CN107148280A - 用于制备疫苗抗原的方法、所得到的疫苗抗原及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备疫苗抗原的方法，其包括通过使用至少一种式(II)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐之一处理所述生物膜，来片段化与所述疫苗抗原相关的生物膜的步骤：其中：X是‑(CH2)‑CO2Y基团，并且Y是碱金属，其中所述得到的疫苗抗原还包括与所述抗原相关的生物膜的片段。本发明还涉及可以通过实施该方法生产的疫苗，在该疫苗的总重量中以0.1至1,000μg的量包括载体形式的式(II)的杯芳烃。本发明进一步涉及如上定义的杯芳烃在疫苗或疫苗抗原的制备中的用途，并且涉及疫苗在感染性疾病的治疗或预防中作为药物的用途。

Description

用于制备疫苗抗原的方法、所得到的疫苗抗原及用途
技术领域
本发明涉及一种用于制备包含膜蛋白的疫苗抗原的方法，并且还涉及疫苗抗原和疫苗及其用途。
本发明在医疗领域且特别是在疫苗制备领域中具有工业用途。
在下面的描述中，括号([])之间的引用请查阅本文末尾出现的参考文献列表。
背景技术
疫苗接种在于通常通过向人或动物施用疫苗来使人或动物免疫传染病。刺激免疫系统的疫苗保护人或动物免受感染或疾病。
已经确定，人类接种疫苗使得其有能够抵抗和消除可能致命的传染性疾病，并且据估计，这种方式每年防止了超过2至3百万人的死亡。其是在卫生领域中最盈利的投资之一。
疫苗是抗原制剂，其使得能够在接种疫苗的人或动物中诱导致病剂特异性免疫应答，这种免疫应答能够保护它们免受自然感染或减弱自然感染的后果。
流感是一种由流感病毒引起的常见的病毒性呼吸道感染并且在世界各地都能见到，其在温和地区的流行性冬季发作中发展。世界卫生组织(WHO)认为，它们在全世界每年造成300至500万例严重病例和250 000至500 000例死亡(http://www.pasteur.fr/fr/institut-pasteur/presse/fiches-info/grippe#sthash.PwUNmJ10.dpuf)。造成人类病理状况的流感病毒是A型和B型流感病毒。B型流感病毒以谱系形式传播，同时根据主要两种表面糖蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性质，将A型流感病毒以病毒亚型分类。流感病毒在其表面上具有300至800个糖蛋白，这与范围可以是1至10的NA/HA比率相关联。
在人类中传播并且造成季节性流行病的病毒是病毒A(H1N1)和A(H3N2)。由于流感病毒的主要传染源是动物传染源(禽类和猪)，动物病毒可以穿过物种屏障并感染人类。病毒如禽类病毒A(H5N1)和大流行性病毒A(H1N1)可导致严重公共健康问题。
事实上，疫苗接种目前是保护群体免受流感病毒侵害的唯一有效手段。“季节性”疫苗使得可以获得针对季节性传播的病毒A如(H1N1)和(H3N2)以及病毒B的各种谱系的免疫。它每年根据前一年的原型菌株进行定义，并含有A型和B型季节性病毒的抗原。宿主的免疫应答主要是体液型，具有针对病毒的HA和NA蛋白的中和抗体的表达。
由于这两种蛋白质中相当大的抗原迁移，疫苗组合物必须每年重新评估。
用于生产疫苗的常规方法，首先基于通过在A/PR8/34(H1N1)菌株和季节性病毒菌株之间的基因重配，以在蛋上获得用于由WHO确定的每年一次原型A菌株的每一种的疫苗种(vaccine seed)。大多数疫苗制造商通常使用主要来自亲本A/PR/8/34病毒的这些重配病毒。因此，每个疫苗种源自原型A菌株和在蛋中具有最佳复制能力的A/PR8/34(H1N1)病毒之间的基因重配的过程。这种B型病毒的产生直接在蛋上进行，不需要与PR8重配。
病毒颗粒含有八个不同的基因片段，该基因片段由与核蛋白连接并与聚合酶复合物相关的单一RNA链组成，每个基因编码一至三个给定的病毒的蛋白：HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NEP、PB1、PB1F2、PB1N40、PB2和PA。因此，长的选择过程使得可以获得疫苗重配，其至少包含在PR8病毒的遗传背景上编码原型菌株的HA和NA的基因片段(组合物“6+2)。然后，在蛋上扩增由2个原型菌株和亲本A/PR/8/34菌株之间的基因重配产生的2个疫苗重配株。从尿囊生产中提取HA和NA抗原，并任选地与佐剂组合以产生疫苗剂量。
这种用于生产疫苗剂量的工业方法较长(4至6个月)。然而，在生产大流行前疫苗，特别是针对人流感的大流行前疫苗的情况下，WHO已评估，如果要实施防治流感大流行的计划，则大约10亿人将必须接种疫苗。事实上，这样的防治计划将部分地取决于大量且快速生产疫苗的效率。
为了面对针对季节性传播菌株的疫苗的日益增长的需求，并且为了面对难于预测的对针对一种(或多种)潜在大流行性新兴菌株的疫苗的需求，蛋的可用性可以被证明是一个限制因素，尤其是因为禽流感在家畜中的风险仍然存在。然而，在蛋中产生良好产量的B菌株以及一些不是6+2而是5+3或4+4的A型重配体，一直存在困难。
因此，为了减少传播的原型菌株的选择和疫苗剂量生产之间的时间，已经开发了替代策略。也可以在细胞系统中产生流感病毒(Barrett PN,Portsmouth D,EhrlichHJ.Developing cell culture-derived pandemic vaccines.Curr Opin MolTher.2010Feb；12(1):21-30([1])；Le Ru A,Jacob D,Transfiguracion J,Ansorge S,Henry O,Kamen AA.Scalable production of influenza virus in HEK-293cells forefficient vaccine manufacturing.Vaccine.2010May 7；28(21):3661-71([2]))。可以使用工业生物反应器在细胞上进行疫苗菌株的生产及其扩增。实际上，使用细胞系扩增疫苗菌株使得尤其可以不再依赖于“蛋”系统(蛋的数量和生产产量不足以控制大流行)，减少了在尿囊生产中经常观察到的表面抗原修饰，并且不引起过敏。这种策略使得可以更容易地满足在大流行性流感病毒(例如A H1N1)出现期间对疫苗的需求。
尽管如此，这些系统，特别是登记的细胞系(MDCK、Vero、PERC6、EB66等)不提供流感病毒的最佳复制，从而在疫苗种生产方面构成了主要的限制因素。细胞系统中的生产产量目前仍然低于尿囊系统中获得的产量。因此，当前，很少有制造商选择这种新的生产方法，因为当前工业过程远不如蛋那样有效。
为了尽可能多地减少疫苗剂量生产时间并且为了在剂量数量方面获得相当的产量水平，可以通过使用反向遗传技术来获得疫苗种，使得可以更快速地获得“6+2”组成的疫苗重配株，从而消除所有的选择步骤。通过反向遗传学生产重组病毒为有效满足疫苗需求提供了最现实的选择。其次，通过反向遗传学产生重组病毒提供了产生“优化的”PR8病毒的可能性，当通过与原型菌株的基因重配的过程使用时，使得可以产生对于蛋内或细胞内疫苗剂量生产具有优化的病毒特征的疫苗重配株。这种类型的方法也可以应用于细胞内生产。
用于优化尿囊和细胞系统中的疫苗生产的另一策略，旨在基于疫苗种的遗传修饰和/或使用靶向宿主细胞的小化学分子，增加病毒生产的产量。这些方法正在进行评估(FR10/55716([3])、WO 2012007380([4])、FR10/59132([5])、WO 2012059696([6]))。
另一策略在于通过添加佐剂来改善疫苗抗原的功效，由此使得对于相同有限数量的蛋和产生的相同量的糖蛋白，可以产生更多的疫苗剂量(Ellebedy AH,WebbyRJ.Influenza vaccines.Vaccine.2009Nov 5；27Suppl 4:D65-8([7]))。这种方法更适合于具有免疫系统缺陷的人。此外，公众舆论对佐剂的使用是相当不利的。
最后，一种策略在于优化生产过程下游的提取疫苗抗原(“分裂”)的步骤：目的是获得更好和更多的提取疫苗抗原，同时更有效地保持它们的构象结构，并从而保持疫苗的保护力直接依赖的抗原性。
更具体地，在蔗糖梯度上，对使用感染的胚胎鸡蛋(收获尿囊液)或在生物反应器中使用感染的细胞系培养物(培养基的收获)获得的病毒生产进行纯化，然后通过化学处理(优选用福尔马林，以获得根据规定的15log的病毒滴度下降)进行灭活。该方法随后涉及使用洗涤剂以破坏/片段化(“破坏/片段化”)病毒(“分裂病毒粒子”)和通过渗滤纯化疫苗抗原.
将获得的分裂或片段化病毒与部分或完全溶解的病毒蛋白组合，由此改变病毒的(传染性)的完整性和功能。分裂还构成了补充该化学方法的灭活的方法；由此使用术语正交灭活。
分裂可以通过使用各种洗涤剂特别是使用非离子和离子(例如阳离子)表面活性剂处理经纯化的病毒来获得，表面活性剂例如烷基糖苷、烷基硫代糖苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧亚甲基烷基醚、N,N-二烷基葡糖酰胺、甲基葡萄糖苷、烷基苯氧基聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、磷酸三正丁酯、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂质体转染(lipofectin)、阳离子脂质体(lipofectamine)、DOT-MA(十二烷基三甲基溴化铵)、辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如Triton X-100或Triton Nl 01)、聚氧乙烯脱水山梨醇酯(Tween表面活性剂)、聚氧乙烯醚、乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、NP9等。
在这方面，已知有许多方法用于分裂(片段化)流感病毒。文献WO02/28422([8])描述了例如通过选自月桂醇聚醚9、NaDOC、肌氨酸钠组、Tween 80TM和Triton X100的分裂剂的分裂方法。文献WO02/067983([9])在其一部分中描述了通过脱氧胆酸钠的分裂方法。
表面活性剂(或洗涤剂)是由在水中具有显着溶解度的明显不同的极性和非极性结构域组成的两亲性分子。超过称为临界胶束浓度(CMC)的精确浓度时，胶束化现象由疏水效应引导(M.Rosen,“Surfactants and Interfacial Phenomena”,3rd Ed.,Hoboken:JohnWiley&Sons,Inc.,2004([10]))。
疏水尾部的性质、其长度、其不饱和度和支化度、芳香核的存在或不存在以及链的数量影响表面活性剂单体的化学性质及其在水溶液中的自组装(CMC，几何形式的聚集体的聚集数、大小和性质)。亲水基团(中性或带电的、小或大体积)的性质对表面活性剂的性质及其生物应用具有强烈影响。
根据其亲水部分的性质，表面活性剂被分为三个主要族(A.M.Schwartz,J.W.Perry,J.Berch,“Surface Active Agents and Detergents”,vol II,R.KriegerPub.Co.,New York,1977([11]))：离子(阳离子或阴离子)表面活性剂、两性离子(或两性)表面活性剂以及中性表面活性剂。它们通常被称为软或粗糙的(硬的，harsh)。在这个意义上，可以根据洗涤剂的最粗糙类别至最软类别对洗涤剂进行分类排序：离子>两性>中性。离子表面活性剂，例如CTAB，通常是变性的。它们破坏蛋白质的分子内库仑相互作用，从而扰乱它们的三维构象。
两性离子表面活性剂(磺基甜菜碱、甜菜碱)在其亲水部分中同时含有正电荷和负电荷，并且是电中性的。
中性表面活性剂(特别是包括烷基糖苷和聚氧亚甲基烷基醚)的特征在于不带电的亲水性头部。它们是软的且非变性的表面活性剂，然而，其破坏蛋白质-脂质和脂质-脂质相互作用，但对蛋白质的分子内库仑相互作用没有影响。
在生物化学中常用包含聚乙二醇型亲水部分的洗涤剂(Triton X100、Tween等)。它们具有被认为是在其PEG(聚乙二醇)基团上具有可变聚合指数n的化学异相分子的缺点。因此，这些批次的商业洗涤剂不是以在溶液中化学明确定义的物种的形式，这可导致其物理化学性质的变化。
在目前大流行性致病病毒出现的背景下，感染(例如流感感染)仅在工业化国家即可导致130万到200万人的住院治疗和280 000到650 000万人的死亡人数(WHO数据)。
因此，主要的经济挑战之一是能够降低制造疫苗剂量的成本(每次产生更多的剂量和/或获得相同量剂量所需的时间减少)。
在这种背景下和从经济的角度，寻找并开发用于生产疫苗种的新的优化过程是合理的，特别是在如下方面：(i)提高生产产量、(ii)减少时间和/或降低成本、(iii)产生更具免疫原性的抗原。
发明内容
本发明的目的正是满足这些需要，其通过提供一种用于制备疫苗抗原的方法，使得在工业生产过程中，特别是在细胞或尿囊系统中，能够定性和定量地优化疫苗抗原(例如流感疫苗抗原)的提取步骤。
事实上，令人惊讶和出乎意料地，申请人已经证明式(I)的杯芳烃并且有利地是式(II)的杯芳烃或它们的药物学上可接受的盐能够被用来片段化(分裂)病毒，特别是通过替换通常用于使膜片段化的洗涤剂，例如Triton X100或Tween 80。
特别地，本发明的方法具有更好地保持膜糖蛋白(诸如表面疫苗抗原)的构象的优点。令人惊讶地，与已知技术相比，本发明在片段化(特别是(“分裂”))病毒的步骤期间能够更好地保持抗原的构象.
在这种情况下，从产生免疫性的观点，其使用使得能够产生更有效的疫苗抗原，并从而减少用于相同或相当保护的疫苗批次中所需的抗原的量。
另外，这些更有效的抗原被更好地保存，有利地使得可以完全或部分地替代已知的佐剂。可替换地，杯芳烃可以在疫苗组合物中用作佐剂和/或赋形剂，以改善疫苗抗原的性质。
与常规使用的Triton X100洗涤剂分子相比，本发明尤其可以提高产生的疫苗抗原的质量和/或数量。
本发明的使用可以适用于存在的各种生产模式(蛋，即尿囊系统，和细胞)，而且可适用于生产优化的其他补充方法(前文提及的)，以及适用于正在开发的生产模式，例如涉及烟草叶、原生动物的方法，这一列举不是限制性的。
因此，在本发明的上下文中，描述了一种制备疫苗抗原的方法，包含使与所述疫苗抗原相关的生物膜与至少一种式(I)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐接触以片段化所述生物膜的步骤：
其中
-n是等于1、3、5或6的整数；
-R1、R2、R3和R4彼此独立地表示氢原子；直链或支链(C1-C18)烷基，其任选地被一个或多个选自O、S、N和P原子的组的杂原子取代；直链或支链(C1-C18)烷基，其任选地取代有-COOR基团，其中R是直链或支链(C1-C4)烷基；包含6至20个碳原子的芳基；
-X1、X2和X3彼此独立地表示-(CH2)m-COOR'或-SO3或-(CH2)mPO(OH)O或-(CH2)m-NR’3基团，其中
-m是0至20范围内的整数，
-R'表示氢原子或者直链或支链(C1-C4)烷基；
其中疫苗抗原不是HIV(人类免疫缺陷病毒)抗原或CMV(巨细胞病毒)病毒。
为了本发明的目的，术语“疫苗抗原”意指包含至少一种能够被病毒表达的膜蛋白的任何制剂。疫苗抗原也可以包含生物膜的片段。在这方面，膜蛋白可以与生物膜相关。疫苗抗原也被理解为是丛生有(bristling with)疫苗抗原的生物膜片段，例如在生物膜的内表面和/或外表面上。
疫苗抗原能够有利地刺激施用有其的人或动物个体针对表达这种抗原的病毒且特别是针对膜蛋白的免疫应答。疫苗抗原可有利地使得个体针对抗原且特别是针对膜蛋白能够完全或部分免疫。
对于本发明的目的，术语“膜蛋白”意指与生物膜相关的蛋白质，也就是说锚定的或整体的，不能在水性介质中自由扩散并且在这些介质中不稳定。在膜蛋白中，例如可以提及血浆膜蛋白和细胞内膜蛋白(例如，线粒体膜蛋白、网状蛋白、高尔基体蛋白、溶酶体蛋白，这一列举不是限制性的)。膜蛋白可以是多穿蛋白(polytopic protein)或单穿蛋白(monotopic protein)。术语“多穿蛋白”意指穿过膜一次或多次的蛋白质。术语“单穿蛋白”意指仅与膜的一侧相互作用的蛋白质。膜蛋白也可以是整合蛋白质或外周蛋白质。术语“整合蛋白质”意指单穿蛋白或多穿蛋白，其与膜强烈相互作用，特别是通过疏水相互作用。这些蛋白质也称为“内在蛋白质”。术语“外周蛋白质”意指单穿蛋白，其与膜弱相互作用，即通过静电键或通过其它膜蛋白。这些蛋白质也被称为“外在蛋白质”。
膜蛋白可以是由感染剂表达的抗原蛋白，需要针对该感染剂其接种疫苗。它可以是病毒或微生物来源的蛋白质。换句话说，膜蛋白可以是由感染剂的基因组编码的蛋白质。在这一方面，感染剂可以是病毒，特别是包膜病毒。当它是病毒时，它可以是选自包括以下的组的任何类型的菌株的野生型或重组病毒：
-正粘液病毒科，特别地包括流感病毒，例如哺乳动物流感病毒，更特别是人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、猫流感病毒、禽流感病毒，例如天鹅流感病毒，
-副粘液病毒科，包括呼吸道病毒(仙台病毒，牛副流感病毒3，人副流感病毒1和3)、腮腺炎病毒(人副流感病毒2、4、4a、4b，人腮腺炎病毒，5型副流感病毒)、禽腮腺病毒(新城疫病毒(NDV))、肺病毒(人类和牛呼吸道合胞病毒)、偏肺病毒(动物和人类偏肺病毒)、麻疹病毒(麻疹病毒、瘟热病毒和牛瘟病毒)和亨尼帕病毒(亨德拉病毒，尼帕病毒等)，
-冠状病毒科，特别地包括人冠状病毒(特别是NL63,SARS-CoV,MERS-CoV)和动物冠状病毒(犬、猪、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎冠状病毒)，
-黄病毒科，特别地包括虫媒病毒(蜱媒脑炎病毒)、黄病毒(登革热病毒，黄热病毒，圣路易脑炎病毒，日本脑炎病毒，西尼罗病毒包括Kunjin亚型，Muray谷病毒，Rocio病毒，Ilheus病毒，蜱传脑膜脑炎病毒)、丙型肝炎病毒(丙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒)和瘟病毒(边缘病病毒，牛腹泻病毒，天鹅热病毒)，
-弹状病毒科，特别地包括水泡性病毒(水泡性口炎病毒)、狂犬病病毒(澳大利亚，欧洲拉各斯蝙蝠病毒，狂犬病病毒)、短暂病毒(牛短暂热病毒)、新生弹状病毒(蛇头病毒，出血性败血症病毒和造血性坏死病毒)，
-披膜病毒科，特别地包括风疹病毒属(风疹病毒)、甲病毒属(特别是辛德比斯病毒、西门利克森林病毒、O'nyong'nyong病毒、基孔肯雅病毒、马雅罗病毒、罗斯河病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)，
-疱疹病毒科，特别地包括人类疱疹病毒(HSV-1、HSV-2、水痘病毒、埃-巴二式病毒(EB病毒)、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、HHV-7和KSHV)，
-痘病毒科，特别地包括正痘病毒(例如特别是骆驼痘、牛痘(cowpox)、天花、牛痘(vaccinia))、腕痘病毒(特别是包括羊痘)、禽痘病毒(特别是包括禽痘)、副痘病毒(尤其包括牛丘疹性口炎病毒)和左旋蛋白病毒(特别是包括粘液瘤病毒)，
-逆转录病毒科，特别是包括慢病毒(特别是包括人类、猫和猴免疫缺陷病毒1和2，山羊关节炎性脑膜炎病毒或梅迪-维纳斯病病毒(Maedi-Visna病病毒))和逆转录病毒(特别是包括劳斯肉瘤病毒，人淋巴细胞性病毒1、2和3)，
该列举不是限制性的。其还可以是通过反向遗传学在细胞系统中产生的经修饰的、重配或原型病毒。
其特别地可以是病毒糖蛋白(例如神经氨酸酶或血凝素)，或M1和M2膜蛋白，核蛋白，流感病毒非结构蛋白(NS1)，或例如副粘液病毒科病毒F融合蛋白或任何其它病毒蛋白，特别是与上述病毒的膜相关的任何蛋白质。其也可以是修饰的病毒蛋白，例如在文献WO2010/058100([26])或WO 2010/058099([27])中描述的融合蛋白F的突变体。
当膜蛋白衍生自原核感染剂时，其可以例如是选自来自沙门氏菌的百日咳杆菌粘附素外表面膜抗原和百日咳博德特菌百日咳杆菌粘附素抗原，这一列举并非限制性的。
对于本发明的目的，术语“生物膜”意指任何将分子组装成将细胞与其环境隔开的双层片，其由两亲性脂质(特别是磷脂)的双层组成，每个膜脂质由指向膜外部的亲水极性头部和指向膜内部的疏水尾部组成。其可以是原核细胞、真核、动物或植物细胞或病毒的膜。
其可以例如是囊泡膜，例如VLP(病毒样颗粒)的膜(例如WO2007132790([29])、WO1999036085([30])、WO2005058357([31])或WO2008092153([32])描述的)、溶酶体的膜、外来体或蛋白脂质体的膜、内质网膜或高尔基体膜，这一列举不是限制性的。
在真核细胞膜的情况下，其可以是囊泡膜、粗糙的内质网膜、高尔基体膜、光滑的内质网膜或质膜，这一列举不是限制性的。其可以是衍生自细胞系的分离的转基因宿主细胞，其中细胞系例如通过重组DNA或RNA遗传工程技术或通过用表达一种或多种目的疫苗抗原的病毒载体感染细胞，表达一种或多种疫苗抗原。可以使用本领域技术人员已知的可以使得在细胞中表达转基因的任何遗传工程技术。其可包括涉及表达通过转导(例如电穿孔、显微注射、超声、感染或转染)引入细胞中的DNA或RNA(例如合成编码mRNA)的技术。例如文献WO02090533([33])中所描述的，表达可以是至少一种目的抗原的瞬时和/或诱导型和/或组成型表达。该细胞可以是任何细胞，特别是除了人胚胎干细胞之外的细胞，例如分离的人细胞(例如排除人胚胎干细胞)，或分离的非人动物或植物细胞。分离的细胞可以来源于选自以下的细胞系：Vero(ATCC No.CCL-81)诸如Vero 76(ATCC No.CRL-1587)、CHO诸如CHO-Kl(CCL 61，ATCC)、BHK诸如BHK-21[C-13](CCL-10TM)、HELA、(Crucell)、HEK293(CRL-1573TM)、Sf9(ATCC，CRL-1711)、(Valneva/Vivalis，描述于文献WO2008129058([12])中)、MDCK例如MDCK(NBL-2)(CCL-34TM)，这一列举不是限制性的。在从细胞系分离的细胞的情况下，该方法包含下列步骤：
-用含有病毒的流体接种分离的细胞，
-在细胞中繁殖病毒，
-将由此繁殖的病毒收集在细胞培养上清液中，
-任选地将由此收集的病毒灭活，
-将病毒膜片段化。
在从细胞系分离的细胞的情况下，本发明的方法可替代地包含下列步骤：
-用含有病毒的流体接种分离的细胞，
-在细胞中繁殖病毒，
-收集在其表面表达抗原的细胞，
-通过膜分离方法例如通过破碎细胞并随后离心从细胞中分离出膜，例如质膜，
-将膜片段化。
或另外可替代地：
-通过遗传工程方法在分离的细胞中表达抗原，
-扩增表达抗原的细胞；
-收集在其表面表达抗原的细胞，
-通过膜分离方法例如通过破碎细胞并随后离心从细胞中分离出膜，例如质膜，
-将膜片段化。
可替换地，该细胞可以源自胚胎的尿囊系统。在这一方面，这种胚胎系统可以是任何动物种类(例如鸡蛋)或任何其他动物(特别是禽类)的尿囊系统，其允许病毒进入的。例如，为了获得产生如上所定义的膜蛋白的含胚鸡蛋，步骤可以如下：
-将例如200μl的浓度为10-3pfu/ml的病毒接种在来自无菌室里饲养的母鸡的11天龄的含胚鸡蛋的尿囊液中，
-然后将这些鸡蛋在约33℃下温育2至3天，在此期间，病毒在尿囊液中积累，
-将鸡蛋切开，将其中感染剂的浓度已经倍增的尿囊液抽出。
在病毒膜的情况下，其可以是通过感染的宿主细胞的细胞质或浆细胞膜出芽而衍生的包膜，这取决于病毒和/或所表达的疫苗抗原的病毒来源。在这种情况下，包膜是感染的细胞的细胞质或细胞浆来源的膜，其通过在病毒发芽过程中与这些膜相关的病毒糖蛋白的表达来修饰，并且包膜的脂质本身是细胞来源的。在这种情况下，其可以是病毒的膜，针对该病毒期望接种疫苗和/或免疫。
对于本发明的目的，术语“杯芳烃”旨在是指杯芳烃家族的超分子表面活性剂。在这一方面，本发明中使用的杯芳烃可以通过本领域技术人员已知的任何技术合成。例如，其可以涉及文献WO2009/144419([28])中描述的方法。
对于本发明的目的，术语“烷基”旨在是指包含1至12个碳原子的饱和或不饱和的、直链、支链或环状的任选被取代的碳基基团。作为指示，可以提及甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基(docecanyl)及其支化异构体。该烷基可以任选地取代有选自基团O、S、N和P的组的一个或多个杂原子。
术语“芳基”通常表示包含6至20个碳原子的环状芳族取代基。在本发明的上下文中，芳基可以是单环或多环的，其任选地被取代。在这方面，可以提及苄基或苯基。
在本发明的上下文中，术语“药物学上可接受的盐”包括取决于化合物上存在的取代基用无毒的酸或碱制备的盐。当本发明的化合物包含酸官能团时，相应的盐可以通过任选在溶剂存在下向中性形式的该化合物中加入有机或无机碱来获得，溶剂优选是惰性的。碱的加成盐的实例可以是钠、钾、钙、铵、氨基(有机)或镁盐。当本发明的化合物包含碱性官能团时，相应的盐可通过任选在(优选为惰性的)溶剂中添加有机或无机酸来获得。无机酸加成盐的实例可以是盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸或氢碘酸的盐。有机酸加成盐的实例可以是乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸或甲磺酸的盐。
在一个特定实施方式中，可以使用至少一种式(I)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐来进行所述片段化步骤，其中：
-n是等于1的整数；
-R1、R2、R3和R4彼此独立地表示氢原子；或直链或支链(C1-C18)烷基；
-X1、X2和X3彼此独立地表示-(CH2)m-COOR’或-SO3Y或-(CH2)m-PO(OH)OY或-(CH2)m-NR’3基团，其中
-m是0至20范围内的整数，
-R’表示氢原子。
一种用于制备疫苗抗原的方法，包含步骤：使与所述疫苗抗原相关的生物膜与至少一种式(III)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐接触以将所述生物膜片段化：
其中：
-X是-(CH2)o-CO2Y基团，
-o是1至3的整数，
-R4是直链或支链(C1-C4)烷基，并且
-Y是碱金属，
其中获得的所述疫苗抗原还包含生物膜的片段，所述片段与该抗原相关。
本发明的主题涉及一种用于制备疫苗抗原的方法，包含步骤：使与所述疫苗抗原相关的生物膜与至少一种式(II)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐接触以将所述生物膜片段化：
其中：
-X是-(CH2)o-CO2Y基团，
-o是1至3的整数，并且
-Y是碱金属，
其中所获得的所述疫苗抗原还包含生物膜的片段，所述片段与这种抗原相关，所述片段化步骤是在这种抗原上进行的。
根据本发明的一个特定实施方式，o等于1。根据本发明的这一方面，杯芳烃被称为CALX133ACE。在其中杯芳烃为CALX133ACE的这种情况下，除了前文描述的疫苗的片段化之外，本发明的方法及其用途可以包含片段化CMV和HIV。在一个替代实施方式中，疫苗抗原不是HIV(人类免疫缺陷病毒)抗原或CMV(巨细胞病毒)抗原。
有利地是，在方法中杯芳烃(特别是式(III)的杯芳烃，特别是CALX133ACE)的使用允许最佳保持疫苗抗原的构象，例如通过保持疫苗抗原在其分裂的病毒膜内的构象。有利地是，事实上，通过实施本发明的方法获得的疫苗抗原包含生物膜的片段，所述片段与疫苗抗原相关，其允许最佳保存疫苗抗原的构象。有利地是，与特别是通过洗涤剂的方式片段化的现有技术方法相比，根据本发明的病毒抗原的构象的保存能够获得更佳的根据本发明的方法片段化的病毒抗原的功效，特别是疫苗功效。
对于本发明的目的，术语“碱金属”是指任何碱金属，例如选自钠盐、钾盐、铵盐、(有机)氨基盐或镁盐。
在一个特定的实施方式中，o等于1，和/或Y是钠。
有利地是，与其它表面活性剂(特别是Triton X100和脱氧胆酸盐)相比，本发明中使用的杯芳烃提供了改善保存的膜糖蛋白(例如表面疫苗抗原)的构象。在本上下文中，使用其使得可以特别有利地产生从免疫原性观点更有效的疫苗抗原，并因此减少疫苗批次中用于相同保护所需的抗原的量。另外，在本发明的一个特定实施方式中，因为这些抗原得到了更好的保存所以更有效，因此使得这些抗原可以完全或部分替代佐剂。
对于本发明的目的，术语“生物膜的片段化”旨在是指将整个膜解离(decomplexification)成膜片段的任何脱复化。有利地是，生物膜的片段化(也称为分裂)使得能够获得包含膜蛋白的生物膜片段。有利地，通过本发明的方法将膜蛋白保持在生物膜片段中，或换言之保持在膜范围内，从而使得能够保存所述膜蛋白的构象并且能够生成从产生免疫性观点看比使用现有技术方法更有效的疫苗抗原。
接触步骤可以在5.5至10的pH范围内进行，优选6至9，例如约7.95。片段化步骤可以在0至100℃的温度范围内进行，优选4至25℃，特别是4℃。片段化步骤可以使用10-6至10-2M范围内的杯芳烃例如CALX133ACE浓度。
由于杯芳烃的表面活性剂性质，所以其可以使用溶液形式的杯芳烃或胶体聚集体形式的杯芳烃进行片段化步骤。对于本发明的目的，术语“胶体聚集体”旨在是指几十至几百个杯芳烃分子的组装，杯芳烃分子根据相对于溶剂的排斥力而组织化。考虑到它们的性质，杯芳烃(例如CALX133ACE)能够在合适的介质中(例如在水中、在水溶液中、在等渗介质中或在生物介质中)形成聚集体。
聚集体优选可以是胶束的形式。术语“胶束”指示根据所使用的溶剂而组织化的式(I)的杯芳烃分子的球形聚集体。例如，在水或水性溶剂中，亲脂端面向胶束，而亲水端形成胶束与溶剂的界面。在有机溶剂，例如油中，排列反转。术语“脂质体”指示小的人工产生的囊泡，其特别地由通过水性区室彼此分隔开的磷脂条带组成。它们可以具有非常接近细胞膜的结构。在本发明的上下文中，术语“纳米颗粒”是指数百至数千个式(I)的杯芳烃分子的组装，产生至少一个维度为纳米尺寸例如1至300nm的物体。在本发明的方法中，使包含待提取的膜蛋白的水性悬浮液与式(I)的杯芳烃接触的步骤，任选地可以在存在至少一种选自包括以下的组的共溶质的存在下进行：
i)选自包括药物学上可接受的盐的组的有机和无机盐；
ii)选自氨基酸、维生素、脂质、类固醇、碳水化合物或代谢物的组的小生物活性分子；
iii)选自肽、寡核苷酸和寡糖的寡聚的组的低聚生物活性分子；
iv)选自蛋白质、多核苷酸和多糖的组的聚合生物分子。
根据本发明的一个实施方式，接触步骤之前可以进行如下步骤，其中：
-将待提取的膜蛋白或含有其的膜部分溶解在缓冲溶液中，和
-根据前文描述的温度、pH和浓度条件加入式(I)的杯芳烃。
根据本发明的一个实施方式中，接触步骤之后可以是离心步骤，使得能够将与式(I)的杯芳烃复合的膜蛋白与非复合的膜蛋白分离开。
与式(I)的杯芳烃复合的膜蛋白及非复合的膜蛋白可以通过离心来分离，例如在4℃和在100 000g的速度下离心1小时。离心条件可取决于蛋白质的性质。本领域技术人员能够了解如何选择最佳的离心条件，例如Lenoir,G.,Menguy,T.,Corre,F.,Montigny,C.,Pedersen,P.A.,Thinès,D.,le Maire,M.,and Falson,P.(2002)Overproduction inyeast and rapid and efficient purification of the rabbit SERCAIa Ca2+-ATPaSe,Biochim.Biophys.Acta 1560,67-83([13])中的描述。
有利地是，在片段化步骤之前和/或之后可以存在通过本领域技术人员任何已知的方法进行灭活的步骤，例如通过甲醛、通过β-丙内酯、通过紫外线辐射、或用福尔马林灭活，任选地之后或之前进行部分纯化的步骤，例如通过超速离心，如文献US 2009/0060950([14])和US6,048,537([15])中的描述。
本发明的方法可以属于任何常规的工业疫苗抗原生产方法，例如文献WO2011051235([16])、US 2011/0014230([17])、WO 2002/028426([18])、US 2009/0060950([14])、WO 02/067983([9])、US4,206,014([19])、WO 2009/115917([20])或WO 2005/113756([21])中描述的方法，不同之处在于将用于片段化(分裂)的化合物替换为式(I)的杯芳烃或其盐。
根据一个实施方式，可以进行渗滤步骤。有利地是，其使得可以除去表面活性剂或其它杂质。该步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，其可以是选自渗析、稀释、柱上的缓冲液交换、酶作用、使用聚合物例如Biobead特别是SM2或Dowex、沉淀的技术或是Ollivon et al.(Ollivon M1,Lesieur S,Grabielle-Madelmont C,PaternostreM.:"Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles"BiochimBiophys Acta.2000Nov 23；1508(1-2):34-50([25]))描述的技术；这一列举不是穷尽的。
有利地是，可以进行无菌过滤步骤。有利地是，该步骤使得可以去除更多的杂质。该步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。其可以例如是过滤，例如通过孔隙率小于0.22μm的过滤膜。
在一个实施方式中，本发明的方法还可以包括渗析所述疫苗抗原的步骤。有利地是，该步骤使得可以去除更多的杂质。该步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。其可以例如是透过具有小于14 000道尔顿孔隙率的膜的渗析。
在一个实施方式中，方法还可以包含浓缩膜蛋白的步骤。该步骤可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。其可以例如是沉淀(例如使用PEG(聚乙二醇)或硫酸铵)、蒸发、使用浓缩器例如型，例如或(Merck Millipore)。
本发明的方法还可以包括本领域技术人员已知的在疫苗制备中的任何步骤，例如文献WO 2011051235([16])、US2011/0014230([17])、WO 2002028426([18])、US 2009/0060950([14])、WO02/067983([9])、US4,206,014([19])、WO2009/115917([20])、WO2005/113756([21])中的方法中的描述。
还描述了可通过实施前文定义的方法生产的疫功抗原，例如其中疫苗抗原不是HIV抗原或CMV抗原。
还描述了包含前文描述的疫苗抗原的疫苗，例如其中疫苗抗原不是HIV抗原或CMV抗原。
疫苗可以通过适于所需疫苗接种的任何已知途径施用，例如通过注射(特别是皮下、皮内、肌肉内、经口、鼻内、经上皮、经皮)、通过贴剂、通过粘膜粘附片剂、直肠(例如通过栓剂)施用。
疫苗可以是具有佐剂的疫苗，型(GSK)、(Novartis)或(Sanofi Pasteur)型，或不具有佐剂的疫苗，三价Fluviral(GSK)或四价Fluarix(GSK)、(Baxter)或(Sanofi Pasteur)型，这一列举不是限制性的。在这些例子中，病毒可以被替换为根据本发明所述的疫苗抗原。在具有佐剂的疫苗的情况下，所述佐剂可以是本领域技术人员已知的任何佐剂，其可以增加免疫应答，例如铝盐、溶血卵磷脂、矿物凝胶、氢氧化铝、微乳液、脂质颗粒或寡核苷酸。
疫苗可以包含任何药物学上可接受的载体，例如上述疫苗中包含的那些，或稳定盐、溶解剂、渗透压调节剂、增稠剂、用于保持生理氧化还原电位的氧化还原化合物，该列举不是限制性的。
用于人的疫苗的剂量可以例如对应于待注射的0.5ml的体积。
疫苗还可以包含式(I)的杯芳烃，特别是以赋形剂的形式。关于本发明，术语“赋形剂”意指意在具有公认效果的物质。其可以有利地赋予最终产品给定的构象或其它特定的物理特性，同时防止与活性成分的任何不希望的相互作用，特别是化学相互作用。在这一点上，可以存在地疫苗中的杯芳烃的量可以为0.1至1000μg，例如0.5至700μg或1至600μg或者5至500μg。
本发明的另一个主题涉及杯芳烃或式(II)的杯芳烃在用于制备疫苗或前文描述的疫苗抗原的用途，例如其中的疫苗抗原不是前文描述的病毒抗原，除了HIV的那些或CMV的抗原。还描述了式(I)的杯芳烃的用途。
本发明的另一主题涉及前文定义的疫苗抗原或疫苗，其在治疗或预防感染性疾病中用作药物的应用，例如其中疫苗抗原不是HIV抗原或CMV抗原。感染性疾病可以例如是由一种或多种选自以下的病毒引起的疾病：
-正粘液病毒科，特别地包括流感病毒，例如哺乳动物流感病毒，更特别是人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、猫流感病毒、禽流感病毒，例如天鹅流感病毒，
-副粘液病毒科，包括呼吸道病毒(仙台病毒，牛副流感病毒3，人副流感病毒1和3)、腮腺炎病毒(人副流感病毒2、4、4a、4b，人腮腺炎病毒，5型副流感病毒)、禽腮腺病毒(新城疫病毒(NDV))、肺病毒(人类和牛呼吸道合胞病毒)、偏肺病毒(动物和人类偏肺病毒)、麻疹病毒(麻疹病毒、瘟热病毒和牛瘟病毒)和亨尼帕病毒(亨德拉病毒，尼帕病毒等)，
-冠状病毒科，特别地包括人冠状病毒(特别是NL63,SARS-CoV,MERS-CoV)和动物冠状病毒(犬、猪、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎冠状病毒)，
-黄病毒科，特别地包括虫媒病毒(蜱媒脑炎病毒)、黄病毒(登革热病毒，黄热病毒，圣路易脑炎病毒，日本脑炎病毒，西尼罗病毒包括Kunjin亚型，Murray谷病毒，Rocio病毒，Ilheus病毒，蜱传脑膜脑炎病毒)、丙型肝炎病毒(丙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒)和瘟病毒(边缘病病毒，牛腹泻病毒，天鹅热病毒)，
-弹状病毒科，特别地包括水泡性病毒(水泡性口炎病毒)、狂犬病病毒(澳大利亚，欧洲拉各斯蝙蝠病毒，狂犬病病毒)、短暂病毒(牛短暂热病毒)、新生弹状病毒(蛇头病毒，出血性败血症病毒和造血性坏死病毒)，
-披膜病毒科，特别地包括风疹病毒属(风疹病毒)、甲病毒属(特别是辛德比斯病毒、西门利克森林病毒、O'nyong'nyong病毒、基孔肯雅病毒、马雅罗病毒、罗斯河病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)，
-疱疹病毒科，特别地包括人类疱疹病毒(HSV-1、HSV-2、水痘病毒、埃-巴二式病毒(EB病毒)、巨细胞病毒、玫瑰疹病毒、HHV-7和KSHV)，
-痘病毒科，特别地包括正痘病毒(例如特别是骆驼痘、牛痘(cowpox)、天花、牛痘(vaccinia))、腕痘病毒(特别是包括羊痘)、禽痘病毒(特别是包括禽痘)、副痘病毒(尤其包括牛丘疹性口炎病毒)和左旋蛋白病毒(特别是包括粘液瘤病毒)，
-逆转录病毒科，特别是包括慢病毒(特别是包括人类、猫和猴免疫缺陷病毒1和2，山羊关节炎性脑膜炎病毒或梅迪-维纳斯病病毒(Maedi-Visna病病毒))和逆转录病毒(特别是包括劳斯肉瘤病毒，人淋巴细胞性病毒1、2和3)，
该列举不是限制性的。
例如，在流感病毒的情况下，疫苗可以包含流感病毒A的一种或多种亚型，所述亚型选自：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7的人类亚型，猪流感的H1N1、H1N2、H3N1和H3N2亚型，犬流感和马流感的H7N7和H3N8亚型，或禽流感的H5N1、H7N2、H1N7、H7N3、H13N6、H5N9、H11N6、H3N8、H9N2、H5N2、H4N8、H10N7、H2N2、H8N4、H14N5、H6N5和H12N5亚型，或任何其他人类和/或动物重配病毒。可替换地，在流感病毒的情况下，疫苗可以包含选自流感病毒B的一种或多种人类亚型，例如选自维多利亚谱系和Yamagata谱系。在流感病毒B的情况下，其特别是B/Massachussetts/2/2012或B/Brisbane/33/2008疫苗菌株的问题。
本发明的另一个主题涉及前文定义的杯芳烃在疫苗中作为佐剂的用途。
前文定义的杯芳烃可以用于它们的免疫活性，更特别是免疫调节活性。取决于受试者、剂量、抗原和施用时间，它们能够引起免疫刺激。
对于本发明的目的，术语“佐剂”旨在是指当与抗原一起施用(吞咽、吸入、注射等)时刺激、激活、延长、增强或调节免疫系统的物质，但是该物质本身不具有任何抗原性质。
在这一方面，可以存在于疫苗中的杯芳烃的量相对于疫苗的总重量可以为0.1至1000μg，例如0.5至700μg，或1至600μg或5至500μg。
在一个特定实施方式中，佐剂可以添加到任何疫苗中，例如加入到灭活或减毒疫苗或分裂疫苗中，而与所使用的生产方法无关。
对于本领域技术人员来说，通过阅读以下通过说明的方式给出的附图所示的实施例，其它优点将变得更加显而易见。
附图说明
-图1示出了在D-42(感染前的42天)、D-21(感染前的21天)、D0(感染当天及血样当天)、D4(感染后的4天)和D14(感染后的14天)，在小鼠中的挑战CALX133ACE免疫方案。
-图2示出了使用H1N1pdm(10e3)感染并任选地使用以下物质(从左到右)免疫的小鼠在D-42("预备")、D-21("样品2")和D0("样品3")的HAI(血细胞凝集抑制)滴度的测量：1/5疫苗、Triton X100阴性对照、CALX133ACE阴性对照、3μg抗原Triton X100、3μg抗原-1剂量Triton X100、3μg抗原CALX133ACE和0.5μg抗原CALX133ACE。
-图3示出了使用H1N1pdm(10e3)感染并且任选地使用以下物质(从左到右)免疫的小鼠在D-42("预备")、D-21("样品2")和D0("样品3")的MN(微量中和)滴度的测量：1/5疫苗、Triton X100阴性对照、CALX133ACE阴性对照、3μg抗原Triton X100、3μg抗原-1剂量Triton X100、3μg CALX133ACE抗原和0.5μg CALX133ACE抗原。
-图4示出了使用H1N1pdm(10e3IU)感染并且施用以下物质免疫的小鼠从D0至D14的重量(单位g)的测量：疫苗、剂量1/5(菱形)、阴性对照Triton X100Neg.C.(方形)、阴性对照CALX133ACE Neg.C(三角形)、3μg使用Triton X100提取的抗原(十字形)、3μg使用CALX133ACE提取的抗原(星形)和0.5μg使用CALX133ACE提取的抗原(圆形)。
具体实施方式
实施例1：使用CALX133ACE和CALX1103ACE分子提取流感疫苗抗原的方案
评价了CALX133ACE和CALX1103ACE分子(CALX1103ACE为杯芳烃，其中R4为C10烷基)提取流感疫苗抗原(从疫苗种X-179a，H1N1大流行2009的生产中产生)的能力，并且将它们与疫苗生产者使用的洗涤剂(Triton X100)和两种商业洗涤剂(FC12和C12E8)进行比较。评价了多种浓度、pH和提取温度条件。
使用用于测量血细胞凝集活性的工业参考测试(血细胞凝集测试：Hirst,G.K.1942.The quantitative determination of influenza virus and antibodies bymeans of red cell agglutination.J.Exp.Med.75:47-64([22])和Salk,J.E.1944.Simplified procedure for titrating hemagglutinating capacity ofinfluenza virus and the corresponding antibody.J.Immunol.49:87-98([23]))，以及所提取抗原的定量法(SRID；A quantitative,single-radial-diffusion test forimmunological studies with influenza virus.Schild GC,Henry-Aymard M,PereiraHG.J Gen Virol.1972Aug；16(2):231-6([24]))，以进行疫苗抗原提取的定量和定性评价。
测试的条件如表I中所示：
表I：
条件号 测试的分子 浓度 温度 PO4缓冲剂的pH 接触时间
1 Triton X100 4％ 室温 7.95 1h
2 Triton X100 4％ 37℃ 7.95 1h
3 CALX133ACE 1％ 室温 7.95 1h
4 CALX133ACE 1％ 37℃ 7.95 1h
5 CALX1103ACE 1％ 室温 7.95 1h
6 CALX1103ACE 1％ 37℃ 7.95 1h
7 CALX133ACE 1％ 4℃ 7.95 2h
8 CALX1103ACE 1％ 4℃ 7.95 2h
9 Triton X100 4％ 37℃ 7.95 1h
10 Triton X100 4％ 37℃ 6.74 1h
提取之后，在常规工业生产过程中(例如[9]、[18])进行相对于1X PBS的片段化抗原(上清液SN和提取团粒)的渗析，从而降低提取产物的盐和洗涤剂浓度。因此，对每个批交进行了渗析。经确定，在渗析过程中未完全除去Triton X100。然而，表现出CALX133ACE分子可以被渗析，表明其仅能以痕量存在于市售的可能的疫苗产品中。
渗析后，将提取产物等分并且滴定其血细胞凝集活性(HA)。数据示于下表II中：
结果显示，在4℃和pH＝7.95的条件下，在1％浓度下，使用CALX133ACE和CALX1103ACE分子提取后获得的片段化抗原(SN)的血细胞凝集(HA)滴度显著(分别为512和1024)。这些滴度显著高于根据常规方案使用Triton X100提取的抗原获得的那些(SN)。
由于(i)获得的血细胞凝集滴度依赖于所使用的CALX133ACE分子浓度(0.1％比1％)和(ii)非提取的抗原(团粒)的残留物的HA滴度与Triton X100获得的值成反比，并且低于Triton X100获得的值，因此这些结果更加显著。提取温度表现为一个重要的参数；4℃的温度表现为使用CALX133ACE和CALX1103ACE分子提取疫苗抗原的最佳温度。
这些第一结果清楚地表明，CALX133ACE分子适于从疫苗制造商使用的尿囊生产系统中产生的批次病毒中提取流感疫苗抗原。从定性的角度，与使用Triton X100的常规提取相比，这些CALX133ACE和CALX1103ACE分子允许更加有效的提取(更多的提取抗原、更高的血细胞凝集活性、抗原寡聚的天然特性)。
实施例2：疫苗抗原片段化的优化及其定量，以用于在鼠模型中进行功效测试
通过用病毒接种物(疫苗种)接种11天龄的含胚鸡蛋，随后浓缩和纯化，以进行病毒生产。与使用CALX133ACE分子进行比较，使用Triton X100(4％)根据常规工业方法进行片段化。
所提取的疫苗抗原的定性评价通过工业参考测试来进行，其为所述疫苗抗原的血细胞凝集活性的测量(主要抗原、血细胞凝集素的活性，以UHA/50ml给出滴度)。定量评价通过工业参考技术进行，这种技术也被药监部门用于疫苗批次的验证和销售许可：单向放射免疫扩散法(SRID，HA的量，单位mg/ml)。最后，通过iTRAQ质谱测定法对HA定量使得能够获得在动物测试中待比较的各种样品之间的相对定量(HA的量，单位mg/ml)。
选择用于片段的分子和条件是：
-4％的Triton X100在37℃下1小时。
-1％的CALX133ACE分子在4℃下2小时。
在血细胞凝集测试中，CALX133ACE分子在不存在流感抗原的情况下不引起任何红细胞溶血。另外，该分子是可渗析的，由此意味着在样品中可以将CALX133ACE限制至痕量。
实施例3：动物实验
在第一实验中，使用Triton X100或CALX133ACE分子作为分裂剂在前文描述的最佳生产条件下，生产了多批抗原。下表III是用于动物测试的片段材料的概述。
在该第一实验中，对于分裂，计划测试两种量的HA抗原(0.5和2.5μg)，并且对于通过超速离心分裂物获得的上清液，仅测试一种量。对于每种条件，对12只Balb.c小鼠肌内注射以进行免疫两次(在D0，然后在D21)(总量100μl)。在D0、D21、D42和D63(心脏穿刺和安乐死)从动物采集多个血液样品。在每个血液样品系列之后，收集来自同一组的血清并混合，以便具有足够的材料用于进行一式两份的血细胞凝抑制(HAI)测试和一式两份的微量中和测试。
下表IV中给出了获得的结果：
验证了由CALX133ACE片段化产生的抗原的实验(小鼠良好的耐受性、取得的血清的质量和量、具有验证的(+)和(-)对照的HAI结果的耐用性)。
HAI和微量中和结果是一致的，并且表明由CALX133ACE片段化产生的抗原分裂诱导显著的抗体响应(样品3和心脏穿刺)，不同于通过分裂物的超速离心纯化的抗原(在表III和IV中指示为“上清液”)，这因这些纯化的抗原不再处于膜的范围内，由此在定性和定量方面验证了使用CALX133ACE分子生产和片段化疫苗抗原的过程。
另外，对于0.5μg的注射剂量(样品3和心脏穿刺)，相对于Triton X100方法，出现了有利于CALX133ACE方法的显著差异。在2.5μg的剂量下发现了相同的趋势，但是HAI的差异不显著(样品3和心脏穿刺)。
此外，表现出通过0.5μg剂量由CALX133ACE方法产生的抗原诱导的抗体应答与通过2.5μg由Triton X100方法产生的抗原诱导的抗体应答类似(样品3和心脏穿刺)。后者的结果对于本发明是重要的，因为其强调，当抗原由CALX133ACE分子产生时，有可能以低五倍(五分之一，5times fewer)的抗原获得抗体应答。
实施例4：用CALX133ACE免疫小鼠：在小鼠中评价所生成的疫苗抗原的保护能力
在第二个实验中，使用Triton X100或CALX133ACE分子作为分裂剂在前文描述的最佳生产条件下生产了多批抗原。下表V是用于该第二动物实验的片段化材料的概述。计划是使用CALX133ACE或Triton X100抗原制剂将Balb/c小鼠免疫两次，然后使用A/H1N1加利福尼亚/7/2009菌株(H1N1pdm09)对小鼠进行感染，从而验证在动物中的保护。
组1：i.m.(肌内注射)1/5剂量的(相应于每抗原3μg HA)，免疫的12只小鼠(阳性对照)。
组2：i.m.Triton X100程序无抗原(6只小鼠)或CALX133ACE程序无抗原(6只小鼠)，免疫的12只阴性对照小鼠("Ctrl")。
组3：i.m.3μg HA制剂与Triton X100免疫的12只小鼠。
组4：i.m.3μg HA制剂与CALX133ACE免疫的12只小鼠。
组5：i.m.0.5μg HA制剂与CALX133ACE免疫的12只小鼠。
图1中示出了免疫方案。
下表V是用于该测试的片段化材料的概述。
在D+4(病毒复制峰)处死小鼠，测量它们的肺病毒滴度。
在D+4安乐死后测量经免疫并使用H1N1pdm09(10e3IU)感染的小鼠的肺病毒滴度，并且示于下表VI中。
表VI：
*只1次免疫
在使用流感病毒A H1N1pdm09(大流行)以10e3IU/小鼠进行鼻内感染后，监测Balb/c小鼠的重量并且描述于图4中。
测量由HAI提供的保护
测试以下组的小鼠：
-用疫苗1/5免疫的小鼠，
-仅用Triton X100免疫的小鼠，
-用CALX133ACE免疫的小鼠，
-用3μg以Triton X100制备的病毒抗原免疫的小鼠,
-用3μg以CALX133ACE提取的疫苗抗原免疫的小鼠，
-用0.5μg以CALX133ACE提取的疫苗抗原免疫的小鼠。
使用H1N1pdm(10e3)感染这些小鼠。
表VI中给出了对小鼠血清进行的HAI测试的结果，小鼠经免疫并感染了H1N1pdm(10e3)。
表VII：
图2中示出了由HAI提供的保护的测量。
由MN提供的保护的测量(微量中和)
测试以下组的小鼠：
-用疫苗1/5免疫的小鼠，
-仅用Triton X100免疫的小鼠，
-用CALX133ACE免疫的小鼠，
-用3μg以Triton X100制备的病毒抗原免疫的小鼠，
-用3μg以CALX133AC提取的疫苗抗原免疫的小鼠，
-用0.5μg以CALX133ACE提取的疫苗抗原免疫的小鼠。
这些小鼠感染有H1N1pdm(103)。
以下表VIII中概述了对经免疫且感染了H1N1pdm(103)的小鼠的血清进行的MN测试。
表VIII：
图3中示出了由MN提供的保护的测量。
小鼠的保护
图5示出了经免疫且感染了H1N1pdm(103IU)的小鼠体重的监测。
在所有免疫组中(Fluviral、Triton X100和CALX133ACE)：无体重减轻或死亡。
只有2个阴性对照组中的小鼠死亡。
结论
HAI和MN测试：
0.5μg抗原分裂/CALX133ACE的免疫效果与3μg的的免疫效果相同。
3μg抗原分裂/CALX133ACE的免疫比3μg抗原分裂/Triton X100的免疫更有效。
保护：
0.5μg的抗原分裂/CALX133ACE的保护效果与3μg的Fluviral或3μg的抗原分裂/Triton X100的保护效果相同。
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33.WO02090533。

Claims (12)

1.一种用于制备疫苗抗原的方法，包括通过使生物膜与至少一种式(II)的杯芳烃或其药物学上可接受的盐接触来片段化与所述疫苗抗原相关的所述生物膜：
其中：
-X是-(CH2)-CO2Y基团，并且
-Y是碱金属，
其中，获得的所述疫苗抗原还包含所述生物膜的片段，所述片段与所述抗原相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中Y是钠。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述生物膜源自原核或真核生物或源自病毒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物膜源自分离的植物或动物细胞或源自含胚卵。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疫苗抗原包含病毒来源或微生物来源的膜蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒来源选自包括以下项的组：正粘液病毒科、副粘液病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科和逆转录病毒科。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述流感病毒选自流感病毒A和流感病毒B。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包含渗析所述疫苗抗原的步骤。
9.一种可以通过实施权利要求1至5中任一项定义的方法生产的疫苗，在所述疫苗的总重量中以0.1至1000μg的量包含赋形剂形式的式(II)的杯芳烃。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述疫苗抗原包含病毒来源或微生物来源的膜蛋白。
11.根据权利要求1和2中任一项中定义的杯芳烃用于制备疫苗或疫苗抗原的用途。
12.根据权利要求9或权利要求10所述的疫苗，其应用作为在感染性疾病的治疗或预防中的药物。
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