CN107174584B - 含哌嗪结构化合物在制备lsd1抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有哌嗪结构的化合物在制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（LSD1）抑制剂中的应用，该化合物的结构通式为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（其中，A为氢、羰基或硫代羰基）或其构型异构体、药用盐；或为

Description

含哌嗪结构化合物在制备LSD1抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及含哌嗪结构化合物在制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（LSD1）抑制剂中的应用。
背景技术
基因的突变可能引起疾病，同样基因活性的变异也可能导致疾病。表观基因蛋白可以通过对DNA甲基化状态的改变或对组蛋白后翻译修饰状态的改变，达到调控基因活性的目的。因此表观基因蛋白的不正常表达或调控可以在不同程度上改变一些重要基因的正常活性，从而导致包括癌症在内的很多疾病。已有报道证实，很多癌症细胞组织的病变都涉及一个或多个表观基因蛋白的非正常表达或调控。所以表观基因蛋白作为药物研发的靶标越来越受到重视。
表观基因蛋白LSD1（Histone Lysine Specific Demethylase 1），即组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1，是一种依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adeninedinulcleotide，FAD）的胺氧化酶，它能够去除组蛋白单、双甲基化的H3K4和H3K9上的甲基（Y. Shi et al.，Cell, 2004，119，941-953）。LSD1的严格调控是发挥机体正常功能所必需的，而LSD1的失调通常与疾病相关联。研究表明LSD1的高表达可以促进非小细胞肺癌的增生、转移和浸润，并与病人预后有显著相关（Lv et al., PLoS ONE, 2012，7：e35065）；LSD1的高表达在原发型肝癌病人也预示不良预后（Zhao et al., World J. Gastroenterol,2012，18，6651-6626）。而失去LSD1会以不依赖于p53或DNMT1的方式，抑制人类结肠癌细胞的增生并改变基因表达（Jin et al., Bio. Chem. J., 2013，449，459-468）。事实上，LSD1在雌激素受体阴性乳腺癌中的高表达，是预示癌症浸润性的生物标记物（Lim et al.,Carcinogenesis, 2010，31，512-520）；而结合雄性激素受体复合激活子和FHL2（four anda half LIM-domain protein 2），利用LSD1的高表达可预测前列腺癌复发的可能性（Kahlet al., Cancer Res., 2006，66，11341-11347）。另外肠道癌细胞的研究还进一步表明，对LSD1的抑制可以诱导癌细胞的凋亡（Ding et al., Br. J. Cancer, 2013，109，994-1003）。这些结果都说明，LSD1可以作为抗癌药物研发的潜在靶标。
在已公布的有关LSD1抑制剂的专利和文献中，大多数早期发明都是利用反苯环丙胺作为分子的核心骨架，在此基础上设计出对LSD1有更好选择性抑制效果的活性分子。其中尤以西班牙的Oryzon Genomics公司最为突出，他们所设计的以反苯环丙胺为核心骨架的抑制剂，极大的提升了其对LSD1抑制效果的选择性，其分子中的反苯环丙胺官能团与LSD1中的FAD发生化学反应而形成共价键。近年来，所发明的越来越多的LSD1抑制剂是基于非共价键设计，例如Utah大学发明的含苯甲酰肼化合物系列，以及郑州大学发明的含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物系列。本发明合成了一系列含哌嗪结构的非共价键抑制剂，对LSD1有较好的抑制效果，可以用于与组蛋白特异性去甲基化酶活性相关的疾病预防和治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含哌嗪结构化合物在制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶（LSD1）抑制剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含哌嗪结构化合物在制备LSD1抑制剂中的应用，所述化合物为式Ⅰ所示结构或其药用盐：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅰ）；
或结构通式为式Ⅱ的化合物或其构型异构体、药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
（Ⅱ）；
其中，A为氢、羰基或硫代羰基；
R1为环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
R2为氢、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；
R3为芳基或杂芳基；
上述取代基中含有0-3个C1-C6烷基、卤素、羟基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、酰基、羧基、苯基、苄基、醚基或羧酸酯基取代。
当A为羰基时，所述化合物为式Ⅲ所示结构或其构型异构体、药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
（Ⅲ）；
当R3为苯基取代时，所述化合物为式Ⅳ所示结构或其构型异构体、药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
（Ⅳ）；
其中，X为羟基、烷氧基或卤素。
当A为氢时，所述化合物为式Ⅴ所示结构或其构型异构体、药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
（Ⅴ）；
当R3为苯基取代时，所述化合物为式Ⅵ所示结构或其构型异构体、药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
（Ⅵ）；
其中，X为羟基、烷氧基或卤素。
所述药用盐包括醋酸盐、硫酸盐、盐酸盐、草酸盐和磷酸盐。
本发明的显著优点在于：经LSD1体外活性试验表明，本发明所提供的含哌嗪结构的化合物对LSD1具有明显抑制作用，可将其作为活性成分制备成LSD1抑制剂，用于与组蛋白特异性去甲基化酶活性相关的疾病预防和治疗。
附图说明
图1为实施例所得化合物-4、10、11、14对HepG2和K562细胞中不同基因表达水平的影响，其中（A）为肝癌HepG2细胞，（B）为急性粒细胞白血病K562细胞。
图2为实施例所得化合物-4、10、11、14对HepG2细胞中H3K4me1和H3K4me2表达的影响，其中（A）为H3K4me1，（B）为H3K4me2。
图3为实施例所得化合物-4、10、11、14对K562细胞中H3K4me1和H3K4me2表达的影响，其中（A）为H3K4me1，（B）为H3K4me2。
图4为实施例所得化合物-4、10、11、14对肝癌HepG2细胞的毒性作用。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
NMR：
仪器产家名称：BRUKER
仪器型号（Model）：AVANCE Ⅱ 400
仪器频率：400 MHz
测试常用的氘代试剂：CDCl3，d6-DMSO
LC-MS：
仪器产家名称：WATERS
仪器型号（Model）：UPLC-SQD
测试常用的溶剂A：0.1%的甲酸水溶液，
测试常用的溶剂B：0.1%的甲酸乙腈溶液。
实施例1
（S）-4-（3-羟基-1-氢-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）的制备
化合物-1具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE016
其具体包括如下步骤：
1）1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）的制备：将3-苯基丙醛（1-1）（5 g，37.3mmol）溶在DMF（50 mL）中，冷至0℃，磁力搅拌下加入三氯乙酸（9.1 g，51.9 mmol）和三氯乙酸钠（10.4 g，55.7 mmol）；反应混合液搅拌下慢慢升到室温，LC-MS跟踪检测反应，直到3-苯基丙醛（1-1）反应完全后，加入乙酸乙酯（50 mL）稀释，然后加入碳酸氢钠水溶液（50mL），滤除固体，分出有机相，水相用乙酸乙酯（20 mL）萃取两次，合并两次萃取液，用饱和食盐水洗两次，用无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩溶剂后，用中压快速硅胶柱层析纯化后得到油状1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）5 g，收率53%，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.34（dd，J=10.0，4.7 Hz，2H），7.29-7.20（m，3H），4.01（ddd，J=10.0，5.4，1.9 Hz，1H），3.03（ddd，J=13.9，9.1，4.8 Hz，1H），2.81（ddd，J=16.8，9.7，5.1 Hz，2H），2.48-2.34（m，1H），2.06-1.95（m，1H）；
2）1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）的制备：将所得1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-2）（2 g，7.9 mmol）溶于二氯甲烷（50 mL），冷至0℃，磁力搅拌下加入Dess-Martin试剂（5 g，11.8 mmol）；反应混合液在0℃下搅拌反应2小时后，加入饱和碳酸氢钠溶液和硫代硫酸钠溶液，反应液搅拌澄清后，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并两次萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩溶剂后，用中压快速硅胶柱层析纯化后得到无色油状1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）1.5g，收率48%；
3）（R）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4）的制备：将所得1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-酮（1-3）（1.1 g，4.4 mmol）、二氯双（4-甲基异丙基苯基）钌（II）（268 mg，0.44 mmol）和（1R,2R）-（-）-N-（对甲基苯磺酰基）-1,2-二苯基乙二胺（320 mg，0.87 mmol）悬浮在无水乙酸乙酯中（10 mL）加入三乙胺（442 mg，4.4 mmol）；反应液用氮气置换三次后，在28℃下磁力搅拌30分钟，然后加入甲酸（1.51 mL），28℃下磁力搅拌过夜；反应加水淬灭，用乙酸乙酯萃取三次，合并三次萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，溶剂减压浓缩后用中压快速硅胶柱层析纯化，得到700 mg无色油状（R）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4），收率64%，1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.37-7.31（m，2H），7.26（dd，J=12.5，7.1 Hz，3H），4.02（ddd，J=10.0，5.4，1.8 Hz，1H），3.03（ddd，J=13.9，9.1，4.8 Hz，1H），2.80（qd，J=11.9，8.5 Hz，2H），2.41（ddd，J=27.3，18.1，11.2 Hz，1H），2.09-1.94（m，1H）；
4）（S）-1-叔丁氧羰基-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6）的制备：将所得（R）-1,1,1-三氯-4-苯基丁-2-醇（1-4）（100 mg，0.4 mmol）、乙二胺（24 mg，0.4 mmol）和苄基三乙基氯化铵（91 mg，0.4 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL）中，冷至0℃，加入氢氧化钠（96 mg，2.4 mmol）的饱和溶液，反应混合液在0℃下磁力搅拌反应17小时后慢慢升到室温，继续反应2小时，然后加入(Boc)2O（87 mg，0.4 mmol）磁力搅拌反应3小时；加入水（2 mL），分液后，水相用二氯甲烷萃取两次，合并两次萃取液，用饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，然后减压浓缩后用制备薄层层析法纯化得到无色油状（S）-1-叔丁氧羰基 3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6） 40 mg，收率33%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）305.2；
5）（S）-1-叔丁氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7）的制备：将所得（S）-1-叔丁氧羰基 3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-6）（40 mg，0.13 mmol）、对甲氧基碘苯（46mg，0.19 mmol）和N,N-二甲基乙二胺（6 mg，0.1 mmol）溶于1,4-二氧六环（3 mL）中，然后加入碳酸钾（54 mg，0.39 mmol）和碘化亚铜（10 mg，0.05 mmol），反应混合液用氮气置换三次后，磁力搅拌下加热到90℃，反应24小时；反应液冷至室温后过滤，滤液减压浓缩后用制备薄层层析法纯化得到36 mg（S）-1-叔丁氧羰基 4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7），收率68%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）411.3；
6）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮盐酸盐（1-8）的制备：将所得（S）-1-叔丁氧羰基 4-（4-甲氧基苯基）-3-氧-2-苯乙基哌嗪（1-7）（36 mg，0.088 mmol）溶于1,4-二氧六环（1mL）中，加入盐酸二氧六环（4N，4 mL），反应混合液室温磁力搅拌反应1小时后，溶剂减压浓缩得到白色固体（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮盐酸盐（1-8），收率100%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）311.3；
7）（S）-4-（3-羟基-1-氢-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）的制备：将3-羟基-1H-吡唑-5-羧酸（30 mg，0.09 mmol）和三乙胺（39 mg，0.38mmol）溶于DMF（2 mL）中，加入HOBT（16 mg，0.11 mmol）和EDCI（46 mg，0.24 mmol），反应混合液室温磁力搅拌20分钟后，加入步骤6）所得（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮盐酸盐（1-8）（30 mg，0.09 mmol），反应混合液磁力搅拌反应48小时后加水淬灭；加入饱和碳酸氢钠水溶液后，用二氯甲烷萃取三次，合并三次萃取液，用饱和食盐水洗一次，然后用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用制备HPLC纯化，得到白色固体（S）-4-（3-羟基-1-氢-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-1）7 mg，收率19%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 421.1。
化合物-1：1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ：12.53（s，1H），7.46-7.07（m，7H），6.95（d，J=8.8 Hz，2H），5.72（s，1H），5.02（s，1H），3.94-3.67（m，5H），3.67-3.40（m，2H），2.76-2.61（m，2H），2.27-2.16（m，2H）。
实施例2
（S）-4-（3-羟基-1-氢-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯乙基哌嗪-2-酮（化合物-2）的制备
化合物-2具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
其具体包括如下步骤：
1）化合物-2（R）-2-苯基-2-对甲苯磺酰氧基乙酸甲酯（2-2）的制备：将D-扁桃酸甲酯（2-1）（1 g，6 mmol）和三乙胺（1.82 g，18 mmol）溶于无水二氯甲烷中（20 mL），反应混合液冷至0℃后，加入对甲苯磺酰氯（1.4 g，7.2 mmol），反应混合液在0℃反应2小时后，加入水（10 mL），分出有机相；有机相用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，溶剂减压浓缩后得到粗产品，用快速硅胶柱层析纯化，得到白色固体（R）-2-苯基-2-（对甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（2-2）1.5g，收率为78%,LC-MS（ESI）：m/z（M+1）321.1；
2）（S）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3）的制备：将所得（R）-2-苯基-2-（对甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（2-2）（500 mg，1.56 mmol）和乙二胺（89 mg，1.48 mmol）溶于甲醇（50 mL），反应混合液加热到50℃反应24小时后，冷至室温，溶剂加压浓缩后，用快速硅胶柱层析分离纯化得到66mg （R）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3），收率24%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）177.2；
3）（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-4）的制备：将所得（R）-3-苯基哌嗪-2-酮（2-3）（66 mg，0.37 mmol）、1-Boc-4-哌啶甲酸（95 mg，0.41 mmol）溶于无水DMF（2mL）中，再加入HBTU（174 mg，0.45 mmol）和DIEPA（145 mg，1.1 mmol）；反应混合液室温磁力搅拌30分钟后加入水和乙酸乙酯，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用制备薄层层析板分离纯化得到73 mg（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-4），收率50%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 388.2；
4）（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5）的制备：将所得（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-4）（40 mg，0.1 mmol）、（4-溴苯氧基）-叔丁基二甲基硅醚（39 mg，0.13 mmol）溶于1,4-二氧六环（3 mL）中，然后加入碳酸钾（43 mg，0.3 mmol）、N,N’-二甲基乙二胺（9 mg，0.1mmol）和碘化亚铜（8 mg，0.04 mmol），反应混合液用氮气置换三次后，磁力搅拌加热到90℃，反应24小时后，反应液冷至室温过滤，滤液减压浓缩后用硅胶快速层析法纯化得到20mg（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5），收率34%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）594.4；
5）（S）-1-（4-羟基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-甲酰基）哌嗪-2-酮（化合物-2）的制备：将所得（S）-1-（N-叔丁氧羰基哌啶-4-甲酰基）-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（2-5）（40 mg，0.07 mmol）溶于二氯甲烷（3 mL）中，加入4N的盐酸二氧六环（3mL）后，室温搅拌反应过夜，溶剂减压浓缩后用制备HPLC分离纯化得到14 mg （S）-1-（4-羟基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-甲酰基）哌嗪-2-酮（化合物-2），收率54%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 379.5。化合物-2：1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ：7.49-7.27（m，5H），7.14（d，J=8.6 Hz，2H），6.77（d，J=8.5 Hz，2H），6.01（s，1H），5.76（s，1H），4.19-4.04（m，1H），3.86-3.64（m，2H），3.57-3.50（m，1H），3.00-2.90（m，2H），2.85-2.77（m，1H），2.70-2.55（m，2H），1.68-1.37（m，4H）。
实施例3
（R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-氨基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3）的制备
化合物-3具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE022
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
其具体包括如下步骤：
1）（S）-2-苯基-2-（对甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）的制备：将L-扁桃酸甲酯（3-1）（1 g，6 mmol）和三乙胺（1.82 g，18 mmol）溶于无水二氯甲烷中（20 mL），反应混合液冷至0℃后，加入对甲苯磺酰氯（1.4 g，7.2 mmol），反应混合液在0℃下反应2小时后，加入水（10 mL），分出有机相；有机相用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，溶剂减压浓缩后得到粗产品，用快速硅胶柱层析纯化，得到白色固体（S）-2-苯基-2-（对甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）1.2 g，收率为41%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）321.1；
2）（R）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3）的制备：将所得（S）-2-苯基-2-（对甲苯磺酰氧基）乙酸甲酯（3-2）（950 mg，2.97 mmol）和乙二胺（175 mg，2.9 mmol）溶于甲醇（50 mL）中，反应混合液加热到50℃后反应24小时，冷至室温，溶剂减压浓缩，用快速硅胶柱层析分离纯化得到150 mg（R）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3），收率29%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）177.2；
3）（R）-1-N-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4）的制备：将所得（R）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-3）（150 mg，0.85 mmol）和三乙胺（172 mg，1.7 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL）中，加入(Boc)2O（278 mg，1.5 mmol），反应混合液室温搅拌2小时后，减压浓缩，硅胶柱层析分离纯化得到220 mg（R）-1-N-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4），收率94%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）277.2；
4）（R）-1-N-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5）的制备：将所得（R）-1-N-叔丁氧羰基-2-苯基哌嗪-3-酮（3-4）（160 mg，0.58 mmol）、（4-溴苯氧基）叔丁基二甲基硅醚（216 mg，0.75 mmol）溶于1,4-二氧六环（3 mL）中，然后加入碳酸钾（239 mg，1.73 mmol）、N,N-二甲基乙二胺（51 mg，0.58 mmol）和碘化亚铜（44 mg，0.23 mmol），反应混合液用氮气置换三次后，磁力搅拌加热到90℃反应24小时后，反应液冷至室温过滤，滤液减压浓缩后用硅胶快速层析法纯化得到150 mg（R）-1-N-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5），收率54%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）483.2；
5）（R）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-6）的制备：将所得（R）-1-N-叔丁氧羰基-4-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-2-苯基哌嗪-3-酮（3-5）（50 mg，0.1 mmol）溶于二氯甲烷（3 mL）中，加入4N的盐酸二氧六环（3 mL），反应混合液室温搅拌反应20分钟后，溶剂减压旋干得到（R）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮的盐酸盐（3-6），收率100%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）383.2；
6）4-羟基-2-硝基-苯甲酸（3-8）的制备：将500 mg 4-羟基-2-硝基-苯甲酸（3-7）悬浮在40%氢溴酸（5 mL）和醋酸（5 mL）的溶液中，反应混合液加热到120℃，反应36小时，冷至室温后，减压浓缩得到粗品；将粗品溶于二氯甲烷中，加饱和碳酸氢钠水溶液搅拌后，分出水相，用1N的盐酸调pH值到2左右，然后用乙酸乙酯萃取，合并的萃取液用饱和的食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩干燥后得到350 mg 4-羟基-2-硝基-苯甲酸（3-8），收率75%；
7）4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9）的制备：将所得4-羟基-2-硝基-苯甲酸（3-8）（120 mg，0.656 mmol）和咪唑（179 mg，2.62 mmol）溶于无水DMF（2 mL）中，加入TBSCl（297 mg，1.97 mmol），反应混合液室温磁力搅拌过夜后，在反应液中加入水和乙酸乙酯，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，用硅胶柱层析分离纯化得到20 mg 4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9），收率69%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）298.2；
8）（R）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-10）的制备：将所得4-（叔丁基二甲基硅氧基）-2-硝基-苯甲酸（3-9）（34mg，0.1 mmol），（R）-1-（4-叔丁基二甲基硅氧基苯基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-6）（39 mg，0.1mmol）溶于无水DMF（2 mL）中，加入HBTU（60 mg，0.15 mmol）和三乙胺（43 μL，0.3 mmol），室温磁力搅拌反应30分钟后加入水和乙酸乙酯，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用制备薄层层析板分离纯化得到32 mg（R）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-10），收率61%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）548.2；
9）（R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-11）的制备：将所得（R）-1-（（4-叔丁基二甲基硅氧基）苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-10）（32 mg，0.06 mmol）溶于THF（2 mL）中，加入四丁基氟化胺（50 mg，0.16 mmol），反应混合液室温磁力搅拌1小时后，加入水和乙酸乙酯，分出有机相，有机相用水洗涤3次，饱和食盐水洗一次后，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩干燥得到20 mg （R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-11），收率80%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）434.2；
10）（R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-氨基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3）的制备：将所得（R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-硝基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（3-11）（20 mg，0.046 mmol）和Pd/C（3 mg）悬浮在乙酸乙酯（5 mL）中，反应液用氢气置换三次后，在氢气球下反应1小时，滤除钯碳后，减压浓缩，用制备HPLC分离纯化得到6 mg（R）-1-（4-羟基苯基）-4-（4-羟基-2-氨基-苯甲酰基）-3-苯基哌嗪-2-酮（化合物-3），收率33%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）404.2。
化合物-3：1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ=9.54（s，1H），9.43（s，1H），7.59-7.37（m，4H），7.37-7.30（m，1H），7.16（d，J=8.7 Hz，2H），6.90（d，J=8.4 Hz，1H），6.78（d，J=8.8 Hz，2H），6.16（d，J=2.2 Hz，1H），6.01（d，J=8.2 Hz，1H），5.90（s，1H），5.32（s，2H），4.01-3.85（m，2H），3.58-3.45（m，2H）。
实施例4
1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（1-甲基-4-羰基咪唑）哌嗪-2-酮（化合物-4）的制备
化合物-4具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
其具体步骤包括：将1-甲基-4-咪唑甲酸（4-1）（265 mg，2.1 mmol）用N,N-二甲基甲酰胺（12 mL）溶解，搅拌下加入N-甲基吗啡啉（850 mg，8.4 mmol），反应液置于冰水浴下慢慢搅拌10分钟，然后慢慢滴入三甲基乙酰氯（277 mg，2.3 mmol），加毕保持冰水浴下搅拌反应30分钟；酸酐完全形成后，冰水浴下慢慢滴入溶解于N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮盐酸盐（4-2）（462 mg，1.8mmol）溶液，加毕，室温搅拌反应1小时，跟踪监测反应；反应结束后，加水淬灭，将反应体系真空浓缩，浓缩物用二氯甲烷萃取，然后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离得到白色固体1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（1-甲基-4-羰基咪唑）哌嗪-2-酮（化合物-4），产率70%，熔点：179-180℃。
化合物-4：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.57（s，1H），7.37（s，1H），7.16（d，J=8.8Hz，1H），6.88（d，J=8.9 Hz，1H），3.87-4.02（bs，1H），3.77（s，1H），3.69（s，1H），3.40-3.65（m，2H），2.82-3.35（m，2H），1.16（d，J =15.2 Hz，1H）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：180.0，168.3，158.2，137.5，136.8，134.8，127.0，126.5，114.4，55.4，40.3，38.5，33.6，27.4，27.1；IR（film） υmax：3467，3114，2945，2357，1651，1610，1545，1510，1429，1366，1322，1247，1167，1074，1030，970，927，835，795，748，664，547；ESI-MS：m/z 329 [M+H]+。
实施例5
4-（4-甲氧基苯甲酰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-5）的制备
化合物-5具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE030
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE032
其具体步骤包括：将对甲氧基苯甲酸（5-1）（76 mg，0.5 mmol）用N,N-二甲基甲酰胺（4 mL）溶解，随后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，422 mg，0.9mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.3 mL，1.8 mmol），加毕室温搅拌反应30~40 分钟，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮盐酸盐（4-2）（116 mg，0.45 mmol）溶液，加毕室温搅拌3小时；反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析，分离得到为白色固体4-（4-甲氧基苯甲酰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-5），产率90%，熔点：156-158℃。
化合物-5：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.43（d，J=8.7 Hz，2H），7.17（d，J=8.9 Hz，2H），6.93（d，J=8.6 Hz，2H），6.91（d，J=8.8 Hz，2H），4.66-5.12（bs，1H），3.86-3.99（m，1H），3.84（s，3H），3.80-3.83（m，1H），3.796（s，3H），3.43-3.63（m，2H），1.63（d，J =7.1 Hz，1H）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：168.7，161.2，158.4，134.6，128.9，127.0，114.6，113.96，55.4，55.4，55.3，50.3；IR（film） υmax：3480，2943，2842，2551，2239，2045，1649，1510，1461，1421，1307，1251，1175，1079，1028，948，916，836，799，732，634，595，522；ESI-MS：m/z377 [M+Na]+。
实施例6
4-（2,4-二甲氧基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-6）的制备
化合物-6具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE034
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
其具体步骤包括：将2,4-二甲基噻唑-5-羧酸（6-1）（121 mg，0.77 mmol）用N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）溶解，随后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，729mg，1.4 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.46 mL，2.8 mmol），加毕室温搅拌反应30~40分钟，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）的1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-2-哌嗪酮盐酸盐（4-2）（180mg，0.7 mmol）溶液，加毕室温搅拌3小时；反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷（15 mL）中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离得到4-（2,4-二甲氧基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-6），产率88%。
化合物-6：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.17（d，J=8.4 Hz，2H），6.92（d，J=8.4 Hz，2H），4.76-5.13（m，1H），4.14-4.54（m，1H），3.82-3.96（m，1H），3.72-3.82（s，3H），3.43-3.71（m，2H），2.69（s，3H），2.45（s，3H），1.63（d，J=6.9 Hz，3H）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：168.1，166.1，162.3，158.5，152.6，134.3，126.9，122.4，114.5，55.4，50.3，29.6，29.2，18.96，17.9，16.2；ESI-MS：m/z 360 [M+H]+。
实施例7
4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7）的制备
化合物-7具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE040
其具体包括如下步骤：
1）3-苯基-哌嗪-2-酮（7-2）的制备：将α-溴苯基乙酸（7-1）（20 g，93 mmol）溶解在无水乙醇（150 mL）中，磁力搅拌下慢慢加入浓盐酸（5 mL），加毕，加热回流反应过夜；将反应液冷却至室温后，减压浓缩得到棕黄色油状物α-溴苯基乙酸乙酯；所得产物直接溶解在无水乙醇（60 mL）中并通过恒压滴液漏斗慢慢加入溶解有乙二胺（11.18 g，186 mmol）的无水乙醇（90 mL）中，加毕，将溶解在无水乙醇（60 mL）中的乙醇钠（185 mmol）加到反应液中，并加热回流16小时；冷却后，通过减压浓缩除去乙醇和过量的乙二胺，浓缩物溶解在水中并用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离（洗脱剂：CH2Cl2：MeOH：NH4OH=20：1：0.2），得白色固体3-苯基-哌嗪-2-酮（7-2）5.736g，产率35%；
2）4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3）的制备：将所得3-苯基-2-哌嗪酮（7-2）（2.3936 g，13.58 mmol）溶解在无水二氯甲烷（65 mL）中，搅拌下加入三乙胺（3.1 mL，22.2mmol），搅拌10分钟后置于冰水浴下继续搅拌，并加入二碳酸二叔丁酯(Boc)2O（3.26 g，14.9 mmol），加毕，搅拌5 分钟后撤去冰水浴，继续在室温下搅拌至反应结束；将反应混合物进行减压浓缩，浓缩物加入乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠溶液进行分层，去除有机相，水相再用乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到白色固体4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3），产率99%，无需纯化，直接进行下一步反应，1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.27-7.47（m，5H），6.40（bs，1H），5.72（bs，1H），4.05（bs，1H），3.46-3.57（m，1H），3.21-3.40（m，2H），1.60（s，3H），1.45（s，9H）；
3）1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）的制备：将对碘苯甲醚（3.095 g，13.2 mmol），所得4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-3）（3.0381 g，11mmol），无水磷酸钾（4.6657 g，22 mmol）和碘化亚铜（423 mg，2.2 mmol）加入100 mL干燥的圆底烧瓶中，加入磁力搅拌子并用螺纹翻口橡胶塞进行密封；使用真空泵交换氮气后，通过注射器加入无水DMF（30 mL），再加入N,N-二甲基乙二胺溶液（0.47 mL）后，将反应混合液油浴加热至70℃，反应24小时后冷却至室温，加压浓缩除去溶剂，加入水溶解浓缩物中的无机盐，并用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物经柱层析分离纯化得到淡黄色固体1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）2.167 g，产率60%；
4）1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）的制备：将所得1-（4-甲氧基苯基）-4-叔丁氧羰基-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-4）（2.167 g，6.6 mmol）溶解在干燥的二氯甲烷（9 mL）中，冰水浴下慢慢加入三氟乙酸（3 mL），混合液在室温下搅拌，TLC检测跟踪至反应完成，然后减压浓缩除去溶剂，浓缩物加入饱和碳酸氢钠溶液进行中和，加入二氯甲烷进行分液并萃取三次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物经柱层析分离纯化得到白色固体1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）1.49g，产率80%；
5）4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7）的制备：将所得2,4-二甲基噻唑-5-羧酸（7-6）（168.7 mg，1.07 mmol）溶解于N,N-二甲基甲酰胺（3 mL）中，随后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，773.8 mg，1.49 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.4 mL，2.3 mmol），加毕室温搅拌反应30分钟，然后冰水浴下慢慢滴加溶解于N,N-二甲基甲酰胺（2 mL）的1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基--哌嗪-2-酮（7-5）（268.4 mg，0.95 mmol）溶液，加毕室温搅拌3小时；反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离得到黄色固体4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-7），产率76%。
化合物-7：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.32-7.50（m，5H），7.19（d，J=8.3 Hz，2H），6.93（d，J=8.3 Hz，2H），5.65-6.40（bs，1H），4.05-4.23（bs，1H），3.81-3.88（m，1H），3.80（s，3H），3.66-3.76（m，1H），3.56-3.65（m，1H），2.63（s，3H），2.42（s，3H）；ESI-MS：m/z 422 [M+H]+。
实施例8
4-（1-氢-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-8）的制备
化合物-8具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE042
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE044
其具体包括如下步骤：将1H-咪唑-4-甲酸（8-1）（175 mg，1.56 mmol）超声溶解于N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）中，随后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，822 mg，1.58 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.54 mL，3.12 mmol），加毕室温搅拌反应30分钟，然后冰水浴下慢慢加入1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮盐酸盐（4-2）（203 mg，0.79 mmol），加毕室温搅拌3小时；反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离得到白色固体4-（1-氢-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-8），产率87%。
化合物-8：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：12.59（bs，1H），7.77（s，1H），7.73（s，1H），7.24（d，J=8.7 Hz，2H），6.94（d，J=8.7 Hz，2H），4.25-6.34（m，2H），3.76-3.88（m，2H），3.75（s，3H），3.51-3.59（m，1H），1.51（bs，3H）；ESI-MS：m/z 315 [M+H]+。
实施例9
4-（1-氢-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-9）的制备
化合物-9具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE046
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE048
其具体包括如下步骤：将1H-咪唑-4-甲酸（9-1）（175 mg，1.56 mmol）超声溶解于N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）中，随后加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，822 mg，1.58 mmol）和N,N-二异丙基乙胺（0.54 mL，3.12 mmol），加毕室温搅拌反应30分钟，然后冰水浴下慢慢加入1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）（223 mg，0.79mmol），加毕室温搅拌3小时；反应结束后，反应体系真空浓缩，浓缩物溶解于二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物进行柱层析分离得到白色固体4-（1-氢-咪唑-4-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（化合物-9），产率78%。
化合物-9：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：12.69（bs，1H），7.79（s，2H），7.49-7.53（m，2H），7.40（dd，J=7.5，7.5 Hz，2H），7.34（d，J=7.4 Hz，2H），7.31（d，J=8.8 Hz，2H），6.97（d，J=8.8 Hz，2H），5.23-6.36（m，1H），3.77-4.57（m，2H），3.76（s，3H），3.27-3.67（m，2H）；ESI-MS：m/z 375 [M-H]-。
实施例10
1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-L-脯氨酰基哌嗪-2-酮（化合物-10）的制备
化合物-10具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE050
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE052
其具体包括如下步骤：将1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（4-2）（0.30 g，1.37mmol）于100 mL单口圆底烧瓶中，加入DMF（15 mL）搅拌至全溶后加入N,N-二异丙基乙胺（2.0 mL，10.96 mmol），室温搅拌反应5分钟后加入Fmoc-L-Pro-OSu（10-1）（2.38 g，5.48mmol），室温继续搅拌反应2小时，体系变浑浊，有白色固体析出，继续搅拌反应过夜；向该反应体系中逐滴加入二乙胺（7.5 mL）以脱除Fmoc，室温搅拌反应2小时，体系析出更多白色固体，TLC跟踪，反应结束；反应液减压浓缩，得微黄色稠状物，硅胶柱层析分离，得白色固体1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-L-脯氨酰基哌嗪-2-酮（化合物-10）0.315g，产率72.5%。
化合物-10：熔点88-89℃。IR（KBr，cm-1） ν：3434，2941，2830，1779，1708，1427，1306，1217，1077，815；1H-NMR（400 MHz，Acetonitrile-d6） δ：7.52（d，J=8.0Hz，2H），6.91（d，J=8.0Hz，2H），5.58~5.54（t，J=8.0 Hz，2H），4.01~3.83（m，4H），3.79（s，3H），3.06~2.83（m，2H），2.11~1.77（m，4H），1.64（s，1H），1.44（d，J=8.0Hz，3H）；13C-NMR（100 MHz，Acetonitrile-d6） δ：172.38，164.43，158.02，136.53，125.86，115.53，59.36，56.08，53.07，48.29，43.07，42.72，31.28，25.02，17.33；MS（ESI） m/z：318.35 [M+H]+。
实施例11
4-（3-羟基-1H-吡唑-5-羰基）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-哌嗪-2-酮（化合物-11）的分析数据
化合物-11具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE054
化合物-11购自ChemBridge试剂公司，CAS：1350985-38-4，ZINC：71774935。化合物为白色固体，熔点：219-221℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-D6） δ：12.03-12.91（m，1H），9.47-11.29（m，1H），7.25（d，J=8.7 Hz，2H），6.95（d，J=8.6 Hz，2H），5.52-6.06（m，1H），3.81-5.33（m，3H），3.76（s，3H），3.27-3.72（m，2H），1.27-1.74（m，3H）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-D6） δ：168.4，161.8，158.1，154.6，146.7，135.6，127.8，114.5，88.8，55.7，55.5，52.4，49.9，17.0；IR（film） υmax：3429，3154，2975，2735，1623，1511，1434，1384，1235，1087，1045，938，823，629；ESI-MS：m/z 331 [M+H]+，353 [M+Na]+。
实施例12
（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-正丙基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12）的制备
化合物-12具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE056
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE058
其具体包括如下步骤：
1）化合物-12（S）-2-苄氧羰基氨基丁酸（12-2）的制备：将（S）-2-（苄氧羰基氨基）丁酸（12-1）（2 g，8.4 mmol），2,2-二甲氧基乙胺（886 mg，8.4 mmol）溶于无水DMF（45 mL）中，加入HBTU（3950 mg，10.21 mmol）和DIEPA（3292 mg，25.0 mmol），反应混合液室温磁力搅拌30分钟后加入水和乙酸乙酯，分出有机相，水相用乙酸乙酯萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用制备薄层层析板分离纯化得到（S）-2-苄氧羰基氨基丁酸（12-2）2.7 g，收率98%.LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 325.2；
2）（S）-1-苄氧羰基-2-乙基-3,4-二氢哌嗪-3-酮（12-3）的制备：在0℃时，将所得（S）-2-苄氧羰基氨基丁酸（12-2）（500 mg，1.54 mmol）分批加入到70%三氟乙酸的水溶液（8mL）中，反应混合液慢慢升到室温，并磁力搅拌过夜，然后缓慢倒入搅拌中的碳酸钠水溶液中，使溶液pH值大于8，并用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到（S）-1-苄氧羰基-2-乙基-3,4-二氢哌嗪-3-酮（12-3）350 mg，收率87%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 261.2；
3）（S）-1-苄氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4）的制备：将所得（S）-1-苄氧羰基-2-乙基-3,4-二氢哌嗪-3-酮（12-3）（100 mg，0.38 mmol）溶于1,2-二氯乙烷中，加入TFA（175mg，1.54 mmol）和三乙基硅烷（112 mg，0.96 mmol）；反应混合液氮气保护下加热回流反应36小时后，减压浓缩得到粗产品，粗品溶于二氯甲烷中，慢慢加入饱和碳酸氢钠溶液，并用二氯甲烷萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用硅胶柱层析纯化得到60 mg（S）-1-苄氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4），收率62%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1）263.2；
4）（S）-1-苄氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5）的制备：将所得（S）-1-苄氧羰基-2-乙基哌嗪-3-酮（12-4）（56 mg，0.2 mmol），4-甲氧基碘苯（65 mg，0.28mmol）溶于1,4-二氧六环（6 mL）中，然后加入碳酸钾（86 mg，0.6 mmol），N,N-二甲基乙二胺（18 mg，0.2 mmol）和碘化亚铜（16 mg，0.08 mmol），反应混合液用氮气置换三次后，磁力搅拌加热到90℃后反应24小时，反应液冷至室温，过滤，滤液减压浓缩后用硅胶快速层析法纯化得到52 mg（S）-1-苄氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5），收率67%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 369.2；
5）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6）的制备：将所得（S）-1-苄氧羰基-4-（4-甲氧基苯基）-2-乙基哌嗪-3-酮（12-5）（52 mg，0.14 mmol）和钯碳（5 mg）悬浮在乙酸乙酯（5 mL）中，用氢气置换三次后，在氢气的条件下室温磁力搅拌2小时，滤除钯碳后，加压浓缩得到（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6），收率100%。LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 235.2；
6）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-叔丁氧羰基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7）的制备：将所得（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-6）（43 mg，0.184 mmol）和N-Boc-D-脯氨醛（37 mg，0.184 mmol）溶于二氯甲烷（2 mL）中，加入三乙酰基硼氢化钠（117 mg，0.552 mmol），反应混合液室温搅拌反应2小时，加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗产品，然后用硅胶柱层析分离纯化，得到 40 mg（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-叔丁氧羰基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7），收率53%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 418.3；
7）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氢吡咯-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-8）的制备：将所得（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-叔丁氧羰基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（12-7）（170 mg，0.41 mmol）溶于二氯甲烷（18 mL）中，加入4N的盐酸二氧六环（18mL）后，反应混合液室温搅拌反应过夜，溶剂减压浓缩后用制备HPLC分离纯化得到（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氢吡咯-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮的盐酸盐（12-8），收率100%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 318.3；
8）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-正丙基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12）的制备：将所得（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（四氢吡咯-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮的盐酸盐（12-8）（60 mg，0.19 mmol）和正丙醛（13 mg，0.23 mmol）溶于二氯甲烷（2mL）中，加入三乙酰基硼氢化钠（117 mg，0.552 mmol），反应混合液室温搅拌反应2小时，加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗产品，经过制备HPLC的分离纯化得到28 mg （S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-正丙基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-12），收率41%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 360.3。
化合物-12：1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.22-7.17（m，2H），6.95-6.91（m，2H），3.82（s，3H），3.77-3.60（m，3H），3.43-3.37（m，1H），3.31-3.23（m，1H），3.17（t，J=4.7 Hz，1H），3.06-2.97（m，1H），2.80-2.71（m，2H），2.40-2.34（m，1H），2.06-2.02（m，2H），1.96-1.89（m，3H），1.86-1.79（m，2H），1.26（t，J=7.0 Hz，3H），1.04-0.94（m，6H）。
实施例13
（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（N-正丙基-四氢吡咯）-2-亚甲基）-3-乙基哌嗪-2-酮（化合物-13）的制备
化合物-13具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE060
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE062
其具体包括如下步骤：
1）1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2）的制备：将吡嗪-2-甲酸盐酸盐（2 g，9.8mmol）和(Boc)2O（8.6 g，39.4 mmol）溶于THF（40 mL）和水（40 mL），加入碳酸氢钠（8.31 g，79.8 mmol），反应混合液室温磁力搅拌4 小时后加乙酸乙酯，倒入分液漏斗分液，分出的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，溶剂减压浓缩后用硅胶柱层析分离纯化得到2.5g 1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2），收率78%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 331.2；
2）1,4-二叔丁氧羰基-2-羟基亚甲基-哌嗪（13-3）的制备：将所得1,4-二叔丁氧羰基哌嗪-2-甲酸（13-2）（500 mg，1.5 mmol）溶于无水THF（10 mL），氮气保护下，逐滴加入硼烷四氢呋喃（4.5 mL，4.5 mmol）后，加热到40℃反应2小时，冷至0℃，逐滴加入甲醇淬灭反应，反应液浓缩干燥后得到470 mg 1,4-二叔丁氧羰基-2-羟基亚甲基-哌嗪（13-3），收率98%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 317.2；
3）1,4-二叔丁氧羰基-2-甲酰基-哌嗪（13-4）的制备：将所得1,4-二叔丁氧羰基-2-羟基亚甲基-哌嗪（13-3）（100 mg，0.32 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL）中，加入戴斯-马丁氧化剂（272 mg，0.64 mmol），反应混合液室温磁力搅拌3小时后，加入碳酸氢钠水溶液和亚硫酸钠水溶液搅拌至澄清，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗产品，然后用硅胶柱层析分离纯化，得到64 mg 1,4-二叔丁氧羰基-2-甲酰基-哌嗪（13-4），收率64%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 314.2；
4）（R）-2-（对甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6）的制备：将（R）-（+）-2-羟基丙酸甲酯（1 g，9.6 mmol）和三乙胺（2.91 g，28.8 mmol）溶于无水二氯甲烷中（32 mL），反应混合液冷至0℃后，加入对甲苯磺酰氯（2.2 g，11.5 mmol），反应混合液在0℃反应2小时后，加入水（16 mL），分出有机相，有机相用饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，溶剂减压浓缩后得到粗产品，用快速硅胶柱层析纯化，得到1.2 g （R）-2-（对甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6），收率49%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 259.2；
5）（S）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8）的制备：将（R）-2-（对甲苯磺酰氧基）丙酸甲酯（13-6）（400 mg，1.55 mmol）和乙二胺（88 mg，1.47 mmol）溶于甲醇（50mL），反应混合液加热到50℃反应24小时后，冷至室温，溶剂加压浓缩后，得到（S）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-7）的粗产品；然后按实施例步骤3）操作得到140 mg （S）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8），两步收率48%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 215.2；
6）（S）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9）的制备：将所得（S）-1-（叔丁氧羰基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-8）（70 mg，0.33 mmol）和4-甲氧基碘苯（100 mg，0.43 mmol）按实施例3步骤4）操作，得到80 mg （S）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9），收率77%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 321.2；
7）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-10）的制备：将所得（S）-1-（叔丁氧羰基）-4-（4-甲氧基苯基）-2-甲基哌嗪-3-酮（13-9）（80 mg，0.25 mmol）按实施例3步骤5）操作，得到（S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮的盐酸盐（13-10），收率100%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 221.2；
8）（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亚甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11）的制备：将所得（S）-1-（（4-甲氧基苯基）-3-甲基哌嗪-2-酮的盐酸盐（13-10）（30mg，0.14 mmol）和1,4-二叔丁氧羰基-2-甲酰基-哌嗪（13-4）（52 mg，0.16 mmol）溶于二氯甲烷（2 mL）中，加入三乙酰基硼氢化钠（89 mg，0.42 mmol），反应混合液室温搅拌反应2小时，加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取，合并萃取液用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩得到粗产品，然后用硅胶柱层析分离纯化，得到47 mg （S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亚甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11），收率67%，LC-MS（ESI）：m/z（M+1） 519.3；
9）（3S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（哌嗪-2-亚甲基）哌嗪-2-酮（化合物-13）的制备：将所得（S）-1-（4-甲氧基苯基）-4-（1,4-二叔丁氧羰基）-2-亚甲基）-3-甲基哌嗪-2-酮（13-11）（47 mg，0.091 mmol）按实施例3步骤5）操作，得到25 mg （3S）-1-（4-甲氧基苯基）-3-甲基-4-（哌嗪-2-亚甲基）哌嗪-2-酮（化合物-13），收率80%。LC-MS（ESI）：m/z（M+1）319.2。
化合物-13：1H-NMR（400 MHz，DMSO） δ：7.20（d，J=8.8 Hz，2H），6.94（d，J=8.7 Hz，2H），3.76（s，3H），3.53-3.39（m，4H），3.24-3.08（m，6H），2.94（s，2H），2.74-2.62（m ，2H），1.39-1.24（m，3H）。
实施例14
6-（4-（2,4-二甲基噻唑-5-羰基）-哌嗪-1-基）-2-甲氧-4-（对甲苯胺基）-吡啶-1-盐（化合物-14）的分析数据
化合物-14具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE064
化合物-14由陶素（上海）生化科技有限公司提供。CAS：1269092-46-7，ZINC:65362942。其测试数据如下：IR（KBr，cm-1） ν：3334，2920，1618，1578，1511，1429，1307，1250，1220，196，999，800；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：8.94（s，1H），7.43（d，J=8.0Hz，2H），7.08（d，J=8.0Hz，2H），5.79（s，2H），3.54（s，8H），3.37（s，1H），2.63（s，3H），2.31-2.24（m，9H）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6） δ：166.17，165.89，162.84，162.28，161.93，150.96，138.58，130.87，129.61，124.45，120.28，81.48，43.83，40.58，26.49，20.86，19.11，16.57；MS（ESI） m/z：423.23[M+H]+。
实施例15
1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-羰基）-哌嗪-2-酮（化合物-15）的制备
化合物-15具有如下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE066
其制备路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE068
其具体包括如下步骤：
1）将N-Boc-4-哌啶甲酸（15-1）（181 mg，0.79 mmol）溶解N,N-二甲基甲酰胺（3mL）中，随后加入N,N-二异丙基乙胺（0.32 mL，1.95 mmol）和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基（PyBop，553 mg，1.06 mmol），加毕，室温搅拌反应30分钟，然后冰水浴下慢慢加入用N,N-二甲基甲酰胺（2 mL）溶解的1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-哌嗪-2-酮（7-5）（200mg，0.71 mmol），加毕，室温搅拌3小时；反应结束后，用保护碳酸氢钠溶液淬灭，乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到油状物（15-2）；
2）将浓缩得到的油状物（15-2）溶解在干燥的二氯甲烷（6 mL）中，冰水浴下慢慢加入三氟乙酸（2 mL），混合液在室温下搅拌，TLC检测跟踪至反应完成，然后减压浓缩除去溶剂，浓缩物加入饱和碳酸氢钠溶液进行中和，加入二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物经柱层析分离纯化得到白色固体1-（4-甲氧基苯基）-3-苯基-4-（哌啶-4-羰基）-哌嗪-2-酮（化合物-15），产率50%。
化合物-15：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6） δ：7.20-7.48（m，7H），6.96（d，J=8.7 Hz，2H），6.03（s，1H），4.09-4.21（m，1H），3.78-3.93（m，1H），3.76（s，3H），3.68-3.75（m，1H），3.52-3.63（m，1H），3.05-3.24（m，2H），2.95-3.05（m，1H），2.70-2.89（m，2H），1.57-1.85（m，4H）；ESI-MS：m/z 394 [M+H]+。
实施例16具体生物测试实施方式
下列试验用于测定本实验化合物作为LSD1体外酶抑制剂、肝癌细胞HepG2和肺癌细胞K562体外增殖抑制剂的活性。
1. LSD1体外酶活性抑制试验
采用购自Enzo Life Science的LSD1荧光药物试剂盒（Instruction Manual BML-AK544）测试实施例化合物对LSD1活性的影响，即以二甲基化的H3-K4肽（H3K4me2）（BML-P256）作为底物。LSD1（BML-SE544）可催化H3K4me2产生H2O2，在CELLestialTM Red基质（BML-KI565）存在的情况下，过氧化氢酶（HRP）可催化H2O2产生荧光信号（激发光波长：530-570nm，发射光波长：590nm）。此荧光信号和LSD1活性呈正相关，荧光强度越强，酶活性越强，实施例化合物对酶的抑制活性越低。
具体来说，以反苯环丙胺为阳性对照，不加任何化合物为阴性对照，每个浓度重复两次，先在384孔板中加入由27.2 μL测定缓冲液，5 μL 0.1μg/μL的LSD1及各个浓度的实施例化合物0.8 μL或dH2O 0.8 μL或反苯环丙胺（TCP）0.8 μL组成的“2×Enzymes”，在室温（23℃）下反应30 分钟，再加入由6.7 μL测定缓冲液，1.6 μL 0.5 mM的H3K4me2，0.4 μL100×CELLestialTM Red和0.8 μL 50×HRP组成的“2×Substrates”后，马上用酶标仪读取荧光值，再软件拟合各个实施例化合物和反苯环丙胺的IC50值，如表1所示。
表1 本发明化合物体外酶抑制实验的活性情况
Figure DEST_PATH_IMAGE070
通过表1的IC50（μM）值可以看出，本发明化合物-10、11、14对LSD1的抑制能力分别是参照化合物TCP的12.8倍，4.6倍，3.4倍，故化合物-10、11、14属于LSD1的高效抑制剂。
2. 本实施例化合物对肝癌HepG2和急性粒细胞白血病（AML）K562细胞内组蛋白第三位赖氨酸一甲基化（H3K4me1）及二甲基化（H3K4me2）的影响测试
分别将HepG2和K562细胞在加入DMEM或RPMI培养基的6孔板中培养，使其细胞浓度达到1×106细胞/孔，以浓度为0.02%的DMSO作为阴性对照，用100 μM本实施例化合物及阳性参照化合物TCP抚育细胞，24小时后收集细胞，通过Western Blot试验ECL方法，分别用非选择性H3抗体、选择性H3K4me1抗体或选择性H3K4me2抗体，检测HepG2细胞及K562细胞中H3K4me1和H3K4me2的表达水平改变，结果如图1所示。用Image J软件对图1中HepG2细胞及K562细胞进行定量分析，分析结果如图2和图3。
从图1（A）可见，在肝癌HepG2细胞试验中，化合物-4、10、11、14及阳性对照化合物TCP对H3K4me1的表达有提高的趋势，TCP及化合物-4、11对H3K4me2有上调作用，组蛋白H3及Beta-actin未显示明显改变。而从图1（B）可见，在急性粒细胞白血病K562细胞试验中，化合物-4、10、11、14及阳性对照化合物TCP对H3K4me1均有上调作用，化合物-4、11、14及TCP对H3K4me2有上调作用。
3. 本实施例化合物对肝癌HepG2细胞的MTT毒性试验
将HepG2细胞加入DMEM或RPMI培养基的96孔板中培养，使其细胞浓度达到1×105胞/孔，以浓度为0.02%的DMSO作为阴性对照，用100 μM本实施例化合物及阳性对照化合物TCP抚育细胞24小时后，按照碧云天公司的MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（C0009）操作要求配制5mg/mL的MTT溶液，每孔加入10 μL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4小时，然后每孔加入100 μL Formanzan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解（通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解），于波长570nm下测定吸光度。根据吸光值，应用Graph Pad Prism5软件绘制图4，得到本实施例化合物对细胞的毒性作用。
从图4可以看出，化合物-4、11、14及阳性对照TCP对HepG2均显示明显的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种含哌嗪结构化合物在制备治疗肝癌或白血病药物中的应用，其特征在于：所述化合物为式Ⅰ所示结构或其药用盐：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅰ）。
2.根据权利要求1所述含哌嗪结构化合物在制备治疗肝癌或白血病药物中的应用，其特征在于：所述药用盐包括醋酸盐、硫酸盐、盐酸盐、草酸盐和磷酸盐。
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