CN107141303A - 一种反应型巯基化合物探针及其制备方法 - Google Patents

一种反应型巯基化合物探针及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种反应型巯基化合物探针及其制备方法，基于硫醇参与的二硫键断裂反应，传感分子释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度显著性增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对巯基化合物的特异性识别响应，检测限达0.124 μM。

Description

一种反应型巯基化合物探针及其制备方法
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种反应型巯基化合物探针及其制备方法。
背景技术
生物体内许多蛋白质和小分子中都含有巯基，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)。巯基在生物体内细胞的抗氧化系统中具有极其重要的作用，它可以防止生物体内细胞受到氧化伤害。医学研究表明谷胱甘肽及半胱氨酸与很多疾病有关，比如肾功能衰竭、老年痴呆症等，它们在生物体内的含量变化可以作为这些疾病诊断的依据，因此开发选择性地检测半胱氨酸的检测方法尤其重要。
目前测定氨基酸含量的方法有很多，如比色法、碘量法、酶循环法、毛细管电泳法和HPLC法等，这些方法各有优点，但也都有不足之处。比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差；碘量法是氧化还原滴定法中，应用比较广泛的一种方法，但对样品溶液的酸度和温度反应敏感，不易操作；酶循环法是利用酶的底物特异性来放大被测物质的测定方法，但使用的工具酶用量大，成本较高；毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法，毛细管直径小，使光路太短，灵敏度较低，而且电渗会因样品组成而变化，进而影响分离重现性；HPLC法准确性高，样品处理简单，但受色谱柱局限，且耗费时间很长。
在这些检测方法中，荧光探针法因其探针特殊的光物理特性和光化学特性，不仅可以有效地提高检测的灵敏度，而且具有动态响应范围广的特点，更重要的是可以检测活体甚至单个活细胞中的巯基含量，从而成为了目前广泛应用的检测生物体内巯基的一种重要的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种反应型巯基化合物探针，还提供了该反应型巯基化合物探针的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种反应型巯基化合物探针，探针分子式为C39H25NO5S2，结构式如下：
上述反应型巯基化合物探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：
(2)化合物1与苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：
(3)化合物2与化合物3反应得到目标产物反应型巯基化合物探针，化合物3的化学式如下：
优选地，步骤(2)中苊酚的制备方法包括以下步骤：
1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6，冰水混合物的体积为反应液体积的10～20倍；
2)将步骤1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；其中，柱色谱分离时洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝38～42：1；
3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；
4)将步骤3)所得苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得苊酚纯品；其中，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝28～32：1。
优选地，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，甲苯中间苯二酚的投加量为2～3mol/L，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。
进一步，步骤(2)中化合物2的制备方法具体为：向甲苯中加入化合物1、苊酚及甲磺酸，于60～70℃搅拌25～35分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，真空干燥，得到化合物2纯品；其中，甲苯中化合物1的投加量为0.09～1.0mol/L，化合物1、苊酚及甲磺酸的摩尔比为1：1：26～27，柱色谱洗脱时洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝48～52：1。
优选地，步骤(3)中化合物3的制备方法包括以下步骤：
1)向苯并噻吩-2-硼酸的乙醇溶液中加入过氧化氢，搅拌反应6～10小时后，蒸出乙醇后的产物溶于水中，并与用氯仿萃取，干燥氯仿萃取相，并在真空浓缩，进一步采用硅胶分离提纯，得到中间体3-1；其中，苯并噻吩-2-硼酸与过氧化氢的摩尔比为1：3～3.5，硅胶分离提纯时洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯＝9：1；
2)将步骤1)中所得中间体3-1溶于四氢呋喃中，升温至55～65℃，加入单水氢氧化锂的水溶液，搅拌15～18小时后，冷却至室温，加入水和乙醚的混合溶液至反应停止，再加入浓盐酸调节pH值为1.8～2.2，分离有机层，经洗涤、干燥、蒸除有机溶剂后，用层析柱分离纯化，得到中间体3-2；其中，中间体3-1与单水氢氧化锂的摩尔比为1：1.2～2，层析柱分离纯化时洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯＝9：1。
3)将步骤2)所得中间体3-2加入至2,2’-二硫二吡啶的二氯甲烷溶液中，于±1℃反应8～15分钟后，再升至室温反应5～8小时，蒸除有机溶剂，采用硅胶分离提纯，即得化合物3；其中，中间体3-2与2,2’-二硫二吡啶的质量比为1：1.2～1.4，硅胶分离提纯时洗脱剂采用石油醚：丙酮＝3：1。
优选地，步骤(3)中反应型巯基化合物探针的制备方法具体为：向二氯甲烷中加入化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶，于±2℃搅拌8～15分钟，得到反应液；将N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液加入反应液中，升至室温并搅拌20～30小时，经柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝4.5～5.5：1，真空干燥，即得；其中，二氯甲烷中化合物2的投加量为0.025～0.027mol/L，化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1.0～1.1：0.75～0.80，所述N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液中N,N'-二环己基碳酰亚胺的浓度为0.65～0.67mol/L。
上述苊酚的合成路线如下：
上述化合物3的合成路线如下：
上述反应型巯基化合物探针的合成路线如下：
上述反应型巯基化合物探针在巯基化合物荧光检测中的应用。
本发明中所使用的各种原料均为普通市售产品，或者通过本领域技术人员公知的方法或现有技术中公开的方法获得。
本发明基于硫醇参与的二硫键断裂反应，传感分子释放出罗丹明染料分子单体，荧光强度显著性增强并伴随明显的颜色变化，选取的干扰离等对检测效果几乎无影响，因而实现了对巯基化合物(尤其是谷胱甘肽及半胱氨酸)的特异性识别响应，检测限达0.124μM。
附图说明
图1是反应型巯基化合物探针(10μM)的溶液随谷胱甘肽加入当量的增大而呈现的荧光光谱及颜色变化；
图2是反应型巯基化合物探针(10μM)的溶液随半胱氨酸加入当量的增大而呈现的荧光光谱及颜色变化；
图3是反应型巯基化合物探针(10μM)溶液在分别加入10当量的不同氨基酸及离子后紫外-可见吸收光谱的变化；
图4是反应型巯基化合物探针(10μM)随半胱氨酸加入当量增大的紫外-可见光谱及颜色变化；
图5是反应型巯基化合物探针(10μM)随谷胱甘肽加入当量增大的紫外-可见光谱及颜色变化；
图6是反应型巯基化合物探针核磁氢谱；
图7是反应型巯基化合物探针核磁氢谱。
具体实施方式
以下通过优选实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
(1)化合物1的制备
向150mL圆底烧瓶中加入40mL甲苯，再加入间苯二酚11.0g(0.1mol)及邻苯二甲酸酐14.8g(0.1mol)，搅拌溶解，搅拌回流5小时，逐渐生成固体，抽滤去固体，用甲醇重结晶，得橙色固体。
合成路线如下：
(2)苊酚的制备
向100mL的三口烧瓶中加入5.0g(32mmol)苊，然后将6.5mL三氯氧磷(POCl3)用恒压漏斗缓慢加入三口烧瓶中(15分钟内滴加完毕)，再加入13.5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌5分钟后缓慢升温至90～95℃，继续搅拌3小时，得到反应液；将反应液加入270mL冰水混合物中，搅拌出现大量粘稠固体，经减压抽滤及真空干燥，得到苊醛粗品；然后采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝40：1，真空干燥，得到2.759g浅黄色针状固体，即5-苊醛纯品，收率为46.74％。
向50mL的圆底烧瓶中加入11mL二氯甲烷和1.0g 5-苊醛，再加入30mg二氧化硒(SeO2)及2mL 30％过氧化氢(H2O2)，然后滴加4滴冰乙酸(约0.2mL)，于25℃水浴搅拌38小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层旋蒸掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液(由0.85g氢氧化钾溶于6mL甲醇制得)中，再置于室温下水解3小时后，加入5mL质量分数为10％的稀盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，用去离子水洗涤乙酸乙酯萃取相2次，然后用适量无水硫酸钠干燥30分钟，得到苊酚粗品；将苊酚粗品采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30：1，真空干燥，得到573mg浅黄色针状固体，即苊酚纯品，收率为61.3％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(d,J＝8.3Hz,1H),7.46–7.40(m,1H),7.28(d,J＝6.8Hz,1H),7.08(d,J＝7.3Hz,1H),6.79(d,J＝7.3Hz,1H),5.08(s,1H),3.43–3.38(m,2H),3.31(dd,J＝8.2,5.0Hz,2H)。
合成路线如下：
(3)化合物2的制备
向50mL圆底烧瓶中加入3mL甲苯，再中加入75mg(0.29mol)化合物1、50mg(0.29mol)苊酚纯品及0.5mL甲磺酸，于65℃油浴加热，搅拌30分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相2次、用无水Na2SO4干燥，得到染料1粗品；将染料1粗品进一步用柱色谱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇(DCM：MeOH)＝50：1，旋蒸出溶剂，真空干燥，得到暗红色固体85mg(yield,74％)。1H NMRδH(400MHz,CDCl3)8.11(1H,d,J 8.2),8.07(1H,dd,J6.3,1.8),7.68–7.62(2H,m),7.62–7.56(1H,m),7.41(1H,d,J 6.8),7.14(1H,dd,J 6.2,1.5),6.92(1H,d,J 2.5),6.73(1H,d,J 8.6),6.58(1H,dd,J 8.6,2.5),6.51(1H,s),3.38(2H,dd,J 11.7,5.3),3.24–3.17(2H,m).δC(101MHz,CDCl3)169.79,157.27,154.22,152.10,145.66,140.92,135.10,129.65,128.46,126.48,125.04,124.02,121.60,117.89,116.49,113.98,112.31,111.36,103.14,30.84,29.62。
合成路线如下：
(4)化合物3的合成
将苯并噻吩-2-硼酸(3.09g，17mmol)加入100mL的圆底烧瓶中，然后加入30mL的乙醇，在机械搅拌的条件下逐滴滴加过氧化氢(5.6mL，30％)，反应8h后，溶液的颜色由粉红变为深红，减压蒸出乙醇后的产物溶于100mL水中，用氯仿萃取3次(每次60mL氯仿)，将氯仿萃取相用MgSO4干燥，并且在真空的条件下浓缩，再用200～300目硅胶分离化合物17，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9：1，得到中间体3-1(2.04g)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.41-7.14(m,1H),3.95(s,1H).
在100mL的圆底烧瓶中，将200mg中间体3-1溶解在10mL四氢呋喃中，加热到60℃，然后加入溶解在10mL水中的单水氢氧化锂(84mg，2mmol)，搅拌16h后，冷却至室温，加入2mL的水和10mL的乙醚至反应停止进行，加入浓盐酸调节pH＝2，分离有机层，用饱和的食盐水洗涤，用Na2SO4干燥，减压蒸除有机溶剂，然后用层析柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝9：1，得桔色晶体，即中间体3-2(168mg)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.45-7.36(m,1H),7.23(t,J＝4.8Hz,1H),7.19(dd,J＝5.6,3.6Hz,2H),3.82(s,2H),3.49(s,1H).MS(m/z):166.9[M-H]-。
在100mL的圆底烧瓶中，将220mg 2,2’-二硫二吡啶溶于30mL二氯甲烷中，冷却至0℃，在此条件下，加入中间体3-2(168mg)，反应10分钟后，升至室温继续反应6小时，减压蒸除有机溶剂，用200～300目硅胶分离，洗脱剂为石油醚：丙酮＝3：1，得到白色固体，即化合物3。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.43(d,J＝5.0Hz,1H),7.84–7.61(m,3H),7.27(tdd,J＝10.5,5.7,2.5Hz,3H),5.51(s,2H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ173.17,159.02,149.02,137.85,135.68,134.68,130.95,129.07,127.98,121.32,120.29.
合成路线如下：
(5)反应型巯基化合物探针的制备
向50mL圆底烧瓶中加入5mL无水二氯甲烷，再加入52mg(0.13mol)化合物2、38.2mg(0.138mmol)化合物3，12.3mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，0℃搅拌10分钟，得到反应液；将N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液缓慢滴加入反应液中，升至室温并搅拌24小时，采用柱色谱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(PE：EA)＝5：1，旋蒸出溶剂，真空干燥，即得淡黄色反应型巯基化合物探针；所述N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液中N,N'-二环己基碳酰亚胺的浓度为0.66mol/L。
合成路线如下：
对反应型巯基化合物探针进行核磁氢谱分析，结果图6所示；对反应型巯基化合物探针进行核磁碳谱分析，结果图7所示。
(6)应用试验
1)检测用储备液的配置
a.反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)的配制：取0.0022g(M＝446)反应型巯基化合物探针溶于5mL乙腈中，配成浓度为1.00×10-3mol·L-1的溶液。
b.各种氨基酸及阴离子(1)半胱氨酸Cys；(2)Hcy；(3)谷胱甘肽GSH；(4)CN-；(5)HS-；(6)CH3COO-；(7)HCO3 -；(8)HSO3 -；(9)SO4 2-；(10)CO3 2-；(11)SCN-；(12)NO2 -；(13)F-；(14)Cl-；(15)Br-；(16)I-均用去离子水配置成为浓度为1.00×10-3mol·L-1或1.00×10-2mol·L-1的溶液。
c.PBS缓冲溶液(0.01mol·L-1，pH＝7.4)的配制：
母液配置：0.2mol·L-1K2HPO4：称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL水中；0.2mol·L-1K2HPO4：称取27.2g K2HPO4·2H2O，溶于1000mL水中。
0.2mol·L-1PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol·L-1K2HPO4，81mL 0.2mol·L- 1K2HPO4，即可。然后取50mL 0.2mol·L-1PBS溶液，加水稀释至1000mL即可。
下述检测中使用的缓冲溶液均为PBS(0.01mol·L-1，pH＝7.4，30％乙醇)，实验用水均为去离子水。
2)检测分析
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入谷胱甘肽储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行荧光检测，激发波长为525nm，狭缝：2.5/5nm，结果如图1所示，随着谷胱甘肽加入当量的增大，探针与谷胱甘肽反应释放出荧光，使荧光强度逐渐增大。图1中右上角插图为反应前后的荧光照片，右上角插图中为仅反应型巯基化合物探针(左)和反应型巯基化合物探针+谷胱甘肽(右)，通过两者的对比，可以明显看出，反应型巯基化合物探针与谷胱甘肽共存时存在荧光响应，在待测样品溶液中，加入反应型巯基化合物探针后，即可判定谷胱甘肽的存在。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入半胱氨酸储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行荧光检测，激发波长为525nm，狭缝：2.5/5nm，结果如图2所示，随着半胱氨酸加入当量的增大，探针与半胱氨酸反应释放出荧光，使荧光强度逐渐增大。图2中右上角插图为反应前后的荧光照片，右上角插图中为仅反应型巯基化合物探针(左)和反应型巯基化合物探针+半胱氨酸(右)，通过两者的对比，可以明显看出，反应型巯基化合物探针与半胱氨酸共存时存在荧光响应，在待测样品溶液中，加入反应型巯基化合物探针后，即可判定半胱氨酸的存在。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再加入(0)Probe；(1)100μM Cys；(2)100μM Hcy；(3)100μM GSH；(4)100μM CN-；(5)100μM HS-；(6)100μM CH3COO-；(7)100μM HCO3 -；(8)100μM HSO3 -；(9)100μM SO4 2-；(10)100μMCO3 2-；(11)100μM SCN-；(12)100μM NO2 -；(13)100μM F-；(14)100μM Cl-；(15)100μM Br-；(16)100μM I-，反应30min后进行紫外可见光谱检测，结果如图3所示，探针与谷胱甘肽或半胱氨酸反应后在520nm处吸光度由0.025增强至0.15，而其他氨基酸和阴离子与探针反应后在此处没有明显的吸光度变化。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入半胱氨酸储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行紫外-可见光谱扫描，结果如图4所示，随着半胱氨酸加入当量的增大，探针与半胱氨酸反应，使吸光度逐渐增大。图4中插图为反应前后可见光下的照片，肉眼可见，半胱氨酸可以使反应型巯基化合物探针样品溶液发生明显的颜色变化。
取3mL缓冲溶液，加入30μL反应型巯基化合物探针样品溶液(1.00×10-3mol·L-1)，再分别加入谷胱甘肽储备液(1.00×10-3mol·L-1)0～3当量，于25℃反应30分钟，然后进行紫外-可见光谱扫描，结果如图5所示，随着谷胱甘肽加入当量的增大，探针与谷胱甘肽反应，使吸光度逐渐增大。图5中插图为反应前后可见光下的照片，肉眼可见，谷胱甘肽可以使反应型巯基化合物探针样品溶液发生明显的颜色变化。

Claims (8)

1.一种反应型巯基化合物探针，其特征在于，探针分子式为C39H25NO5S2，结构式如下：
2.权利要求1所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)间苯二酚与邻苯二甲酸酐反应得到化合物1，化合物1的结构式如下：
(2)化合物1与苊酚反应得到化合物2，化合物2的结构式如下：
(3)化合物2与化合物3反应得到目标产物反应型巯基化合物探针，化合物3的化学式如下：
3.根据权利要求2反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中苊酚的制备方法包括以下步骤：
1)向苊中依次加入三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺，搅拌混匀后升温至90～95℃，继续搅拌2.5～3.5小时，得到反应液；将反应液加入冰水混合物中，生成粘稠固体，经抽滤及真空干燥，得到5-苊醛粗品；其中，苊、三氯氧磷及N，N-二甲基甲酰胺的摩尔比为1：2～2.5：5～6；
2)将步骤1)所得5-苊醛粗品采用柱色谱分离，真空干燥，得到5-苊醛纯品；
3)向二氯甲烷中加入5-苊醛纯品、二氧化硒、过氧化氢及冰乙酸，于20～30℃搅拌35～40小时，过滤取滤液、静置分层后，取有机层蒸发掉溶剂，并于冰浴环境溶于氢氧化钾的甲醇溶液中，再置于室温下水解2.5～3.5小时后，加入盐酸酸化，再用乙酸乙酯萃取，水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到苊酚粗品；其中，二氯甲烷中5-苊醛纯品的投加量为80～100g/L、二氧化硒的投加量为2～3g/L、过氧化氢的投加量为1.6～2mol/L、冰乙酸的投加量为0.29～0.35mol/L，所述氢氧化钾的甲醇溶液中氢氧化钾的浓度为0.13～0.16g/mL，氢氧化钾与氯化氢的摩尔比为1：1～1.1；
4)将步骤3)所得苊酚粗品采用柱色谱分离，真空干燥，即得苊酚纯品。
4.根据权利要求2所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中化合物1的制备方法具体为：将间苯二酚及邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，搅拌回流至生成固体，抽滤取固体，用甲醇重结晶，即得；其中，间苯二酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求4所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中化合物2的制备方法具体为：向甲苯中加入化合物1、苊酚及甲磺酸，于60～70℃搅拌25～35分钟，将反应液用乙酸乙酯萃取，再水洗乙酸乙酯萃取相、干燥，得到化合物2粗品；将化合物2粗品进一步用柱色谱分离，真空干燥，得到化合物2纯品；其中，化合物1、苊酚及甲磺酸的摩尔比为1：1：26～27。
6.根据权利要求2所述反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中化合物3的制备方法包括以下步骤：
1)向苯并噻吩-2-硼酸的乙醇溶液中加入过氧化氢，搅拌反应6～10小时后，蒸出乙醇后的产物溶于水中，并与用氯仿萃取，干燥氯仿萃取相，并在真空浓缩，进一步采用硅胶分离提纯，得到中间体3-1；其中，苯并噻吩-2-硼酸与过氧化氢的摩尔比为1：3～3.5；
2)将步骤1)中所得中间体3-1溶于四氢呋喃中，升温至55～65℃，加入单水氢氧化锂的水溶液，搅拌15～18小时后，冷却至室温，加入水和乙醚的混合溶液至反应停止，再加入浓盐酸调节pH值为1.8～2.2，分离有机层，经洗涤、干燥、蒸除有机溶剂后，用层析柱分离纯化，得到中间体3-2；其中，中间体3-1与单水氢氧化锂的摩尔比为1：1.2～2。
3)将步骤2)所得中间体3-2加入至2,2’-二硫二吡啶的二氯甲烷溶液中，于±1℃反应8～15分钟后，再升至室温反应5～8小时，蒸除有机溶剂，采用硅胶分离提纯，即得化合物3；其中，中间体3-2与2,2’-二硫二吡啶的质量比为1：1.2～1.4。
7.根据权利要求2至6任一反应型巯基化合物探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中反应型巯基化合物探针的制备方法具体为：向二氯甲烷中加入化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶，于±2℃搅拌8～15分钟，得到反应液；将N,N'-二环己基碳酰亚胺的二氯甲烷溶液加入反应液中，升至室温并搅拌20～30小时，经柱色谱分离，真空干燥，即得；其中，化合物2、化合物3及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1.0～1.1：0.75～0.80。
8.权利要求1所述反应型巯基化合物探针在巯基化合物荧光检测中的应用。
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