CN107198715A - 一种药物组合物及其在制备抗感染药物中的应用 - Google Patents

一种药物组合物及其在制备抗感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物及其在制备抗感染药物中的应用。本发明公开的药物组合物包括人参、生黄芪和肉桂。本发明公开的药物组合物为保元汤的减味方，与保元汤相比，本发明的药物组合物在不含炙甘草的情况下，具有同等的体内抗感染作用和毒副作用。因此本发明的药物组合物与保元汤相比，更经济，更适合在制备抗感染疾病的药物中应用。

Description

一种药物组合物及其在制备抗感染药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种药物组合物及其制备方法，具体涉及该药物组合物在制备抗感染疾病药物中的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛应用及其滥用，越来越多的细菌对抗生素药物出现了不敏感现象，甚至是产生了严重的耐药性。尽管科学家不断研究制造抗菌谱更广、抗菌作用更强的新抗生素，但却仍然不能控制耐药菌的产生和发展。因此，寻找具有抗菌效果的新型药物迫在眉睫。
Ausubel实验室曾利用E.faecalis strains MMH594，OG1RF，OG1RF△fsrB，V583，VS583等感染野生型N2秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，缩写C.elegans)及glp-4(bn2ts)；sek-1(km4)突变株系线虫对6000种合成药及1136种天然提取药进行抗感染药效的筛选，并成功筛选出16种具有高抗感染活性的药物。杨再昌等在Ausubel的实验基础上，利用C.elegans作为模型评估了黄连中药的体内抗感染活性，发现中草药黄连具有体内抗感染作用，而黄连已在感染小鼠实验中证明具有较好的抗感染效果。因此，秀丽隐杆线虫感染模型能够对具有抗感染作用的药物进行有效的筛选。
本发明公开了一种药物组合物，所述的药物组合物包括人参、生黄芪、肉桂，该药物组合物为保元汤的减味方，与保元汤相比，本发明的药物组合物在不含炙甘草的情况下，具有同等的体内抗感染作用和毒副作用。因此本发明的药物组合物与保元汤相比，更经济，更适合在制备抗感染疾病的药物中应用。
发明内容
本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物按重量份，包括人参5份，生黄芪15份，肉桂3份。
优选地，所述的人参为0.125g，生黄芪为0.375g，肉桂为0.075g。
其中，所述的药物组合物的制备方法如下：
a、按比例称取药材人参，生黄芪，肉桂，加蒸馏水，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加与a等体积的蒸馏水，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
优选地，所述的药物组合物的生药浓度为11.5g/L。
本发明还提供了一种药物组合物在制备抗感染药物中的应用。
其中，所述的感染是由粪肠球菌或铜绿假单胞菌引起的。
另外，本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，所述的药物组合物的制备方法如下：
a、按比例称取药材人参，生黄芪，肉桂，加蒸馏水，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加与a等体积的蒸馏水，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
附图说明
图1为不同浓度保元汤对秀丽隐杆线虫SS104-E.faecalis OG1RF感染模型的寿命影响的药效比较。
图2为不同浓度保元汤对秀丽隐杆线虫SS104-E.faecalis OG1RF感染模型寿命的半数致死时间影响的药效比较。
图3为20倍稀释的保元汤及其同倍稀释的拆方药物组合物对秀丽隐杆线虫SS104-E.faecalis OG1RF感染模型寿命影响的药效比较。
图4为20倍稀释的保元汤及其同倍稀释的拆方药物组合物对秀丽隐杆线虫SS104-E.faecalis OG1RF感染模型寿命的半数致死时间影响的药效比较。
图5为20倍稀释的配方2对秀丽隐杆线虫SS104-P.aeruginosa感染模型寿命影响的药效比较。
图6为20倍稀释的配方2对秀丽隐杆线虫SS104-P.aeruginosa感染模型寿命的半数致死时间影响的药效比较。
图7为20倍稀释的保元汤及其同倍稀释的配方1与配方2对秀丽隐杆线虫N2寿命影响的药效比较。
图8为20倍稀释的保元汤及其同倍稀释的配方1与配方2对秀丽隐杆线虫N2寿命的半数致死时间影响的药效比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例一 药物组合物的制备
材料：人参、生黄芪和肉桂购买于兰州惠仁堂药业连锁有限责任公司。
本发明的药物组合物(配方2)包括人参2.5g，生黄芪7.5g，肉桂1.5g。
制备方法：
所述的药物组合物的制备方法如下：
a、称取药材人参2.5g，生黄芪7.5g，肉桂1.5g，加蒸馏水150mL，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加蒸馏水150mL，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容至50mL；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
实施例二 药物组合物的体外抑菌作用
1、生物材料
(1)埃希氏菌属大肠杆菌OP50(E.coli OP50)，购自Caenorhabditis GeneticsCenter(CGC)。
(2)金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213(S.aureus ATCC29213)，购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号29213。
(3)铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853(P.aeruginosa ATCC27853)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号27853。
(4)粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212(E.faecalis ATCC 29212)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号29212。
(5)白色念珠菌Canidia Albicans ATCC 10231(C.albicans ATCC 10231)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号10231。
2、试剂
(1)药物：为实施例一制备得到的药物组合物。
(2)固体BHI(Brain Heart Infusion)培养基成分与制作(以1升为例)(BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司)：
固体BHI培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(3)固体LB(Lysogeny Broth)培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
蛋白胨 10.00g
酵母粉 5.00g
NaCl 10.00g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体LB培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(4)固体MH(Mueller-Hinton)培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
牛肉浸膏 6.00g
可溶性淀粉 1.50g
酸水解酪蛋白 17.50g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体MH培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(5)固体改良马丁培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
蛋白胨 5.00g
K2HPO4 1.00g
酵母粉 2.00g
MgSO4 0.50g
葡萄糖 20.00g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体改良马丁培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(6)固体营养肉汤培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
蛋白胨 10.00g
牛肉浸膏 3.00g
NaCl 5.00g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体营养肉汤培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
3、仪器
高压灭菌锅 (上海申安医疗器械厂)
单人单面净化工作台 (苏州净化设备厂)
恒温培养摇床 (上海一恒科技有限公司)
连续变倍体视显微镜 (上海一恒科学仪器有限公司)
电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)
漩涡搅拌器 (上海精科仪器有限公司)
离心机 (CT15E，日立)
4、实施步骤
(1)菌液培养：
取20μL S.aureus的菌液在营养肉汤固体培养基上划单克隆，37℃培养48h。挑单克隆于150mL营养肉汤液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至培养基混浊。4℃冷藏，备用。
取20μL P.aeruginosa的菌液在LB固体培养基上划单克隆，37℃培养48h。挑单克隆于150mL LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至培养基混浊。4℃冷藏，备用。
取20μL E.coli的菌液在营养肉汤固体培养基上划单克隆，37℃培养48h。挑单克隆于150mL营养肉汤液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至培养基混浊。4℃冷藏，备用。
取20μL E.faecalis ATCC 29212的菌液在BHI固体培养基上划单克隆，37℃培养48h。挑单克隆于150mL BHI液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至培养基混浊。4℃冷藏，备用。
取20μL C.albicans的菌液在改良的马丁固体培养基上划单克隆，37℃下培养48h。挑单克隆于150mL马丁液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养至培养基混浊。4℃冷藏，备用。
(2)牛津杯法体外抑菌实验
设置阴性对照组(无菌蒸馏水)，阳性对照组(0.125g/L左氧氟沙星或100μg/mL制霉素)，药物组合物水煎液实验组。
采用麦氏比浊法用相应菌的液体培养基将菌液稀释至0.5(即细菌数在1.5×108/mL，见表1)。在MH固体培养基板上，涂布200μL菌液，其中菌液包括：S.aureus、P.aeruginosa、E.coli、E.faecalis ATCC 29212(每个菌株设置2～3个平行)。而在马丁固体培养基上涂布200μL C.albicans菌液，同样设置2～3个平行。
待菌液被培养基吸收后，在各个培养基上各放置三个牛津杯，S.aureus、P.aeruginosa、E.coli、E.faecalis ATCC 29212组的菌板分别加入200μL无菌蒸馏水、200μL 0.125g/L左氧氟沙星、200μL药物组合物水煎液；C.albicans组的菌板分别加入200μL无菌蒸馏水、200μL 100μg/mL制霉素、200μL药物组合物水煎液。
放入37℃恒温箱培养，12h后进行观察。若12h后出现明显的抑菌圈，取出S.aureus、P.aeruginosa、E.coli、E.faecalis、C.albicans的各培养基，测量抑菌圈直径(mm)。当抑菌圈直径d≥20mm时定为极敏，记作“+++”；当抑菌圈直径15≤d＜20mm时定为高敏，记作“++”；当抑菌圈直径10≤d＜15mm时定为中敏，记作“+”；当抑菌圈直径d＜10mm时定为低敏或无效，记作“－”。结果见表2。
表1麦氏比浊法
浊度 BaCl2(1.175％，g/L) H2SO4(1％，v/v) 细菌数×108/mL
0.5 0.5mL 99.5mL 1.5
1 1.0mL 99.0mL 3.0
表2药物组合物水煎液的体外抑菌结果
表2中阴性对照组为无菌蒸馏水，阳性对照组为0.125g/L左氧氟沙星(可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌生长)或100μg/mL制霉素(可抑制白色念珠菌生长)，实验组为药物组合物水煎液。
表2中所展示的是阴性对照组、阳性对照组及药物组合物水煎液抑菌圈直径的测量数值。从结果中可以看出，本发明所公开的药物组合物水煎液在该浓度下对五种供试菌均无直接抑制生长作用，说明本发明所研究的药物组合物水煎液在该浓度下无体外抑菌效果。
实施例三 药物组合物及其保元汤的体内抗感染作用与毒副作用
1、生物材料
(1)C.elegans SS104购自Caenorhabditis Genetics Center；基因型为glp-4(bn2)I，在温度为20℃的恒温箱里能正常生长，并繁殖后代，在温度为25℃的恒温箱里生长可诱导不育。
(2)C.elegans N2购自Caenorhabditis Genetics Center；为野生型，在温度为20℃的恒温箱里能正常生长，并繁殖后代。
(3)埃希氏菌属大肠杆菌OP50(E.coli OP50)，购自Caenorhabditis GeneticsCenter，作为C.elegans的食物。
(4)粪肠球菌Enterococcus faecalis OG1RF(E.faecalis OG1RF)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号47077。
(5)铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853(P.aeruginosa ATCC27853)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号27853。
2、试剂
(1)药物：实施例一制备得到的药物组合物水煎液(配方2)；保元汤；配方1；配方3；配方4配方分别为：
保元汤：人参2.5g，生黄芪7.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；
配方1：人参2.5g，生黄芪7.5g，炙甘草2.5g；
配方3：人参2.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；
配方4：生黄芪7.5g，肉桂1.5g，炙甘草2.5g；
制备方法如下：
a、按配方比例称取药材，加蒸馏水150mL，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加蒸馏水150mL，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容至50mL；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
(2)固体NGM(Nematode Growth Medium)培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
NaCl 3.00g
K2HPO4 2.34g
KH2PO4 17.23g
蛋白胨 2.50g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体NGM培养基配制好后，121℃高压恒温灭菌20min，在无菌操作台中加入5g/L胆固醇1mL，1M MgSO4 1mL，1M CaCl2 1mL，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(3)固体BHI(Brain Heart Infusion)培养基成分与制作(以1升为例)(BHI培养基购自青岛海博生物技术有限公司)：
成分 含量
BHI 38.50g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
固体BHI培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(4)改良NGM培养基成分与制作(以1升为例)：
成分 含量
NaCl 3.00g
K2HPO4 2.34g
KH2PO4 17.23g
蛋白胨 3.50g
琼脂粉 17.00g
补充H2O至 1000mL
改良NGM培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5g/L胆固醇1mL，1M MgSO4 1mL，1M CaCl2 1mL，摇匀，趁热倒入已灭菌培养皿。静置等待培养基凝固，备用。
(5)M液配方
成分 含量
Na2HPO4 6.00g
KH2PO4 3.00g
NaCl 5.00g
1M MgSO4 1.00mL
补充H2O至 1000mL
配制好M液之后，121℃下高压恒温灭菌20min，待其冷却，置于室温下，备用。
(6)秀丽隐杆线虫裂解液的配制
取0.32mL的NaClO液体溶于4.68mL的M液，再加入5mL 1M的NaOH溶液，即为秀丽隐杆线虫裂解液。
(7)配制不含药物的BHI培养基
吸取3mL无菌蒸馏水，溶于27mL灭菌之后的BHI培养基中，再把培养基均分至10个35mm的培养皿中。
(8)配制含有不同浓度保元汤水煎液的BHI培养基
吸取3mL的保元汤水煎液溶于27mL灭菌之后的BHI培养基，即为10倍稀释保元汤；吸取4mL的保元汤水煎液溶于4mL的无菌蒸馏水，记为液体1，吸取3mL液体1溶于27mL灭菌之后的BHI培养基，即为20倍稀释保元汤；吸取4mL的液体1溶于4mL的无菌蒸馏水，记为液体2，吸取3mL液体2溶于27mL灭菌之后的BHI培养基，即为40倍稀释保元汤；吸取4mL的液体2溶于4mL的无菌蒸馏水，记为液体3，吸取3mL液体3溶于27mL灭菌之后的BHI培养基，即为80倍稀释保元汤。以此方法得到生药浓度为28g/L、14g/L、7g/L、3.5g/L的10倍稀释的保元汤、20倍稀释的保元汤、40倍稀释的保元汤、80倍稀释的保元汤。
将含不同浓度保元汤的培养基均分至10个35mm的培养皿中。
(9)配制含有不同药物组别水煎液的BHI培养基
分别吸取2mL的不同药物组别水煎液溶于2mL的无菌蒸馏水，记为液体1，分别吸取3mL液体1溶于27mL灭菌之后的BHI培养基，即为20倍稀释的不同药物组别水煎液。
将含20倍稀释的不同药物组别水煎液的培养基均分至10个35mm的培养皿中。
(10)配制不含药物水煎液的改良NGM培养基
吸取3mL无菌蒸馏水，溶于27mL灭菌之后的改良NGM培养基中，把培养基均分至10个35mm的培养皿中。
(11)配制含有20倍稀释的药物组合物(配方2)水煎液的改良NGM培养基
吸取2mL的药物组合物(人参、生黄芪和肉桂)水煎液溶于2mL的无菌蒸馏水，记为液体1。再吸取3mL液体1溶于27mL灭菌之后的改良NGM培养基，即为配方2。
将含配方2的培养基均分至10个35mm的培养皿中。
3、仪器
高压灭菌锅 (上海申安医疗器械厂)
单人单面净化工作台 (苏州净化设备厂)
SPX智能型生化培养箱 (宁波江南仪器厂)
恒温培养摇床 (上海一恒科技有限公司)
连续变倍体视显微镜 (上海一恒科学仪器有限公司)
电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)
漩涡搅拌器 (上海精科仪器有限公司)
离心机 (CT15E，日立)
4、实施步骤
(1)秀丽隐杆线虫的培养：
将秀丽隐杆线虫接在涂布有200μLE.coli OP50的固体NGM培养基上，然后置于20℃的恒温箱中培养，秀丽隐杆线虫长到成虫阶段开始产卵，当固体NGM培养基表面的卵数与幼虫数比例大约1:1时，进行同步化处理。
(2)秀丽隐杆线虫同步化：
挑选含有大量成虫并且有部分虫卵已经孵出的NGM培养基，用M液将秀丽隐杆线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使秀丽隐杆线虫自由沉降至管底，弃上清。根据秀丽隐杆线虫的数量向离心管中加入秀丽隐杆线虫裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7min待秀丽隐杆线虫全部断裂时停止涡旋，并分装于1.5mL离心管中，用M液洗虫卵三次，然后把秀丽隐杆线虫的卵直接加到涂有OP50的含有药物的NGM培养基上。
(一)不同浓度保元汤的体内抗粪肠球菌感染作用
同步化后的C.elegans SS104 25℃恒温箱内生长到L4期时，用M液冲洗下C.elegans SS104，收集在1.5mL离心管中，涡旋5s，1500rpm 2min离心，重复操作两次。将冲洗干净的C.elegans SS104接到涂布有E.faecalis OG1RF固体BHI培养基上，于25℃恒温箱内培养24h。24h之后，将被粪肠球菌感染的C.elegans SS104挑至涂布有E.faecalis OG1RF不含药物的直径35mm的BHI培养基(空白对照组)及各涂布有E.faecalis OG1RF含有不同浓度药物组合物的BHI培养基(实验组)上，每个处理设置3个平行，每个平行35条C.elegansSS104，于25℃恒温箱内培养。每隔24h进行统计各对照组及实验组C.elegans SS104的死活数，直到全部C.elegans SS104死亡。
图1、2中10倍稀释保元汤、20倍稀释保元汤、40倍稀释保元汤、80倍稀释保元汤分别代表10倍稀释的保元汤水煎液(生药量为28g/L)，20倍稀释的保元汤水煎液(生药量为14g/L)，40倍稀释的保元汤水煎液(生药量为7g/L)，80倍稀释的保元汤水煎液(生药量为3.5g/L)。空白对照组是无菌蒸馏水。图1的纵坐标表示感染状态下不同浓度药物处理的C.elegans SS104的生存比例，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中存活的C.elegans SS104数量越多，即药物延长粪肠球菌感染状态下C.elegans SS104的寿命的作用越强，由图1可以看出，在每个时间点，20倍稀释的保元汤处理的C.elegans SS104存活数都最大，且从图2(图中a、b、c、d表示各组之间的差异显著性，相同标记之间没有显著性差异)中的半数致死时间可以看出，20倍稀释的保元汤与其它组别均具有极显著的差异，说明其在延长粪肠球菌感染状态下C.elegans SS104的寿命有明显作用，即说明20倍稀释的保元汤具有较好的体内抗感染效果。
(二)20倍稀释的保元汤及其同倍稀释的拆方药物组合物的体内抗粪肠球菌感染作用
同步化后的C.elegans SS104 25℃恒温箱内生长到L4期时，用M液冲洗下C.elegans SS104，收集在1.5mL离心管中，涡旋5s，1500rpm 2min离心，重复操作两次。将冲洗干净的C.elegans SS104接到涂布有E.faecalis OG1RF固体BHI培养基上，于25℃恒温箱内培养24h。24h之后，将被E.faecalis OG1RF感染秀丽隐杆线虫的C.elegans SS104挑至涂布有E.faecalis OG1RF不含药物的直径35mm的BHI培养基(空白对照组)及各涂布有E.faecalis OG1RF含有20倍稀释的不同药物的BHI培养基(实验组)上，每个处理设置3个平行，每个平行35条C.elegans SS104，于25℃恒温箱内培养。每隔24h进行统计各对照组及实验组C.elegans SS104的死活数，直到全部C.elegans SS104死亡。
图3、4中20倍稀释保元汤、配方1、配方2、配方3、配方4分别代表20倍稀释的保元汤水煎液，20倍稀释的药物组合物(人参、生黄芪和炙甘草)水煎液(生药量为12.5g/L)，20倍稀释的药物组合物(人参、生黄芪和肉桂)水煎液(生药量为11.5g/L)，20倍稀释的药物组合物(人参、炙甘草和肉桂)水煎液(生药量为6.5g/L)，20倍稀释的药物组合物(生黄芪、炙甘草和肉桂)水煎液(生药量为11.5g/L)。空白对照组代表无菌蒸馏水。图3的纵坐标表示感染状态下20倍稀释的不同药物处理的C.elegans SS104的生存比例，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中存活的C.elegans SS104数量越多，即药物延长粪肠球菌感染状态下C.elegans SS104的寿命的作用越强，由图3(图中a、b、c表示各组之间的差异显著性，相同标记之间没有显著性差异)可以看出，在每个时间点，20倍稀释的保元汤处理的C.elegansSS104存活数与配方1和配方2无显著性差异，从图4中的半数致死时间结果也同样可以看出。说明20倍稀释的保元汤与配方1和配方2均具有很好的体内抗感染效果。
(三)20倍稀释的药物组合物(配方2)的体内抗铜绿假单胞菌感染作用
为了观察药物组合物除了能体内抗革兰氏阳性菌粪肠球菌外，是否还能抗革兰氏阴性菌，因此选择铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)进行了探究。
同步化后的C.elegans SS104 25℃恒温箱内生长到L4期时，用M液冲洗下C.elegans SS104，收集在1.5mL离心管中，涡旋5s，1500rpm 2min离心，重复操作两次。将冲洗干净的C.elegans SS104接到涂布有P.aeruginosa固体改良NGM培养基上，于25℃恒温箱内培养24h。24h之后，将感染好的C.elegans SS104挑至涂布有P.aeruginosa不含药物的直径35mm的改良NGM培养基(空白对照组)及涂布有P.aeruginosa含有20倍稀释的保元汤的改良NGM培养基(实验组)上，处理设置3个平行，每个平行35条C.elegans SS104，于25℃恒温箱内培养。每隔24h进行统计各对照组及实验组C.elegans SS104的死活数，直到全部C.elegans SS104死亡。
图5、6中配方2代表20倍稀释的药物组合物(人参、生黄芪和肉桂)水煎液。空白对照组代表无菌蒸馏水。图5的纵坐标表示感染状态下药物组合物配方2处理的C.elegansSS104的生存比例，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中存活的C.elegans SS104数量越多，即药物延长P.aeruginosa感染状态下C.elegans SS104的寿命的作用越强，在每个时间点，配方2处理的C.elegans SS104存活数都比对照组的大，且从图6(图中a、b表示配方2组与空白对照组之间具有显著性差异)的半数致死时间可以清晰地看出，配方2与对照组具有极显著的差异，说明配方2同样也具有较好的体内抗革兰氏阴性菌感染的效果。
(四)20倍稀释的保元汤及同浓度配方1与配方2的毒副作用
因为20倍稀释保元汤与配方1和配方2均具有很好的体内抗感染效果，考虑到药物可能存在毒副作用，影响正常机体。因此进行了毒性评价试验，以此来评价三者的毒副作用。
同步化后的C.elegans N2 20℃恒温箱内生长到L4期时，用M液冲洗下C.elegansN2，收集在1.5mL离心管中，涡旋5s，1500rpm 2min离心，重复操作两次。将冲洗干净的C.elegans N2接到涂布有E.coli OP50固体NGM培养基上，于20℃恒温箱内培养24h。24h之后，将C.elegans N2挑至涂布有E.coli OP50不含药物的直径35mm的NGM培养基(空白对照组)及各涂布有E.coli OP50含有20倍稀释的不同药物组合物的NGM培养基(实验组)上，每个处理设置3个平行，每个平行35条C.elegans N2，于20℃恒温箱内培养。每隔24h进行统计各对照组及实验组C.elegans N2的死活数，直到全部C.elegans N2死亡。
图7、8中20倍稀释保元汤、配方1、配方2分别代表20倍稀释的保元汤水煎液，20倍稀释的药物组合物(人参、生黄芪和炙甘草)水煎液，20倍稀释的药物组合物(人参、生黄芪和肉桂)水煎液。空白对照组代表无菌蒸馏水。图5的纵坐标表示20倍稀释的不同药物组合物处理的C.elegans N2的生存比例，在同一个时间点，此值越大，表明该处理组中存活的C.elegans N2数量越多，即药物毒副作用越低。图7显示，在每个时间点，配方2与20倍稀释保元汤处理的C.elegans N2存活数之间无显著性差异，同时从图8(图中a、b表示各组之间的差异显著性，相同标记之间没有显著性差异)的半数致死时间也可以清晰地看出，配方2与20倍稀释保元汤之间无显著差异。由于配方2在抗感染效果与毒副作用上与保元汤均无显著性差异，说明可以通过对保元汤进行减味，达到相同的体内抗感染效果。
本发明提供的药物组合物(配方2，包含人参、生黄芪和肉桂)在体外无抑菌效果的浓度下，不仅对革兰氏阳性菌的感染有治疗作用，对革兰氏阴性菌的感染同样有治疗作用。说明本发明所提供的药物组合物具有很好的体内抗感染效果。同时，本发明提供的药物组合物与保元汤毒副作用无显著性差异。综上所述，本发明提供的药物组合物可在制备治疗感染疾病的药物中应用。

Claims (7)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物按重量份，包括人参5份，生黄芪15份，肉桂3份。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的人参为0.125g，生黄芪为0.375g，肉桂为0.075g。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的制备方法如下：
a、按比例称取药材人参，生黄芪，肉桂，加蒸馏水，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加与a等体积蒸馏水，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的生药浓度为11.5g/L。
5.如权利要求1-4任一项所述的药物组合物在制备抗感染药物中的应用。
6.如权利要求5所述的药物组合物在制备抗感染药物中的应用，其特征在于，所述的感染是由粪肠球菌或铜绿假单胞菌引起的。
7.一种制备如权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的药物组合物的制备方法如下：
a、按比例称取药材人参，生黄芪，肉桂，加蒸馏水，浸泡20min，煮沸30min；
b、停止加热，冷却后，滤出即得第一次煎煮液；
c、将b所得药渣加与a等体积的蒸馏水，煮沸30min；
d、停止加热，冷却后，滤出即得第二次煎煮液；
e、合并b、d所得煎煮液，定容；
f、将e所得煎煮液在12000rpm，10min条件下离心2次，沉淀药渣，留取上清液；
g、将f所得上清液用0.22μm的无菌滤头过滤除菌即得。
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