CN107132293B - 一种快速检测脑组织EETs的新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测脑组织EETs的新方法。本发明使用样品萃取溶剂对脑组织EETs进行快速检测，样品萃取溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12‑EET‑d11。本发明快速检测脑组织EETs的新方法在沉淀蛋白法的基础上，优化了前处理过程，具有快速高效、操作简单、重复性好等优点，对神经精神疾病等医学研究具有重要意义。

Description

一种快速检测脑组织EETs的新方法
技术领域
本发明属生物检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种快速高效的检测生物样本中EETs的新方法。
背景技术
脑内富含脂肪酸，特别是不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)；主要有三种：分别花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenic acid,EPA)。ARA是细胞膜的重要组成部分，也是类花生四烯酸的主要前体；细胞膜上的ARA与磷脂结合，简称脂化(Esterified)。当膜受体与配体结合后，激活磷脂酶A2(PLA2)，引起ARA脱脂化而形成游离的ARA；在多种代谢酶的作用下，游离的ARA生成具有多种生物活性的类花生四烯酸(Eicosanoids)。
花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)的代谢产物具有广泛的生理功能，其信号通路在很多神经性疾病中发生改变，如疼痛、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、抑郁症等。但生物样品的成分复杂、基质干扰大，并且环氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，EETs)在血浆和脑组织中极其不稳定。因此，建立高效、灵敏的生物样品ARA代谢产物分析方法对于很多神经性疾病的精准诊断和治疗具有重要的科学意义。
ARA代谢主要有三条途径：环加氧酶(COX)、脂氧合酶(LOX)和细胞色素P450(CYP)途径。类花生四烯酸与炎症有密切关系，因此，ARA-COX、ARA-LOX代谢途径的酶、受体以及代谢产物等作为靶点被广泛用于抗炎药物的研发，包括各种COX抑制剂、LOX抑制剂等。CYP途径分为：ω-水解途径(ω-hydroxylases)和环氧花生四烯酸(epoxyeicosatrienoicacids，EETs)生成途径(后者简称ARA-EETs代谢途径)(请参见图1)。对ARA-EETs代谢途径的研究始于1980年，直到1996年发现EETs是一类内皮细胞源性的血管舒张因子后，对ARA-EETs代谢途径的研究才引起学界的广泛兴趣。
ARA在CYP2J/C的作用下生成EETs；环氧化物水解酶(sEH)将一个水分子插入EETs的环氧基团，生成相应的、低活性的二羟基二十碳三烯酸(DHET)。EETs有四个异构体：5,6-、8,9-、11,12-、14,15-EET；EETs具有多种相似的生物活性，如抗炎、抗血小板聚集、舒张血管、促进血液干细胞移植体的生长等等，但四个异构体存在组织分布、生物学特性的个体差异。
提高生物样本中ARA代谢产物的检测精准性，可从采用精准的检测仪器和改变样品的前处理程序两方面着手；在相同实验设备的条件下，完善样品的前处理方法可以提高生物样本中ARA代谢产物的检测精准性。国内外最常见的生物样品前处理方法有以下几种，它们各自的优缺点如下：
1、沉淀蛋白法：通过沉淀蛋白质可以将待测的化合物释放出来，起到提取和纯化待测物的目的，可用于测定化合物的浓度。其优点是操作简便易行、效率高、省时省力、节约成本，目标物回收率较高，可以减少样品的乳化现象，另外还可以保护仪器，延长使用命。缺点：与液液萃取相比，该法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去；且运用该方法处理后的样品，目标物会被稀释，浓度降低，对仪器的灵敏度要求更高；另外，此法所得样品不能用光谱法检测。
2、液液萃取法：液-液萃取(LLE)是在液体混合物中加入与其不相混溶(或稍相混溶)的溶剂，利用组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的，又称溶剂萃取或抽提。其优点是应用范围广、经该方法处理后样品纯度较高，基质效应小。缺点是需要大量使用有机溶剂，而大部分有机溶剂有毒，存在乳化现象，也难以实现自动化；此外，与沉淀蛋白法相比，LLE步骤较多，易产生损耗，萃取率不高。
固相萃取法：固相萃取法(SPE)是用固体物质作为萃取剂，采用高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。其优点是安全性高、选择性好、分析速度快、回收率高、自动化程度高、操作简单而应用广；且溶剂用量少，不易产生乳化。但缺点是操作步骤多，效率低；柱子截面积小，流量低，易堵塞；易产生缝隙，降低提取效率；重复性较差；且前处理成本高。
鉴于此，迫切需要一种简单高效、操作简单、重复性好的检测生物样本中EETs的新方法。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有生物样本中花生四烯酸代谢产物—环氧花生四烯酸(EETs)的检测方法中存在的缺陷，提供一种样品萃取溶剂及应用该样品萃取溶剂实现检测生物样本中环氧花生四烯酸的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种样品萃取溶剂，其包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-EET-d11。
优选，所述的样品萃取溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-EET-d11，其中按体积比，甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％，11,12-EET-d11的终浓度为20ppb。
本发明样品萃取溶剂可以用于快速检测脑组织中的EETs，具体检测方法包括如下步骤：
(1)取生物样品，加入PBS溶液并制成匀浆；
(2)在匀浆中加入sEH抑制剂反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-环己氧基}-苯甲酸，再加入等比例加入样品萃取溶剂，震荡离心后沉淀；
(3)离心取上清过滤，滤液作为待测样品；
(4)将待测样品通过Thermo Fisher Scientific TurboFlow在线样品前处理系统和超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，即可得出脑组织中EETs的浓度；
其中，步骤(2)所述样品萃取溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-EET-d11。
优选，所述的样品萃取溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-EET-d11，其中按体积比，甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％，11,12-EET-d11的终浓度为20ppb。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(1)中，所述PBS溶液的加入量为10μl/mg生物样品。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(2)中，所述sEH抑制剂反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-环己氧基}-苯甲酸的终浓度为0.8nmol/L。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(2)中，所述震荡时间为10min，所述离心的条件为5000rpm离心1min。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(2)中，所述沉淀温度为-20℃，沉淀时间为1.5h。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(3)中，所述离心的条件为4℃、14000rpm离心10min。
作为本发明快速检测脑组织EETs的方法的一种改进，步骤(3)中，所述过滤是使用0.22μm微孔滤膜过滤。
相对于现有技术，本发明样品萃取溶剂及其在花生四烯酸代谢产物检测中的应用具有如下有益效果：
(1)本发明样品萃取溶剂应用于花生四烯酸代谢产物的沉淀蛋白法检测中，具有EETs提取效率高、防止EETs被氧化、减缓EETs转化为DHET的速度等优点。
(2)本发明快速检测脑组织EETs的方法在沉淀蛋白法的基础上，优化了前处理过程，具有定量准确、快速高效、操作简单、重复性好等优点，对神经精神疾病等医学研究具有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明快速检测脑组织EETs的新方法及其有益效果进行详细说明。
图1为ARA-EETs代谢途径示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
样品前处理：
(1)取新鲜脑组织样品，称湿重，按10μl/mg比例加入PBS液，用均质器充分匀浆(6500rpm,1min)，立取匀浆液到1.5ml离心管中，加入sEH抑制剂反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-环己氧基}-苯甲酸(4μl/100μl，终浓度0.8nmol/L)，得到待处理样品。
(2)沉淀蛋白：在步骤(1)的待处理样品中等比例(1：1)加入终浓度为20ng/ml(20ppb)的样品萃取溶剂，震荡10min，4℃5000rpm离心1分钟，置于–20°冰箱沉淀蛋白1.5小时，取出后4℃14000rpm离心10分钟，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，放入进样小瓶中待测(按下述UPLC-MS/MS条件、色谱条件和质谱条件进行分析)。
其中，20ng/ml的样品萃取溶剂的组分为甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％(V/V/V)，该溶剂中还含有终浓度为20ppb的内标(11,12-EET-d11)。
含有终浓度为20ppb内标的样品萃取溶剂的配制方法如下：
(1)10ml甲醇、10ml乙腈、8μl乙酸混匀于50ml离心管管中，保存于–20℃冰箱中备用。其中10ml甲醇中含有终浓度为40ppb的内标(11,12-EET-d11)。
(2)含有终浓度为40ppb内标的10ml甲醇溶液配制方法如下：9.6ml的甲醇溶液中加入400μl终浓度为1ppm的内标(11,12-EET-d11)，混匀，定容为10ml，–20℃冰箱中备用。
(3)终浓度为1ppm的内标(11,12-EET-d11)配制方法如下：990μl甲醇溶液中加入10μl EET内标11,12-EET-d11的原液(100ppm)，混匀，定容为1ml，置于–80℃冰箱保存。
上述实验试剂中，EET标准品，(5,6-、8,9-、11,12-、14,15-EET)与内标(11,12-EET-d11)购自Cayman Chemical公司，质谱级的甲醇、乙腈、异丙醇均购自德国默克公司(Merck KGaA)，质谱级的甲酸、乙酸来自于美国赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Corp.USA)，双蒸水为屈臣氏蒸馏水。
UPLC-MS/MS条件：
使用仪器：Thermo Fisher Scientific TurboFlow在线样品前处理系统和ThermoFisher Scientific TSQ QuantivaTM三重四极杆液相色谱串联质谱仪，Tracefinder 3.3数据处理系统(Thermo Fisher Scientific Corp.USA)，法国Bertin Precellys 24生物样品均质器(Bertin Precellys 24-Dual,Bertin Technologies)。
色谱条件：分析柱：Waters Acquity UPLC BEH C18column(2.1×150mm,1.7μm).预柱：美国赛默飞世尔TurboFlow Cyclone P columns(0.5×50mm)；流动相：0.02％乙酸水(A)、乙腈(B)、乙腈：异丙醇＝1:1(C)；流速：0.30ml/min；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；进样量：20μl；梯度洗脱程序请参见表1。
质谱条件：质谱采用选择反应监测扫描方式和负离子监测模式进行样品分析。EET和EET内标的电喷雾电压均为+2000V，-2500V；毛细管温度：350℃；离子化温度均为：300℃；鞘气流速：55Arb；辅助气流速：12Arb；其他主要质谱条件请参见表2；扫描时间为10min。
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0001312594900000081
Figure BDA0001312594900000091
表2EET和其内标主要质谱条件，Q2代表定量子离子
Figure BDA0001312594900000092
结果发现，按上述方法进行前处理后再测定脑小鼠脑组织内EETs，其EETs的提取效率得到了很大的提高，具体参数为：绝对回收率为97.71％、14,15-EET峰面积为1038，14,15-EET(ng/g)为3.15。
实验例2沉淀蛋白所用溶剂的选择
甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，本发明检测方法经实验考察:分别采用六种溶剂(等比例的甲醇:异丙醇，等比例的甲醇:异丙醇加0.04％乙酸、等比例的甲醇:乙腈、等比例的甲醇乙腈加0.04％乙酸、纯乙腈、纯乙腈加0.04％乙酸)，用蛋白沉淀法提取小鼠脑组织(皮层)的EETs(具体操作方法参照实施例1，只是样品萃取溶剂的配方不同而已)，比较六种样品萃取溶剂对小鼠脑组织内EETs浓度的提取效率，发现当甲醇：乙腈＝1:1混合，并在其中加入0.04％乙酸时，对脑组织沉淀蛋白法效果最佳，这是因为乙酸的加入具有防止EETs被氧化，减缓EETs转化为DHETs的效率，提高EETs的提取效率的效果。故最优选采用此比例配置，结果请参见表3(其中，绝对回收率低于70％的溶剂不再计算目标物峰面积与含量)。
表3不同溶剂对小鼠脑组织内EETs的提取效率
Figure BDA0001312594900000101
实验例3
实施例1色谱质谱条件测定所配制的EETs标准溶液，以11,12-EET-d11为内标，终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml，以待测物的浓度为横坐标，待测物与内标峰面积的比值为纵坐标，用加权最小溢乘法(W＝1/x)进行回归运算各被测物质的线性相关系数均大于0.99，结果请参见表4。
表4表性化合物的线性关系及定量限
Figure BDA0001312594900000111
实验例4准确度、精密度、基质效应和回收率
以脑前额叶皮质样本为代表，在样品处理前加入0.2、2、20ng/ml 3个浓度的混合标准溶液(5,6-，8,9-，11,12-，14,15-EET四种EETs标准品混合液)，每个浓度平行制备3个样品，以相对回收率和RSD来表征方法的准确度和日内精密度；日间精密度的评价是在5个工作日内分别制备3个浓度的样品，计算其RSD值。结果由表5可见，待测物质的回收率在80.7～100.6％之间，方法重复性在可接受的范围内(RSD<15％)。
由于空白生物样品无法得到，本实验例通过比较相同量的内标在实际组织与纯溶剂中的峰面积之比考察是否有离子增强或抑制效应。结果显示，内标在相应保留时间出峰，且响应信号没有明显的增强或减弱，说明不存在明显的基质效应影响(结果请参见表5)。
表5代表性化合物的回收率、基质效应以及日间精密度
Figure BDA0001312594900000121
实施例5
C57BL6/J小鼠不同脑区脑组织EETs测定：
1)8-10周龄成年C57BL6/J小鼠8只，10％水合氯醛腹腔注射350mg/kg麻醉，断头、取脑，分别分离前额叶皮层(mPFC)、皮层(Cerebral cortex)、海马(hippocampus)、纹状体(striatum)、伏隔核(NAc)。
2)取新鲜脑组织样品20mg，称湿重，按10μl/mg比例加入PBS液200μl，用均质器充分匀浆1min(6500rpm)，立取匀浆液200μl到1.5ml离心管中，加入sEH抑制剂反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-环己氧基}-苯甲酸8μl(4μl/100μl，终浓0.8nmol/L)，待处理。
3)沉淀蛋白：在步骤2)的200μl待处理的脑组织样品中加入终浓度为20ng/ml的样品萃取溶剂(同实施例1)200μl，震荡10min(4500rpm)，4℃5000rpm离心1分钟，置于–20°冰箱沉淀蛋白1.5小时，取出后4℃14000rpm离心10分钟，取上清200μl，0.22μm微孔滤膜过滤，放入进样小瓶中待测。
4)采用Thermo Fisher Scientific TurboFlow在线样品前处理系统和ThermoFisher Scientific TSQ QuantivaTM三重四极杆液相色谱串联质谱仪进行检测。检测结果如表6所示。
表6不同脑区组织的EETs浓度结果如下(n＝8.
Figure BDA0001312594900000131
)：
Figure BDA0001312594900000132
该表格是不同脑区里EETs浓度结果，其中样本量等于8，浓度结果用平均值±标准差表示。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (3)

1.一种快速检测脑组织EETs的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取生物样品，加入PBS溶液并制成匀浆，所述PBS溶液的加入量为10μl/mg生物样品；
(2)在匀浆中加入终浓度为0.8nmol/L的sEH抑制剂反式-4-{4-[3-(4-三氟甲氧基-苯基)-脲基]-环己氧基}-苯甲酸，再等比例加入终浓度为20ng/ml的样品萃取溶剂，震荡离心后沉淀；所述震荡时间为10min，所述离心的条件为5000rpm离心1min；所述沉淀温度为-20℃，沉淀时间为1.5h；
(3)离心取上清过滤，滤液作为待测样品；
(4)将待测样品通过Thermo Fisher Scientific TurboFlow在线样品前处理系统和超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，即可得出脑组织中EETs的浓度；
其中，步骤(2)所述样品萃取溶剂包括甲醇、乙腈、乙酸和11,12-EET-d11，其中按体积比，甲醇：乙腈：乙酸＝1:1:0.04％，11,12-EET-d11的终浓度为20ppb；
所述的超高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件：
分析柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 column， 规格2.1×150mm,1.7μm；
预柱：美国赛默飞世尔TurboFlow Cyclone P columns， 规格0.5×50mm；
流动相包括：流动相A为0.02％乙酸水、流动相B为乙腈、流动相C为乙腈：异丙醇＝1:1；
流速：0.30ml/min；柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；进样量：20μl；
梯度洗脱程序见表1；
质谱条件：质谱采用选择反应监测扫描方式和负离子监测模式进行样品分析；EET和EET内标的电喷雾电压均为+2000V，-2500V；毛细管温度：350℃；离子化温度均为：300℃；鞘气流速：55Arb；辅助气流速：12Arb；其他主要质谱条件见表2；扫描时间为10min；
表1梯度洗脱程序
Figure FDA0002737509830000011
Figure FDA0002737509830000021
表2 EET和其内标主要质谱条件，Q2代表定量子离子
Figure FDA0002737509830000022
2.根据权利要求1所述的快速检测脑组织EETs的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心的条件为4℃、14000rpm离心10min。
3.根据权利要求1所述的快速检测脑组织EETs的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述过滤是使用0.22μm微孔滤膜过滤。
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