BR102017015955A2 - Moléculas estimuladoras do sistema imunológico para tratamento de dependência a drogas de abuso, processos de síntese, vacina antidroga e usos - Google Patents

Abstract

moléculas estimuladoras do sistema imunológico para tratamento de dependência a drogas de abuso, processos de síntese, vacina antidroga e usos. a presente tecnologia trata de moléculas estimuladoras do sistema imunológico para serem utilizadas no tratamento da dependência e do uso abusivo de drogas e seus processos de síntese. essas moléculas compreendem uma estrutura química do tipo calixareno, preferencialmente calix[4]areno e/ou calix[8]areno, acoplada a um hapteno análogo da cocaína, preferencialmente gne e/ou gnc. descreve-se também uma vacina antidroga, especificamente anti-cocaína, utilizando tais moléculas. a vacina antidrogas pode também ser utilizada na prevenção da exposição fetal às drogas, em mulheres grávidas que façam uso de drogas e que não desejem ou não consigam interromper o uso delas durante a gravidez.

Description

“MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO PARA TRATAMENTO DE DEPENDÊNCIA A DROGAS DE ABUSO, PROCESSOS DE SÍNTESE, VACINA ANTIDROGA E USOS” [001] A presente tecnologia trata de moléculas estimuladoras do sistema imunológico para serem utilizadas no tratamento da dependência e do uso abusivo de drogas e seus processos de síntese. Essas moléculas compreendem uma estrutura química do tipo calixareno, preferencialmente calix[4]areno e/ou calix[8]areno, acoplada a um hapteno análogo da cocaína, preferencialmente GNE e/ou GNC. Descreve-se também uma vacina antidroga, especificamente anti-cocaína, utilizando tais moléculas. A vacina antidrogas pode também ser utilizada na prevenção da exposição fetal às drogas, em mulheres grávidas que façam uso de drogas e que não desejem ou não consigam interromper o uso delas durante a gravidez.

[002] O uso e a dependência à cocaína e ao crack são causas importantes de morbidade e mortalidade em todo o mundo, sendo considerado um verdadeiro problema de saúde pública e acometendo até 1% da população mundial. Atualmente, os tratamentos farmacológicos disponíveis para a reabilitação dos dependentes químicos à cocaína são baseados no uso de fármacos agonistas e antagonistas de neurotransmissores, nas psicoterapias e no emprego de técnicas de reabilitação psicossocial. Apesar dos esforços, a taxa de eficácia ainda é inferior a 45% dos casos tratados e a falta de medicamentos específicos ainda é um grande limitador (Global lllicit Drug Trends - United Nations Office on Drugs and Crime, UNODC 2003 - ISBN 92-1-148156-2).

[003] Nesse contexto, outras estratégias farmacológicas têm sido estudadas para o tratamento dos transtornos pelo uso abusivo de substâncias, como as dependências. Muitos usuários de drogas apresentam anticorpos antidroga, ou seja, anticorpos que se ligam às drogas, em sua corrente sanguínea, mesmo sem uma estimulação

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2/51 imunológica especifica para produção desses anticorpos (Martell et al., Vaccine pharmacotherapy for the treatment of cocaine dependence. Biol Psychiatry 58(2): 158-164; 2005). Esses anticorpos antidroga são capazes de se ligar à droga e impedir sua ação farmacológica (Kosten et al., Human therapeutic cocaine vaccine: safety and immunogenicity. Vaccine 20(7-8): 1196-1204; 2002). Além do efeito quelante, ou seja, de bloquear a ação da droga em receptores específicos na corrente sanguínea, os anticorpos antidroga, quando ligados à droga, aumentam muito a massa molecular dela. Esse fenômeno impede a passagem da droga pela barreira hematoencefálica e com isso a entrada dela no sistema nervoso central. Com isso, a droga não atua em seus sítios de ligação, não produzindo seu efeito. Acredita-se que a falta de um efeito psicotrópico “agradável” faça com que o usuário tenda a diminuir ou abandonar o uso da droga, interrompendo o ciclo que mantém a dependência química (Haney et al., Cocaine-specific antibodies blunt the subjective effects of smoked cocaine in humans. Biol Psychiatry 67(1): 59-65; 2010).

[004] Desde 1974, outros grupos de pesquisa têm utilizado estratégias de imunização para a produção de substâncias capazes de produzir anticorpos antidrogas (Bonese et al. Changes in heroin self-administration by a rhesus monkey after morphine immunisation. Nature. 1974; 252:708-710). O uso de várias estratégias de imunização faz-se necessário, visto que as estruturas químicas de drogas psicotrópicas são, por essência, moléculas de baixo peso molecular e, portanto, pouco indutoras de resposta imune contra elas, ou seja, pouco imunogênicas.

[005] As estratégias já utilizadas para tornar as drogas psicotrópicas imunogênicas envolvem, em sua maioria, o acoplamento da molécula de droga psicotrópica a uma proteína com alto peso molecular, como a albumina, as hemocianinas, ou às proteínas bacterianas e virais. Além disso, associa-se a utilização de substâncias moduladoras do sistema

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3/51 imune, conhecidas como adjuvantes. Até o momento, as vacinas antidroga descritas induzem a produção de anticorpos antidrogas, mas a resposta imune não produz anticorpos em quantidade suficiente para quelar a maior parte da droga na corrente sanguínea em aproximadamente 60% dos indivíduos imunizados. Mesmo com essa limitação, os estudos pré-clínicos e clínicos de fase I e II, de vacinas para o tratamento da dependência de cocaína, heroína, nicotina e anfetaminas, demonstraram um forte potencial deste tipo de tratamento para as dependências químicas (Kosten, Rosen et ai. 2002, Martell, Mitchell et ai. 2005, Haney, Gunderson et ai. 2010).

[006] Para que a estrutura química da cocaína possa ser conjugada à estrutura de uma proteína é necessário convertê-la em um derivado denominado hapteno. Alguns haptenos análogos da cocaína já foram descritos e preparados, como a succinil norcocaína (SNC), o GNC e também o GNE. Isolados, os haptenos não são capazes de induzir uma resposta imunológica, porque possuem uma baixa massa molecular e, por isso, para tornarem-se imunogênicos, são conjugados às estruturas de proteínas. Preparado em 2013 por Cai e colaboradores (Cai, X.; Whitfield, T.; Hixon, M. S.; Grant, Y.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Probing active cocaine vaccination performance through catalytic and noncatalytic hapten design. J. Med. Chem. 2013, 56, p.3701-3709), o hapteno GNE trata-se de um derivado amidíco da cocaína que foi conjugado à estrutura das proteínas do capsídeo de adenovírus sorotipo 5 e denominado dAdõGNE. Estudos relatados por Wee e colaboradores apontaram que ratos imunizados com dAdõGNE produziram elevados títulos IgG anticocaína por até 20 semanas (Wee, S.; Hicks, M. J.; De, Β. P.; Rosenberg, J. B.; Moreno, A. Y.; Kaminsky, S. M.; Janda, K. D.; Crystal, R. G.; Koob, G. F. Novel Cocaine Vaccine Linked to a Disrupted Adenovírus Gene Transfer Vector Blocks Cocaine Psychostimulant and Reinforcing Effects. Neuropsychopharmacology 2012, 37, p. 1083-1091). Já o hapteno GNC

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4/51 trata-se de um derivado éster da cocaína, preparado em 1995 por Carrera e colaboradores (Carrera, M. R. A.; Ashley, J. A.; Parsons, L. H.; Wirsching, P.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Suppression of psychoactive effects of cocaine by active immunization. Nature 1995, 378, p.727-730). Nesse trabalho, o hapteno GNC foi conjugado à proteína KLH (Keyhole limpet hemocyanin) do molusco Megathura crenulata e então designado KLH-GNC. Dentre os principais resultados, os autores observaram que ratos pré-imunizados com o conjugado KLH-GNC apresentaram alterações de comportamento e supressão na atividade locomotora, quando administrados com a cocaína. [007] Dentre as limitações atuais para o desenvolvimento de uma vacina antidrogas, estão: (1) a baixa imunogenicidade; (2) o risco da produção de reações imunológicas cruzadas entre as proteínas carreadoras de haptenos e com isso do desenvolvimento de doenças autoimunes; (3) a inespecificidade das moléculas imunógenas e com isso a produção de anticorpos pouco eficazes em quelar a droga alvo; (4) a instabilidade das moléculas, visto que são proteínas que podem ser degradadas pelas diferenças de temperatura e exposição aos raios ultravioleta.

[008] Por exemplo, a vacina anti-cocaína denominada ΤΑ-CD, que consiste em succinil norcocaína (SNC) conjugada com a subunidade B da toxina da cólera e o adjuvante hidróxido de alumínio gel, demonstrou, em testes clínicos, uma variação na concentração de anticorpos produzidos. Apenas os pacientes com altos títulos de anticorpos tornaram-se abstinentes (Martell et al. Cocaine Vaccine for the Treatment of Cocaine Dependence in Methadone-Maintained Patients: A Randomized, Double-Blind, PlaceboControlled Efficacy Trial. Arch Gen Psychiatry. 2009;66:1116-1123).

[009] O documento de patente US19910808515, de 16/12/1991, intitulado “Cocaine derivatives”, descreve a síntese de substâncias derivadas da cocaína que podem ser conjugadas a proteínas antigênicas para a

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5/51 produção de anticorpos para ensaios imunológicos, indicando a possibilidade de se produzir anticorpos a partir da molécula de cocaína. [010] O documento de patente US19920862801, de 03/04/1992, intitulado “Reagents for generating a polyclonal hydrolytic antibody response against cocaine and the monoclonal hydrolytic antibodies against cocaine derived through these reagentes”, descreve uma substância compreendendo um grupamento metil ecgonina ligado a um grupamento fenilfosfórico que é análogo a um intermediário do estado de transição da hidrólise do grupamento éster benzoílico da cocaína. Descreve também esses análogos ligados a proteínas carreadoras, capazes de produzir anticorpos anticocaína.

[011] O documento de patente US19950572849, de 14/12/1995, intitulado “Anti-cocaine vaccine”, descreve uma vacina anti-cocaína compreendendo a conjugação de um hapteno a uma proteína carreadora capaz de produzir uma resposta imune que reduz o efeito psicoativo da cocaína.

[012] Outras estratégias para produção de anticorpos já foram descritas, como no documento de patente US20100314847, de 17/03/2010, intitulado “Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse”, que descreve o uso de um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica para um anticorpo anti-cocaína.

[013] No artigo publicado por Quian Du e colaboradores (Du Q, Chen CP, Du LM; “Spectrofluorimetric study on the inclusion behavior of p-sulfonated calix [4, 6, 8] arene with cocaine hydrochloride”, Analytical Chemistry and Indian Journal ACAIJ, 15 (8) 2015, págs. 281-289), os autores descrevem o uso dos ácidos p-sulfônicos calix[n]arenos (n = 4, 6 ou 8) como moléculas hóspede para a cocaína, visando o estabelecimento de um método analítico para determinação da cocaína em amostras. Para tal, Du e colaboradores realizaram vários estudos de fluorescência e de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) sobre a estabilidade do complexo supramolecular formado

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6/51 entre os ácidos p-sulfônicos calix[n]arenos (n = 4, 6 ou 8) e a cocaína. O objetivo destes autores não incluiu ou citou o uso desse complexo supramolecular como um potencial imunógeno para a cocaína.

[014] No estado da técnica não foi encontrada tecnologia semelhante à descrita na presente invenção, que proponha a utilização de moléculas não proteicas, os ácidos p-sulfônicos calix[n]arenos (n = 4, 6 ou 8), como plataformas estruturais carreadoras de haptenos na síntese de vacinas para o tratamento de dependências de substâncias de abuso.

[015] A presente invenção propõe substâncias com uma estrutura bem definida; de fácil obtenção, purificação e caracterização; de fácil escalonamento; de considerável estabilidade a altas temperaturas e à luz; e de alto peso molecular g mol'¹, fator fundamental para promover a indução de uma resposta imunológica. Além disso, por não serem moléculas de origem proteica, elas têm um menor potencial para produzir reações imunológicas cruzadas. Isso faz com que elas tenham menor risco para o desenvolvimento de doenças autoimunes ou de interferências no organismo imunizado.

[016] As moléculas propostas na presente invenção mostraram-se capazes de imunizar ativamente os pacientes tratados com ela. Essa imunização faz com que o organismo imunizado produza anticorpos específicos contra a droga. Esses anticorpos são capazes de se ligar à droga na corrente sanguínea, impedindo a ação farmacológica dela no sistema nervoso central e em órgãos periféricos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [017] A Figura 1 apresenta as estruturas das substâncias V8N1, V8N2, V4N1 e V4N2.

[018] A Figura 2 apresenta o esquema de reação de acoplamento entre os haptenos GNC e GNE aos calixarenos 4NH e 8NH.

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7/51 [019] A Figura 3 apresenta a rota sintética para obtenção dos calixarenos 4NH e 8NH.

[020] A Figura 4 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 4OH.

[021] A Figura 5 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 4OH.

[022] A Figura 6 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 4TA.

[023] A Figura 7 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 4TA.

[024] A Figura 8 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 4NO.

[025] A Figura 9 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 400 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 4NO.

[026] A Figura 10 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 4NH.

[027] A Figura 11 apresenta o espectro no infravermelho obtido para a substância 4NH.

[028] A Figura 12 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 4NH.

[029] A Figura 13 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de ¹³C; 50 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 4NH.

[030] A Figura 14 apresenta a rota sintética para obtenção dos haptenos GNEeGNC.

[031] A Figura 15 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 3Bz.

[032] A Figura 16 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CD₃OD] obtido para a substância 3Bz.

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8/51 [033] A Figura 17 apresenta o esquema de reação de obtenção das substâncias AP1 eAP2.

[034] A Figura 18 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância AP1.

[035] A Figura 19 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância AP2.

[036] A Figura 20 o esquema de reação de obtenção dos intermediários 2NBn e 2OBn.

[037] A Figura 21 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 2OBn.

[038] A Figura 22 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 2NBn.

[039] A Figura 23 apresenta as reações para a obtenção dos haptenos GNCeGNE.

[040] A Figura 24 apresenta o espectro no infravermelho obtido para a substância GNC.

[041] A Figura 25 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI3] obtido para a substância GNC. [042] A Figura 26 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de ¹³C; 50 MHz, CDCI3] obtido para a substância GNC.

[043] A Figura 27 apresenta o espectro no infravermelho obtido para a substância GNE.

[044] A Figura 28 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CD₃OD] obtido para a substância GNE.

[045] A Figura 29 apresenta o esquema de reação de obtenção das substâncias V4N1 e V4N2.

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9/51 [046] A Figura 30 apresenta o espectro de massas (MALDI-TOF) para a substância V4N1.

[047] A Figura 31 apresenta o espectro no infravermelho obtido para a substância V4N2.

[048] A Figura 32 apresenta o mapa de contorno HSQC obtido para a substância V4N2.

[049] A Figura 33 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 8OH.

[050] A Figura 34 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 8OH.

[051] A Figura 35 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 8TA.

[052] A Figura 36 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 8TA.

[053] A Figura 37 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 8NO.

[054] A Figura 38 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 8NO.

[055] A Figura 39 apresenta o esquema de reação de obtenção da substância 8NH.

[056] A Figura 40 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 200 MHz, CDCI₃] obtido para a substância 8NH.

[057] A Figura 41 apresenta o esquema de reação de obtenção das substâncias V8N1 e V8N2.

[058] A Figura 42 apresenta o espectro de massas (MALDI-TOF) para a substância V8N1.

[059] A Figura 43 apresenta o espectro no infravermelho obtido para a substância V8N2.

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10/51 [060] A Figura 44 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogênio [RMN de ¹H; 400 MHz, CDCI₃] obtido para a substância V8N2.

[061] A Figura 45 apresenta o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de ¹³C; 100 MHz, CDCI₃] obtido para a substância V8N2.

[062] A Figura 46 apresenta o espectro de massas (MALDI-TOF) para a substância V8N2.

[063] A Figura 47 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgG, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e positivo e da substância V4N2 na dose de 30 nM. A concentração de IgG anticocaína é significativamente maior que o grupo controle negativo do sétimo ao 42- dia após o início da vacinação.*p^0,001 V4N2 versus Controle negativo; **p<0,01 V4N2 versus KLH+GNE; ANOVA, teste de Bonferroni.

[064] A Figura 48 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgM, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e positivo e da substância V4N2 na dose de 30 nM. A concentração de IgM anticocaína é significativamente menor que o grupo controle negativo no sétimo e no 42° dias após a primeira vacinação para os grupos controle positivo e V4N2.*p<0,01 V4N2 versus Controle negativo; ANOVA, teste de Bonferroni. [065] A Figura 49 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgG, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e diferentes doses da substância V4N2. A concentração de IgG anticocaína é significativamente maior que o grupo controle negativo no sétimo dia para todas as doses. *p<0,001 entre V4N2 todas doses versus Controle negativo; **p<0,01 entre V4N2 300nMe30nMversusControle negativo; ***p<0,001 V4N2 30nMversusControle negativo. ANOVA, teste de Bonferroni.

[066] A Figura 50 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgM, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e diferentes doses da molécula V4N2. A concentração de IgM anticocaína é significativamente

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11/51 maior que o grupo controle negativo no sétimo dia para a dose de 30 nM, no quadragésimo segundo dia para as doses de 3,0 ΠΜ e 30 nM. *p<0,001, V4N2 30 nM versus Controle negativo; **p<0,05, V4N2 3,0 M e30 nM versus Controle negativo; ANOVA, teste de Bonferroni.

[067] A Figura 51 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgG, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e positivo e da molécula V8N2 na dose de 30 nM. A concentração de IgG anticocaína é significativamente maior que o grupo controle negativo do sétimo ao quadragésimo segundo dia do início da vacinação.*p^0,001 V8N2 versus Controle negativo; **p<0,01 V8N2 versus KLH+GNE; ***p>0,005 Controle negativo versus V8N2 e KLH+GNE; ****p>0,001 Controle negativo versus KLH+GNE e p=0,01 Controle negativo versus V8N2, ANOVA, teste de Bonferroni.

[068] A Figura 52 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgM, medido por ELISA dos grupos controle negativo e positivo e da molécula V8N2. A concentração de IgM anticocaína é significativamente menor que o grupo controle negativo no sétimo dia após a primeira imunização. *p<0,001 Controle negativo versus V8N2; ANOVA, teste de Bonferroni.

[069] A Figura 53 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgG, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e diferentes doses da molécula V8N2 (300ΠΜ; 3,0nM; 30 nM). A concentração de IgG anticocaína é significativamente maior que o grupo controle negativo no sétimo dia para todas as doses. *p<0,001 Controle negativo versus V8N2 todas doses; **p<0,02 Controle negativo versus V8N2 30 nM e p=0,047 Controle negativo versus V8N2 3,0 ΠΜ; ***p=0,02 Controle negativo versus V8N2 30 nM; p=0,042 Controle negativo versus V8N2 3,0 DM e p=0,002 Controle negativo versus V8N2 300 ΠΜ. ANOVA, teste de Bonferroni.

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12/51 [070] A Figura 54 apresenta a produção de anticorpos anticocaína tipo IgM, medidas por ELISA dos grupos controle negativo e diferentes doses da substância V8N2 (300 ΠΜ, 3,0 ΠΜ, 30nM). *p>0,001 Controle negativo versus V8N2 30 nM; **p=0,002 Controle negativo versus V8N2 300 ΠΜ; ANOVA, teste de Bonferroni.

[071] A Figura 55 apresenta o ensaio de adsorção do plasma de animais imunizados com cocaína em doses de 10'² a 10'⁹mg mL'¹ de cocaína.

[072] A Figura 56 apresenta os estudos de biodistribuição ex vivo do radiotraçador, 90 minutos após administração intravenosa do [^99mTc]TRODAT-1 em animais previamente imunizados com V4N2 e V8N2 (n=7). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e analisados pelo Teste one-way ANOVA e Newman-Keuls Muitipie Comparison Test.

[073] A Figura 57 apresenta a biodistribuição ex vivo do radiotraçador, 90 minutos após administração intravenosa do [^99mTc]-TRODAT-1 no cérebro e sangue de animais previamente imunizados com V4N2 e V8N2 (n=7). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão e analisados pelo Teste one-way ANOVA e Newman-Keuls Muitipie Comparison Test.

[074] A Figura 58 apresenta as imagens cintilográficas dos cérebros dos animais dos grupos Controle, V4N2 e V8N2. A escala de cores representa os níveis de radioatividade, sendo a cor azul a menor captação de radioatividade da ordem do background. Por outro lado, o maior nível de radioatividade está representado na escala pela cor rosa claro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [075] A presente tecnologia trata de moléculas estimuladoras do sistema imunológico para serem utilizadas no tratamento da dependência e do uso abusivo de drogas e seus processos de síntese. Essas moléculas compreendem uma estrutura química do tipo calixareno, preferencialmente calix[4]areno e/ou calix[8]areno, acoplada a um hapteno análogo da cocaína, preferencialmente GNE e/ou GNC. Descreve-se também uma

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13/51 vacina antidroga, especificamente anti-cocaína, utilizando tais moléculas. A vacina antidrogas pode também ser utilizada na prevenção da exposição fetal às drogas, em mulheres grávidas que façam uso de drogas e que não desejem ou não consigam interromper o uso delas durante a gravidez.

[076] Mais especificamente, a presente invenção compreende moléculas formadas pelo acoplamento de calixarenos ao hapteno GNE (ácido 6(2/?,3S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo [3.2.1] octano-2-carboxamidohexanoico) e/ou ao hapteno GNC (ácido 6-(7/?,2/?,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2-carboniloxi-hexanoico), preferencialmente as moléculas formadas pelo acoplamento do calix[4]areno ao hapteno GNC ou GNE, aqui referidas como V4N1 e V4N2, respectivamente; e as moléculas formadas pelo acoplamento do calix[8]areno ao hapteno GNC ou GNE, aqui referidas como V8N1 e V8N2, respectivamente; conforme representadas na Figura 1.

[077] O processo proposto para a síntese das moléculas estimuladoras do sistema imunológico V4N1 e V4N2 compreende as seguintes etapas:

a. Obtenção da substância 4 OH, conforme ilustrado na Figura 4:

i. Preparar uma mistura de p-fen>butilfenol (0,141 a 14,100 g ml_'¹) e de hidróxido de sódio (0,002 a 0,200 g ml_'¹) em formaldeído;

ii. Aquecer a 110-120°C e agitar o sistema até a formação de um sólido amarelo;

iii. Adicionar éter difenílico para fazer uma solução 0,3 a 0,7% m/v (de p-fen>butilfenol em relação ao éter difenílico). Agitar e manter sob condições de refluxo por 150 a 210 minutos;

iv. Resfriar até temperatura ambiente, adicionar acetato de etila (180 a 220% v/v), agitar por 90 a 150 minutos e repousar;

v. Filtrar e lavar o sólido usando, sucessivamente acetato de etila, ácido acético e água destilada;

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b. Obtenção da substância 4TA, conforme ilustrado na Figura 6:

i. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “a” (0,003 a 0,300 g.mL'¹) e hidreto de sódio (0,001 a 0,100 g mL'¹) em dimetilformamida;

ii. Agitar por 50 a 70 minutos e adicionar n-bromobutano (0,008 a 0,800 g mL'¹);

iii. Aquecer a 55 a 65°C e agitar por 22 a 26 horas;

iv. Resfriar à temperatura ambiente;

v. Adicionar água (20 a 30% v/v) e filtrar o sólido obtido;

c. Obtenção da substância 4NO, conforme ilustrado na Figura 8:

i. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “b” (0,87 a 87,0% m/v) juntamente com ácido trifluoroacético (1,2 a 120,0% v/v) e ácido nítrico fumegante (1,0 a 100,0% v/v) em diclorometano;

ii. Agitar por 50 a 70 minutos e verter em água destilada (0,145 a 14,5% m/v);

iii. Realizar a extração do produto obtido em “ii” utilizando diclorometano;

iv. Lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, posteriormente, com solução saturada de cloreto de sódio;

v. Secar, filtrar e evaporar a fase orgânica utilizando, preferencialmente, destilação a pressão reduzida;

vi. Recristalizar o sólido obtido em “v” usando clorofórmio e metanol (2 a 8 % m/v).

vii. Filtrar o sólido branco obtido;

d. Obtenção da substância 4NH, conforme ilustrado pela Figura 10:

i. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “c” (0,2 a 20,0% m/v) juntamente com hidrazina (2,0 a 200,0% v/v) e paládio (quantidade catalítica) em etanol;

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15/51 ii. Aquecer a 80°C e agitar por 48 horas;

iii. Remover o catalisador por filtração;

iv. Evaporar a fase orgânica e lavar o sólido obtido com água destilada;

e. Preparação dos imunógenos V4N1 e V4N2 pela reação de acoplamento entre o calixareno 4NH e o hapteno GNC ou GNE, respectivamente, conforme ilustrado pela Figura 2:

I. Preparar uma mistura do hapteno (0,012 a 1,200 g mL'¹), sendo o hapteno GNE (para a síntese da V4N2) e o hapteno GNC (para a síntese da V4N1), juntamente com diisopropiletilamina (0,004 a 0,400 g mL'¹) e hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-ox/)-tris(pirrolidino)fosfônio (0,02 a 2,00 g ml_'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 30 a 50 minutos à temperatura ambiente;

ii. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “d” (0,003 a 0,300 g ml_'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 5 a 15 minutos à temperatura ambiente;

iii. Transferir a solução obtida na etapa “ii” gota-a-gota, sob atmosfera de gás inerte, para o recipiente contendo a mistura obtida na etapa “i”, para uma concentração final de 0,039 a 3,9 g mL'¹ e agitar à temperatura ambiente por 22 a 28 horas;

iv. Adicionar diclorometano e lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, posteriormente, com água destilada;

v. Secar, filtrar e evaporar a fase orgânica, preferencial mente por destilação. Purificar o produto utilizando preferencialmente cromatografia em coluna.

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16/51 [078] O processo proposto para a síntese das moléculas estimuladoras do sistema imunológico V8N1 e V8N2 compreende as seguintes etapas:

a. Obtenção da substância 8OH, pela reação de ciclocondensação do p-terc-butilfenol com o paraformaldeído, conforme ilustrado na Figura 28:

i. Preparar uma solução de p-fen>butilfenol (25 a 100 g L'¹) juntamente com paraformaldeído (10 a 36 g L'¹) e hidróxido de sódio (solução aquosa de 10 mol L'¹; 0,15 a 15 mL) em xileno;

ii. Agitar e manter sob condições de refluxo à temperatura de 130 a 150°C, por 4 a 10 horas;

jjj. Resfriar até temperatura ambiente;

iv. Filtrar o precipitado e lavar sucessivamente com porções de tolueno, éter etílico, acetona e água destilada, na proporção sólido/solvente de 20 a 25% m/v;

v. Dissolver o precipitado em clorofórmio para fazer uma solução de 7,0 a 8,0% m/v e levar ao aquecimento (40 a 60°C);

vi. Resfriar a solução até a temperatura ambiente e filtrar o sólido recristalizado obtido;

b. Obtenção da substância 8TA, a partir da O-alquilação de 8OH, conforme ilustrado na Figura 31:

i. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “a” (3 a 15 g L'¹) em dimetilformamida;

ii. Aquecer à temperatura de 50 a 80°C, adicionar hidreto de sódio (12 a 50 g L'¹), agitar de 20 minutos a 3 horas e então adicionar n-bromobutano (280 a 560 g L'¹) e iodeto de potássio (2 a 50 g L'¹);

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17/51 jjj. Resfriar a solução até a temperatura ambiente e agitar por 72 a 96 horas;

iv. Adicionar diclorometano (2,0 a 3,5% m/v);

v. Lavar a fase orgânica com solução ácida de 0,1 mol L'¹;

vi. Evaporar a fase orgânica, preferencialmente por destilação;

vii. Adicionar acetona (2,0 a 20% m/v);

viii. Filtrar o precipitado obtido em “vii”;

c. Obtenção da substância 8NO, a partir da ipso-nitração de 8TA, conforme ilustrado na Figura 32:

I. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “b” (50 a 200 g.L'¹) juntamente com nitrato de sódio (260 a 1500 g L'¹) em ácido, preferencialmente ácido acético glacial;

ii. Manter sob agitação à temperatura ambiente por 4 a 10 horas;

iii. Verter em água destilada (1,2 a 2,0% m/v), filtrar, lavar o precipitado com (2,0 a 3,0% m/v) de metanol e em seguida solubilizar em acetato de etila (30,0 a 60,0% m/v), adicionar metanol (20,0 a 30,0% m/v) e filtrar o sólido obtido;

d. Obtenção da substância 8NH, a partir da redução de 8NO, conforme ilustrado na Figura 34:

I. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “c” (1 a 5 g L'¹) juntamente com hidrazina monoidratada (90 a 300 g L'¹) e paládio (0,02 a 1,5 g L'¹ de) em mistura de etanol e tetraidrofurano (1:1; v/v);

ii. Manter em agitação sob condições de refluxo por 24 a 36 horas, filtrar o paládio, e lavar o sólido obtido com metanol (de 2,0 a 8,0% m/v) e uma solução metanólica ácida (2 mol L'¹; de 2,0 a 8,0% m/v);

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18/51 iii. Concentrar pelo menos 50% da fase orgânica e adicionar água destilada (2 a 8% m/v);

iv. Filtrar o precipitado obtido em “iii” e lavar com água destilada;

e. Obtenção dos imunógenos V8N1 e V8N2, pela reação de acoplamento entre o calixareno 8NH e o hapteno GNC ou GNE, respectivamente, conforme ilustrado na Figura 2:

i. Preparar uma mistura do hapteno GNE ou GNC (20 a 80 g L ¹) juntamente com diisopropiletilamina (5 a 35 g L'¹) e hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-il-oxi)-tris(pirrolidino)fosfônio (20 a 100 g L'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 30 a 50 minutos à temperatura ambiente;

ii. Preparar uma solução do sólido obtido na etapa “d” (4 a 25 g ml_'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 5 a 15 minutos à temperatura ambiente;

iii. Transferir a solução obtida na etapa “ii” gota-a-gota, sob atmosfera de gás inerte, para o recipiente contendo a mistura obtida na etapa “i”, para a concentração final de 49 a 240 g ml_'¹;

iv. Agitar à temperatura ambiente por 24 a 28 horas;

v. Adicionar diclorometano e lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, posteriormente, com água destilada, secar, filtrar e evaporar a fase orgânica, preferencialmente por destilação, e purificar o produto utilizando preferencialmente cromatografia em coluna.

[079] A vacina antidroga, especificamente anti-cocaína, compreende pelo menos uma das moléculas estimuladoras do sistema imunológico definidas acima e excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis. Pode

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19/51 ser utilizada na preparação de uma vacina, para tratar pacientes com dependência a drogas de abuso, preferencialmente cocaína e também para prevenir a exposição fetal às drogas, em mulheres grávidas que façam uso de drogas, preferencialmente cocaína.

[080] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.

EXEMPLO 1 - Síntese do imunógeno V4N1 e V4N2 [081] Os imunógenos V4N1 e V4N2 foram preparados pela reação de acoplamento entre o calixareno 4NH e o hapteno GNC ou GNE, respectivamente, conforme representado na Figura 2. A metodologia utilizada na presente invenção para a ligação do hapteno GNC ou GNE ao calixareno 4NH é uma metodologia para formação de ligações amida, adaptada de Geraci, C.; Consoli, G. M. L.; Galante, E.; Bousquet, E.; Pappalardo, M.; Spadaro, A. Calix[4]arene decorated with four Tn Antigen Glycomimetic Units and P3CS Immunoadjuvant: synthesis, characterization, and Anticancer Immunological Evaluation. Bioconjugate Chem. 2008, 19, p.751-758.

[082] O calixareno 4NH foi preparado em quatro etapas, a partir do p-tercbutilfenol, conforme representado na Figura 3. As quatro reações da presente invenção tratam-se de adaptações de quatro metodologias do estado da técnica (Gutsche, C. D.; Iqbal, M. p-tert-butylcalix[4]arene. Org. Synth. 1990, 68, p.234-236 ; Kenis, P. J. A.; Noordman, O. F. J.; Schõnherr, H.; Kerver, E. G.; Snellink-Ruêl, B. Η. M.; van Hummel, G. J.; Harkema, S.; van der Vorst, C. P. J. M.; Hare, J.; Picken, S. J.; Engbersen, J. F. J.; van Hulst, N. F.; Vancso, J.; Reinhoudt, D. N. Supramolecular materiais: molecular packing of tetranitrotetrapropoxycalix[4]arene in highly stable films with second-order nonlinear optical properties. Chem. Eur. J. 1998, 4, p.1225-1234; Verboom, W.; Durie, A.; Egberink, R. J. M.; Asfari, Z.; Reinhoudt, D. N. Ipso Nitration of p-tert-Butylcalix[4]arenes. J. Org. Chem.

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1992, 57, p.1313-1316; Sansone, F.; Dudic, M.; Donofrio, G.; Rivetti, C.; Baldini, L.; Casnati, A.; Cellai, S.; Ungaro, R. DNA Condensation and Cell transfection properties of Guanidinium Calixarenes: Dependence on macrocycle lipophilicity, size, and conformation. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, p. 14528-14536).

[083] A substância 4OH foi obtida conforme representado na Figura 4. A metodologia desenvolvida na presente invenção foi adaptada de Gutsche, C. D.; Iqbal, M. p-tert-butylcalix[4]arene. Org. Synth. 1990, 68, p.234-236. Em um balão contendo 25,37 g (166,5 mmol) de p-ten>butilfenol, adicionaram-se 18 mL de formaldeído (solução a 37% em água) e 0,31 g (7,5 mmol) de hidróxido de sódio. A mistura reacional foi aquecida a uma temperatura de 110-120°C e mantida sob agitação mecânica por 60 minutos. À medida do progresso da reação, o meio adquiriu uma coloração amarelada e, posteriormente, originou um sólido amarelo, sobre o qual foram adicionados 250 mL de éter difenílico. O sistema reacional foi mantido sob agitação mecânica por mais 60 minutos, ocorrendo a formação de espuma. Em seguida, a mistura reacional foi mantida sob refluxo (aproximadamente a 260°C) por 180 minutos e adquiriu coloração bastante escura. Após atingir a temperatura ambiente, cerca de 500 mL de acetato de etila foram adicionados ao meio e mantido sob agitação por 120 minutos. Após repouso por aproximadamente 12 horas, o sólido obtido foi removido por filtração a vácuo e submetido a lavagens consecutivas usando acetato de etila (100 mL), ácido acético (100 mL) e água destilada (500 mL). O produto desejado foi obtido como um sólido branco em 51% de rendimento (13,99 g).

[084] O espectro no infravermelho obtido para a substância 4OH apresenta banda característica dos estiramentos das ligações O-H em 3158 cm'¹. Uma banda intensa foi observada na frequência de 1200 cm'¹, característica dos estiramentos das ligações C-0 em combinação com as

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21/51 deformações angulares das ligações O-H. As bandas referentes ao estiramento das ligações C=C dos anéis aromáticos foram observadas em 1481 e 1462 cm'¹. Já nas frequências de 1392 e 1361 cm-1 foram verificadas duas bandas de absorção relacionadas, possivelmente, às deformações angulares das ligações C-H dos grupos fen>butila.

[085] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 5) observa-se o simpleto em 1,21 ppm relacionado aos 36 átomos de hidrogênio dos grupamentos fen>butila. Centralizados em 3,50 e 4,26 ppm, foram verificados dois dupletos atribuídos aos hidrogênios dos grupos metileno situados entre os anéis aromáticos. O simpleto em 7,05 ppm, integrado para oito átomos de hidrogênio, foi atribuído aos hidrogênios dos grupamentos aromáticos. Por fim, o sinal mais desblindado deste espectro, em 10,35 ppm, foi atribuído aos quatro hidrogênios fenólicos presentes na estrutura de 4OH.

[086] No espectro de RMN de ¹³C do da substância 4OH são observados quatro sinais (125,9; 127,7; 144,4 e 146,7 ppm) pertencentes aos carbonos dos anéis aromáticos, dos quais apenas um (125,9 ppm) está presente no subespectro DEPT-135. Identificou-se também o sinal referente aos átomos de carbono -CH₃ em 31,4 ppm e o sinal referente aos carbonos metilênicos em 32,6 ppm que apresenta fase invertida no subespectro DEPT-135. Em □34,0 ppm, foi verificado o sinal relativo aos carbonos não-hidrogenados dos grupamentos fen>butila.

[087] A substância 4TA foi obtida conforme representado na Figura 6. A metodologia desenvolvida na presente invenção trata de uma adaptação de Kenis, P. J. A.; Noordman, O. F. J.; Schõnherr, H.; Kerver, E. G.; SnellinkRuêl, Β. Η. M.; van Hummel, G. J.; Harkema, S.; van der Vorst, C. P. J. M.; Hare, J.; Picken, S. J.; Engbersen, J. F. J.; van Hulst, N. F.; Vancso, J.; Reinhoudt, D. N. Supramolecular materiais: molecular packing of tetranitrotetrapropoxycalix[4]arene in highly stable films with second-order

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22/51 nonlinear optical properties. Chem. Eur. J. 1998, 4, p. 1225-1234. Em um balão de 100 ml_ contendo 0,65 g (1 mmol) de 4OH, adicionaram-se 20 ml_ de dimetilformamida (DMF) anidra e 0,20 g (5 mmol) de hidreto de sódio (60% em óleo mineral). A mistura de reação foi mantida sob agitação magnética por 60 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, foram adicionados 0,69 g (5 mmol) de n-bromobutano. O sistema foi mantido a 60°C por 24 horas, sob agitação magnética. Após resfriar até temperatura ambiente, a agitação foi interrompida e adicionados, aproximadamente, 5 ml_ de água destilada gelada para a precipitação do sólido. O precipitado foi filtrado sob vácuo e, posteriormente, lavado com metanol. Foram obtidos 0,67 g do sólido branco, correspondendo a 77% de rendimento da reação. [088] No espectro no infravermelho obtido para a substância 4TA é possível verificar o desparecimento da banda característica dos estiramentos das ligações O-H em 3158 cm'¹, presente no espectro da substância 4OH. Bandas de estiramentos das ligações C-H dos grupos fen>butila puderam ser identificadas em 2954 e 2867 cm'¹. Uma banda intensa foi observada na frequência de 1199 cm'¹, característica dos estiramentos das ligações C-O-C de alquil aril éteres.

[089] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 7) é possível identificar um multipleto em 1,08-0,97 ppm, integrado para 48 hidrogênios, atribuídos aos hidrogênios -CH₃ dos grupos fen>butila e nbutila. Os hidrogênios metilênicos situados entre os anéis aromáticos apresentam-se como um par de dupletos em 4,42 e 3,11 ppm (J = 12,0 Hz). [090] No espectro de RMN de ¹³C da referida substância estão contidos os sinais dos grupamentos ferobutila (em 31,7 ppm e em 34,0 ppm) e os sinais dos quatro carbonos dos grupos n-butila, entre eles o sinal do carbono terminal em 14,4 ppm.

[091] A substância 4NO foi obtida conforme representado na Figura 8. A metodologia da presente invenção foi adaptada de Verboom, W.; Durie, A.;

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Egberink, R. J. M.; Asfari, Z.; Reinhoudt, D. N. Ipso Nitration of p-tertButylcalix[4]arenes. J. Org. Chem. 1992, 57, p.1313-1316. A um balão foram adicionados 0,87 g (1,0 mmol) de 4TA, 1,2 ml_ de ácido trifluoroacético (TFA), 1 ml_ de HNO₃ fumegante (gota-a-gota) e 10 ml_ de DCM. Após uma hora de agitação magnética à temperatura ambiente, a reação foi encerrada, vertendo-a em um béquer contendo 50 ml_ de água gelada. Em seguida, realizou-se uma extração líquido-líquido utilizando 50 ml_ de DCM. A fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaHCO₃ (2 x 20 ml_) e solução saturada de NaCI (2 x 20 ml_) e, posteriormente, secada com MgSO₄ anidro e filtrada. Após concentrar a fase orgânica utilizando o evaporador rotatório sob pressão reduzida, o produto bruto foi recristalizado em uma mistura CHCI₃/MeOH. Depois de realizar uma filtração sob pressão reduzida, o produto desejado foi obtido como um sólido branco em 91% de rendimento (0,75 g).

[092] No espectro no infravermelho obtido para a substância 4NO foram identificadas duas importantes bandas em 1515 e 1343 cm'¹ relacionadas, provável e respectivamente, aos estiramentos assimétrico e simétrico dos grupos nitro.

[093] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 9) a principal alteração em relação ao espectro do material de partida 4TA é o desparecimento do sinal multipleto referente aos hidrogênios do grupo tercbutila (1,08-0,97 ppm, integrado para 48 hidrogênios). O tripleto em 1,02 ppm, integrado para 12 átomos de hidrogênio, foi atribuído aos hidrogênios —CH₃ do grupamento n-butila. O sinal dos hidrogênios aromáticos em 7,57 ppm, integrado para 8 hidrogênios, é justificado pelo elevado efeito retirador de densidade eletrônica, promovido pelos grupamentos nitro. Os demais sinais presentes no espectro foram atribuídos aos hidrogênios metilênicos entre os anéis (4,53 ppm e 3,41 ppm) e aos hidrogênios alifáticos do grupo n-butila.

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24/51 [094] A análise e interpretação dos espectros de RMN de ¹³C e DEPT-135 para 4NO indicou a presença de quatro sinais de carbonos aromáticos (161,9; 143,1; 135,6 e 124,2 ppm), entretanto apenas um deles, em 124,2 ppm, é hidrogenado. Estes dados são condizentes com a estrutura proposta para o produto 4NO. A realização do experimento bidimensional HSQC permitiu a atribuição dos sinais com □ bastante próximos (32,3 e

31,3 ppm).

[095] A substância 4NH foi obtida conforme representado na Figura 10. A metodologia desenvolvida na presente invenção foi adaptada de Sansone, F.; Dudic, M.; Donofrio, G.; Rivetti, C.; Baldini, L.; Casnati, A.; Cellai, S.; Ungaro, R. DNA Condensation and Cell transfection properties of Guanidinium Calixarenes: Dependence on macrocycle lipophilicity, size, and conformation. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, p. 14528-14536. Foram pesados 0,50 g (0,60 mmol) de 4NO e adicionados a um balão de fundo redondo. Em seguida, foram acrescentados 5,0 mL de hidrazina monoidratada, 25 mL de etanol absoluto e quantidade catalítica de paládio/carbono 10%. A mistura de reação foi mantida sob agitação magnética, a uma temperatura de 80°C, durante 48 horas. Após esse período, o catalisador foi removido por filtração simples e a fase orgânica filtrada concentrada em evaporador rotatório. O sólido obtido foi lavado com água destilada, fornecendo o produto de interesse em 94% de rendimento (0,40 g).

[096] No espectro no infravermelho obtido para a substância 4NH (Figura 11) é perceptível a ausência das bandas de absorção em 1515 e 1343 cm'¹ características dos grupos nitro e presentes no espectro do precursor 4NO. Além disso, é possível identificar no espectro de 4HN bandas em torno de 3342 cm'¹, possivelmente associadas aos estiramentos de aminas primárias aromáticas.

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25/51 [097] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 12) observa-se o sinal simpleto, relacionado aos oito hidrogênios aromáticos, em 6,05 ppm enquanto que esse mesmo sinal, no precursor 4NO (Figura 9), apresenta-se em 7,58 ppm. O referido sinal é verificado numa região mais blindada no espectro de 4NH, provavelmente, pelo efeito doador de densidade eletrônica dos grupos amino. Ainda é possível verificar o sinal largo atribuído aos hidrogênios do grupamento NH₂ em □ 3,04, sobreposto ao sinal dupleto de um dos hidrogênios da ponte metilênica.

[098] O espectro de RMN de ¹³C da referida substância (Figura 13) ao ser comparado com o espectro do precursor 4NO observa-se uma alteração no valor dos deslocamentos químicos dos carbonos aromáticos, principalmente nos carbonos das posições orto e para. O grupamento amino aumenta a densidade eletrônica nos carbonos destas posições devido ao efeito de ressonância e, por este motivo, estes são observados em uma região mais blindada do espectro.

[099] A preparação do hapteno GNE, análogo da cocaína, foi realizada conforme representado na Figura 14. As reações da Figura 14 foram desenvolvidas na presente invenção baseadas em Findlay, S. P. The threedimensional structure of the Cocaines: Part I. Cocaine and Pseudococaine. J. Am. Chem. Soc. 1954, 11, p.2855-2862; Sakurai, M.; Wirsching, P.; Janda, K. D. Design and synthesis of a cocaine-diamide hapten for vaccine development. Tetrahedron Lett. 1996, 37, p.5479-5482; Cai, X.; Whitfield, T.; Hixon, M. S.; Grant, Y.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Probing active cocaine vaccination performance through catalytic and noncatalytic hapten design. J. Med. Chem. 2013, 56, p.3701-3709.

[0100]A preparação do hapteno GNC, outro análogo da cocaína, foi realizada segundo representado na Figura 14. Essas reações foram desenvolvidas na presente invenção baseadas nos trabalhos de Findlay, S. P. The three-dimensional structure of the Cocaines: Part I. Cocaine and

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Pseudococaine. J. Am. Chem. Soc. 1954, 11, p.2855-2862; Sakurai, M.; Wirsching, P.; Janda, K. D. Design and synthesis of a cocaine-diamide hapten for vaccine development. Tetrahedron Lett. 1996, 37, p.54795482;Cai, X.; Whitfield, T.; Hixon, M. S.; Grant, Y.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Probing active cocaine vaccination performance through catalytic and noncatalytic hapten design. J. Med. Chem. 2013, 56, p.3701-3709.

[0101]A substância 3Bz foi obtida a partir da hidrólise cocaína conforme representado na Figura 15 (Findlay, S. P. The three-dimensional structure of the Cocaines: Part I. Cocaine and Pseudococaine. J. Am. Chem. Soc. 1954, 11, p.2855-2862).

[0102] Nesta metodologia, 3,87 mmol de cocaína foram adicionados a 20 mL de água destilada e o sistema foi aquecido e mantido sob refluxo e agitação magnética por 24 horas. Após remoção do solvente e adição de 80 mL de acetona, o produto desejado 3Bz foi obtido em 84% de rendimento. [0103] O espectro no infravermelho obtido para a substância 3Bz apresentou uma banda característica de estiramento de ligações N-H em 3224 cm'¹, a banda de estiramento de carbonilas de grupos éster (1718 cm'¹) e também uma banda do estiramento assimétrico de grupos carboxilato (1590 cm'¹).

[0104] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 16) verificou-se os sinais dos hidrogênios do grupo benzoíla: um multipleto em 8,05-8,01 ppm (atribuído aos hidrogênios orto ao substituinte), um multipleto emD7,64-7,57 ppm (atribuído ao hidrogênio para ao substituinte) e um tripleto em 7,46 ppm (atribuído aos hidrogênios meta ao substituinte).

[0105] No espectro de RMN de ¹³C da referida substância observa-se 14 sinais, condizentes com a estrutura proposta para 3Bz, destacando-se o sinal em 177,2 ppm do carbono do grupo éster benzoílico e o sinal em 50,3 ppm do carbono do grupo metila ligado ao átomo de nitrogênio. No espectro DEPT-135, foram observados três sinais de carbono com fase invertida em

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34,4, 25,1 e 24,7 ppm, referentes aos três carbonos metilênicos da estrutura.

[0106]A substância AP1 foi obtida a partir do ácido-6-bromoexanoico (Bezwada, R. S. Functionalized Biodegradable triclosan monomers and oligomers for controlled release. Patente US 2009/0105352 A1, 2009), conforme representado na Figura 17. Em um balão de 125 mL contendo 2,34 g (12 mmol) de ácido 6-bromoexanoico, foram adicionados 1,30 g (12 mmol) de álcool benzílico, juntamente com 0,06 g (0,30 mmol) de ácido ptoluenossulfônico monoidratado e 50 mL de tolueno. Foram acoplados o sistema condensador e o aparato Dean-Stark ao balão. O sistema foi aquecido e mantido sob refluxo e agitação magnética por 24 horas. Após finalizar a reação, realizou-se extração líquido-líquido utilizando uma solução 5% NaHCO₃ (2 x 50 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e evaporada utilizando evaporador rotativo. O produto desejado, de coloração marrom claro, foi obtido em 69% de rendimento (2,36 g).

[0107] No espectro do AP1 na região do infravermelho realizada em ATR foi observada uma banda de absorção em 1731 cm'¹, referente ao estiramento da ligação C=O do éster benzílico. As bandas presentes em 1496 e 1454 cm'¹ foram associadas aos estiramentos das ligações C=C do anel aromático. A banda em 3032 cm'¹foi relacionada ao estiramento de C-H do anel aromático. A banda em 1253 cm'¹ foi relacionada aos estiramentos da ligação C-0 do éster benzílico [0108] No espectro de RMN de ¹H do produto AP1 (Figura 18) um sinal largo em 7,37 ppm, integrado para 5H, foi atribuído aos átomos de hidrogênio do anel aromático. Um simpleto em 5,14ppm,integrado para 2H foi atribuído aos hidrogênios metilênicos do grupo de proteção benzila.

[0109] No espectro de RMN de ¹³C do produto AP1 foi identificado o sinal da carbonila do éster benzílico em 173,1 ppm que desapareceu, como já era

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28/51 esperado, no subespectro DEPT-135. Foram identificados apenas dois sinais de carbonos hidrogenados (128,1 e 128,5 ppm) na região de carbonos aromáticos. Entretanto, de acordo com a estrutura do produto, eram previstos três sinais nessa região. Como a intensidade do sinal em

128,1 ppm é maior que o sinal em 128,5 ppm, conclui-se que, provavelmente, o primeiro sinal é atribuído a três dos cinco átomos do anel aromático de AP1.

[0110]A substância AP2 foi obtida a partir do ácido-6-aminohexanoico, conforme representado na Figura 17. Em um balão de 50 ml_ contendo 1,32 g (10,1 mmol) de ácido 6-aminocaproico, foram adicionados 3,82 g (35,3 mmol) de álcool benzílico, juntamente com 2,01 g (10,6 mmol) de ácido p-toluenossulfônico e 25 ml_ de tolueno. Foram acoplados o sistema condensador e o aparato Dean-Stark. O sistema foi aquecido e mantido sob refluxo e agitação magnética por 24 horas. Em seguida, o precipitado obtido foi submetido à filtração sob pressão reduzida e realizada lavagem do sólido com aproximadamente 50 ml_ de éter etílico. O sólido formado, de coloração levemente amarelada, foi obtido em 99% de rendimento (3,93 g).

[0111] O espectro no infravermelho obtido para a substância AP2 apresenta bandas características dos estiramentos dos grupos NH₃ ⁺ em 3262 e 3186 cm'¹ e uma banda característica de carbonilas de ésteres em 1725 cm'¹. As bandas presentes em 1194 e 1161 cm'¹ foram associadas aos estiramentos da ligação C-0 de ésteres.

[0112] No espectro de RMN de ¹H da referida substância (Figura 18) observa-se os sinais em 5,07 ppm e 7,32 ppm atribuídos, respectivamente, aos hidrogênios metilênicos e aromáticos do grupo benzila. Ainda na região de hidrogênios aromáticos deste espectro é possível identificar dois dupletos (7,73 e 7,15 ppm; J=8,0 Hz) atribuídos aos hidrogênios aromáticos do grupo tosilato.

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29/51 [0113] No espectro de RMN de ¹³C da referida substância observa-se o sinal em 173,3 ppm atribuído à carbonila do grupo éster formado. Foram identificados sete sinais na região de carbonos aromáticos, entretanto esperar-se-iam oito sinais de acordo com a estrutura proposta. O sinal em

128,3 ppm tem uma intensidade, aproximadamente, 30% maior que a intensidade do sinal em 128,7 ppm, sugerindo que o sinal mais intenso é atribuído a dois carbonos aromáticos distintos. Outros sinais presentes como o em 21,4 ppm atribuído ao grupo metila do tosilato, confirmaram a obtenção do produto desejado.

[0114] A substância 2OBn foi obtida submetendo-se os fragmentos AP1 e 3Bz a uma reação em acetonitrila sob refluxo, na presença de carbonato de potássio e, em quantidades catalíticas, o iodeto de potássio, como representado na Figura 20 (Meijler, M.M.; Kaufmann, G.F.; Qi, L.; Mee, J.M.; Coyle, A.R.; Moss, J.A.; Wirsching, P.; Matsushida, M.; Janda, K.D. Fluorescent cocaine probes: a tool for the selection and engineering of therapeutic antibodies. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, p.2477-2484). Em um balão de 125 mL de fundo redondo contendo 0,58 g (2 mmol) de 3Bz, foram adicionados 0,57 g (2 mmol) de AP1, 0,28 g (2 mmol) de carbonato de potássio, 0,33 g (0,2 mmol) de iodeto de potássio e 15 mL de acetonitrila. Após acoplar o condensador ao balão, a reação foi iniciada à temperatura de 80°C e sob agitação magnética. Após 72 horas, a reação foi encerrada e solvente evaporado no evaporador rotativo. O bruto da reação foi solubilizado em 30 mL de acetato de etila e a fase orgânica foi lavada com água destilada (3x15 mL). Em seguida, a mesma foi seca com sulfato de magnésio anidro, filtrada e concentrada no evaporador rotativo. O sólido obtido foi purificado numa coluna cromatográfica utilizando como eluente DCM/MeOH (98:2; v/v), permitindo a obtenção de 0,71 g (72%) do produto desejado.

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30/51 [0115] No espectro no infravermelho do composto 2OBn apresenta bandas características dos estiramentos das ligações C=O dos ésteres em 1736, 1712 cm'¹. Outra banda verificada em 1275 cm'¹ foi atribuída, aos estiramentos das ligações C-0 de grupamentos ésteres.

[0116]A análise do espectro de RMN de ¹H do produto 2OBn (Figura 21) permitiu a confirmação da estrutura química proposta para o 2OBn. Em 5,10 ppm aparece um simpleto referente aos hidrogênios do carbono metilênico do grupo de proteção benzílico. Na região dos hidrogênios aromáticos aparecem alguns sinais sobrepostos: em 7,45 ppm um sinal largo foi atribuído aos hidrogênios aromáticos do grupo de proteção benzila enquanto um tripleto em 7,52 ppm foi atribuído ao hidrogênio aromático do éster benzílico.

[0117] A análise do espectro de RMN de ¹³C e do subespectro de DEPT-135 da substancia 2OBn indicou a presença das três carbonilas: 173,3, 170,3 e

166,3 ppm.

[0118]A substância 2NBn foi obtida a partir do acoplamento entre as substâncias 3Bz e AP2 (Sakurai, M.; Wirsching, P.; Janda, K. D. Design and synthesis of a cocaine-diamide hapten for vaccine development. Tetrahedron Lett. 1996, 37, p.5479-5482). A um balão tritubulado foram adicionados 1,16 g (4 mmol) de 3Bz, 1,57 g (4 mmol) de AP2 e 0,50 g (4 mmol) de dimetilaminopiridina (DMAP). Em seguida, foram adicionados 20 ml_ de CH2CI2 anidro e o sistema ficou sob atmosfera de argônio e agitação magnética por 90 minutos, em banho de gelo. A outro balão foram adicionados 0,86 g (4,4 mmol) de EDC, juntamente com 0,56 ml_ (4 mmol) de trietilamina e 10 ml_ de CH₂CI₂ anidro. Após 10 minutos de agitação magnética, o conteúdo foi transferido para o balão tritubulado, gota-a-gota sob atmosfera de gás inerte. Após 96 horas de agitação magnética à temperatura ambiente, a reação foi encerrada e realizada a lavagem da fase orgânica utilizando solução aquosa de ácido cítrico 10% (3x15 ml_).

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Em seguida, a fase orgânica foi lavada utilizando, respectivamente, 20 mL de água destilada e 20 mL de solução aquosa concentrada de NaCI. A fase orgânica foi secada com Na₂SO₄ anidro, filtrada e concentrada sob pressão reduzida no evaporador rotatório. Após cromatografia em coluna [acetato de etila/hexano/trietilamina (30:10:4)], o produto desejado foi purificado e obtido em 71% de rendimento (1,39 g).

[0119]O espectro no infravermelho obtido para a substância 2NBn (Figura 19) apresenta bandas características dos estiramentos das ligações C=O de amidas em 1663 cm'¹. Outras bandas verificadas em 1718 e 1276 cm'¹ foram atribuídas, respectivamente, aos estiramentos das ligações C=O e CO de grupamentos ésteres.

[0120] No espectro de RMN de ¹H da substância 2NBn observa-se o sinal em 9,54 ppm atribuído ao hidrogênio da ligação amídica formada. O dupleto integrado para dois hidrogênios em 7,98 ppm foi atribuído ao Hn. Os demais hidrogênios aromáticos foram relacionados ao multipleto centralizado em 7,41 ppm (integrado para oito hidrogênios). Outros dois sinais importantes de destacar são o tripleto duplo em 5,31 ppm, atribuído ao H₃, e o simpleto em 5,10 ppm do H₂i.

[0121]A análise do espectro de RMN de ¹³C juntamente ao espectro DEPT135 (Figura 20) também puderam confirmar a estrutura do produto de interesse. Na região de carbonos aromáticos eram esperados 8 sinais distintos, entretanto foram identificados apenas sete sinais, fato explicado pela provável sobreposição de dois sinais, como anteriormente discutido para o fragmento AP2. Como esperado, foram identificados nove sinais de carbonos metilênicos, entre eles o sinal de C₂i em 65,9 ppm.

[0122] O hapteno GNC foi obtido a partir da reação de hidrogenólise de 2OBn conforme representado na Figura 23 (Cai, X.; Whitfield, T.; Hixon, M. S.; Grant, Y.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Probing active cocaine vaccination performance through catalytic and noncatalytic hapten design. J. Med.

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Chem. 2013, 56, p.3701-3709). Foram transferidos 0,24 g (0,48 mmol) de 2OBn para um reator de aço inoxidável juntamente com 0,06 g de 10% Pd/C e 25 mL de acetato de etila. O sistema foi submetido à pressão de H₂(g) (50 Kgf.cm'²) e agitação magnética por 48 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, a reação foi filtrada em Celite para remoção do catalisador e o solvente foi evaporado em evaporador rotativo sob pressão reduzida. Foram obtidos 0,19 g do produto desejado (84% de rendimento) como um sólido de coloração levemente amarelada.

[0123] No espectro na região do infravermelho do composto GNC (Figura 24) apresenta banda característica e atribuída ao estiramento de ligações C=O éster (1710 cm'¹). Outras duas importantes bandas foram verificadas: uma em 1559 cm'¹ atribuída ao estiramento assimétrico de grupo carboxilato e outra em 1272 e 1227 cm'¹associada aos estiramentos de CO de ácidos carboxílicos e ésteres.

[0124] O espectro de RMN de ¹H para o hapteno GNC (Figura 25) nota-se o desaparecimento dos sinais característicos dos hidrogênios aromáticos do grupo de proteção benzila que se apresentavam como simpletos aparentes em 7,34 e 7,35 ppm, no espectro do seu intermediário, o produto 2OBn (Figura 21). É possível observar no espectro de RMN de 1H do hapteno GNC na região dos hidrogênios aromáticos, os tripletos referentes aos hidrogênios do éster benzílico do alcalóide.

[0125]As análises de RMN de ¹³C e do subespectro de DEPT-135 também foram realizadas para o hapteno GNC (Figura 26). Na região de carbonos aromáticos, verificou-se a presença de apenas quatro sinais referentes ao éster benzílico: 133,1, 130,5, 129,9 e 128,4 ppm, sendo que apenas um deles não apareceu no subespectro de DEPT-135, demonstrando assim, que o mesmo se tratava do carbono ligado ao substituinte carboxílico. A ausência de mais sinais na região de carbonos aromáticos demonstra que o

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33/51 grupo protetor benzila realmente foi retirado, formando assim os produtos de interesse.

[0126] O hapteno GNE foi obtido a partir da reação de hidrogenólise de 2NBn (Cai, X.; Whitfield, T.; Hixon, M. S.; Grant, Y.; Koob, G. F.; Janda, K. D. Probing active cocaine vaccination performance through catalytic and noncatalytic hapten design. J. Med. Chem. 2013, 56, p.3701-3709). 1,35 g (2,7 mmol) de 2NBn foram transferidos para um reator de aço inoxidável juntamente com 0,22 g de 10% Pd/C e 40 ml_ de acetato de etila. O sistema foi submetido à pressão de H₂(g) (50 Kgf.cm'²) e agitação magnética por 96 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, a reação foi filtrada em Celite® para remoção do catalisador e o solvente foi evaporado em evaporador rotativo sob pressão reduzida. Foram obtidos 0,98 g do produto desejado (89% de rendimento) como um sólido de coloração levemente amarelada.

[0127] O espectro no infravermelho obtido para o hapteno GNE (Figura 21) apresenta bandas características e atribuídas aos estiramentos de ligações C=O de amida (1638 cm'¹) e de éster (1716 cm'¹). Outras duas importantes bandas foram verificadas: uma em 1553 cm'¹ atribuída ao estiramento assimétrico de grupo carboxilato e outra em 3255 cm'¹ associada à ligação N-H de amina.

[0128] No espectro de RMN de 1H para a substância GNE, quando comparado com o espectro de RMN de ¹H do precursor 2NBn, percebeu-se a ausência dos sinais caraterísticos do grupo benzila. O multipleto centralizado em 7,41 ppm, que estava integrado para oito hidrogênios, agora está integrado para apenas 3 hidrogênios. Além disso, o simpleto em 5,10 ppm atribuído aos H₂i, que estava presente no espectro do 2NBn, desapareceu no espectro de GNE.

[0129]As análises de RMN de ¹³C e DEPT-135 também foram realizadas para GNE. Na região de carbonos aromáticos verificou-se a presença dos

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34/51 quatro sinais do grupo benzoíla em 134,9, 130,9, 130,8 e 129,8 ppm, sendo que apenas um deles não apareceu no DEPT-135. Três sinais em 181,4,

173,1 e 166,8 ppm indicaram a presença das três carbonilas da estrutura proposta e oito sinais em fase invertida no DEPT-135 indicaram a presença dos oito carbonos metilênicos na estrutura do produto esperado.

[0130] Para o acoplamento do hapteno GNC ao calixareno 4NH e, portanto, obtenção do imunógeno V4N1, foi realizado o procedimento conforme representado na Figura 29. Em um balão contendo 0,29 g (0,72 mmol) do hapteno GNC foram adicionados 0,93 g (0,72 mmol) de diisopropiletilamina (DIPEA) e 0,46 g (0,89 mmol) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)-tris(pirrolidino)-fosfônio (PyBOP). Em seguida, foram adicionados 5 ml_ de DCM anidro e o sistema ficou sob atmosfera de argônio e agitação magnética por 40 minutos, à temperatura ambiente. A um outro balão foram adicionados 0,11 g (0,15 mmol) do aminocalix[4]areno 4NH, juntamente com 7 ml_ de DCM anidro. Após 10 minutos de agitação magnética, o conteúdo foi transferido para o primeiro balão, gota-a-gota sob atmosfera de argônio. Após 30 horas de agitação magnética à temperatura ambiente, a reação foi encerrada e diluída para 80 ml_ de diclorometano. Em seguida, foram realizadas lavagens utilizando solução saturada de NaHCO₃ (2 x 25 ml_) e água destilada (1 x 25 ml_). Após adição de sulfato de sódio anidro e filtração, a fase orgânica foi evaporada utilizando evaporador rotativo. Finalmente, a purificação foi realizada utilizando cromatografia em coluna [7% metanol em CHCI₃ + gotas de trietilamina], fornecendo o produto desejado em 74% de rendimento (0,25 g).

[0131]A análise por espectrometria de massas MALDI-TOF (Figura 30) apresentou o pico do íon esperado para a estrutura de V4N1 [M+H⁺] (m/z) calculado 2.251,2278; obtido 2.251,2373.

[0132] Para o acoplamento do hapteno GNE ao calixareno 4NH e, portanto, obtenção do imunógeno V4N2, foi realizado o procedimento conforme

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35/51 representado na Figura 22. As reações da Figura 22 foram desenvolvidas e adaptadas na presente invenção e tratam-se de reações para formação de ligações amida, baseadas em Geraci, C.; Consoli, G. M. L.; Galante, E.; Bousquet, E.; Pappalardo, M.; Spadaro, A. Calix[4]arene decorated with four Tn Antigen Glycomimetic Units and P3CS Immunoadjuvant: synthesis, characterization, and Anticancer Immunological Evaluation. Bioconjugate Chem. 2008, 19, p.751-758. Em um balão contendo 0,98 g (2,43 mmol) do hapteno GNE foram adicionados 0,31 g (2,43 mmol) de diisopropiletilamina (DIPEA) e 1,58 g (3,04 mmol) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)-tris(pirrolidino)-fosfônio (PyBOP). Em seguida, foram adicionados 8 ml_ de DCM anidro e o sistema ficou sob atmosfera de argônio e agitação magnética por 40 minutos, à temperatura ambiente. A um outro balão foram adicionados 0,32 g (0,45 mmol) do aminocalix[4]areno 4NH, juntamente com 10 ml_ de DCM anidro. Após 10 minutos de agitação magnética, o conteúdo foi transferido para o primeiro balão, gota-a-gota sob atmosfera de argônio. Após 26 horas de agitação magnética à temperatura ambiente, a reação foi encerrada e diluída para 80 mL de diclorometano. Em seguida, foram realizadas lavagens utilizando solução saturada de NaHCO3 (2 x 25 mL) e água destilada (1 x 25 mL). Após adição de sulfato de sódio anidro e filtração, a fase orgânica foi evaporada utilizando evaporador rotativo. Finalmente, a purificação foi realizada utilizando cromatografia em coluna [7% metanol em CHCI3 + gotas de trietilamina], fornecendo o produto desejado em 59% de rendimento (0,60 g).

[0133] O espectro no infravermelho obtido para o imunógeno V4N2 apresentou bandas características dos estiramentos das ligações C=O de éster (1716 cm-1) e de amida (1651 cm-1). Em 1539 cm-1 foi verificada uma banda intensa que pode ser atribuída à deformação angular das ligações N-H de grupo amida e em 1267 cm-1 uma banda atribuída ao estiramento das ligações C-0 de grupo éster.

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36/51 [0134] O espectro de RMN de ¹H obtido para V4N2 está representado na Figura 23. Nele é possível verificar o sinal em 9,60 ppm relacionado ao NH vizinho de C17. Centralizados em 4,38 e 3,07 ppm observaram-se dois dupletos atribuídos aos hidrogênios H_7a e H_7b, respectivamente. Na região dos sinais de hidrogênios aromáticos há o dupleto em 7,97 ppm de H₂g, o multipleto em 7,44-7,35 ppm (atribuído a H₃₀ e H₃₁) e dois sinais largos em 6,75 e 6,75 ppm, provavelmente, dos hidrogênios aromáticos H₃ do calix[4]areno. Diferentes sinais foram atribuídos ao H₃ porque cogita-se a possibilidade da existência de isômeros em virtude da ressonância do grupo amida vizinho. Em 5,31 ppm, integrado para quatro hidrogênios, foi verificado o tripleto duplo atribuído ao H₂i e em 1,00 ppm foi verificado um tripleto atribuído ao Hn (integrado para 12).

[0135] Os espectros de RMN de ¹³C e DEPT-135 para V4N2 estão representados, respectivamente, nas Figuras 24 e 25. A análise de ambos os espectros permitiu afirmar que a reação de preparação de V4N2 foi realizada com sucesso. Foram visualizados no espectro de RMN de ¹³C 29 sinais distintos e condizentes com a estrutura proposta, entre eles oito sinais na região aromática do espectro, três sinais de carbonilas (171,5,

171,2 e 166,1 ppm) e 18 sinais de carbonos alifáticos. O padrão de hidrogenação foi verificado pela análise de espectro DEPT-135 e constatado que, dos 18 sinais de carbonos alifáticos, 12 são carbonos metilênicos.

[0136]Através da análise do mapa de contorno HSQC (Figura 26) foi possível atribuir alguns sinais como C₃ em 121,4 ppm, C₃₀ em 128,4 ppm, Cn em 14,2 ppm, C₂₆ em 40,5 ppm, C₂i em 66,2 ppm, C₇ em 31,1 ppm, entre outros. A análise do espectro de massas MALDI-TOF (Figura 27) apresentou o pico do íon esperado para a estrutura de V4N2 [M+H⁺ (m/z) calculado 2.247,2917; obtido 2.247,2908].

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EXEMPLO 2 - Síntese do imunógeno V8N2 [0137] Os imunógenos V8N1 e V8N2 foram preparados pela reação de acoplamento entre o calixareno 8NH e os haptenos GNC e GNE, respectivamente, conforme representado na Figura 2.

[0138]O calix[n]areno 8NH foi preparado em quatro etapas, a partir do ptenc-butilfenol, conforme representado na Figura 3.

[0139] A substância 8OH foi obtida a partir da reação de ciclocondensação do p-fen>butilfenol com o paraformaldeído, conforme representado na Figura 33 (Gutsche, C.D.; Dhawan, B.; No, K.H.; Muthukrishnan, R. The synthesis, Characterization, and Properties of the Calixarenes from p-tertbutylphenol. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, p.3782-3792). Em um balão tritubulado de 1 L, contendo uma barra de agitação magnética, e, adaptado para a entrada de um fluxo contínuo de nitrogênio, foram adicionados 10 g de p-fen>butilfenol (66,5 mmol), 3,6 g de paraformaldeído (120 mmol), 1,5 mL de uma solução de hidróxido de sódio de 10 mol/L e 300 mL de xileno. A mistura heterogênea formada foi agitada mecanicamente por aproximadamente 15 minutos. Posteriormente o balão foi acoplado a um aparato de Dean-Stark (contendo 100 mL de xileno) e a um condensador de bolas. A reação foi submetida ao refluxo, a 115°C, com fluxo contínuo de nitrogênio por aproximadamente 4 horas. Após 30 minutos de aquecimento a reação tornou-se uma mistura homogênea, e, após 1 hora, um precipitado branco começou a ser formado. A mistura foi resfriada a temperatura ambiente e o precipitado formado foi recolhido por filtração. O precipitado foi lavado sucessivamente com porções de 200 mL de tolueno, 200 mL de éter etílico, 200 mL de acetona e final mente com 200 mL de água destilada. Posteriormente, o filtrado foi seco em evaporador rotatório sob pressão reduzida. Ao final do processo, o sólido obtido foi dissolvido em 800 mL de clorofórmio e foi levado ao aquecimento até o seu volume ser reduzido a 600 mL. A solução foi então resfriada a temperatura ambiente e o

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38/51 precipitado formado foi então coletado e seco em bomba de alto vácuo, fornecendo o produto 8OH como um sólido branco com 52% de rendimento.

[0140] O espectro no infravermelho obtido para a substância 8OH apresenta uma banda larga em 3225 cm'¹, característica dos estiramentos das ligações O-H. As bandas em 1602, 1486 e 1452 cm'¹ referem-se aos estiramentos de C=C dos anéis aromáticos. A banda em 1203 cm'¹ é característica dos estiramentos das ligações C-0 em combinação com as deformações angulares das ligações O-H. Em 1391 e 1361 cm'¹ foram observadas duas bandas de absorção relacionadas, às deformações angulares das ligações C-H dos grupos fen>butila.

[0141] No espectro de RMN de ¹H da substância 8OH, representado na Figura 34, observa-se o simpleto em 1,26 ppm referente aos 72 hidrogênios dos grupos -CH₃ dos substituintes fen>butila (H₆). Centralizados em 3,50 e 4,37 ppm estão dois dupletos atribuídos aos hidrogênios metilênicos situados entre os anéis aromáticos: H_7a e H_7b.

[0142] No espectro de RMN de ¹³C de 8OH observa-se a presença de quatro sinais na região de carbonos aromáticos, condizentes com a estrutura proposta para a substância. Em 31,4 ppm encontra-se o sinal intenso referente aos hidrogênios dos grupos -CH₃ dos substituintes tercbutila.

[0143]A substância 8TA foi obtida a partir da O-alquilação de 8OH, conforme representado na Figura 35 (Modificado de Yi, J.; Tang, K.; Huang, S. Synthesis of p-terc-butylcalix[8]arene ether derivatives. Indian Joumal of Chemistry. 2008, 47B, p.1435-1437). Em um balão de 500 mL, contendo uma barra de agitação magnética e acoplado a um respiro, foram adicionados 1 g (0,77 mmol) do p-fe/ic-butilcalix[8]areno (8OH) e 150 mL de dimetilformamida. A mistura foi aquecida a 70°C até se obter uma solução translúcida. Após esse ponto, foram adicionados 6 g de NaH. A mistura

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39/51 permaneceu sob agitação a 60°C por aproximadamente 30 minutos. Posteriormente foram adicionadas à mistura 50 mL de n-bromobutano (77 mmol) e 5 g de iodeto de potássio (30 mmol). A temperatura foi diminuída para 50°C e a reação permaneceu sob agitação por 72 horas. Decorrido esse tempo, foram adicionados 100 mL de diclorometano. Essa fase orgânica foi lavada com 200 mL de solução ácida de 0,1 mol L'¹. A fase orgânica foi separada da fase aquosa e levada ao evaporador rotatório a pressão reduzida até que metade da quantidade de solvente adicionado fosse evaporada. Posteriormente foram adicionados 200 mL de acetona e a mistura foi novamente levada ao evaporador rotatório e permaneceu sob baixa pressão até que se observasse a formação de um precipitado esbranquiçado. O precipitado foi recuperado e lavado com acetona, fornecendo um sólido branco com 80% de rendimento.

[0144] No espectro no infravermelho obtido para a substância 8TA, quando comparado com o espectro da substância precursora, é possível verificar o desaparecimento da banda dos estiramentos das ligações O-H em 3225 cm'¹. Bandas de estiramentos das ligações C-H dos grupos fen>butila puderam ser identificadas em 2955 e 2868 cm'¹. Bandas características de deformação angular de grupos terc-butila apareceram em 1381 e 1360 cm ¹. Uma banda intensa foi observada na frequência de 1190 cm'¹, característica dos estiramentos das ligações C-O.

[0145] O espectro de RMN de ¹H da substância 8TA está representado na Figura 36. Nele observa-se em 0,67 ppm um tripleto atribuído aos hidrogênios Hn. Um simpleto em 1,09 ppm, integrado para 72 hidrogênios, é atribuído ao núcleo do hidrogênio H6. Os hidrogênios diasterotópicos, H7a e H7b, apresentam-se como um simpleto em 4,05 ppm. Na região de hidrogênios aromáticos, aparece um simpleto em 6,96 ppm referente à H3. [0146] Nos espectros de RMN de ¹³C e de DEPT-135 da substância 8TA é possível determinar os sinais referentes aos carbonos C6 e C₅ do

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40/51 substituinte fen>butila: em 31,6 ppm e em 34,4 ppm, respectivamente. Além disso, foram identificados os sinais dos quatro carbonos dos grupos nbutila, entre eles, o sinal de Cn em 14,0 ppm.

[0147]A substância 8NO foi obtida a partir da /pso-nitração de 8TA, conforme representado na Figura 37 (Modificado de Dudic, M.; Colombo, A.; Sansone, F.; Casnate, A.; Donofrio, G.; Ungaro, R.A general synthesis of water soluble upper rim calix[n]arene guanidinium derivatives which bind to plasmid DNA. Tetrahedrün. 2004, 60. p. 11613-11618). Em um balão de fundo redondo, contendo uma barra de agitação magnética, foram adicionados 500 mg do 8TA (0,385 mmol), 2,60 g de NaNO₃ (30,5 mmol) e 2,4 mL de ácido trifluoroacético (TFA) (30,5 mmol). Após adicionar o TFA, gota a gota, o balão foi tampado com uma tampa de vidro e a mistura foi mantida sob agitação por, aproximadamente, seis horas. Para a elaboração, a mistura então formada foi vertida em 200 mL de água gelada, procedimento no qual se observa a precipitação do produto impuro. O precipitado foi filtrado e lavado com 50 mL de água destilada e 50 mL de metanol, e seco em bomba de alto vácuo. Posteriormente o precipitado foi solubilizado em 8 mL de acetato de etila destilado e depois foram adicionados mais 20 mL de metanol. Após 24 horas de recristalização ocorreu a precipitação de um sólido rosa claro como forma pura do produto 8NO com 64% de rendimento.

[0148] O espectro na região do infravermelho obtido para a substância 8NO apresenta bandas características de estiramento assimétrico e simétrico dos grupos -NO₂, respectivamente, em 1518 e 1340 cm'¹. Foi possível observar também as bandas de estiramento C-H de carbono sp³ em 2956 e 2872 cm'¹ e o estiramento C-O-C em 1232 cm'¹.

[0149] No espectro de RMN de ¹H da substância 8NO, representado na Figura 38, observa-se que o sinal referente aos hidrogênios aromáticos (H₃) encontra-se em uma região do espectro mais desblindada (7,78 ppm),

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41/51 quando comparado com o precursor 8TA. Os demais sinais presentes no espectro foram atribuídos aos hidrogênios metilênicos: H_7a e H_7b em 4,17 ppm e aos hidrogênios alifáticos: H₈: 3,89 ppm; H₉:entre 1,72-1,75 ppm; H₁₀: entre 1,39-1,42 ppm e Η^: 0,88 ppm.

[0150] Nos espectros de RMN de ¹³C e DEPT-135 da substância 8NO observa-se a presença de quatro sinais na região de carbonos aromáticos. Pela análise do espectro DEPT-135 apenas um deles, em 124,8 ppm, é hidrogenado.

[0151]A substância 8NH foi obtida a partir da redução de 8NO, conforme representado na Figura 39 (Modificado de Podoprygorina, G.; Zhang., J.;Bolte., M.; Janshoff, A.; Bohmer, V. Supramolecular structures formed by calix[8]arene derivatives. Org. Lett. 2003, 5(26), p. 5071-5074). Em um balão de fundo redondo contendo uma barra de agitação magnética, foram adicionados 100 mg do 8NO (0,06 mmol), 20 ml_ de Etanol/THF (1:1; v/v), 5 ml_ de hidrazina NH2NH2.H2O (80%) e 20 mg de Pd/C (10%). A mistura permaneceu sob agitação e refluxo por 24 horas. Após esse período a mistura foi submetida a uma filtração à vácuo com papel quantitativo para remover o Pd/C (10%) do meio reacional, sendo posteriormente lavada com uma mistura de 40 ml_ de metanol acidificado. O filtrado foi então concentrado em evaporador rotativo até que seu volume de solvente fosse reduzido pela metade. Posteriormente foram adicionados 50 ml_ de água destilada e, a partir daí, observou-se a formação de um precipitado branco que foi filtrado, lavado com água destilada e seco em bomba de alto vácuo, fornecendo o produto 8NH com 85% de rendimento.

[0152] O espectro no infravermelho obtido para a substância 8NH apresenta bandas características em 3358 cm'¹, possivelmente associadas aos estiramentos N-H de aminas primárias aromáticas bem como, as bandas em 2955, 2930 e 2868 cm'¹, que estão associadas ao estiramento de C-H de carbono sp³.

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42/51 [0153] No espectro de RMN de ¹H da substância 8NH, representado na Figura 40, observa-se o simpleto em 6,17 ppm relacionado aos 16 hidrogênios aromáticos. O sinal referente aos hidrogênios da ponte metilênica (H7a e H7b), aparece como um simpleto localizado em 3,83 ppm e que se sobrepõe ao sinal de Hn, que é um tripleto localizado em 3,77 ppm. [0154] No espectro de RMN de ¹³C da substância 8NH observa-se uma alteração no valor dos deslocamentos químicos dos carbonos aromáticos, principalmente ao carbono C3. O grupamento amino aumenta a densidade eletrônica no carbono C₃ devido ao efeito de ressonância do par de elétrons não ligante do nitrogênio e o anel aromático e, por este motivo, o sinal referente à C₃ é observado em 115,2 ppm para ο 8NH.

[0155] Os procedimentos para a obtenção dos haptenos GNC e GNE foram descritos anteriormente no Exemplo 1.

[0156] Para o acoplamento do hapteno GNC ao calixareno 8NH e, portanto, obtenção do imunógeno V8N2, foi realizado o procedimento conforme representado na Figura 41. Em um balão de fundo redondo, com uma barra de agitação magnética, foram adicionados 0,433 g (1,08 mmol) do hapteno GNC, 300 pl_ de diisopropiletilamina (DIPEA), 0,700 g (1,34 mmol) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi-)-tris(pirrolidino)-fosfônio (PyBOP) e 10 ml_ de DCM anidro, que foi adicionado através de uma seringa. A mistura de reação foi mantida por agitação por aproximadamente 30 minutos sob atmosfera de argônio. Em outro balão foram adicionados 0,100 g (0,07 mmol) de 8NH e 5 ml_ de DCM anidro, e, sob atmosfera de argônio, permitiu-se a mistura sob agitação por 10 minutos. Através de uma cânula e bexigas de argônio, realizou-se a transferência da mistura de 8NH e DCM anidro, gota a gota, para o balão contendo o hapteno GNC, o reagente de acoplamento PyBOP e a base DIPEA. Essa mistura final ficou sob agitação por 48 horas. Decorrido esse tempo, mistura foi submetida a duas purificações, uma por coluna de Sephadex LH-20 (em CH2CI2) e outra

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43/51 por coluna em sílica-gel utilizando como eluente a mistura clorofórmio:metanol:trietilamina (95:4:1 v/v). Através desse procedimento foi obtido um sólido amarelado e cristalino como o produto V8N1 com 51% de rendimento.

[0157]A análise por espectrometria de massas MALDI-TOF (Figura 42) apresentou o pico do íon esperado para a estrutura de V8N1 [M⁺ (m/z) calculado 4.501, 5790; obtido 4.501, 3548].

[0158] Para o acoplamento do hapteno GNE ao calixareno 8NH e, portanto, obtenção do imunógeno V8N2, foi realizado o procedimento conforme representado na Figura 41. Em um balão de fundo redondo, com uma barra de agitação magnética, foram adicionados 0,433 g (1,08 mmol) do hapteno GNE, 300 pL de diisopropiletilamina (DIPEA), 0,700 g (1,34 mmol) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxZ-)-fr/s(pirrolidino)-fosfônio (PyBOP) e 10 mL de DCM anidro, que foi adicionado através de uma seringa. A mistura de reação foi mantida por agitação por aproximadamente 30 minutos sob atmosfera de argônio. Em outro balão foram adicionados 0,100 g (0,07 mmol) de 8NH e 5 mL de DCM anidro, e, sob atmosfera de argônio, permitiu-se a mistura sob agitação por 10 minutos. Em seguida, realizou-se a transferência desta mistura, gota a gota, para o balão contendo o hapteno GNE, o reagente de acoplamento PyBOP e a base DIPEA. Após 48 horas de agitação, a mistura foi submetida a duas purificações, uma por coluna de Sephadex LH-20 (em CH2CI2) e outra por coluna em sílica-gel utilizando como eluente a mistura clorofórmio:metanol:trietilamina (94:5:1; v/v). Por meio destes procedimentos foi obtido um sólido amarelado e cristalino como o produto desejado V8N2 em 60% de rendimento.

[0159] No espectro na região do infravermelho obtido para a substância V8N2, representado na Figura 43, observaram-se bandas em 1711 e 1649 cm'¹ que são referentes ao estiramento das carbonilas. Em 2932 e 2863

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44/51 cm'¹ aparecem bandas referentes ao estiramento da ligação C-H dos anéis aromáticos. A banda em 1267 cm'¹ é referente à ligação C-0 do éster benzílico presente no alcalóide.

[0160] No espectro de RMN de ¹H da substância V8N2, representado na Figura 44, observa-se o tripleto em 1,08 ppm referente aos hidrogênios Hn do macrociclo calix[8]areno e o simpleto, em 3,23 ppm, referentes aos hidrogênios da ponte metilênica também do macrociclo calix[8]areno, H_7a e H_7b. Observou-se o tripleto centralizado em 9,56 ppm referente ao N-H vizinho do carbono Ci₅. Na região dos sinais de hidrogênios aromáticos apareceram sinais característicos do hapteno GNE, um dupleto em 7,95 ppm referente a H₂g, um tripleto em 7,47 ppm referente a H₃₁ e um tripleto em 7,35 ppm referente a H₃₀. Ainda na região dos hidrogênios aromáticos, um sinal largo centralizado em 7,02 ppm refere-se aos hidrogênios dos anéis aromáticos do calix[8]areno, H₃. Um sinal largo para 8H, entre 5,275,28 ppm, refere-se ao hidrogênio do biciclo tropano, o H₂₁. O simpleto intenso em 2,18 ppm refere-se aos hidrogênios da metila ligada ao nitrogênio do biciclo, o H₂₆.

[0161] No espectro de RMN de ¹³C da substância V8N2 , representado na Figura 45, observam-se sinais distintos e condizentes com a estrutura proposta, dentre eles, 3 sinais na região de carbonilas: 166,0; 171,2e171,8 ppm: C₂₇, Cie e Ci₂, respectivamente.

[0162] A análise do espectro obtido por espectrometria de massas (MALDITOF), representado na Figura 46, apresentou o pico do íon esperado para a estrutura de V8N2: [M+H]⁺ (m/z) calculado: 4.494,7009; obtido: 4.494,6128.

EXEMPLO 3 - Avaliação da capacidade de estimulação imunológica para a produção de anticorpos anti-cocaína [0163] Para avaliar a capacidade de estimulação imunológica para a produção de anticorpos anti-cocaína, realizou-se um experimento de

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45/51 imunização ativa de camundongos. Neste experimento avaliou-se a capacidade da molécula V4N2 de produzir anticorpos anti-cocaína e a melhor dose da molécula a ser inoculada para produção de anticorpos. Utilizou-se como comparador negativo o adjuvante de Freund e como comparador positivo o GNE ligado ao KLH (KLH-GNE), conforme descrito previamente (Wirsching, P.; Janda, K. D. Patente US 6383490 B1 2002, Anti-cocaine vaccine).

[0164] Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo as melhores práticas de manejo e experimentação. Os animais utilizados foram armazenados no biotério com um ciclo luminoso de 12 horas, à temperatura a 21 °C com comida e água ad libidum. Cinco grupos cada um composto por 12 camundongos Balb-C (Biotério Central UFMG, Brasil) foram imunizados nos tempos 0, 7, 21 e 42 dias. No dia 0 inoculou-se um volume de 300 microlitros de uma solução do tratamento testado em adjuvante de Freund completo (Sigma, USA). Nos demais tempos inoculouse o mesmo volume de uma solução composta do tratamento testado e de adjuvante de Freund incompleto (Sigma, USA). Os grupos receberam os seguintes tratamentos: 1. Adjuvante de Freund; 2. KLH+GNE; 3. V4N2 30 nM; 4. V4N2 3,0 M; 5. V4N2 300 M; 6. V8N2 30 nM; 7. V8N2 3,0 M; 8. V8N2 300 ΠΜ. Após anestesia com solução de xilazina 15 mg kg'¹ e cetamina 150 mg kg'¹, injetada por via intraperitoneal (I.P.), coletou-se 0,2 mg de sangue através da veia submandibular e injetou-se o tratamento por via I.P. O sangue foi imediatamente centrifugado a 4°C e o plasma foi segregado e armazenado a -80°C até a análise.

[0165] Os títulos de anticorpos anti-cocaína foram dosados utilizando-se a técnica de imunoabsorção enzimática (ELISA), utilizando técnica previamente descrita por Fetissov (Fetissov, S. O. Neuropeptide autoantibodies assay. Methods Mol Biol. 2011; 789:295-302). No primeiro dia, a fixação da cocaína foi feita pela incubação de 100 microlitros de

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46/51 solução da droga em tampão de fixação (0.05 bicarbonato, pH 9,6 com 2x10'⁴ g ml_'¹ de azida sódica) durante 12 horas a 4°C em uma placa com 96 micro poços (MaxiSorb™Thermo Fisher Scientific, MA, USA). No segundo dia, diluiu-se 10 microlitros de plasma de cada amostra em 2 ml_ de tampão de amostra (PBS com 2x10'⁴ g ml_'¹ de azida sódica). A placa foi lavada por 3 vezes com tampão de lavagem (PBS com Tween 20 (Sigma, USA) a 0,05%). Incubou-se, em seguida, 100 microlitros de cada amostra em duplicata. A placa foi incubada por 12 horas a 4°C. No terceiro dia, a placa foi lavada por 3 vezes com tampão de lavagem e incubou-se 100 microlitros em solução de 0,5 microlitros de anticorpos por ml_ de tampão de amostra por 3 horas, a 37°C. Foram usados anticorpos ligados à fosfatase alcalina anti-lgG (Anti-Mouse IgG (Fab specific) Alkaline phosphatase, produzido em cabra, Sigma, USA) e anti-lgM (Anti-Mouse IgM (μ-chain specific) Alkaline phosphatase, produzido em cabra, Sigma, USA). Após a incubação lavou-se a placa por 3 vezes com tampão de lavagem se incubou 100 microlitros de solução de revelação (paranitrofenil 1 mg ml_'¹, 0,2 M tampão Tris, Sigmafast® p-nitrophenyl phosphate, Sigma, USA), em cada poço durante 40 minutos a temperatura ambiente e protegido da luz. Após a incubação colocou-se 50 microlitros de NaOH a 3 N em cada poço da placa para interromper a reação. A leitura foi feita por absorbância (densidade ótica) no leitor automatizado VICTOR Multilabel Plate Reader, (PerkinElmer, Wellesley, MA, USA), com filtro de 405 nm.

[0166] Na Figura 47 observa-se que o tratamento com V4N2 na dose de 30 nM produz uma resposta estatisticamente significante maior que o controle negativo em todos os tempos estudados e superior ao tratamento com KLH-GNE no tempo 21.

[0167] Na Figura 48 observa-se que o tratamento com V4N2 na dose de 30 nM é a que induz a produção de IgM anti-cocaína em títulos superiores ao

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47/51 grupo controle negativo e que esta resposta é estatisticamente significativa apenas nos tempos 7 e 42 dias.

[0168] Na Figura 49 observa-se que no sétimo dia todas as três doses produziram uma resposta imune significativamente maior que a do grupo controle negativo. Essa resposta se mantém para a dose de 30 nM em todos os tempos e deixa de ser significativa para a dose de 3,0 QM no tempo 21 dias e para a dose de 300 QM no tempo 42 dias.

[0169] Na Figura 50 observa-se que a produção de anticorpos IgM anticocaína foi maior para a dose 30 nM nos dias sete e quarenta e dois.

[0170] Na Figura 51 observa-se que o tratamento com a molécula V8N2 na dose de 30 nM produz uma resposta estatisticamente significante maior que o controle negativo em todos os tempos estudados e superior ao tratamento com KLH-GNE no tempo 21.

[0171] Na Figura 52 observa-se que a dose de 30 nM de V8N2 é a que induz a produção de IgM anti-cocaína em títulos superiores ao grupo controle negativo e que esta resposta é estatisticamente significativa apenas no tempo 7 dias.

[0172] Na Figura 53 observa-se que no sétimo dia todas as três doses da molécula V8N2 produziram IgG numa concentração significativamente maior que a do grupo controle negativo. Essa resposta se mantém para a dose de 30 nM e 3,0 M nos tempos 7, 21 e 42 dias e para a dose de 300 □ Ma diferença é significativa nos dias 7 e 42 dias.

[0173] Na Figura 54 observa-se que a produção de IgM anti-cocaína foi significativamente maior para a dose 30 nM no dia sete e para a dose 300 □ M no dia 21.

[0174] Para avaliar se a resposta obtida no ELISA deve-se à ligação da cocaína ao anticorpo e que esta resposta é dose-dependente realizou-se um experimento de adsorção dos anticorpos à cocaína. Para isso, misturouse o plasma dos cinco camundongos que obtiveram os maiores títulos de

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48/51 anticorpos anti-cocaína no tempo 42. Incubou-se 10 microlitros do plasma em 2000 microlitros de tampão de amostra com cocaína em doses de 10'² a 10'⁹ mg mL'¹, por 4 horas a 37°C. Após a incubação realizou-se o ELISA, conforme descrito anteriormente.

[0175] De acordo com os dados da Figura 55 a adsorção com cocaína em doses progressivas produz uma curva dose resposta, com um declínio da titulação de anticorpos de acordo com o aumento da dose de cocaína incubada.

EXEMPLO 4 - Experimentos com o marcador TRODAT-1 [0176] Para realizar os estudos de biodistribuição utilizou-se um análogo da cocaína, denominado TRODAT-1, produto disponível no mercado em forma de kit de diagnóstico para uso em Medicina Nuclear. Portanto, o TRODAT-1 apresenta um mecanismo de ação muito semelhante à cocaína, ou seja, uma grande afinidade pelo transportador de dopamina (TDA), apresentando alta seletividade e especificidade por esses transportadores localizados no cérebro. Neste sentido, na corrente sanguínea, o radiotraçador [^99mTc]TRODAT-1 comportaria-se de forma semelhante a cocaína ligando-se aos anticorpos presentes no sangue dos animais que foram previamente imunizados com as substâncias V4N2 e V8N2 Desta maneira, espera-se que o complexo [^99mTc]-TRODAT-1-anticorpos distribuam-se menos no tecido cerebral.

[0177] O reagente TRODAT-1 foi marcado com o isótopo radioativo tecnécio-99m, emissor de radiação gama, energia de 140 keV, meia-vida física de 6,02 horas, reunindo características ideais para a geração de imagens cintilográficas.

[0178]A marcação foi realizada de acordo com as instruções de uso do produto TRODAT-1 da marca RPHPHARMA. O kit foi reconstituído com 5 mL de uma solução estéril de pertecnetato de sódio (Na^99mTcO₄) recentemente eluída do gerador de molibdênio-99/tecnécio-99m

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49/51 (⁹⁹Mo/^99mTc; IPEN/CNEN), contendo uma atividade de 1.628 MBq (44 mCi). Em seguida, a solução foi incubada por 30 minutos em banho-maria à temperatura de 100°C.

[0179] Para a determinação da Pureza Radioquímica (PR) foram utilizadas as instruções de uso do produto TRODAT-1 da empresa RPHPHARMA. Utilizou-se placas de Papel Whatman 3 MM (PLACA 1) e de sílica gel 60 (PLACA 2). Alíquotas do radiofármaco (3 pl_) ^mTc-TRODAT-1 foram aplicadas em cada uma das placas. A placa de Papel Whatman 3 MM foi colocada em uma cuba cromatográfica contendo Butanona PA. Com este método foi determinado o percentual de radioatividade relativa ao tecnécio hidrolisado e reduzido (^99mTcO2). A placa de sílica gel 60 foi colocada em uma cuba cromatográfica contendo solução de Cloreto de Sódio 0,9%. Com este método foi determinado o percentual de radioatividade relativo ao pertecnetato (^99mTcO₄·). A PR deve ser > 90%. A radioatividade das cromatografias foi contada em um curiômetro (Capintec CRC 15R, EUA). A PR foi determinada da seguinte forma:

Placa 1: % ^mTcO2 = atividade fração 2 x 100 atividades das frações 1 +2

Placa 2: % ^99mTcO₄· = atividade fração 1 x 100 atividades das frações 1 +2 [0180]Após a marcação, camundongos machos BALB/c, imunizados previamente com as substâncias V4N2 e V8N2 na concentração de 30 nM, foram anestesiados com uma mistura de cetamina (80 mg kg'¹) e xilazina (15 mg kg'¹) e, em seguida, 0,1 mL (3,7 MBq) de ^mTc-TRODAT-1 foi injetado na veia da cauda dos animais (n=7). Após 90 min da injeção, os animais foram novamente anestesiados e colocados em decúbito dorsal sob uma gama-câmara (Mediso, Hungria) equipada com um colimador de furo único. As imagens foram adquiridas utilizando um tamanho de matriz de 512 x 512 x 16 pixels durante um período de 10 min.

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50/51 [0181]Após a obtenção das imagens cintilográficas, os animais foram submetidos à eutanásia e amostras do sangue e dos órgãos fígado, baço, estômago, rins, pulmões e cérebro foram retirados, pesados e a radioatividade foi determinada utilizando o contador de poço Wizard (Turku, Finlândia). Utilizou-se padrões de dose para corrigir o decaimento físico do ^99mTc e para calcular o percentual de dose injetada por grama de tecido (% Dl/g), conforme a fórmula representada abaixo.

% Dl/g = *cpm /q (tecido) x 100 cpm do padrão de dose *cpm = contagem por minuto [0182]A pureza radioquímica do TRODAT-1 radiomarcado com tecnécio99m foi da ordem de 93%, significando que 93% dos átomos de tecnécio99m ligaram-se nas moléculas de TRODAT-1. Portanto, o resultado foi compatível com investigações empregando imagens cintilográficas e, também, com estudos de biodistribuição.

[0183] Pela análise da Figura 56 não se observaram diferenças estatisticamente significativas entre os órgãos coração, rins, estômago, baço, fígado e pulmões de cada grupo investigado (p>0,05).

[0184] A análise da Figura 57 permitiu inferir que os cérebros dos animais imunizados com as substâncias V4N2 e V8N2 apresentaram menor captação do ^mTc-TRODAT-1 em relação ao Controle (p<0,05). Observouse maior captação do radiotraçador no sangue dos animais imunizados quando comparado com os animais do grupo Controle (p<0,05).

[0185] Os resultados de biodistribuição ex vivo sugerem que os anticorpos produzidos e induzidos na administração de V4N2 e V8N2 ligaram-se ao [^99mTc]-TRODAT-1 reduzindo a captação em torno de 37,0% desse radiotraçador no cérebro, contribuindo para aumentar significativamente, ou

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51/51 seja, na mesma proporção (44,0%) a concentração do radiotraçador no sangue.

[0186] Observa-se, qualitativamente, nas imagens cintilográficas uma maior captação de radioatividade na área delimitada, ou seja, de [^99mTc]TRODAT-1 representada pela cor rosa clara no cérebro do animal Controle, quando comparado com as imagens dos animais previamente imunizados com V4N2 e V8N2 (Figura 58).

[0187] As imagens cintilográficas (Figura 58) corroboram os dados obtidos nos estudos de biodistribuição ex vivo, mostrados nas Figuras 55 e 56. Esses resultados indicam que houve uma proteção mediada pelos anticorpos produzidos pela imunização ativa com as substâncias V4N2 e V8N2 no que tange a captação do análogo da cocaína [^99mTc]-TRODAT-1 pelo tecido cerebral.

Claims (8)

1. MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, caracterizadas por compreenderem calixarenos, preferencialmente calix[4]areno e/ou calix[8]areno, acoplados um hapteno análogo à cocaína, preferencialmente o hapteno GNE (ácido 6-(2R,3S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8azabiciclo [3.2.1] octano-2-carboxamido-hexanóico) e/ou o hapteno GNC (ácido 6-(7R,2R,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1]octano-2carboniloxi-hexanoico).

2. PROCESSO DE SÍNTESE DE MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, caracterizado por produzir calix[4]areno acoplado aos haptenos GNC ou GNE, denominados V4 N1 ou V4N2, respectivamente, e compreender as seguintes etapas:

a) Obtenção da substância 4OH, pela reação de ciclocondensação do p-fen>butilfenol com o formaldeído;

b) Obtenção da substância 4TA, a partir da O-alquilação da substância 4OH obtida em “a”;

c) Obtenção da substância 4NO, a partir da /pso-nitração da substância 4TA obtida na etapa “b”;

d) Obtenção da substância 4NH, a partir da redução da substância 4NO obtido na etapa “c”;

e) Obtenção dos imunógenos V4N1 e V4N2, pela reação de acoplamento entre o calixareno 4NH obtido em “d” e o hapteno GNC ou GNE, respectivamente.

3. PROCESSO DE SÍNTESE DE MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, de acordo com a reivindicação 2 etapa “e”, caracterizado pela reação de acoplamento ser realizada através das seguintes etapas:

I. Preparar uma mistura do hapteno GNE (para síntese do V4N2) ou GNC (para síntese do V4N1) (0,012 a 1,200 g mL'¹)

Petição 870170052564, de 25/07/2017, pág. 63/97

2/4 juntamente com diisopropiletilamina (0,004 a 0,400 g mL'¹) e hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-ox/)-tris(pirrolidino)fosfônio (0,02 a 2,00 g ml_'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 30 a 50 minutos à temperatura ambiente;

ii. Preparar uma solução do sólido obtido na reivindicação 2 etapa “d” (0,003 a 0,300 g mL'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 5 a 15 minutos à temperatura ambiente;

iii. Transferir a solução obtida na etapa “ii” gota-a-gota, sob atmosfera de gás inerte, para o recipiente contendo a mistura obtida na etapa “i”, para uma concentração final de 0,039 a 3,9 g mL'¹ e agitar à temperatura ambiente por 24 a 30 horas;

iv. Adicionar diclorometano e lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, posteriormente, com água destilada;

v. Secar, filtrar e evaporar a fase orgânica, preferencialmente por destilação, e purificar o produto utilizando preferencialmente cromatografia em coluna.

4. PROCESSO DE SÍNTESE DE MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, caracterizado por produzir calix[8]areno acoplado aos haptenos GNC ou GNE, denominados V8N1 ou V8N2, respectivamente, e compreender as seguintes etapas:

a) Obtenção da substância 8OH, pela reação de ciclocondensação do p-terc-butilfenol com o paraformaldeído;

b) Obtenção da substância 8TA, a partir da O-alquilação do sólido 8OH obtido em “a”;

c) Obtenção da substância 8NO, a partir da ipso-nitração do sólido 8TA obtido na etapa “b”;

Petição 870170052564, de 25/07/2017, pág. 64/97

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d) Obtenção da substância 8NH, a partir da redução do sólido 8NO obtido na etapa “c”;

e) Obtenção dos imunógenos V8N1 e V8N2, pela reação de acoplamento entre o calixareno 8NH obtido na etapa “d” e o hapteno GNC ou GNE, respectivamente.

5. PROCESSO DE SÍNTESE DE MOLÉCULAS ESTIMULADORAS DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, de acordo com a reivindicação 4 etapa “e”, caracterizado pela reação de acoplamento ser realizada através das seguintes etapas:

i. Preparar uma mistura do hapteno GNE (para síntese do V8N2) ou GNC (para síntese do V8N1) (20 a 80 g L'¹) juntamente com diisopropiletilamina (5 a 35 g L'¹) e hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il-oxi)-tris(pirrolidino)-fosfônio (20 a 100 g L'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 30 a 50 minutos à temperatura ambiente;

ii. Preparar uma solução do sólido obtido na reivindicação 4 etapa “d” (4 a 25 g mL'¹) em diclorometano anidro, sob atmosfera de gás inerte e agitar por 5 a 15 minutos à temperatura ambiente;

iii. Transferir a solução obtida na etapa “ii” gota-a-gota, sob atmosfera de gás inerte, para o recipiente contendo a mistura obtida na etapa “i”, para a concentração final de 49 a 240 g mL

1.

J iv. Agitar à temperatura ambiente por 24 a 28 horas;

v. Adicionar diclorometano e lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, posteriormente, com água destilada, secar, filtrar e evaporar a fase orgânica, preferencialmente por destilação, e purificar o produto utilizando preferencialmente cromatografia em coluna.

Petição 870170052564, de 25/07/2017, pág. 65/97

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6. VACINA ANTIDROGA, caracterizada por compreender pelo menos uma das moléculas estimuladoras do sistema imunológico definidas na reivindicação 1 e excipientes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.

7. USO DAS MOLÉCULAS ESTIMULADORAS, conforme definidas na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar uma vacina para tratar pacientes com dependência a drogas de abuso, preferencialmente cocaína.

8. USO DAS MOLÉCULAS ESTIMULADORAS, conforme definidas na reivindicação 1, caracterizado por ser para preparar uma vacina para prevenir a exposição fetal às drogas, em mulheres grávidas que façam uso de drogas, preferencialmente cocaína.