CN107137652A - 草果油的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了草果油在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。本发明还提供了草果油与β‑内酰胺类抗生素联合使用在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。本发明草果油具有明显体外抗MRSA活性和体内抗MRSA感染疗效，且具有增强β‑内酰胺类抗生素体外抗MRSA活性，说明草果油不仅具有单独作为抗感染药物新药的开发与应用前景，还具有与β‑内酰胺类抗生素联合使用，恢复其抗MRSA活性，逆转MRSA多重耐药活性中药新药的开发与应用前景。

Description

草果油的新用途
技术领域
本发明涉及草果油在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途，属药物领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，自1961年Jevons在英国首次发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)以来，MRSA在上世纪70年代遍布全球，是目前院内感染和社区获得性感染最常见、最重要的多重耐药致病菌，可引起肺炎、心内膜炎和败血症等严重感染，MRSA具有明显遗传多样性，可在动物之间、动物和人群之间广泛传播。据报道，MRSA对现有β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等多种抗生素耐药，其中，MRSA对最有效也是使用最广泛的所有β-内酰胺类抗生素几乎呈交叉耐药，又被称为“超级细菌”，MRSA感染与乙型肝炎、艾滋病被列为世界三大最难解决感染性疾病。据报道，美国每年MRSA侵袭性感染患者约9.5万人，死亡1.9万人，血流感染死亡率较高，平均约30％，部分地区可达65％，高于艾滋病、病毒性肝炎、结核和流感死亡率的总和，严重威胁着人类健康，成为全球的公共安全卫生问题。
目前，万古霉素和利奈唑胺等少数药物是临床抗MRSA感染的一线药物，随着临床耐万古霉素和利奈唑胺耐药菌株的不断增加，以及万古霉素严重的耳/肾毒性和静脉炎等不良反应导致其在临床用药的局限性，临床抗MRSA感染正面临“用药难”和“难用药”的严峻挑战，新型抗MRSA感染药物研发迫在眉睫。相对于抗生素新药研发周期长、易产生耐药性和明显毒副作用等不足，传统药物具有资源广、毒副作用小和逆转细菌耐药性等优点，在控制感染性疾病，尤其是多重耐药菌引起的感染性疾病方面具有化学合成抗菌药物所不可比拟的优势。草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)为姜科豆蔻属植物，主产于广西、云南、贵州等地，是药食两用大宗中药材，常用于治疗疟疾寒热、胸满腹胀、恶心呕吐等症。此外，草果也是常用的调味品，用于糕点，食物，火锅等食品的加香。
目前，已有草果油用于细菌感染性疾病的报道，如专利申请号：201010622746.8，发明名称：草果油在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的用途，该申请公开了草果油在制备治疗细菌感染性疾病的药物中的用途，提供了一种治疗细菌感染性疾病的药物组合物。本发明药物对革兰氏阳性菌和阴性菌具有抗菌活性,对其中的耐药株也有较强的抑菌作用,并且在体内同样具有良好的抗菌作用,能有效治疗临床革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的各类菌株所致的感染性疾病。针对“超级”耐药菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的治疗，没有相关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供了草果油的新用途，具体是在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。
本发明还提供了草果油在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。
本发明还提供了草果油与β-内酰胺类抗生素联合使用在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。
其中，所述的草果油来源于姜科豆蔻属植物草果Amomum tsa-ko Crevost etLemaire的成熟果实提取的挥发油。
其中，所述的草果油是通过如下方法制备得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸馏水，浸泡1～5小时后，采用水蒸气蒸馏法提取2～6小时，即得草果油。
本发明还提供了一种治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物组合物，它含有草果油为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
其中，所述的活性成分还包括β-内酰胺类抗生素。
本发明药物组合物是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
草果油0.1－0.9份、β-内酰胺类抗生素0.9－0.1份。
其中，所述的草果油是通过如下方法制备得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸馏水，浸泡1～5小时后，采用水蒸气蒸馏法提取2～6小时，即得草果油；所述的β-内酰胺类抗生素为阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟。
其中，所述的药剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。
本发明原料草果在当代主要用作食物香料，不仅具有自身兼有抗MRSA活性和逆转MRSA多重耐药活性，还具有资源广、安全无毒和不易产生耐药性等优点，在抗MRSA感染性疾病新药研发中具有广泛的开发与应用前景。
本发明草果油具有明显体外抗MRSA活性和体内抗MRSA感染疗效，且具有增强β-内酰胺类抗生素体外抗MRSA活性，说明草果油不仅具有单独作为抗感染药物新药的开发与应用前景，还具有与β-内酰胺类抗生素联合使用，恢复其抗MRSA活性，逆转MRSA多重耐药活性中药新药的开发与应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1本发明药物草果油的制备
取草果，粉碎过20-40目筛，加入10-14倍重量的蒸馏水，浸泡1-5小时后，采用水蒸气蒸馏法提取2-6小时，即得本发明草果油。
本发明草果油也可按照药典(2005年版)附录XD挥发油测定法提取，还可采用有机溶剂提取、超临界CO2萃取等现有技术进行提取，或者通过购买市售产品的方式获得。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1本发明药物药效试验
1材料与方法
1.1实验菌株
MRSA标准株ATCC43300和ATCC33591均购自美国典型菌种保藏中心；MRSA临床分离株25株来源于四川省妇幼保健院；所有菌株均保存于成都医学院医学检验实验教学示范中心，菌株编号和来源见表1。
表1：受试菌株的编号和来源
1.2实验药物
实验药物：本发明药物；
抗生素：阿莫西林(Amoxicillin hydrochloride trihydrate)，批号B326BA3634，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；头孢氨苄(Cephalexin monohydrate)，批号BA14BA0016，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；头孢吡肟(cefepime)，批号RK9Y-DN25，购自中国食品药品检定研究院。Vancomycin，购自Sigma公司。
1.3实验动物
KM小鼠，SPF级，体重(20±2)g，由四川省成都生物制品研究所有限责任公司提供，动物生产许可证号SCXK(川)2016-08。
1.4培养基
MUELLER-HINTON BROTH(MHB)，批号583507，购自英国OXOID公司；MUELLER-HINTONAGAR(MHA)，批号1376993，购自英国OXOID公司；营养琼脂，批号20150810，购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.5主要试剂
大豆油，浙江田雨山药用油有限公司，批号20140702；0.5麦氏比浊管，购自bioMerieux SA公司；Tween-80，批号20150429，购自国药集团化学试剂有限公司；0.9％氯化钠注射液，批号B16051903，购自四川科伦药业股份有限公司；96-孔板，批号160805-078，购自加拿大JET BIOFIL公司。
1.6主要仪器
生物安全柜(BIOsafe12)，上海力申科学仪器有限公司；自动高压灭菌锅(HICLAVEHVE-50)，日本HIRAYAMA公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；电热鼓风干燥箱(GZX-9240MBE),上海博迅实业有限公司医疗设备厂；优普UPH-II-10T纯水系统；分析天平(ME104)，美国METTLER TOLEDO公司；血细胞分析仪：法国HORIBA ABX公司。
2实验方法
2.1草果油提取
按照中华人民共和国药典标准，采用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油，并用无水十二烷基磺酸钠进行去水处理，测其密度(ρ＝929mg/ml)，存放于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
2.2本发明药物体外抗MRSA活性
2.2.1最低抑菌浓度(MIC)测定药液稀释
药液配置：以Tween-80对草果油进行乳化，制备成185.80mg/ml乳剂，二倍稀释法对乳化液进行系列稀释，共稀释成12个不同浓度梯度的稀释液，用于测定MIC、MBC和FIC；以无菌水为溶剂，将抗生素溶解和稀释，配制成浓度为4096μg/ml的母液，4℃冰箱保存备用。采用二倍稀释法对抗生素母液进行系列稀释，共稀释成12个不同浓度梯度的稀释液，用于测定MIC、MBC和FIC。
菌液制备：取各受试菌进行活化，挑取单克隆菌落于0.9％生理盐水中，将菌液配置成0.5麦氏浓度(1.5×108CFU/ml)，后用Mueller-Hinton无菌肉汤稀释50倍备用。
MIC测定：用96-孔板微量稀释法分别测定本发明药物和阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟的MIC。具体方法如下：在96-孔板中每孔分别加入100μl MHB，50μl稀释后不同浓度的药液，50μl制备的受试菌液，使本发明药物在每孔中的终浓度为0.023mg/ml～46.45mg/ml，抗生素的终浓度为1μg/ml～2048μg/ml，37℃恒温培养18h-24h，观察其受试菌的生长情况，以无生长的药物最低浓度为该药对该受试菌的MIC。以不加药物为受试菌的阳性对照，以不加菌液为药物阴性对照，以仅含培养液的为空白对照，每株受试菌进行三个平行实验，实验重复三次。
2.2.2最低杀菌浓度(MBC)测定
药液稀释和菌液配制同MIC测定。首先用96-孔板微量稀释法测定本发明药物对不同受试菌的MIC值(方法同上)，37℃恒温培养18h-24h后，将培养板中未见细菌生长的肉汤接种于MHA琼脂平板上，37℃恒温培养18-24h，观察受试菌生长情况，以未见菌落生长的最小药物浓度，即引起大多数细菌裂解的最低浓度为该药物MBC。以不加药物为受试菌的阳性对照，以不加菌液为药物阴性对照，以仅含培养液的为空白对照，每株受试菌进行三个平行实验，实验重复三次。
2.3发明药增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA体外活性
药液稀释和菌液制备同MIC测定。
联合抑菌指数(FIC)测定：根据发明药和β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟)的MIC结果，用棋盘法测量草果油与β-内酰胺类抗生素联合使用的FIC。具体方法如下：将96孔板横排(1-12)，竖列(A-E)分别加上不同浓度梯度(2MIC～1/16MIC)的发明药(甲药)和抗生素(乙药)各50ul，再加上100μl受试菌液，使其总浓度为1.5×106CFU/ml)，37℃恒温培养18-24h，观察细菌生长情况，统计两药联合使用的MIC。以不加药物为受试菌的阳性对照，以不加菌液为药物阴性对照，以仅含培养液的为空白对照，每株受试菌进行三个平行实验，实验重复三次。
统计分析：FIC＝甲药联用的MIC/甲药单用的MIC+乙药联用的MIC/乙药单用的MIC。其中FIC≤0.5为协同作用，0.5<FIC≤1为相加作用，1<FIC≤2为无关作用，FIC>2为拮抗作用。
2.4本发明药物体内抗MRSA感染活性
2.4.1MRSA感染小鼠模型制备
细菌毒力(MLD)测定：适应性饲喂后，按体重将KM小鼠(SPF级)随机分为6组，每组10只，分为5个实验组和空白组。37℃恒温培养MRSA标准株ATCC43300至对数期，用生理盐水将菌液稀释成五个不同浓度梯度的菌液，腹腔注射KM小鼠。在空白对照组小鼠不死亡的前提下，记录实验组小鼠72h内的死亡率，测定SPF小鼠全部死亡的最低细菌量，即为ATCC43300的最小致死量(Minimum lethal dose,MLD)。
MRSA全身感染模型小鼠制备：以MLD菌液腹腔注射KM小鼠(SPF级)，制备MRSA感染小鼠模型。
2.4.2实验分组及给药
肌内注射预防给药：KM小鼠(SPF级)适应性饲喂后，雌雄各半，按体重随机共分7组，每组小鼠10只。其中分为空白对照组(N＝10)，模型对照组(N＝10)，溶剂对照组(N＝10)，阳性药物对照组(N＝10)，实验组分高、中、低3个剂量组(N＝30)。其中空白组和模型组肌内注射生理盐水，溶剂对照组肌内注射大豆油，阳性对照组肌内注射万古霉素，实验组分别按不同剂量注射草果油，1次/d，连续给药5d，给药剂量详见表6。除空白组不攻毒外，其余各组小鼠均在第5d给药后，用最小致死量MRSA菌液腹腔注射小鼠进行攻毒，观察小鼠存活情况。
肌内注射治疗给药：KM小鼠(SPF级)适应性饲喂后，按体重随机共分8组，每组小鼠10只。其中分为空白对照组(N＝10)，模型对照组(N＝10)，阳性药物对照组(N＝10)，实验药物5组(N＝50)。其中空白组和模型组肌内注射生理盐水，阳性对照组肌内注射万古霉素，实验组注射发明药，给药剂量详见表7。小鼠用MLD菌液量腹腔注射MRSA后，立即给药，1次/d，连续给药3d，观察小鼠的存活情况。
灌胃预防给药：KM小鼠(SPF级)适应性饲喂后，按体重随机共分9组，每组小鼠10只。其中分为空白对照组(N＝10)，模型对照2组(N＝20)，溶剂对照组(N＝10)，阳性药物对照组(N＝10)，实验组分为高、中、低3个剂量组((N＝10)。其中空白组和模型组灌胃生理盐水，溶剂对照组灌胃吐温-80，阳性对照组口服万古霉素，实验组灌胃草果油，1次/d，连续给药5d，给药剂量详见表8。除空白组不攻毒外，其余各组小鼠均在第5d给药后，用最小致死量MRSA菌液腹腔注射小鼠进行攻毒，观察小鼠存活情况。
2.4.3数据统计
统计分析小鼠攻毒感染后7d内的存活和体内保护率，采用寇氏法统计分析发明药体内抗MRSA感染的半数有效量(50％effective dose,ED50)。
3结果与分析
3.1发明药抗MRSA体外活性
采用96-孔板微量稀释法分别测定了草果油和3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟)的MIC和MBC，结果见表2。
表2：发明药和3种β-内酰胺类抗生素对MRSA的体外活性
由上表可知，本发明药物对MRSA的MIC为0.36mg/ml～2.90mg/ml，MBC为1.45mg/ml～11.61mg/ml，说明草果油具有明显抗MRSA体外活性。临床常用3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟)对MRSA的MIC分别为4μg/ml～128μg/ml、4μg/ml～512μg/ml、4μg/ml～512μg/ml，MBC分别为32μg/ml～1024μg/ml、256μg/ml～1024μg/ml、256μg/ml～1024μg/ml，多表现为高水平耐药。
3.2发明药增强β-内酰胺类抗生素抗MRSA体外活性
采用棋盘法分别测定了发明药和3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟)联合使用对MRSA的FIC指数，分析了发明药与β-内酰胺类抗生素联合使用对2株MRSA标准株的活性变化，结果见表3；统计分析了发明药和β-内酰胺类抗生素联合使用对27株MRSA受试菌的相互作用，结果见表4。
表3：发明药与β-内酰胺类抗生素联合运用对MRSA标准株的MIC比较分析
由上表可知，3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟)在单独使用和联合发明药使用时，MIC明显降低，说明发明药能有效逆转MRSA标准株ATCC33591和ATCC43300的多重耐药活性。
表4：发明药与β-内酰胺类抗生素联合使用抗MRSA活性
由上表可知，草果油分别与3种β-内酰胺类抗生素联合使用，主要表现为协同作用，其次为相加作用，仅有1株(3.33％)表现为无关作用。其中与阿莫西林、头孢氨苄和头孢吡肟的协同率分别为81.48％、81.48％和77.78％，说明草果油与3种β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟)对80％左右的MRSA菌株具有协同作用，可有效增强β-内酰胺类抗生素治疗MRSA作用，具有逆转MRSA对β-内酰胺类抗生素的多重耐药活性。
3.3发明药体内抗MRSA感染疗效
3.3.1MRSA的最小致死量
采用5种不同剂量对MRSA ATCC43300进行腹腔注射感染攻毒，测得金黄色葡萄球菌的最小致死量为3.0×1010CFU/kg。
3.3.2本发明药物体内抗MRSA感染疗效
(1)本发明药物肌内注射预防给药的体内疗效
用发明药肌内注射小鼠，采用预防给药方式，即1次/d，连续给药5d，最后一次给药后用MRSA菌株攻毒，实验结果见表5。
表5：发明药肌内注射(预防给药)体内抗MRSA感染疗效
由上表可知，发明药注射预防给药对由MRSA诱导的感染模型小鼠有很好的体内抗菌活性，高、中、低剂量对MRSA感染模型小鼠的体内保护率分别为100％、70％和40％，呈明显量效关系。
(2)发明药肌内注射治疗给药的体内疗效
用发明药0.46g/kg肌内注射治疗MRSA感染模型小鼠，采用治疗给药方式，即攻毒小鼠后立即给药治疗，1次/d，连续给药3d，观察草果油的治疗用药情况，实验结果见表6。
表6：草果油肌内注射(治疗给药)体内抗MRSA感染疗效
由上表可知，草果油肌内注射治疗给药对MRSA感染模型小鼠有明显体内抗感染疗效，保护率达100％，且呈明显量效关系。寇氏法计算发明药治疗MRSA感染的ED50为0.18g/kg。
(3)发明药灌胃预防给药
用发明药灌胃小鼠，1次/d，连续给药5d，最后一次给药后，立即用MRSA攻毒小鼠，实验结果见表7。
表7：发明药灌胃(预防给药)体内抗MRSA感染疗效
由上表可知，发明药灌胃，高、中、低剂量对MRSA感染模型小鼠的体内保护率分别为100％、80％和60％，呈明显量效关系。
总之，发明药具有明显体外抗MRSA活性和体内抗MRSA感染疗效，且具有增强β-内酰胺类抗生素体外抗MRSA活性，说明发明药不仅具有单独作为抗MRSA感染性疾病药物新药的开发与应用前景，还具有与β-内酰胺类抗生素联合使用，恢复其抗MRSA活性，逆转MRSA多重耐药活性中药新药的开发与应用前景。

Claims (9)

1.草果油在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。
2.草果油与β-内酰胺类抗生素联合使用在制备治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于；所述的草果油来源于姜科豆蔻属植物草果Amomum tsa-ko Crevost et Lemaire的成熟果实提取的挥发油。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的草果油是通过如下方法制备得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸馏水，浸泡1～5小时后，采用水蒸气蒸馏法提取2～6小时，即得草果油。
5.一种治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染疾病的药物组合物，其特征在于：它含有草果油为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的活性成分还包括β-内酰胺类抗生素。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：
草果油0.1～0.9份、β-内酰胺类抗生素0.9～0.1份。
8.根据权利要求5－7任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的草果油是通过如下方法制备得到的：取草果，粉碎成粗粉，加入10～14倍重量的蒸馏水，浸泡1～5小时后，采用水蒸气蒸馏法提取2～6小时，即得草果油；所述的β-内酰胺类抗生素为阿莫西林、头孢氨苄、头孢吡肟。
9.根据权利要求5-7任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是外用制剂、口服制剂或注射制剂。
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