可以是紫外光。
在另一示例性实施方案中，用于向眼的角膜施加治疗的方法包括向所述角膜施用组合物。所述组合物包含交联剂，其响应于对光活化光的暴露而在所述角膜中产生交联活性。所述组合物还包含铁添加剂和柠檬酸盐缓冲液。所述方法还包括向所述角膜施加光活化光以在所述角膜中产生交联活性。在一些情况下，所述交联剂可以包括核黄素。在其他情况下，所述铁添加剂可以包括FeSO4。在进一步的情况下，所述铁添加剂可以溶于所述柠檬盐缓冲液。在其他情况下，所述光活化光可以是紫外光。在一些情况下，所述光活化光可以是脉冲的。在其他情况下，所述光活化光可以是连续波。所述方法还可以包括向所述眼施用选定浓度的氧，其中所述选定浓度大于空气中的氧浓度。
发明详述
图1说明在眼1的角膜2中产生胶原的交联的示例性治疗系统100。所述治疗系统100包括将交联剂130施用至所述角膜2的涂药器132。在示例性实施方案中，所述涂药器132可以是将光敏剂(photosensitizer)130作为滴剂施用至所述角膜2的眼滴管、注射器等。所述交联剂130可以在允许所述交联剂130通过角膜上皮2a至角膜基质2b中的底层区域的制剂中提供。或者，可以将所述角膜上皮2a去除或以其他方式切割以允许所述交联剂130更直接地施用至底层组织。
所述治疗系统100包括光源110和引导光至所述角膜2的光学元件112。所述光引起所述交联剂130的光活化以在所述角膜2中产生交联活性。例如，所述交联剂可以包括核黄素并且所述光活化光可以是紫外线A(UVA)(例如，365nm)光。或者，所述光活化光可以具有另一波长，如可见波长(例如，452nm)。如下文进一步描述的，角膜交联通过根据光化学动力学反应的系统在角膜组织内产生化学键来提高角膜强度。例如，施用核黄素和所述光活化光以稳定和/或增强角膜组织以处理疾病(如圆锥角膜或LASIK后扩张)。另外，如以下进一步描述的，多种药剂、添加剂、缓冲剂等可以用于具有所述交联剂的制剂以增强交联治疗。
所述治疗系统100包括控制所述系统100的方面的一个或多个控制器120，包括所述光源110和/或所述光学元件112。在实施方案中，所述角膜2可以用所述交联剂130(例如，用眼滴管、注射器等)更广泛治疗，并且可以根据特定模式将来自所述光源110的所述光活化光选择性地引导至治疗的角膜2的区域。
所述光学元件112可以包括将所述光源110发射的所述光活化光引导并聚焦至角膜2上的特定模式的一个或多个镜子或透镜。所述光学元件112可以进一步包括滤镜，其用于部分阻断所述光源110发射的光的波长以及选择光的特定波长引导至所述角膜2以激活所述交联剂130。此外，所述光学元件112可以包括分割所述光源110发射的光束的一个或多个分束器，并且可以包括吸收所述光源110发射的光的一个或多个散热器。所述光学元件112还可以将所述光活化光准确和精确地聚焦至所述角膜2内的特定焦平面，例如期望交联活性的底层区域2b中的特定深度。
此外，可以调整所述光活化光的具体方案以在所述角膜2的选定区域中达到期望程度的交联。所述一个或多个控制器120可以用来控制所述光源110和/或所述光学元件112的操作以根据以下的任何组合递送所述光活化光：波长、带宽、强度、功率、位置、穿透深度和/或治疗的持续时间(曝光周期、黑暗周期的持续时间以及曝光周期比黑暗周期持续时间的比率)。
可以调整所述交联剂130的光活化的参数，例如，以便减少达到期望的交联所需要的时间量。在示例性实施中，时间可以从几分钟减少至几秒。虽然一些配置可以施用辐照度为5mW/cm2的光活化光，但是可以施用较大辐照度的光活化光(例如，5mW/cm2的多倍)以减少达到所述期望的交联所需要的时间。所述角膜2中吸收的能量的总剂量可以被描述为有效剂量，其是通过所述角膜上皮2a的面积吸收的能量的量。例如，角膜表面2A的区域的有效剂量可以是例如5J/cm2，或者高达20J/cm2或30J/cm2。描述的所述有效剂量可以被递送自能量的单次施用，或者递送自能量的重复施用。
所述治疗系统100的所述光学元件112可以包括数字微镜设备(DMD)以在空间和时间上调节光活化光的施用。利用DMD技术，来自所述光源110的光活化光以精确的空间模式投影，所述精确的空间模式是通过以矩阵排列在半导体芯片上的显微小镜子(microscopically small mirrors)产生的。每个镜子代表投影光的模式(pattern)中的一个或多个像素。用DMD可以进行地形指导的交联(topography guided cross-linking)。根据地形的DMD控制可以采用几种不同的空间的和时间的辐照度和剂量谱。这些空间的和时间的剂量谱可以利用连续波照明产生，但是还可以通过如上文所述在不同频率和占空比(duty cycle)的方案下脉冲照明光源经脉冲照明进行调节。或者，DMD可以基于各个像素调节不同频率和占空比以利用连续波照明给出最终的灵活性。或者，可以组合脉冲照明以及调节的DMD频率和占空比组合。这允许特定量的空间确定的角膜交联。这种空间确定的交联可以与剂量测定、干涉测量、光学相干层析成像(OCT)、角膜地形图等组合，用于治疗前计划和/或实时监测以及治疗期间角膜交联的调节。此外，临床前患者的信息可以与有限元生物力学计算机建模组合以产生患者特异性的治疗前计划。
为了控制光活化光的递送的方面，实施方案还可以采用多光子激发显微镜的方面。特别地，与其递送特定波长的单光子至角膜2，所述治疗系统100可以递送较长波长的多个光子(即，较低能量)，其组合以引发交联。有利地，在角膜2内较长波长比较短波长更少程度地分散，这允许较长波长的光比较短波长光更有效地穿透角膜2。在角膜内较深深度的入射辐射的屏蔽效应也比常规的短波照明减少，因为光敏剂在较长波长下吸收光少很多。这允许对深度特异性交联的控制增强。例如，在一些实施方案中，可以采用两个光子，其中每个光子携带激发所述交联剂130中的分子所必需的大约一半能量以产生下文中进一步描述的光化学动力学反应。当交联剂分子同时吸收两个光子时，其吸收足够的能量以在角膜组织中释放反应自由基。实施方案还可以利用较低能量光子，从而使得交联剂分子必须同时吸收例如3、4或5个光子以释放反应自由基。多个光子几乎同时吸收的可能性低，因此可能需要高通量的激发光子，并且高通量可能通过飞秒激光递送。
大量条件和参数影响使用交联剂130交联的角膜胶原。例如，当交联剂130是核黄素且光活化光是UVA光时，辐照度和剂量均影响交联的量和速率。UVA光可以连续(连续波(CW))或作为脉冲光施加，并且这个选择对交联的量、速率和程度有影响。
如果UVA光作为脉冲光施加，则曝光周期、黑暗周期的持续时间和曝光周期比黑暗周期持续时间的比率对导致的角膜硬化有影响。对于递送的相同量或剂量的能量，脉冲光照明可以用来产生比用连续波照明可以达到的更多或更少的角膜组织硬化。合适长度和频率的光脉冲可以用来实现更优化的化学放大。对于脉冲光治疗，开/关占空比可以为约1000/1-约1/1000；辐照度可以为约1mW/cm2-约1000mW/cm2平均辐照度，并且脉冲率可以为约0.01HZ-约1000Hz或约1000Hz-100,000Hz。
所述治疗系统100可以通过采用DMD、电子开启和关闭所述光源110、和/或使用机械或光电(例如，普克尔盒(pockels cell))快门或机械斩波器或旋转孔径产生脉冲光。因为DMD的像素特异性调节能力和随后基于调节频率、占空比、辐照度和递送至角膜的剂量的硬度赋予，可以将复杂的生物力学硬度模式赋予角膜以允许各种量的屈光矫正。例如，这些屈光矫正可以包括近视、远视、散光、不规则散光、老花眼和因为眼部疾病状况的复合角膜屈光表面矫正的组合，所述眼部疾病状况如圆锥角膜、透明边缘病、LASIK后扩张和角膜生物力学改变/变性的其他疾病状况等。DMD系统和方法的特定优势是其允许随机异步脉冲地形图模式，产生非周期性和均匀出现的照明，这消除2Hz-84Hz的脉冲频率触发光敏性癫痫发作或闪烁眩晕的可能性。
虽然示例性实施方案可以采用逐步开/关脉冲光函数，但是应当理解将光施用至角膜的其他函数可以用来达到相似效果。例如，可以根据正弦函数、锯齿函数或其他复杂函数或曲线或者函数或曲线的任何组合将光施用至角膜。实际上，应当理解函数可以实质上是逐步的，其中在开/关值之间可以有更多逐渐转变。此外，应当理解辐照度在关周期期间不必减少至0的值，并且在关周期期间可以在0以上。可以通过根据在两个或更多个值之间改变辐照度的曲线将光施用至角膜来达到期望的效果。
递送光活化光的系统和方法的示例性描述于例如2011年3月18日提交且题为“Systems and Methods for Applying and Monitoring Eye Therapy”的美国专利申请公开第2011/0237999号，2012年4月3日提交且题为“Systems and Methods for Applyingand Monitoring Eye Therapy”的美国专利申请公开第2012/0215155号和2013年3月15日提交且题为“Systems and Methods for Corneal Cross-Linking with Pulsed Light”的美国专利申请公开第2013/0245536号，这些申请的内容整体援引加入本文。
氧的添加也影响角膜硬化的量。在人组织中，O2含量与空气相比非常低。但是，当用光活化光照射时，角膜中的交联速率与O2的浓度有关。因此，增加或减少照射期间活性O2的浓度以控制交联速率直至达到期望量的交联可能是有利的。可以在交联治疗期间以许多不同方式施用氧。一种方法涉及用O2过饱和核黄素。因此，当将核黄素施用至眼时，较高浓度的O2与核黄素直接递送入角膜并且在核黄素暴露于光活化光时影响涉及O2的反应。根据另一种方法，可以在角膜表面保持稳定状态的O2(以选定的浓度)以将角膜暴露于选定量的O2并使O2进入角膜。如图1所示，例如，所述治疗系统100还包括氧源140和氧递送装置142，其任选地递送选定浓度的氧至角膜2。在交联治疗期间施用氧的示例性系统和方法描述于例如2010年10月21日提交且题为“Eye Therapy”的美国专利第8,574,277号，2012年10月31日提交且题为“Systems and Methods for Corneal Cross-Linking with Pulsed Light”的美国专利申请公开第2013/0060187号，这些申请的内容整体援引加入本文。
当核黄素吸收辐射能量特别是光时，其经历光活化。核黄素光活化有两种光化学动力学途径，I型和II型。I型和II型机制中涉及的一些反应如下：
常见反应：
Rf→Rf1 *， I； (r1)
Rf1 *→Rf， κ1； (r2)
Rf1 *→Rf3 *， κ2； (r3)
I型反应：
Rf3 *+DH→RfH.+D.， κ3； (r4)
2RfH.→Rf+RfH2， κ4； (r5)
II型反应：
Figure BDA0001363850040000112
Figure BDA0001363850040000111
Dox+DH→D-D， κ7； CXL (r8)
在本文描述的反应中，Rf代表基态的核黄素。Rf* 1代表激发单重态的核黄素。Rf＊ 3代表三重激发态的核黄素。Rf.-是核黄素的还原自由基阴离子形式。RfH.是核黄素的自由基形式。RfH2是核黄素的还原形式。DH是底物。DH.+是中间体自由基阳离子。D.是自由基。Dox是底物的氧化形式。
如反应(r1)-(r3)所示将核黄素激发入其三重激发态Rf* 3。从所述三重激发态Rf* 3，核黄素一般根据I型或II型机制进一步反应。在I型机制中，底物与激发态核黄素反应以通过氢原子或电子转移分别产生自由基或自由基离子。在II型机制中，激发态核黄素与氧反应以形成单线态分子氧。然后所述单线态分子氧对组织作用以产生额外的交联键。
角膜中的氧浓度通过UVA辐照度和温度来调节，并且在UVA暴露开始时迅速减少。利用特定占空比、频率和辐照度的脉冲光，来自I型和II型光化学动力学机制的输入可以用来达到更大量的光化学效率。此外，利用脉冲光允许调节涉及核黄素的反应的速率。根据需要，可以通过调节以下参数之一来增加或减少反应速率：如辐照度、剂量、开/关占空比、核黄素浓度、浸泡时间及其他。此外，可以将影响反应和交联速率的额外成分添加至角膜。
如果在氧耗尽之后立刻停止UVA辐射，则氧浓度开始增加(补充)。过量的氧在角膜交联过程中可能是有害的，因为氧能够通过与自由基物质反应形成链终止过氧化物分子来抑制游离基光聚合反应。可以调整脉冲率、辐照度、剂量和其他参数以达到更优化的氧再生率。计算和调整氧再生率是调整反应参数以达到期望量的角膜硬化的另一实例。
氧含量可以通过各种化学反应在整个角膜耗尽，除了非常薄的角膜层(其中氧扩散能够跟上反应的动力学)。由于底物吸收氧的反应能力降低，这种扩散控制的区域会逐步向角膜深处移动。
核黄素可逆或不可逆地减少(失活)和/或随着辐照度增加而光降解到更大的程度。光子优化可以通过允许还原的核黄素在I型反应中返回基态核黄素来实现。I型反应中还原的核黄素返回基态的速率由许多因素决定。这些因素包括但不限于脉冲光治疗的开/关占空比、脉冲率频率、辐照度和剂量。此外，核黄素浓度、浸泡时间和额外其他物质(包括氧化剂)影响氧吸收速率。可以选择这些和其他参数，包括占空比、脉冲率频率、辐照度和剂量，以达到更优化的光子效率并有效利用核黄素光敏作用的I型以及II型光化学动力学机制。此外，可以以这样的方式选择这些参数以达到更优化的化学扩增效应。
但是，除了上文的光化学动力学反应(r1)-(r8)，本发明人已鉴定了也在核黄素光活化期间发生的以下光化学动力学反应(r9)-(r26)：
Rf3 *→Rf， κ8； (r9)
Rf3 *+Rf→2RfH.， κ9； (r10)
RfH2+O2→RfH.+H++O2 -， κ10； (r11)
RfH.+O2→Rf+H++O2 -， κ11； (r12)
2RfH2+O2 -→2RfH.+H2O2， κ12； (r13)
2RfH.+O2 -→2Rf+H2O2， κ13； (r14)
RfH.+H2O2→OH.+Rf+H2O， κ14； (r15)
OH.+DH→D.+H2O， κ15； (r16)
D.+D.→D-D， κ16； CXL (r17)
Figure BDA0001363850040000131
D.+RfH2→RfH.+DH， κ19； (r19)
Figure BDA0001363850040000132
Figure BDA0001363850040000133
Figure BDA0001363850040000134
Rf1 *+A→Rf+A， κ1a (r23)
Rf3 *+A→Rf+A， κ3a (r24)
Figure BDA0001363850040000135
OH°+CXL→惰性产物， κOH (r26)
图2A说明上文反应(r1)-(r26)中提供的光化学动力学反应的图。该图总结了UVA光活化光下核黄素(Rf)的光化学转化及其通过电子转移与各种供体(DH)的相互作用。如图所示，交联反应通过以下而发生：(A)在反应(r6)-(r8)中通过单线态氧的存在(II型机制)；(B)在反应(r4)和(r17)中没有使用氧(I型机制)；以及(C)在反应(r13)-(r17)中通过过氧化物(H2O2)、超氧化物(O2 -)和羟基自由基(.OH)的存在。
如图2A所示，本发明人还确定从包括过氧化物、超氧化物和羟基自由基的反应产生更大程度的交联活性。从包括单线态氧的反应和无氧反应产生较少程度的交联反应。基于反应(r1)-(r26)的一些模型可以说明各反应产生的交联活性水平。例如，当单线态氧在产生交联活性中起较小作用时，可以通过作为常数处理单线态氧所致的交联活性来简化模型。
如反应(r1)-(r3)提供的，所有反应从Rf3*开始。Rf3*的猝灭在反应(r10)中通过与基态Rf的化学反应发生，并且在反应(r9)中通过与水相互作用来灭活而发生。
如上文所述，过量的氧在角膜交联过程中可能是有害的。如图2A所示，当系统变得光子有限和氧丰富时，从包括超氧化物、过氧化物和羟基自由基的进一步反应可以破坏交联。实际上，在某些情况下，过量的氧可以导致相对于交联产生的交联净破坏。
如上文所述，各种因素影响交联反应的速率和由于交联达到的生物力学硬度的量。许多这些因素是相互关联的，使得改变一个因素可能对另一因素具有意想不到的影响。但是，上文鉴定的光化学反应(r1)-(r26)提供更全面模型以理解交联治疗的不同因素之间的关系。因此，系统和方法可以根据这个光化学动力学交联模型调整交联治疗的各种参数，所述光化学动力学交联模型提供氧动力学和交联活性的统一描述。所述模型可以用来基于治疗参数的不同组合评价预期结果以及鉴定提供期望结果的治疗参数的组合。例如，所述参数可以包括但不限于：施用的交联剂的浓度和/或浸泡时间；光活化光的剂量、波长、辐照度、持续时间和/或开/关占空比；组织中的氧化条件；和/或额外的物质和溶液的存在。
已通过至少5种评价交联活性的不同方法验证基于反应(r1)-(r26)的方面的模型：
·氧耗尽实验
·非线性光学显微镜荧光实验
·基于木瓜蛋白酶消化方法实验的荧光数据
·角膜基质分界线相关实验
·布里渊(Brillouin)显微镜实验
这些评价例如记载于2015年10月27日提交的PCT国际专利申请第PCT/US15/57628号和2015年11月14日提交的美国临时专利申请第62/255452号，这些申请的内容全部援引加入本文。
图3说明采用基于上文鉴定的光化学动力学反应(r1)-(r26)的模型的示例性系统100。控制器120包括处理器122和计算机可读取的存储介质124。存储介质124储存在将来自光源110的光活化光递送至用交联剂治疗的角膜的选定区域时确定交联量的程序指令。特别地，基于反应(r1)-(r26)的光化学动力学模型126可以包括第一组程序指令A，其用于确定包括活性氧(ROS)(包括过氧化物、超氧化物、羟基自由基和/或单线态氧的组合)的反应所致的交联，以及第二组程序指令B，其用于确定来自不包括氧的反应的交联。控制器120接收关于治疗参数和/或其他相关信息的输入。然后控制器120可以执行程序指令A和B以基于输入输出关于角膜选定区域的三维交联分布的信息。然后三维交联分布可以被用来确定怎样控制光源110、光学元件112、交联剂130、涂药器132、氧源140和/或氧递送装置142的方面以在角膜的选定区域中达到期望的治疗。(当然，图3中示出的系统100和这种方法可以被用于相同角膜的一个以上选定区域的治疗。)
根据一实施方案，可以评价三维交联分布以计算对应于由于交联的愈合反应和活性氧在角膜选定区域中的影响的阈值深度。额外地或可选地，可以评价三维交联分布以计算对应于角膜选定区域中的生物力学组织反应的生物力学组织硬度阈值深度。角膜中愈合反应和/或生物力学组织硬度的深度的信息可以用来确定怎样控制光源110、光学元件112、交联剂130、涂药器132、氧源140和/或氧递送装置142的方面。在角膜的某些深度，某些愈合反应和/或生物力学组织硬度可能是期望或不期望的。
如上文所述，图2A-B显示涉及角膜交联治疗期间施用的核黄素和光活化光(例如，紫外线A(UVA)光)的光化学动力学反应的图。然而，不是所有的产生于图2A-B所示的反应的超氧化物阴离子都消耗在全部反应中。超氧化物阴离子(与其共轭酸处于平衡状态)可以产生过氧化氢并随后产生羟基自由基，如在图4的图中所示。特别地，图4显示通过电子转移反应形成氧化剂以及通过夺氢可能引发聚合。图4中的不同活性氧(ROS)对胶原的作用的总体情况是复杂的。超氧化物阴离子的反应性不是非常高，但能够降解胶原。相反，羟基自由基独自能够引起蛋白质聚集。羟基自由基被认为不仅仅是蛋白质聚合的引发剂。然而，羟基自由基与超氧化物阴离子的混合物(前者过量)刺激蛋白质降解。
图4证明过氧化氢是羟基自由基的直接前体(immediate precursor)。可以促进过氧化氢的分解，以增加羟基自由基的浓度和促进胶原交联。实现这个目的的一种方法包括使用芬顿反应。
H2O2+Fe(II)→OH-+OH.+Fe(III)
因为Fe(III)与超氧化物阴离子反应产生Fe(II)，所以溶液中Fe(II)的浓度不太高：
Fe(III)+O2 .-→O2+Fe(II)。
此外，当以UV光辐射时，Fe(III)的羟基络合物光化学还原成Fe(II)。在该光还原过程中生成的羟基自由基是额外的收获：
Fe(III)-OH+(UV光)→Fe(II)+OH.。
可以使用铜离子代替铁，而且在该条件下观察到胶原的交联是一个很好的迹象。
向核黄素制剂添加微量的金属(例如铁或铜)增强UV光情况下的角膜胶原交联。可以介导活性氧和活性氮的形成的其他金属包括例如：锰、铬、钒、铝、钴、汞、镉、镍或砷。
一般而言，在下文的研究中鉴定了用于交联治疗的多种药剂、添加剂、缓冲剂等。所述多种药剂、添加剂、缓冲剂等的特征可以用于具有交联剂的制剂以增强交联治疗。
以核黄素和铁(II)交联
以下研究进行了确定在核黄素溶液中铁(II)的存在如何增强作为交联活性的指示的胶原相关性荧光的研究。
A.材料和方法
在设置在37℃的培养箱中，仅以0.1％的核黄素dH2O溶液、或以在0.1％的核黄素dH2O溶液中的1mM FeSO4(硫酸亚铁(II))浸泡去上皮的眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在角膜上。在充满氧的圆筒中，以365-nm光源(脉冲，1秒开、1秒关)(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以选定的辐照度(30mW/cm2)对角膜进行全角膜(pan-corneally)辐射8分钟(7.2J的总剂量)，所述辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。在辐射开始之前，氧暴露2分钟。借助Intralase飞秒激光器(AbbotMedical Optics,Santa Ana,CA)从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。将角膜瓣用蒸馏水洗涤两次，用滤纸干燥，用dH2O洗涤两次，然后真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papayalatex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用BBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon Technology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
使用该方法是因为之前通过使用木瓜蛋白酶消化物的荧光量化了胶原中的非酶法交联密度。荧光与递增的交联活性之间存在线性关系。
B.结果/结论
图5显示与未经交联的对照相比(F/Fo)，具有在交联过程中施用的不同浓度的铁(II)溶液的角膜消化物在450nm的荧光。如图5中的结果所表明的，铁(II)在核黄素溶液中的存在增强了暴露于UVA光之后在450nm的胶原相关性荧光(指示了交联活性)。
以过氧化氢和铁(II)交联
以下研究进行了在过氧化氢预浸泡的情况下使用由FeSO4溶液制成的0.1％铁(II)溶液来测试角膜交联的研究。
A.材料和方法
在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。眼在实验时有几日龄。将眼清理干净并除去上皮。借助Intralase飞秒激光器(AbbotMedical Optics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGHTechnology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。
用蒸馏水或稀H2O2(1％)浸泡角膜瓣20分钟。将浸泡在H2O2中的瓣用蒸馏水清洗两次，或者将其从H2O2中移出并置于0.1％的FeSO4蒸馏水溶液中进行另外20分钟的浸泡，然后用蒸馏水清洗两次。将瓣真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papayalatex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用BBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon Technology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
处理：
对照：将角膜瓣置于1.5mL微量离心管中并用dH2O浸泡20分钟。
H2O2：将角膜瓣置于1.5mL微量离心管中并用1％H2O2浸泡20分钟。将角膜瓣用dH2O清洗两次，然后干燥。
H2O2+铁(II)：将角膜瓣置于1.5mL微量离心管中并用1％H2O2浸泡20分钟。将瓣从最初的管中移出并转移到具有在dH2O中的0.1％铁(II)溶液的新微量离心管中，保持20分钟。将瓣用dH2O清洗两次，然后干燥。
B.结果/结论
图6说明用(1)dH2O、(2)H2O2以及(3)H2O2和0.1％铁(II)处理的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣的荧光计数。如图6中的结果所表明的，H2O2+0.1％铁(II)的条件下的荧光特征(pattern)与正常的交联形式类似。这表明，交联发生于在H2O2之后将瓣置于所述铁溶液中时，而不是当将其仅仅暴露于H2O2时。
以核黄素和铁(II)进一步交联
以下研究考察了在0.1％的核黄素dH2O溶液中的0.5mM FeSO4对角膜胶原交联的作用。对样品连续辐射，或以氧和脉冲UVA辐射。以下描述结合了来自两个单独的实验日的数据。
A.材料和方法
在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。将眼清理干净并除去上皮。在设置在37℃的培养箱中，以dH2O、0.1％的核黄素dH2O溶液、或在0.1％的核黄素dH2O溶液中的0.5mM FeSO4浸泡眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在眼睛上面。若有规定，则在辐射前，将眼睛置于培养室中具有细小的氧气流的烧杯中，保持2分钟。以365-nm光源(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以选定的辐照度(30mW/cm2，脉冲的或非脉冲的)对角膜进行全角膜辐射，持续选定的时间(4或8分钟)，所述辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。借助Intralase飞秒激光器(Abbot MedicalOptics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。使用具有5个齿的跨距3mm宽度的biorake附件，将瓣放入双向伸长计(CellScale Biotester 5000,Waterloo,ON)中。在37℃于盐水中以4μm/s的恒定速率拉伸各样品直至样品破坏。将瓣用蒸馏水洗涤两次，用滤纸干燥，用dH2O洗涤两次，然后真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3 A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papaya latex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge 05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用1XBBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon Technology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
处理：
对照：在dH2O中浸泡后，以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素，CW：在0.1％核黄素中浸泡后，用30mW/cm2的UVA光照射眼睛4分钟，连续波(CW)。以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素+0.5mM FeSO4，CW：在0.1％核黄素+0.5mM FeSO4中浸泡后，用30mW/cm2的UVA光照射眼睛4分钟，连续波(CW)。以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素，PW+O2：在0.1％核黄素中浸泡后，将眼睛置于具有氧气流的烧杯中保持2分钟，然后用30mW/cm2的脉冲UVA光照射8分钟(1秒开:1秒关)(脉冲波(PW))。在暴露时间期间，向烧杯持续提供氧。以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素+0.5mM FeSO4，PW+O2：在0.1％核黄素+0.5mM FeSO4中浸泡后，将眼睛置于具有氧气流的烧杯中保持2分钟，然后用30mW/cm2的脉冲UVA光照射8分钟(1秒开:1秒关)(脉冲波(PW))。在暴露时间期间，向烧杯持续提供氧。以约200μm切成角膜瓣。
B.结果
图7显示在450nm记录的(1)0.1％核黄素(连续波(CW))、(2)0.1％核黄素+0.5mMFeSO4(CW)、(3)0.1％核黄素(脉冲波(PW)+O2)以及(4)0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(PW+O2)的荧光(与未处理的对照相比)。
图8显示与对照(1)相比，对于0.1％核黄素(CW)(2)和0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(CW)(3)，通过张力测量法测得的各角膜瓣的平均力vs.移位。
图7-8显示对于重复实验，与对照(1)相比，对于0.1％核黄素(PW+O2)(2)和0.1％核黄素+0.5mM FeSO4(PW+O2)(3)，通过张力测量法测得的各角膜瓣的平均力vs.移位。
C.结论
使用了两种方法来测定角膜瓣中的角膜交联。首先，木瓜蛋白酶消化的结果显示，在连续(CW)和脉冲(PW)+O2的条件下并且在添加FeSO4的情况下荧光增加。第二种方法(张力测量法)在添加FeSO4时，对于PW+O2条件仅显示双向张力的增加。
图7的相对荧光图显示，在氧气下，当向0.1％核黄素添加FeSO4时以及当将UVA施加从连续剂量改变为脉冲剂量时，荧光计数增加。
图8显示来自连续UVA剂量处理组的张力测量结果。当移位增加时，0.1％核黄素组和0.1％核黄素+0.5mM FeSO4组均显示类似的力和移位之间的相关性。这两组都高于对照组。
图9和10显示来自脉冲UVA施加和氧处理组的张力测量结果。当移位增加时，0.1％核黄素+0.5mM FeSO4组显示略高的力。PW+O2处理组的力的增加大于CW处理组。
以核黄素和溶于柠檬酸盐缓冲液的铁(II)交联
以下研究考察了用在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素(以
Figure BDA0001363850040000201
PHOTREXAZDTM获得)相较于用在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素和溶于柠檬酸盐缓冲液的铁(II)处理的角膜瓣中胶原交联的水平。
通过此处理，柠檬酸根配体保护铁离子和亚铁离子免于水和氧的作用，所述作用形成低溶解度的产物氢氧化铁和其他不溶性的铁或亚铁物质。虽然铁(II)与柠檬酸根的络合可以延迟铁(II)氧化的动力学，但是在所研究的系统中一些铁离子仍可参与芬顿样反应。
A.材料和方法
将FeSO4添加至柠檬酸盐缓冲液(100mM柠檬酸盐缓冲液母液：柠檬酸和在dH2O中的0.33％NaCl，用柠檬酸三钠调节至pH 6.0；将缓冲液用dH2O稀释至所需浓度)。将100μL的各Fe-柠檬酸根溶液添加至10mL在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素，最终pH为7.1-7.2。在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。将眼清理干净并去除上皮。在设置在37℃的培养箱中，用在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素、在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素+0.25mM FeSO4+0.5mM柠檬酸盐缓冲液、或在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素+0.5mM FeSO4+0.25mM柠檬酸盐缓冲液浸泡眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在眼睛上面。在辐射前，将眼睛置于培养室中具有细小的氧气流的烧杯中，保持2分钟。以365-nm光源(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以选定的辐照度(30mW/cm2，脉冲1秒开:1秒关)对角膜进行全角膜辐射，持续4分钟，所述辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。借助Intralase飞秒激光器(Abbot Medical Optics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。将瓣用蒸馏水洗涤两次，用滤纸干燥，用dH2O洗涤两次，然后真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3 A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papaya latex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge 05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用1XBBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(PhotonTechnology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
处理：
对照：在浸泡于0.1％的核黄素缓冲盐水溶液中20分钟后，以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)，PW+O2：在浸泡于0.1％的核黄素缓冲盐水溶液中20分钟后，将眼睛置于具有细小的氧气流的烧杯中保持2分钟，然后在氧气条件下用30mW/cm2的脉冲UVA光照射4分钟(1秒开:1秒关)。以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.25mM铁+0.5mM柠檬酸盐缓冲液，PW+O2：在浸泡于0.1％的核黄素缓冲盐水溶液+0.25mM铁+0.5mM柠檬酸盐缓冲液中20分钟后，将眼睛置于具有细小的氧气流的烧杯中保持2分钟，然后在氧气条件下用30mW/cm2的脉冲UVA光照射4分钟(1秒开:1秒关)。以约200μm切成角膜瓣。
0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.5mM铁+0.25mM柠檬酸盐缓冲液，PW+O2：在浸泡于0.1％的核黄素缓冲盐水溶液+0.5mM铁+0.25mM柠檬酸盐缓冲液中20分钟后，将眼睛置于具有细小的氧气流的烧杯中保持2分钟，然后在氧气条件下用30mW/cm2的脉冲UVA光照射4分钟(1秒开:1秒关)。以约200μm切成角膜瓣。
B.结果
图64显示用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相较于用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.25mM铁+0.5mM柠檬酸盐缓冲液处理的交联瓣的相对荧光，其中在氧气条件下将眼睛用30mW/cm2的CW UVA光照射4分钟并脉冲。
图65显示用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相较于用0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)+0.5mM铁+0.25mM柠檬酸盐缓冲液处理的交联瓣的相对荧光，其中在氧气条件下将眼睛用30mW/cm2的CW UVA光照射4分钟并脉冲。
C.结论
以在50mM柠檬酸盐缓冲液中的25mM FeSO4或在25mM柠檬酸盐缓冲液中的50mMFeSO4形式，将硫酸亚铁(II)溶于柠檬酸盐缓冲液。对于这两种溶液，将100uL添加至10mL的0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)，以达到所需浓度。在两种情况下，都没有可见的沉淀而且溶液在室温下仍然稳定持续延长的时间段。
与单独的0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相比，具有0.25mM FeSO4的0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)具有略高的来自木瓜蛋白酶消化的平均荧光计数。与单独的0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)相比，具有0.5mM FeSO4的0.1％核黄素(缓冲盐水溶液)具有约高26％的来自木瓜蛋白酶消化的荧光计数。
以核黄素和2,3-丁二酮交联
联乙酰(2,3-丁二酮)是天然存在于黄油和包括乳制品和酒精饮料在内的多种食物中的α-二酮，其为细菌发酵的产物。美国食品和药品管理局批准联乙酰作为直接食品成分是GRAS(一般认为是安全的)状态，而且未报道服用存在于食品中的低水平联乙酰导致人体健康风险。
据研究，2,3-丁二酮是用UV光辐射后在核黄素溶液中检测到的主要挥发性产物。机制包括单线态氧和核黄素之间的相互作用。图11显示由核黄素和单线态氧形成2,3-丁二酮的机制。研究证实了UV辐射后核黄素溶液中2,3-丁二酮的产生，而且已经提出其参与角膜交联。以下研究进行了在有核黄素和没有核黄素的情况下使用2,3-丁二酮进行角膜交联时定量测量2,3-丁二酮的交联效率的研究。
A.材料和方法
在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。将眼清理干净并除去上皮。在设置在37℃的培养箱中，以在dH2O中的0.1％核黄素或在dH2O中的0.1％2,3-丁二酮(BD)浸泡眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在眼睛上面。以365-nm光源(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以辐照度30mW/cm2对角膜进行全角膜辐射，持续4分钟，所述辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。借助Intralase飞秒激光器(Abbott Medical Optics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。使用具有5个齿的跨距3mm宽度的biorake附件，将瓣放入双向伸长计(CellScale Biotester 5000,Waterloo,ON)中。在37℃于盐水中以4μm/s的恒定速率拉伸各样品直至样品破坏。将瓣用蒸馏水清洗，真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papaya latex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Minicentrifuge 05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用1XBBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon Technology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
B.结果/结论
图12显示在没有紫外(UV)光(左侧图)和有UV光(右侧图)(365nm,30mW持续4min)的情况下，用2,3-丁二酮(BD)在dH2O中的1％溶液处理的角膜瓣的移位-力图。
图13显示在有和没有UV光的情况下，在450nm记录的来自用1％的BD溶液处理的经木瓜蛋白酶消化的200μm厚的角膜瓣的荧光(与未处理的对照Fo相比)。
图14显示与对照(1)相比，用UV光(365nm,30mW持续4min)和在dH2O中的0.1％核黄素溶液(1)、在dH2O中的0.1％BD(4)、以及在dH2O中的0.1％核黄素和0.1％BD的混合物(3)处理的角膜瓣的移位-力图。
图15显示在450nm记录的来自用持续4min的30mW UVA和在dH2O中的0.1％核黄素溶液、在dH2O中的0.1％BD、以及在dH2O中的0.1％核黄素和0.1％BD的混合物处理的经木瓜蛋白酶消化的200μm厚的角膜瓣的荧光(与未处理的对照Fo相比)。
如图12和13所示，2,3-丁二酮自身(没有UV光)不使角膜瓣交联，但当以365nm UV光辐射时，其导致从经处理的角膜记录的角膜硬度和荧光输出增加。图14和15显示当BD和核黄素的混合物用于交联时角膜瓣的硬度的变化。
因此，2,3-丁二酮可以用作核黄素制剂的添加剂以增加交联效率。
基于以上所述的其在角膜交联中的参与，也预期2,3-丁二酮还可以用作主要的交联剂(没有核黄素)。
以来自核黄素水解的产物交联
核黄素在碱性溶液中水解，产生脲和1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉-羧酸等水解产物。图26显示核黄素(A)碱性水解为1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉-羧酸(B)。
已经以分光光度计测量的方式跟踪了碱性降解的动力学，而且已经注意到初始核黄素溶液的光密度在450nm和370nm下降但在310nm增加。当发明人在120℃加热在0.85％缓冲血库盐水(BBBS)(Thermo Scientific)中的0.1％核黄素-5-磷酸酯溶液时，他们检测到类似的进展(如图27所示)。具体而言，图27显示保持在120℃的在BBBS中的0.1％核黄素-5-磷酸酯在不同时间量的UV/可见(Vis)光谱。
在加热过程中，核黄素浓度随时间降低(图27，参见在450nm的吸光度改变)。核黄素破坏的速度也依赖于其在溶液中的浓度。例如，发明人已发现0.1％溶液的水解速度是0.5％溶液的1.3倍(如图28所示)。具体而言，图28显示通过在450nm的吸光度测量的核黄素于120℃在BBBS中的水解速度(0.1％溶液和0.5％溶液，A0是加热前的吸光度)。
同时，存在由水解产生的产物的蓄积(如图29所示)。具体而言，图29显示UV/Vis谱，其通过减去剩余核黄素的吸光度而由图27得到。
通过合并高斯吸收峰形可以分析图29的光谱(如图30所示)。具体而言，图30显示于120℃在90min后水解溶液的光谱分析(从分析的光谱减去剩余核黄素的吸光度)。
核黄素水解期间的产物蓄积之后是在209nm、237nm、257nm、300nm和355nm吸收的线性增加(如图31所示)。具体而言，图31显示在水解时间过程中不同峰的吸光度的改变。
对于核黄素降解产物的HPLC(高压液相色谱)分析，使用Dionex UltiMate 3000和来自Merck Millipore的Lichrospher WP300RP18柱，250mm×4.0mm，5μm。流动相(A)是包含磷酸二氢钾(7.35g/L)和(B)甲醇的水。一般而言，等度条件(15％B，流速1.70mL/min，30min，40℃)适合降解过程的分析。使用二极管阵列检测器(λ＝200-450nm)和Chromeleon软件，在HPLC分析期间得到UV谱。
以作为流动相的水(A)和具有多种TFA浓度的乙腈(B)进行的操作成功地用于终产物分析(参见上文)，但用于降解过程的分析时失败。
对于交联处理，可以合成1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐2，其为一种核黄素的早期碱性降解产物，如图32所示。通过使用来自Surrey等人,J.Am.Chem.Soc.1951,73,3236-2338的合成方案，可以制备所述喹喔啉2。图33显示所合成的核黄素降解产物2的NMR谱。
降解实验证明，所合成的化合物2也通过单磷酸化的核黄素(5-FMN)的热降解而产生并且对应于图35至39的峰B。图34显示在不热处理的情况下，在缓冲血库盐水中的单磷酸化核黄素(5-FMN)。图35显示1小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。图36显示2小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。图37显示3小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。图38显示4小时的热处理后，在缓冲血库盐水中的5-FMN。图39显示所合成的核黄素降解产物2的HPLC微量。
在5-FMN的热降解过程中还产生第二降解产物A。由于其更具极性的特征(更短的保留时间)，假设该峰对应于磷酸化喹喔啉化合物。该假设可以通过比较两种化合物的UV谱来证实。光谱的相似性表明没有发生生色团的改变。因此，假设该喹喔啉中间体是通过在不水解磷酸酯的情况下失去一个脲分子而形成的。
将在0.85％缓冲血库盐水(Thermo Scientific)中的核黄素-5-磷酸酯溶液(0.5％的核黄素)密封在塑料容器中并在120℃保持2小时。在热处理后测量该溶液的吸光度并与未处理的在0.85％BBBS中的溶液(含有～0.1％核黄素)的吸光度比较(溶液的pH＝对于热处理的，6.6；对于未处理的，6.9)。图40显示加热的(红线)和未加热的(蓝线)核黄素溶液的吸收光谱(在200μm光程的石英比色皿中记录)。图41显示图34中的两个光谱的区别。
两种核黄素溶液用于猪角膜的交联(无上皮，20min浸泡，30mW/cm2持续4min的连续UVA暴露，在辐射期间不施用核黄素滴剂)。以200μm的平均厚度切成瓣。用木瓜蛋白酶缓冲液消化的角膜的荧光提供于图42。具体而言，图42显示经消化的角膜的荧光：未经交联的对照(黑线)，以未加热的0.1％核黄素交联(蓝线)，以热处理的核黄素溶液交联(红线)。图43显示交联的角膜样品的相对荧光：红色-使用经热处理的核黄素溶液，蓝色-使用未加热的0.1％核黄素溶液。
如图44所示的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐具有在360nm处的强吸光度(如图45和46所示)和在460nm附近的显著的最大荧光(如图47所示)。图45显示1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐在BBBS中的0.001％溶液的吸收光谱(石英，1cm光程)。图46显示1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐在360nm的UV吸光度(在BBBS中的溶液，石英比色皿，1cm光程)。图47显示在BBBS溶液中的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐的荧光(360nm激发)。
在BBBS中的0.1％的核黄素-5-磷酸酯溶液和0.1％的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物钠盐溶液用于猪角膜的交联(无上皮，20min浸泡，30mW/cm2持续4min的连续UVA暴露，在辐射期间不施用核黄素或其他交联剂滴剂)。以200μm的平均厚度切成瓣。提供用木瓜蛋白酶缓冲液消化的角膜的荧光。以核黄素或1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联的角膜均在450nm区域显示升高的荧光(如图48所示)。图48显示经消化的角膜的荧光：未经交联的对照(黑色)，以在BBBS中的0.1％核黄素交联(红线)，以0.1％的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联(蓝线)。
在另一实验中，从猪眼切下没有上皮的200μm厚的角膜瓣，置于1mL的在BBBS中的0.1％核黄素溶液或在BBBS中的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物钠盐的0.1％溶液中，通过鼓入氩气脱氧3min，然后密封在石英片之间并在CO2气氛中以30mW/cm2辐射4min。将瓣用蒸馏水漂洗，真空干燥并在木瓜蛋白酶缓冲液中消化。在360nm激发下记录所得溶液的荧光，以评价胶原荧光(如图49所示)。图49显示经消化的角膜瓣的荧光：未经交联的对照(黑色)，以在BBBS中的0.1％核黄素交联(红线)，以0.1％的1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联(蓝线)。
以1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐交联的角膜瓣的荧光高于以核黄素交联的角膜瓣的荧光。这表明在使用1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐作为交联剂时对氧的存在的较低敏感性。因此，根据本公开的方面，在对氧的存在的较低敏感性是有利的情况中，实施方案可以使用该盐用于处理。
在BBBS中制备如图50所示的3-羟基-2-喹喔啉羧酸的0.17％和0.017％溶液，并记录如图51所示的吸光度(在200μm和1cm厚的石英比色皿中)。图51显示3-羟基-2-喹喔啉羧酸的吸收光谱。
3-羟基-2-喹喔啉羧酸的0.17％溶液显示强荧光淬灭(如图52所示)，这是因为稀释后其荧光显著增加。图52显示在BBBS中具有不同浓度的3-羟基-2-喹喔啉羧酸溶液的荧光，在360nm激发下记录。图53显示与未经交联的对照(黑线)相比，以3-羟基-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.17％溶液(红线)和0.017％溶液(蓝线)交联的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣(200μm厚)(无上皮，20min的浸泡时间，30mW/cm2持续4min)的荧光。图54显示与未经交联的对照(黑线)相比，以0.17％的核黄素(红线)和0.17％的3-羟基-2-喹喔啉羧酸(3H2QXCA，绿线)预饱和20min，以30mW/cm2辐射4min的200μm厚的角膜瓣的张力测量曲线。图55显示以0.1％的核黄素(蓝色柱，溶液2)和包含3-羟基-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.02％溶液的0.1％核黄素(红色柱，溶液1)交联的经木瓜蛋白酶消化的角膜瓣(200μm厚)(无上皮，20min的浸泡时间，30mW/cm2持续4min)的相对荧光，其中F0–未经交联的瓣的荧光。
如图56所示的4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸具有在360nm处的强吸光度(如图57所示)和在460nm附近的一些最大荧光(如图58所示)。图57显示4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.01mg/ml溶液的吸收光谱(石英，1cm光程)。图58显示在BBBS溶液中的4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸的荧光(360nm激发)。图59显示经木瓜蛋白酶消化的角膜的荧光：未经交联的对照(黑线)，以4-甲基-3-氧代-3,4-二氢-2-喹喔啉羧酸在BBBS中的0.1mg/ml溶液(红线)和1mg/ml溶液(绿线)交联，其中将角膜去除上皮，以交联剂的溶液浸泡20min，然后以30mW/cm2UVA光(360nm)辐射4min。
根据本公开的方面，用于治疗眼睛的系统和方法使用在核黄素水解期间产生的交联剂。例如，核黄素的水解产生1,2-二氢-6,7-二甲基-2-酮基-1-D-核糖醇基-3-喹喔啉羧酸一水合物的钠盐。已发现，与核黄素的常规治疗溶液相比，该盐更不容易受缺氧的影响(即，对氧的存在的敏感性较低)。当单独地或与核黄素的溶液组合使用该盐时，可以实现更有效的交联，以用于眼睛治疗。
根据本公开的方面，系统和方法使用核黄素溶液的热处理以得到核黄素水解的结果，包括交联剂的产生。
根据本公开的方面，系统和方法使用喹喔啉来引起用于眼治疗的交联活性。如图60所示，喹喔啉(又称作苯并吡嗪)为包含由苯环和吡嗪环构成的环复合体的杂环化合物。喹喔啉衍生物广泛地分布于自然界，而且它们中的许多(例如抗生素、棘霉素和actinoleutin)具有非常有用的生物活性。此外，大量的合成喹喔啉也已显示抗菌、杀真菌、杀虫、抗癌、镇静和抗抑郁性质。根据本公开的方面，对于某些眼治疗，可以利用所述喹喔啉用作交联剂的能力，并具有这些其他益处，例如抗菌或杀真菌特性。合成和筛选研究组的协作已经持续进行，产生了多种生物活性喹喔啉。因此，已表明喹喔啉1,4-二氧化物是抗菌的，而且喹喔啉-2,3-二硫酮环状二硫代碳酸酯(灭螨猛)和三硫代碳酸酯(Eradox)(如图61所示)具有杀真菌和杀虫作用。2,3,7-三氯-6-甲基氨磺酰基喹喔啉已作为抗癌剂被授予专利权。2-苯基-3-哌啶基喹喔啉以及其衍生物中的一些是选择性除草剂。
以奥喹多司交联
因为其具有抗菌性质，奥喹多司(N-(2-羟基乙基)-3-甲基-2-喹喔啉甲酰胺1,4-二氧化物)(VETRANALTM)自1975年一直用作家畜的生长促进剂。奥喹多司与一般类别的喹喔啉有关。商购制剂包含10％的在碳酸钙载体中的作为活性成分的奥喹多司，以及1.5％的用于减少制备过程中的粉尘的甘油基聚乙二醇蓖麻油酸酯。奥喹多司在饲料中的浓度一般为50ppm。在等电聚焦和电泳系统中，在人血清白蛋白的存在下辐射时，奥喹多司在20秒内完全消失；形成N-一氧化物以及具有改变的性质的改性白蛋白。以下研究评价了奥喹多司的交联潜能。
A.材料和方法
在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。将眼清理干净并除去上皮。在设置在37℃的培养箱中，以在PBS中的0.4％奥喹多司浸泡眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在眼睛上面。将一些眼睛在空气中以连续UVA光辐射，将一些眼睛在辐射前置于培养室中具有细小的氧气流的烧杯中保持2分钟。以365-nm光源(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以选定的辐照度(30mW/cm2，脉冲的，1秒开1秒关)对角膜进行全角膜辐射，持续4或8分钟。UV辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。借助Intralase飞秒激光器(Abbot Medical Optics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。使用具有5个齿的跨距3mm宽度的biorake附件，将瓣放入双向伸长计(CellScale Biotester 5000,Waterloo,ON)中。在37℃于盐水中以4μm/s的恒定速率拉伸各样品直至样品破坏。将瓣用蒸馏水洗涤两次，用滤纸干燥，用dH2O洗涤两次，然后真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3A652-01-903,BOCEdwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1mL木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papaya latex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge 05-090-100,FisherScientific)离心5秒，用1XBBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon TechnologyInt.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
B.结果/结论
图24显示与对照(1)相比，在以30mW/cm2辐射4min(CW)(2)以及以30mW/cm2的脉冲UVA光和O2(3)辐射8分钟(1秒开:1秒关)下，用在PBS中的0.4％奥喹多司浸泡的200um厚的角膜瓣的双向拉伸测量。
图25显示在PBS中的0.4％奥喹多司条件下，在450nm记录的交联瓣的相对荧光：(1)未辐射的对照；(2)以30mW/cm2连续辐射4min(CW)；和(3)以30mW/cm2的脉冲UVA光和O2辐射8分钟(1秒开:1秒关)。
在暴露于UVA后，角膜胶原变得更硬并在450nm获得荧光。因此，奥喹多司是有效的水溶性交联剂。
以核黄素和叶酸交联
如图16所示的叶酸(FA)或维生素B9被美国食品和药品管理局根据21CFR§172.345(f)特别地认为是安全的药食成分之一。FA本身不具有强荧光而且不能有效地敏化单线态氧的形成(最可能是因为对氨基苯甲酰基谷氨酸取代基涉及由单线态激发状态的非辐射失活引起的内部荧光淬灭，导致无效的系统间交叉)。然而，UV辐射引起FA氧化，导致形成6-甲酰基蝶呤和随后形成蝶呤-6-羧酸(PCA)，如图17所示。
PCA是单线态氧的有效光敏剂和生成剂。因此，FA和PCA二者都能产生胶原交联。FA可以与核黄素组合使用，因为核黄素的添加明显地加强FA的氧化，而大部分核黄素保持不分解。
FA溶于水，取决于pH和温度。在以下研究中，例如其在磷酸盐缓冲液中的溶解度为在25℃下5.5mg/ml且最终溶液的pH为7.0。FA在400nm以下具有UV光吸收(如图18所示的360nm处的长波峰)，在460nm附近具有最大荧光(如图19所示)。图20显示FA在360nm的FA吸光度，其为FA在磷酸盐缓冲液中浓度的函数。
A.材料和方法
在前一夜将猪眼在冰上从屠宰场(SiouxPreme,Sioux City,IA)运送来，在盐水中清洗。将眼清理干净并除去上皮。磷酸钠缓冲液(pH 7.6，以磷酸二氢钠和氯化钠在蒸馏水中制成)用作所有溶液的缓冲液。核黄素溶液、FA溶液以及它们的混合物的最终pH值为7.3-7.4。在设置在37℃的培养箱中，以0.1％FA、0.1％核黄素或0.1％FA+0.1％核黄素浸泡眼睛20分钟，通过使用橡胶环使溶液保持在眼睛上面。在辐射前，将眼睛置于培养室中充满纯氧的烧杯中，保持2分钟。以365-nm光源(UV LED NCSU033B[T]；Nichia Co.,Tokushima,Japan)用平顶光束(3％均方根)以选定的辐照度(30mW/cm2，脉冲1秒开:1秒关)对角膜进行全角膜辐射，持续8分钟，所述辐照度是用功率传感器(model PD-300-UV；Ophir,Inc.,Jerusalem,Israel)在角膜表面测量的。借助Intralase飞秒激光器(Abbot MedicalOptics,Santa Ana,CA)，从眼睛切除角膜瓣(约200μm厚)。用超声厚度计(DGH Technology,Exton,PA)计算角膜瓣的平均厚度，其为从眼睛切除之前和之后的测量值的差。使用具有5个齿的跨距3mm宽度的biorake附件，将瓣放入双向伸长计(CellScale Biotester 5000,Waterloo,ON)中。在37℃于盐水中以4μm/s的恒定速率拉伸各样品直至样品破坏。将瓣用蒸馏水洗涤两次，用滤纸干燥，用dH2O洗涤两次，然后真空干燥直至重量变化变成小于10％(回转叶片式真空泵RV3A652-01-903,BOC Edwards,West Sussex,UK)。将各瓣用在1ml木瓜蛋白酶缓冲液[BBBS(pH 7.0-7.2),2mM L-半胱氨酸和2mM EDTA]中的2.5单位/ml的木瓜蛋白酶(来自Papaya latex,Sigma)在65℃下消化2.5小时。将木瓜蛋白酶消化物以2200xG(Mini centrifuge 05-090-100,Fisher Scientific)离心5秒，用1XBBBS稀释0.5倍，并且在QM-40分光荧光计(Photon Technology Int.,London,Ontario,Canada)中在λex＝360nm激发下测量溶液的荧光。通过在不存在组织的情况下测量荧光并将该值从样品的荧光中减去而将木瓜蛋白酶缓冲液的荧光考虑在内。
B.结果/结论
图21显示以下角膜样品的移位vs.力：(1)未暴露于UV光；(2)0.1％核黄素，暴露于UV光；(3)0.1％FA，暴露于UV光；以及(4)0.1％核黄素和0.1％FA的混合物，暴露于UV光，其中UV暴露为365nm,30mW/cm2,1秒开:1秒关脉冲，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
图22显示以木瓜蛋白酶消化后，以下角膜样品的荧光(360nm激发)：(1)未暴露于UV光；(2)0.1％核黄素，暴露于UV光；(3)0.1％FA，暴露于UV光；以及(4)0.1％核黄素和0.1％FA的混合物，暴露于UV光，其中UV暴露为365nm,30mW/cm2,1秒开:1秒关脉冲，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
如图21所示，UV光暴露对角膜胶原的作用对于所有三组研究溶液(0.1％核黄素、0.1％FA、以及0.1％核黄素和0.1％FA的混合物)而言非常相似。与未暴露的对照相比，用溶液浸泡然后将其暴露于UV导致角膜样品的显著变硬。图22显示，与未暴露于UV的对照样品相比，交联胶原样品的荧光增加。
如上所述，也预期FA还可以用作主要交联剂(没有核黄素)。
C.附加实验
当FA溶于含有在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素(以
Figure BDA0001363850040000321
PHOTREXA ZDTM获得)的制剂溶液时，进行了附加实验。图23显示以下角膜样品(厚度300um，每组3个样品)的移位vs.力曲线：(1)未保护于UV光的对照；(2)在缓冲液中的0.1％FA，暴露于UV光；(3)在缓冲盐水溶液中的0.1％核黄素，暴露于UV光；以及(4)在缓冲盐水溶液中的0.1％FA和0.1％核黄素的混合物，暴露于UV光；其中UV暴露为365nm,30mW/cm2,1秒开:1秒关脉冲，共持续8分钟，角膜上为氧气氛。
其他交联剂
药物氯喹、羟氯喹和地布卡因在水溶液中可以具有光敏化能力，例如通过用365nmUV光辐射。氯喹、羟氯喹和奎宁与一般类别的喹喔啉有关。根据本公开的方面，基于其光敏化能力，这些药物可以在角膜治疗中用作交联剂。
如图62所示的甲氨蝶呤是一种免疫抑制药的通用名，其已用于治疗某些癌症以及诸如类风湿性关节炎和葡萄膜炎的炎性疾病。与FA类似，MTX(甲氨蝶呤)在360nm具有明显的UV光吸收。将MTX用作可能的胶原交联剂的想法来自于在兔眼结膜(conjunctive)上测得的有关MTX光敏化性质的数据。
已经对如图63所示的甲萘醌(维生素K3)观察到了显著的胸苷UVA光敏作用，而且在三线态甲萘醌和胸苷之间的单电子转移反应之后发生光氧化产物5,6-二羟基-5,6-二氢胸苷的形成。甲萘醌可以是UVA光敏剂，并因此可以是胶原交联剂。
因此，在研究中鉴定和描述了多种用于交联治疗的药剂和添加剂。所述多种药剂和添加剂的特征可以有利地用于在眼睛的交联治疗中施用的制剂中。在一些实施方案中，核黄素与铁(II)组合以提高核黄素产生的交联活性。在其他实施方案中，交联治疗使用铁(II)溶液与过氧化氢预浸泡的联合。在又一实施方案中，使用2,3-丁二酮以增加诸如核黄素的光敏剂的角膜交联效力。在其他实施方案中，使用叶酸与诸如核黄素的光敏剂联合以增强交联活性。在另外的其他实施方案中，使用3-丁二酮、叶酸、喹喔啉、喹啉、地布卡因、甲氨蝶呤、甲萘醌或其衍生物作为交联剂。
如上文所述，根据本公开的一些方面，上文描述和说明的方法的一些或全部步骤可以在控制器(例如，控制器120)的控制下自动化或被引导。一般来说，控制器可以作为硬件和软件元件的组合而实现。硬件方面可以包括可操作地偶联的硬件组件的组合，包括微处理器、逻辑电路、通信/网络端口、数字滤波器、内存或逻辑电路。控制器可以适于进行计算机可执行代码指定的操作，所述计算机可执行代码可以储存在计算机可读取介质上。
如上文所述，控制器可以是可编程的处理装置，如外部常规计算机或机载(on-board)现场可编程门阵列(FPGA)或数字信号处理器(DSP)，其执行软件，或者储存指令。一般来说，本公开的实施方案采用的用于任何处理或评价的物理处理器和/或机器可以包括根据本公开的示例性实施方案的教导编程的一个或多个网络或非网络一般目的计算机系统、微处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、数字信号处理器(DSP)、微控制器等，如计算机和软件领域技术人员理解的。物理处理器和/或机器可以与图像捕获装置外部联网，或者可以集成至图像捕获装置内。如软件领域技术人员理解的，基于示例性实施方案的教导，普通技术程序员可以容易地准备适当的软件。此外，如电子领域技术人员理解的，示例性实施方案的装置和子系统可以通过准备专用集成电路或通过互相连接常规组件电路的适当网络实现。因此，示例性实施方案不限于硬件电路和/或软件的任何特定组合。
储存在任何一个计算机可读取介质或计算机可读取介质的组合上，本公开的示例性实施方案可以包括控制示例性实施方案的装置和子系统、驱动示例性实施方案的装置和子系统、使得示例性实施方案的装置和子系统能够与人类用户互动等的软件。这样的软件可能包括但不限于装置驱动程序、固件、操作系统、开发工具、应用软件等。这样的计算机可读取介质可以进一步包括本公开的实施方案的计算机程序产物用于进行执行中进行的全部或部分(如果处理是分布的)处理。本公开的示例性实施方案的计算机代码装置可以包括任何合适的可解释或可执行的代码机制，包括但不限于脚本、可解释的程序、动态链接库(DLL)、Java类和小程序、完整的可执行程序等。此外，本公开的示例性实施方案的处理的部分可以为了更好的性能、可靠性、成本等分布。
计算机可读取介质的常见形式可以包括例如软盘、可折叠磁盘、硬盘、磁带、任何其他合适的磁性介质、CD-ROM、CDRW、DVD、任何其他合适的光学介质、穿孔卡片、纸带、光学标记表、任何其他合适的具有孔或其他光学可识别标记模式的物理介质、RAM、PROM、EPROM、FLASH-EPROM、任何其他合适的存储器片或盒、载波或者计算机可以读取的任何其他合适的介质。
虽然已参考一个或多个实施方案描述本公开，本领域技术人员会认识到可以对其进行许多改变而不背离本公开的精神和范围。这些实施方案及其明显变化中的每个均被考虑落在本公开的精神和范围内。还考虑根据本公开的方面的额外实施方案可以组合任何数量的来自本文所述任何实施方案的特征。

Claims (9)

1.用于向眼的角膜施加治疗的组合物，所述组合物包含：
0.1％核黄素，其响应于对光活化光的暴露而在所述角膜中产生交联活性；
0.5mM FeSO4；以及
0.25mM柠檬酸盐缓冲液。
2.权利要求1的组合物，其中所述FeSO4溶于所述柠檬酸盐缓冲液。
3.权利要求1的组合物，其中所述光活化光是紫外光。
4.组合物在制备用于向眼的角膜施加治疗的药物中的用途，其中所述组合物包含：0.1％核黄素，其响应于对光活化光的暴露而在所述角膜中产生交联活性；0.5mM FeSO4 ；以及0.25mM柠檬酸盐缓冲液。
5.权利要求4的用途，其中所述FeSO4溶于所述柠檬酸盐缓冲液。
6.权利要求4的用途，其中所述光活化光是紫外光。
7.权利要求4的用途，其中所述光活化光是脉冲的。
8.权利要求4的用途，其中所述光活化光是连续的。
9.权利要求4的用途，其中所述治疗包括向所述眼施用选定浓度的氧，所述选定浓度大于空气中的氧浓度。
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