KR102234258B1 - 안압이 상승된 동물 모델, 그의 제조방법 및 그를 이용한 녹내장 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

안압이 상승된 동물 모델, 그의 제조방법 및 그를 이용한 녹내장 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 안압이 상승된 동물 모델, 그의 제조방법 및 그를 이용한 녹내장 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 일 구체예에 따라, 리보플라빈 및 자외선을 이용하여 안압이 상승된 동물 모델을 제조할 수 있고, 그에 의해 제조된 동물 모델은 상승된 안압이 12주 이상 동안 지속되어, 녹내장의 발병기전 및 치료에 관해 연구하는데 유용하고, 녹내장 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝에 이용될 수 있다.

Description

안압이 상승된 동물 모델, 그의 제조방법 및 그를 이용한 녹내장 치료제의 스크리닝 방법{Animal model having increased intraocular pressure, method of producing the same and uses thereof}
본 발명은 안압이 상승된 동물 모델을 제조하는 방법, 그 방법에 의해 제조한 안압이 상승된 동물 모델 및 안압이 상승된 동물 모델을 이용하여 녹내장의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
녹내장은 전세계적으로 백내장, 당뇨성 망막증과 함께 실명의 큰 원인을 차지하며, 가장 흔한 안과 질환 중의 하나로서 안압 상승을 비롯한 여러 가지 원인에 의하여 망막신경절세포와 그 축삭의 변성이 발생하며 이에 따라 시야의 결손이 나타나게 되는 시신경병증이다. 녹내장 발생의 여러 가지 위험요인 중 안압은 우리가 조절할 수 있는 유일한 주요 위험인자이다. 또한 안압이 정상인 녹내장 환자에서조차 안압을 떨어뜨리는 것은 녹내장의 진행을 늦추는 것으로 알려졌다.
따라서 안압을 낮추는 것은 녹내장의 예방 및 치료에 중요하다. 녹내장의 연구를 위해 실험 동물 모델을 대상으로 안압을 상승시키는 방법으로는 상공막정맥을 폐쇄시키는 방법, 레이저 섬유주 성형술을 시행하거나, 작은 구슬을 주입하여 방수유출로를 폐쇄하는 방법, 또는 스테로이드를 투여하는 것 등이 알려져 있다. 다만 이러한 방법들에 의하면 오랜 기간 안압 상승을 유지할 수 없거나 시술에 따른 부작용 등이 발생한다.
이에 본 발명자들은 충분한 기간 동안 안정적으로 안압 상승을 유지할 수 있는 동물 모델을 제조하고, 이 모델을 이용하여 안압을 저하시키는 물질을 스크리닝할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0125209호
본 발명의 목적은 리보플라빈 및 자외선을 이용하여 안압이 상승된 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 리보플라빈 및 자외선을 이용하여 제조한 안압이 상승된 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 안압이 상승된 동물 모델을 이용하여, 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 녹내장 예방 또는 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
동물의 안구 전방(anterior chamber)에 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및
리보플라빈을 포함하는 조성물이 투여된 동물의 안구에 자외선을 조사하는 단계를 포함하는 안압이 상승된 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
통상적으로, 정상 안압의 평균범위는 10 내지 21mmHg이고, 21mmHg 또는 2.8kPa를 초과하여 안압 상승이 지속될 경우, 망막 신경절 세포의 손실을 동반하고 시신경을 손상시켜 녹내장이 발병할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델은 상기 방법을 수행하지 않은 대조군보다 5 내지 20mmHg 이상, 5 내지 15mmHg 이상, 10 내지 15mmHg 이상 또는 10mmHg 이상 안압이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델은 상기 방법을 수행하지 않은 대조군 대비 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 30% 내지 200%, 30% 내지 180%, 50% 내지 180%, 60% 내지 180%, 70% 내지 180%, 80% 내지 180%, 90% 내지 180%, 또는 100% 내지 180% 안압이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델에서 상기 방법을 수행하지 않은 대조군 대비 안압 상승률이 30% 내지 200%, 30% 내지 180%, 50% 내지 180%, 60% 내지 180%, 70% 내지 180%, 80% 내지 180%, 90% 내지 180%, 100% 내지 180%, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 100% 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 안압 상승률은 하기 수학식 1에 의해서 계산된 것일 수 있다.
Figure 112019010123191-pat00001
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델에서 3주 내지 20주 동안, 4주 내지 20주 동안, 5주 내지 20주 동안, 6주 내지 15주 동안, 8주 내지 15주 동안, 10주 내지 12주 동안, 8주 동안, 10주 동안, 12주 동안, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 또는 12주 이상 상승된 안압이 유지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 동물의 안구 전방(anterior chamber)에 주사 또는 주입하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 리보플라빈을 포함하는 조성물은 주사제, 점안제, 안연고제, 안구 삽입제형을 포함하나 이에 한정되지 않는 어떤 투여 경로에 적합한 여러 형태일 수 있고 이를 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하는 단계는 주사기를 이용하여 동물의 안구 전방(anterior chamber)에 직접 리보플라빈을 포함하는 조성물을 주사하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물이 주사제로서 투여되는 경우 용해제，등장화제，현탁화제, 유화제，안정화제，또는 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물에 사용될 수 있는 적합한 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 인산염 완충 식염수(Phosphate-Buffered Saline; PBS) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물은 멸균된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물이 주사제로서 투여되는 경우 쉽게 주사를 놓을 수 있을 정도의 유체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물을 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈(riboflavin)은 식물과 많은 미생물 군집에 의해 생성된 수용성 비타민으로 식용으로 사용할 수 있으며 무독성, 생체적 합성, 생분해성 등 여러 특성을 가지는 천연 광개시제이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈은 자외선, 가시광선 영역에서 흡수 스펙트럼을 나타내기 때문에 다양한 광반응을 유도하는 개시제로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈과 자외선이 반응하면 활성산소가 만들어지고 이 활성산소가 콜라겐원섬유(collagen fibril)의 아미노 그룹간 공유결합을 유도하게 되어 안내의 방수(aqueous humor)의 배출을 방해할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물은 0.1 내지 0.9%(w/v), 0.2 내지 0.8%(w/v), 0.3 내지 0.7%(w/v), 0.4 내지 0.6%(w/v), 0.5 내지 0.6%(w/v) 또는 0.5%(w/v)의 리보플라빈을 함유하는 것일 수 있다. 1.0%(w/v) 이상 리보플라빈을 함유하는 조성물을 안구 전방에 투여하는 경우에는 동물 모델의 안구에서 각막손실, 각막이상 및/또는 안구팽창 등의 부작용이 있고, 안압 상승이 지속적으로 유지될 수 없으며 지속적으로 유지되는 고안압에 의해 발생되는 시신경 손상 또는 녹내장의 발생기전을 살펴보기 위한 모델로서 적합하지 않다.
본 발명에서,"중량/부피 퍼센트" 또 는"%(w/v)"은 용액 부피에 대한 용질의 질량으로 계산된 용액 내 용질의 질량 퍼센트를 나타내는 것으로，일 예로 1%(w/v) 조성물은 100L 조성물 내 1g의 용질이 용해되어 있는 것을 의미한다. 예를 들면 0.5%(w/v)의 리포플라빈을 포함하는 조성물은 100L의 조성물에 0.5g의 리보플라빈이 용해되어있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 리보플라빈을 포함하는 조성물은 전체 조성물의 부피 기준으로 0.1 내지 0.9중량%(w/v %), 0.2 내지 0.8중량%(w/v %), 0.3 내지 0.7중량%(w/v %), 0.4 내지 0.6중량%(w/v %), 0.5 내지 0.6중량%(w/v %) 또는 0.5중량%(w/v %)의 리보플라빈을 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 자외선 조사는 100nm 내지 400nm, 150nm 내지 400nm, 200nm 내지 400nm, 또는 315nm 내지 400nm의 파장에서 수행될 수 있다. 상기 범위의 파장에서 자외선을 조사함으로써 리보플라빈과 반응하여 광중합반응을 구현할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안구에 조사되는 자외선의 강도는 1 내지 100mW/cm2, 1 내지 80mW/cm2, 3 내지 80mW/cm2, 3 내지 70mW/cm2, 3 내지 60mW/cm2, 3 내지 50mW/cm2, 3 내지 30mW/cm2, 3 내지 20mW/cm2, 또는 9 내지 18mW/cm2 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 자외선을 조사하는 단계는 2 내지 100J/cm2, 2 내지 90J/cm2, 2 내지 80J/cm2, 2 내지 70J/cm2, 2 내지 60J/cm2, 5 내지 60J/cm2, 5 내지 50J/cm2, 5 내지 50J/cm2, 10 내지 50J/cm2, 10 내지 45J/cm2, 10 내지 40J/cm2, 10 내지 30J/cm2, 15 내지 30J/cm2, 16 내지 27J/cm2 또는 16.2 내지 27J/cm2 의 에너지 양으로 자외선을 조사하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 자외선을 조사하는 단계는 5 내지 100J, 10 내지 80J, 10 내지 60J, 12 내지 50J, 12 내지 45J, 12 내지 40J, 15 내지 40J, 15 내지 35J, 15 내지 30J, 16 내지 27J 또는 16.2 내지 27J의 에너지 양으로 자외선을 조사하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 동물 모델의 안구에 조사되는 단위 면적당 자외선의 광량(에너지 양)은 15 내지 30J/cm2 또는 16.2 내지 27J/cm2일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자외선을 조사하는 단계는 동물의 안구 전방에 주입되었던 리보플라빈이 섬유주(trabecular meshwork)를 통해 배출될 때 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 자외선을 조사하는 단계는 상기 리보플라빈을 투여하는 단계 후 5분 내지 20분, 5분 내지 18분, 7분 내지 18분, 5분 내지 15분, 10분 내지 20분, 또는 10분 내지 15분 경과시 수행되는 것일 수 있다.
리보플라빈을 안구 전방에 투여한 직후 자외선을 조사하면, 리보플라빈이 안구 전방으로부터 배출되기 전 광중합이 일어나, 안구 팽창 및 염증 없이 안압 만을 상승시킬 수 없고, 안압 상승의 효과가 미미하다. 또한, 리보플라빈을 투여하고 20분을 초과한 후 자외선을 조사하면, 리보플라빈이 배출이 완료된 후에 광중합이 일어나 효과적으로 방수(aqueous humor)의 배출을 방해할 수 없어 안압 상승의 효과가 미미하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하기 전에 동물을 마취시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 마취시키는 단계는 예를 들면, 이소플루란(isoflurane)을 이용한 호흡 마취, 케타민 및/또는 자일라진 등의 마취제를 이용한 근육 주사, 또는 프로파라카인, 베녹시네이트 테트라카인, 알카인 등의 점안 마취제를 이용하여 마취하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 행해질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 원숭이, 랫트, 마우스, 또는 토끼인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 방법으로 발생한 안압 상승이 녹내장의 발생기전을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 상기 방법으로 제조된 안압이 상승된 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델은 상기 방법을 수행하지 않은 대조군보다 5 내지 20mmHg 이상, 5 내지 15mmHg 이상, 10 내지 15mmHg 이상 또는 10mmHg 이상 안압이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델은 상기 방법을 수행하지 않은 대조군 대비 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 110% 이상, 120% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 150% 이상, 30% 내지 200%, 30% 내지 180%, 50% 내지 180%, 60% 내지 180%, 70% 내지 180%, 80% 내지 180%, 90% 내지 180%, 또는 100% 내지 180% 안압이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델에서 상기 방법을 수행하지 않은 대조군 대비 안압 상승률이 30% 내지 200%, 30% 내지 180%, 50% 내지 180%, 60% 내지 180%, 70% 내지 180%, 80% 내지 180%, 90% 내지 180%, 100% 내지 180%, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 100% 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 안압 상승률은 상기 수학식 1에 의해서 계산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압이 상승된 동물 모델에서 3주 내지 20주 동안, 4주 내지 20주 동안, 5주 내지 20주 동안, 6주 내지 15주 동안, 8주 내지 15주 동안, 10주 내지 12주 동안, 8주 동안, 10주 동안, 12주 동안, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 또는 12주 이상 상승된 안압이 유지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 원숭이, 랫트, 마우스, 또는 토끼인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은,
안압이 상승된 동물 모델의 안구에 후보 물질을 투여하는 단계;
후보 물질을 투여한 후 동물 모델의 안압을 측정하는 단계; 및
상기 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 녹내장의 예방 또는 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양상은,
안압이 상승된 동물 모델의 안구에 후보 물질을 투여하는 단계;
후보 물질을 투여한 후 동물 모델의 안압을 측정하는 단계; 및
상기 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 안압을 저하시키는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동물은 원숭이, 랫트, 마우스, 또는 토끼인 것일 수 있다.
본 발명에서, "녹내장"은 안압이 정상(10 내지 21mmHg)보다 상승되어 시신경을 압박하고, 이에 시신경이 손상 또는 파괴됨으로써 시력이 저하 또는 상실되는 안과 질환을 말한다. 따라서 본 발명의 일 구체예에 따른 안압을 저하시키는 물질은 녹내장의 예방 또는 치료를 위한 약물로서 사용될 수 있다. 녹내장은 선천 녹내장, 다른 원인 질환 없이 나타나는 원발 녹내장, 및 외상이나 약제의 부작용 등에 의한 속발 녹내장으로 나눌 수 있다. 선천 녹내장은 선천적으로 방수가 배출되는 우각에 발육 부전이 있고, 이로 인해 방수의 배출이 방해되기 때문에 발생하는 녹내장이다. 원발 녹내장의 경우, 방수가 안구에서 빠져나가는 전방각의 개폐여부에 따라 다시 개방각 녹내장과 폐쇄각 녹내장으로 분류하며 그에 따른 증상이 다르다.
개방각 녹내장은 전방각은 열려 있으나, 방수가 빠져나가는 섬유주의 저항이 증가되어 방수 유출에 장애가 생김으로써, 안압이 상승하게 되는 증상을 보이는 녹내장의 일유형이다. 폐쇄각 녹내장은 전방각의 폐쇄로 방수유출이 이루어지지 않아 안압이 상승하는 증상이 나타나며, 이러한 전방각 폐쇄가 갑자기 발생하는 경우 급성 폐쇄각 녹내장이라고 한다. 이 때에는, 안압이 급격하게 상승하여 심한 눈의 통증과 두통, 구역질, 시력저하가 유발된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, "후보 물질"은 안압을 저하시키는 활성이 있는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 물질로서, 안압을 저하시키는 효능을 나타낼 가능성이 있거나 나타낼 것으로 기대되는 각종 천연물, 화합물 라이브러리, 유전자 또는 단백질 라이브러리 등일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면,　평가 대상이 되는 후보 물질은 통상 점안제로서　안구에 국소적으로 투여될 수 있다. 그러나, 어떠한 투여 경로의 약물 또는 약제도 평가할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 비경구적 또는 경구적으로 투여되는 후보 물질을 평가할 수 있다. 비경구적으로 투여되는 약제의 예로는, 전술된 점안제 이외에 눈 연고제, 주사제, 외용제, 좌제를 들 수 있다. 약물의 투여량은 약물의 성질, 투여 대상의 종류, 연령이나 체중 등의 조건을 기초로 종합적으로 판단하여, 최적의 양을 적절하게 결정해야 하며 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 투여 시기나 투여 회수 등의 투여 조건은 약물의 성질, 시험 및 평가 목적 등에 따라 적절하게 최적이 되도록 설정할 수 있고, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 방법으로서,　동물 모델의 제조 직후, 제조 72시간 후, 1주 후, 3주 후, 5주 후, 7주 후, 10주 후, 12주 후, 15주 후, 또는 20주 후에 1시간 마다 수회 투여하고, 그 때마다 안압계를 이용하여 안압을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 단계는 원하는 목적을 달성시키는 방법이면 어떠한 방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 안압을 측정하는 안압계를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압을 측정하기 위한 안압계로서 접촉식 안압계로서, 골드만 압평 안압계(Goldmann Applanation Tonometer), 리바운드 안압계, 또는 토노펜(Tonopen) 등을 사용하거나, 비접촉식 안압계(Non Contact typed Tonometer)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 안압을 측정하기 위한 안압계로서 설치류의 안압을 측정하기 위해 각막탄성도를 고려하여 제작된 리바운드 안압계를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 안압이 상승된 동물 모델에서는 안압 상승이 지속되어 시신경이 손상될 수 있고, 이는 개방각 녹내장의 발병 과정과 유사하므로, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 녹내장의 예방 또는 치료를 위한 약물의 스크리닝을 위해 안압이 상승된 동물 모델을 이용하여 안압을 저하시킬 수 있는 물질을 선별할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 녹내장은 개방각 녹내장인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 의하면, 리보플라빈 및 자외선을 이용하여 안압이 상승된 동물 모델을 제조할 수 있고, 본 발명의 일 구체예에 따라 제조된 동물 모델은 상승된 안압이 12주 이상 동안 지속되어, 녹내장의 발병 및 치료에 관해 연구하는데 유용하다.
또한, 안압이 상승된 동물 모델을 이용하여 안압을 저하시키는 물질을 선별할 수 있으므로, 용이하게 녹내장 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 리보플라빈을 포함하는 조성물을 안구 전방에 주입한 랫트의 안구에 자외선(UV)을 조사하는 모습을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 리보플라빈(riboflavin, RF) 투여 및 자외선(UV) 조사 후 1주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 구체적으로, 도 2a는 PBS 또는 0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여한 랫트 및 자외선(Diameter 7mm, 18mW/cm2을 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2) 또는 15분(16.2J/cm2) 동안 조사한 후 1주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 도 2b는 리보플라빈의 투여 농도(0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)) 및 자외선 조사 시간(자외선 에너지 양)(5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2))을 달리하여 리보플라빈 투여 및 자외선 조사 후 1주가 지난 랫트의 안구상태를 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 리보플라빈(riboflavin, RF) 투여 및 자외선(UV) 조사 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 구체적으로, 도 3a는 PBS 또는 0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여한 랫트 및 자외선(18mW/cm2)을 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2) 동안 조사한 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 도 3b는 리보플라빈의 투여 농도(0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)) 및 자외선 조사 시간(자외선 에너지 양)(5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2))을 달리하여 리보플라빈 투여 및 자외선 조사 후 3주가 지난 랫트의 안구상태를 나타낸다.
도 4는 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여한 랫트에서 부작용이 일어난 안구를 나타낸다.
도 5는 PBS(0% RF) 또는 0.5%(w/v)의 리보플라빈(0.5% RF)의 투여 및 자외선(UV) 조사 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다.
도 6은 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈(RF)을 투여하거나, 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여하고 자외선(UV)을 5분(5.4J/cm2) 내지 15분(16.2J/cm2) 동안 조사한 랫트에서의 안압 상승률(%)을 측정한 결과를 나타낸다. PBS를 안구 전방에 투여하고 72시간이 경과한 후 측정한 안압을 기준으로 각 실험군에서 안압 상승률(%)을 계산하였다.
도 7a 내지 도 7e는 0.5%(w/v)의 리보플라빈(0.5% R)을 안구 전방에 투여하고, 안구에 자외선(18mW/cm2)을 5분(도 7a, 5.4J/cm2), 10분(도 7b, 10.8J/cm2), 15분(도 7c, 16.2J/cm2), 20분(도 7d, 21.6J/cm2), 또는 25분(도 7e, 27J/cm2) 동안 조사한 랫트에서 측정한 안압을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 안압이 상승된 동물 모델의 제조
1.5 내지 2.0kg의 체중을 갖는 수컷 Sprague Dawley(SD) 랫트(rat, (주)오리엔트바이오)의 안구 전방(anterior chamber)에 31G 인슐린 주사기(BD Becton,Dickinson ultra-FineTMII short needle insulin Syringe 0.25mm(31G) × 8mm)를 이용하여 인산염 완충 식염수(Phosphate-Buffered Saline; 이하 PBS)에 용해시킨 0.5%(weight/volume, 이하 w/v), 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 포함하는 조성물(이하, 0.5%(w/v), 1%(w/v) 또는 2%(w/v) 리보플라빈)을 주사하여 투여하였다.
리보플라빈 또는 PBS를 투여한 뒤 5분 내지 20분 후에 랫트의 안구에 자외선 조사 기기(intacx XL, NanoSigma)를 이용하여 365±5nm의 자외선(7mm diameter, 18mW/cm2)을 0분, 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 15분(16.2J/cm2), 20분(21.6J/cm2) 또는 25분(27J/cm2) 동안 조사하여 광중합을 유도하였다.
각막 손상 및 염증을 방지하기 위해 모든 랫트의 안구에 폴리믹신 B, 네오마이신 및 덱사메타손을 포함하는 안연고를 처치하였다.
리보플라빈을 포함하는 조성물을 안구 전방에 투여하고 5분이 지나지 않아 자외선을 조사하면, 리보플라빈이 안구 전방으로부터 배출되기 전 광중합이 일어나, 안구 팽창 및 염증 없이 안압만을 상승시킬 수 없고, 지속적이고 안정적인 안압상승을 유도할 수 없었다. 또한, 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하고 20분을 초과하여 자외선을 조사하면, 리보플라빈이 배출이 완료된 후에 광중합이 일어나 효과적으로 방수의 배출을 방해할 수 없어 안압 상승의 효과가 미미하였다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 리보플라빈을 포함하는 조성물을 안구 전방에 주입한 랫트의 안구에 자외선(UV)을 조사하는 모습을 나타낸다.
실시예 2. 안정적으로 안압 상승을 유도하기 위한 조건
실시예 2-1. 동물 모델의 안구 관찰
리보플라빈(0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v))만을 투여하거나 자외선(7mm diameter, 18mW/cm2의 세기로 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2))만을 조사한 랫트 및 실시예 1에서 제조한 랫트의 안구를 관찰하였다. 실시예 1과 동일하게 리보플라빈만을 투여하거나 자외선만을 조사한 랫트에도 각막 손상 및 염증을 방지하기 위해 랫트의 안구에 폴리믹신 B, 네오마이신 및 덱사메타손을 포함하는 안연고를 처치하였다.
도 2a 및 도 2b는 리보플라빈(riboflavin, 도면상에 RF로 기재됨) 투여 및 자외선(UV) 조사 후 1주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 구체적으로, 도 2a는 PBS 또는 0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여한 랫트 및 자외선(7mm diameter, 18mW/cm2)을 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2) 또는 15분(16.2J/cm2) 동안 조사한 후 1주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 도 2b는 리보플라빈의 농도(0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)) 및 자외선 조사 시간(자외선 에너지 양)(5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2))을 달리하여 리보플라빈 투여 및 자외선 조사 후 1주가 지난 랫트의 안구상태를 나타낸다.
도 2a 및 2b에 나타난 바와 같이, 1%(w/v) 및 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여한 군에서 자외선 조사 여부와 관계 없이 각막손실이나, 안구팽창, 각막이상 등의 부작용이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
도 3a 및 도 3b는 리보플라빈(riboflavin, 도면상에 RF로 기재됨) 투여 및 자외선(UV) 조사 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 구체적으로, 도 3a는 PBS 또는 0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여한 랫트 및 자외선(18mW/cm2)을 5분, 10분, 또는 15분 동안 조사한 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 도 3b는 리보플라빈의 농도(0.5%(w/v), 1%(w/v), 또는 2%(w/v)) 및 자외선 조사 시간(자외선 에너지 양)(5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2))을 달리하여 리보플라빈 투여 및 자외선 조사 후 3주가 지난 랫트의 안구상태를 나타낸다.
도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 1%(w/v) 및 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여한 군에서 자외선 조사 여부와 관계 없이 각막손실이나, 안구팽창, 각막이상 등의 부작용이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
도 4는 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여한 랫트에서 각막손실, 각막이상, 또는 안구팽창의 부작용이 일어난 안구를 나타낸다.
상기와 같이 안구 이상이 존재하는 개체는 오랜 기간 동안 생존에 문제가 있고, 4주 내지 6주 이상 실험을 진행하기 불가능하여 안락사를 진행하였다. 동물 모델의 안구에 각막손실, 각막이상 또는 안구팽창 등의 부작용이 나타나면, 오랜 기간 동안 안정적으로 안압 상승을 유도할 수 없었다.
도 5는 PBS(도면상에 0% RF로 기재됨) 또는 0.5%(w/v)의 리보플라빈(도면상에 0.5% RF로 기재됨) 투여 및 자외선(UV)을 조사(18mW/cm2의 강도로 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 15분(16.2J/cm2), 20분(21.6J/cm2), 또는 25분(27J/cm2) 동안 조사) 후 3주가 지난 랫트의 안구 상태를 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, PBS 또는 0.5%의 리보플라빈을 함유하는 조성물이 투여된 모든 랫트의 안구에 각막손실, 각막이상, 안구팽창 등의 부작용이 존재하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. 안압 측정
실시예 2-1에 기재된 바와 같이 안구 이상이 존재하는 개체는 오랜 기간 동안 생존에 문제가 있고, 4주 내지 6주 이상 실험을 진행하기 불가능하여 안락사를 진행하였다. 안락사를 진행하기 전, 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여하거나, 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여하고 자외선을 조사(18mW/cm2의 강도로 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2) 동안 조사)한 랫트에서의 안압(Intraocular pressure)을 안압계(tonometer, Icare® TONOLAB rebound tonometer, ICARE FINLAND)를 이용하여 측정하였다.
도 6은 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈(RF)을 투여하거나, 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여하고 자외선(UV)을 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 또는 15분(16.2J/cm2) 동안 조사한 랫트에서의 안압 상승률(%)을 나타낸다. PBS를 안구 전방에 투여하고 72시간이 경과한 후 측정한 안압을 대조군의 안압으로 하여, 하기 수학식 1에 의해 각 실험군에서 안압 상승률을 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112019010123191-pat00002
도 6에 나타난 바와 같이, 72시간 경과시 PBS를 투여한 대조군 대비 다른 실험군에서 안압 상승이 관찰되나 이는 안구의 팽창에 의한 것이고, 시간이 경과할수록 상승된 안압이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PBS를 투여한 대조군에서는 안압이 상승되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한 실시예 2-1에서 살펴본 바와 같이, 1%(w/v) 또는 2%(w/v)의 리보플라빈을 투여한 랫트는 각막손실, 각막이상, 안구팽창 등의 부작용 등이 수반되어 시간이 경과할수록 안락사시킨 개체수가 증가하였다.
동물 모델에서 안압은 스트레스에 영향을 많이 받고, 동물 모델의 안구에 각막손실, 각막이상 또는 안구팽창 등의 부작용이 나타나면, 오랜기간 동안 안정적으로 안압 상승을 유도할 수 없다.
따라서, 실시예 2-1 및 상기 결과로부터 1%(w/v) 또는 2%(w/v) 농도의 리보플라빈을 투여시 개체의 안구에 손상을 일으키고, 효과적이고 안정적으로 안압을 상승시킬 수 없는 것을 알 수 있으므로, 0.5%(w/v)농도의 리보플라빈을 이용하여 후속 실험을 진행하였다.
실시예 3. 안압이 상승된 동물 모델의 안압 측정
전술한 바와 같이, 0.5%(w/v)의 리보플라빈을 포함하는 조성물(이하, 0.5%(w/v)의 리보플라빈)을 안구 전방에 투여하고, 5분 내지 25분 동안 자외선을 조사한 랫트에서는 각막손실, 각막이상, 안구팽창 등의 부작용 등이 수반되지 않았다(도 5). 따라서, 0.5%(w/v)의 리보플라빈을 이용하여 안압이 상승된 동물 모델을 제조하고, 오랜 시간동안 안정적으로 상승된 안압이 유지되는지 여부를 살펴보기 위하여 제조 직전(초기), 제조 후 72시간 내지 12주 경과 후의 기간 동안 동물 모델에서 안압을 측정하였다.
실시예 1의 방법과 같이 0.5%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여하고, 랫트의 안구에 자외선을 조사(18mW/cm2의 강도로 5분(5.4J/cm2), 10분(10.8J/cm2), 15분(16.2J/cm2), 20분(21.6J/cm2) 또는 25분(27J/cm2) 동안 조사)하여 안압이 상승된 동물 모델을 제조하고, 안압(Intraocular pressure)을 안압계(tonometer, icare®TonoLab tonometer)를 이용하여 측정하였다.
표 1 내지 표 10 및 도 7a 내지 도 7e는 0.5%(w/v)의 리보플라빈을 안구 전방에 투여하고, 안구에 자외선(18mW/cm2)을 5분, 10분, 15분, 20분 또는 25분 조사하여 각각 안구에 5.4J/cm2 (도 7a 및 표 1), 10.8J/cm2 (도 7b 및 표 3), 16.2J/cm2 (도 7c 및 표 5), 21.6J/cm2 (도 7d 및 표 7) 또는 27J/cm2 (도 7e 및 표 9)의 자외선을 조사한 랫트 또는 자외선만을 조사한 랫트에서 측정한 안압(mmHg)을 나타내고, 표 2(5.4J/cm2), 4(10.8J/cm2), 6(16.2J/cm2), 8(21.6J/cm2), 및 10(27J/cm2)은 각각의 조건에서 계산한 안압 상승률(%)을 나타낸다.
안압은 스트레스에 영향을 많이 받기 때문에, 상승된 안압이 스트레스에 의한 것인지 확인하기 위해서, 리보플라빈 투여 및 자외선을 조사하지 않은 반대편 안구에서 측정한 안압을 대조군으로서 측정하였다.
상기 수학식 1을 이용하여, 리보플라빈 투여 및 자외선을 조사하지 않은 반대편 안구에서 초기에 측정한 안압(10.1mmHg)을 수학식 1에서의 대조군의 안압으로 하여 안압 상승률(%)을 계산하였다. 표 1, 3, 5, 7, 9 및 도 7a 내지 도 7e에 기재된 결과값은 3개체 이상에서 3회 이상 안압을 측정하여 얻은 평균값(단위: mmHg)을 나타낸다.
Figure 112019010123191-pat00003
Figure 112019010123191-pat00004
Figure 112019010123191-pat00005
Figure 112019010123191-pat00006
Figure 112019010123191-pat00007
Figure 112019010123191-pat00008
Figure 112019010123191-pat00009
Figure 112019010123191-pat00010
Figure 112019010123191-pat00011
Figure 112019010123191-pat00012
표 1 내지 10 및 도 7a 내지 도 7e에 나타난 바와 같이, 자외선만을 조사한 랫트보다 리보플라빈을 투여하고 자외선을 조사한 랫트에서 대체적으로 안압 상승률이 크고, 오랜 기간 동안 안압상승이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 경향성은 16.2J/cm2 이상의 자외선이 조사된 경우(자외선의 조사 시간이 15분 이상인 경우) 더욱 뚜렷이 나타나며, 2주차부터 본 발명의 일 구체예에 따라 제조된 랫트에서 대조군보다 80 내지 100% 이상 안압이 상승된 것으로 나타났고, 상승된 안압은 12주까지 유지되는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 일 구체예에 따라 0.5%(w/v) 리보플라빈을 투여하고, 16.2J/cm2 이상의 자외선이 조사된 경우, 평균적으로 100% 이상의 안압 상승률을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
통상적으로, 안압 상승이 지속될 경우, 망막 신경절 세포의 손실을 동반하고 시신경을 손상시켜 녹내장에 이를 수 있고, 본 발명의 일 구체예에 따라 제작된 동물 모델은 안압 상승의 폭이 크고, 안정적으로 안압 상승이 지속되므로 누적된 안압 상승으로 인한 시신경 손상의 가능성이 높으므로 이는 녹내장의 발병기전 및 치료에 관한 연구에 용이하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 인간을 제외한 동물의 안구 전방(anterior chamber)에 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하는 단계; 및
    리보플라빈을 포함하는 조성물이 투여된 동물의 안구에 15 내지 30J/cm2의 에너지 양으로 자외선을 조사하는 단계를 포함하며,
    상기 자외선을 조사하는 단계는 상기 리보플라빈을 포함하는 조성물을 투여하는 단계 후 5분 내지 20분 경과시 수행되는 것인, 안압이 상승된 동물 모델을 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 0.1 내지 0.9%(w/v)의 리보플라빈을 함유하는 것인 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서 상기 동물은 원숭이, 랫트, 마우스, 또는 토끼인 것인 방법.
  6. 청구항 1, 2 및 5 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 안압이 상승된 동물 모델.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 동물 모델은 12주 이상 상승된 안압이 유지되는 것인 동물 모델.
  8. 청구항 6에 따른 안압이 상승된 동물 모델의 안구에 후보 물질을 투여하는 단계;
    후보 물질을 투여한 후 동물 모델의 안압을 측정하는 단계; 및
    상기 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 안압을 저하시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 개방각 녹내장의 예방 또는 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법.

  9. 삭제
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