CN107119138A - 一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法，利用发明的引物进行PCR扩增，能够检测日光蜂以及被寄生的苹果绵蚜基因组DNA中的日光蜂的目的基因，从而区分苹果绵蚜是否被日光蜂寄生。本发明的方法可以很清楚地计算出日光蜂产卵量，比解剖的方法精准简单；可以准确地计算出日光蜂对苹果绵蚜的寄生率，明确日光蜂对苹果绵蚜的控害效果，克服由于日光蜂卵发育过程中死亡或部分已被寄生的苹果绵蚜又被捕食或丢失造成寄生率偏低现象。

Description

一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术检测领域，具体涉及一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法。
背景技术
苹果绵蚜Eriosoma lanigerum(Hausmann)是苹果属的重要害虫，它的繁殖力强，因为身上有一层棉絮状物质，致使喷洒药液时，对其造成的伤害极小，普通的化学药剂根本杀害不了它。近年来，在我国危害日趋严重，并有进一步扩大蔓延的趋势。苹果绵蚜主要以成虫和若虫整年寄生在苹果树上为害，常在苹果枝干及根部形成瘤状虫瘿，直接影响苹果树的生长发育，花芽的分化，果实的品质变劣；虫瘿逐渐扩大后，破裂的伤口招致苹果的腐烂病及其他病症，使农民受益减产。
苹果绵蚜体表分泌大量的白色棉絮状蜡质，阻挡化学药剂防治，并且化学防治污染环境、造成农药残留，而采用生物方法防治苹果绵蚜是害虫防治的可持续治理策略，日光蜂Aphelinus mali(Haldeman)是苹果绵蚜的最重要的内寄生蜂，专一性强，也是我国苹果绵蚜的优势种天敌，在苹果绵蚜的所有天敌中，日光蜂对苹果绵蚜的制约作用最大，发生高峰期寄生率高达80％以上。
日光蜂通过把卵产在苹果绵蚜体内，达到对苹果绵蚜寄生作用，卵在苹果绵蚜体内发育为幼虫，并吸取其营养物质，在日光蜂化蛹前后，苹果绵蚜变黑死亡，以前统计日光蜂寄生率是以苹果绵蚜变黑死亡为标准，统计被日光蜂寄生的苹果绵蚜数量的，由于日光蜂在田间寄生苹果绵蚜后，在日光蜂发育过程中，有部分被日光蜂寄生的苹果绵蚜会由于其它天敌捕食、雨水冲刷而丢失，更重要的是在田间，并不是所有日光蜂的卵都能发育到幼虫期或蛹期，部分被日光蜂寄生的苹果绵蚜，日光蜂卵不能孵化或者在没有发育到蛹期就死亡了，因此用统计苹果绵蚜变黑死亡数量作为日光蜂寄生苹果绵蚜的数量是不准确的，这样计算得到的寄生率也是不准确的。日光蜂产卵量统计方法，以前一般采用解剖方法，在解剖镜下通过解剖苹果绵蚜，观察苹果绵蚜体内是否有日光蜂的卵，但是日光蜂的卵长椭圆形，珍珠白颜色，与苹果绵蚜体液相仿，且极其微小，即使在解剖镜下也很难辨别，此方法统计日光蜂产卵量不够准确，而且费时费工。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法。
申请人在研究中发现，可以通过pCR检测的方法来检测测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量，再通过分析我国辽宁支系和山东支系两个日光蜂遗传支系的遗传信息，比较了日光蜂和苹果绵蚜的基因差异，提供了一种检测日光蜂和苹果绵蚜的引物，该引物适合于我国辽宁支系和山东支系两个日光蜂遗传支系对苹果绵蚜寄生率及产卵量的检测，
本发明所提供的引物，其序列信息如下：
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’(SEQ ID NO:1)；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’(SEQ ID NO:2)；
本发明的引物用来检测苹果绵蚜是否被日光蜂寄生以及日光蜂的产卵量；
本发明再一个方面提供一种日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量检测方法，步骤如下：
1)田间采集被日光蜂寄生的苹果绵蚜，记录采取的苹果绵蚜的数量为A；
2)取新羽化的日光蜂，雌雄交配后，把1对雌雄蜂接种在装有足够数量苹果绵蚜的大型玻璃容器中，置于25℃的培养箱中，每天更换新鲜的苹果绵蚜，换下被寄生的苹果绵蚜，直至雌蜂死亡；换下的被寄生苹果绵蚜放在另外25℃的培养箱中继续发育3天，然后把所有被寄生的苹果绵蚜收集在一起，记录总数量为B；
3)配制裂解液
准备好200ml以上容量的试剂瓶，洗干净后用于配制100mL 0.05mol/L、pH8.4的Tris-HCl，各物质的比例如下：
1)Tris：0.6055％
2)盐酸：0.06493％
加水定容至100mL，灭菌后，再按比例加入以下4种试剂：
全部加好后置于4℃冰箱过夜，用于提取时再按比例加入Proteinase K 8mg(按浓度换算成80μg/ml)，配置完成。(蛋白酶K工作浓度为20mg/ml，配制提取液1ml加4ul)。
4)提取日光蜂DNA及(1)和(2)中苹果绵蚜DNA；
5)对步骤4)获得的日光蜂寄生的苹果绵蚜DNA(1)、(2)为模板，利用上述的一引物在56.1℃的退火温度进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
6)对步骤5)获得的PCR产物(1)、(2)进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像仪中摄影拍照，获得电泳图谱；根据PCR产物(1)出现750bp左右条带数目C，PCR产物(2)出现750bp左右条带数目D，计算得到日光蜂对苹果绵蚜寄生率为C/A*100％；日光蜂产卵量为D。
7)测定苹果园中日光蜂对苹果绵蚜的寄生率时，直接从果园中采集带有苹果绵蚜的枝条，收集苹果绵蚜，记录数量，然后重复(3)-(6)步骤，即获得日光蜂对苹果绵蚜的寄生率。
优选的，所述步骤(2)中每对雌雄蜂提供带有100头苹果绵蚜的苹果枝条，放在0.1立方米的大型玻璃容器中；
优选的，所述步骤(5)中PCR扩增的扩增体系为13μl；其中，基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq Buffer1.3μl，10mM dNTP 1.04μl，ddH20 7.94μl；
优选的，所述步骤(5)中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
本发明能够检测日光蜂对苹果绵蚜寄生的引物能够扩增日光蜂、被寄生的苹果绵蚜基因组DNA中的日光蜂的目的基因。从本发明的电泳图谱就可以很清楚地计算出日光蜂产卵量，比解剖的方法精准简单；可以准确地计算出日光蜂对苹果绵蚜的寄生率，明确日光蜂对苹果绵蚜的控害效果，克服由于日光蜂卵发育过程中死亡或部分已被寄生的苹果绵蚜再被捕食或丢失造成的寄生率偏低现象；另外由于在田间日光蜂活动空间大，在果园自然环境中，日光蜂在一头苹果绵蚜体内一般只产一粒卵，因此本发明为每对日光蜂提供0.1立方米的活动空间，而且提供100头苹果绵蚜供其寄生，这样既保证了日光蜂足够大的活动空间，而且也满足了足够多数量的寄主，每对日光蜂日光蜂在一头苹果绵蚜体内一般只产一粒卵，所以利用PCR扩增技术检测日光蜂技术可以测定日光蜂产卵量。
附图说明
图1：PCR扩增技术检测日光蜂、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜图；
图2：PCR扩增技术检测田间苹果绵蚜被日光蜂寄生的寄生率图；
图3：PCR扩增引物的筛选检测结果图。
具体实施方式
申请人在研究中发现，在实验室内给日光蜂创造足够大的活动空间，而且提供足够多数量的寄生寄主-苹果绵蚜情况下，日光蜂也会像在自然环境中一样，在一头苹果绵蚜体内只产一粒卵，所以利用PCR扩增技术检测日光蜂技术可以测定日光蜂产卵量。
本发明中所使用的分子检测方法均可按照本领域常规技术操作，例如《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)中的相应记载。
在本发明说明书中，实施例1中所述日光蜂于2016年采集于河北省秦皇岛市昌黎和山东省青岛市城阳区苹果园；实施例2中所述日光蜂于2016年采集于山东省青岛市城阳区苹果园；实施例3中所述苹果绵蚜、被日光蜂寄生的苹果绵蚜于2016年采集于山东省青岛市城阳区苹果园；实施例4中所述苹果绵蚜为实验室内用苹果苗木饲养得到；日光蜂成虫为从田间采集的被日光蜂寄生的苹果绵蚜黑蛹于室内羽化得到；
实施例所述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Tris-HCl、Taq酶、蛋白酶K均购自青岛生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。
实施例1：引物的设计
申请人前期研究发现，基于线粒体COI后半段700bp左右基因，我国日光蜂分为Hap1、Hap2、Hap3三种单倍体型，可以分为辽宁支系和山东支系两个日光蜂遗传支系，这两个遗传支系在生物学特性以及控害能力方面存在差异，并且研究发现YL(伊犁)、ZT(昭通)、HZ(菏泽)、TA(泰安)、LC(聊城)和QD(青岛)是山东支系的纯种群，DL(大连)、HLD(葫芦岛)、QHD(秦皇岛)和SJZ(石家庄)是辽宁支系的纯种群，YT(烟台)、WF(潍坊)、BD(保定)、JZ(晋中)、CC(长治)和YC(运城)是两个支系的混合种群。因此在研究日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量检测方法时，应全面考虑我国日光蜂的这两个遗传支系，找到适合于这两个遗传支系日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量检测方法。
其中线粒体COI的测序步骤如下：
(1)2016年在河北省秦皇岛市昌黎和山东省青岛市城阳区苹果园分别采集日光蜂成虫、各100头；
(2)按照常规的酚-氯仿法提取辽宁和山东支系日光蜂基因组DNA，用紫外分光光度计和凝胶电泳双重检测其浓度和纯度。
(3)根据已测定的日光蜂COI后段序列和已知的膜翅目昆虫COI序列设计扩增日光蜂COI的特异性引物；
(4)PCR扩增的反应体系如下：
(5)PCR程序为：
94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
(6)将PCR产物克隆到PMD-18T(Takara,JAP)载体中，在ABI3730全自动测序仪中测序。
(7)获得我国辽宁支系和山东支系两个日光蜂遗传支系COI基因全长序列如下:
山东支系日光蜂COI基因全长序列:
TTATTTAATATAAATTTTAGGAATTTCATTAAAAGAATGATAACTAGGAGGAAAATTTATAACTCATTCAATTGAATTATTTATATTTTTTATATAAATTAATACACGATTAGAAATTAATCTATCTCATAAAATAAAAAAAAATAATAAAGTTCTAACTAATGAAATTATAGAACCAATAGATGACACTAAATTTCAACATAAATATCTATCTGGATAATCTGAATATCGACGAGGTATACCTCTTAATCCTAAAAAATGTTGAGGAAAAAAAGTTAAATTTACACCAATAAATATTAAAAAAAATTGAATTTTTAATCATTTTTGATTTATAGTTAAACCAAATATTATAGGAAATCAATAAATAAATCTTCCAAAAATTGCAAATACAGCCCCTATTGATAAAACATAATGAAAATGAGCAACTACATAATAAGTATCATGTAAAATAATATCAATTGAAGAATTTGATAAAATAATTCCAGTCAATCCCCCAACAGTAAATAAAAAAATAAAACCTAATAATCATAAATTAGTAACATTAAATTTAATTTTTATTCCATTTATTGAAGCAAGTCATCTAAAAATCTTAATTCCTGTAGGAATTGCAATAATTATAGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCGAGTATCTACATCCATTCCTACTGTAAATATATGATGTGCTCACACAATAAAACCTAACAACCCAATAGAAATTATTGCATAAATTATTCCTATAGATCCAAATACTTCTTTTTTTATACTTTCATTACAAATTATATGAGAAATTAAACCAAATCCTGGTAAAATTAAAATATAAACTTCTGGATGACCAAAAAATCAAAATAAATGTTGATATAAAATAGGATCACCACCACCAGAAGGATCAAAAAATGAAGTATTTAAATTTCGATCAAATAATAACATAGTAATAGCACCAGCTAAAACAGGTAAAGATAATAATAATAAAATAGCAGTTAATAATATTGCTCAAGAAAATAAAGAAATATTTTCAATTTTATAAATTTTTATGTTTAAAATTGTACAAATAAAATTAATTGAACCTATAATTGAAGAAAGACCAGCAATATGTAAAGAAAAAATAGATAAATCTACTGAAGGACCACTATGTGATAAATTTAAAGATAATGGAGGATAAACAGTTCAACCTGTCCCAGTACCAATTCCAATAAATATACTAGATATTAATAATATTAAACTTGGAGGTAAAAGTCAAAATCTTATATTATTTATTCGAGGAAAAGCTATATCTACTGAACCTAATATTAAAGGAATTAAGTAATTCCCAAACCCTCCTATTATTACAGGTATAACAAAAAAAAAAATTATAGTAAAAGCATGACTAGTAACAATAGAATTATAAATTTGATCATTACCAATTAATGAACCAGGATTCCCTAATTCTAAACGAATAATTAATCTTATTGATAATCCTAAAATTCCTGCTCATATTCCAAAAATAAAATATAAAATTCCAATATATTTATGATTTGTAGAAAATAATCATAATTTCATAATTTTTATGTAGTTTAAAAT。
辽宁支系日光蜂COI基因全长序列:
TTATTTAATATAAATTTTAGGAATTTCATTAAAAGAATGATAACTAGGAGGAAAATTTATAATTCATTCAATTGAATTATTTATATTTTTTATATAAATTAATACGCGATTAGAAATTAATCTATCCCATAAAATAAAAAAAAATAATAAAGTTCTAATCAATGAAATTATAGAACCAATAGATGAAATTAAATTCCAACATAAATATCTATCTGGATAATCTGAATATCGACGAGGCATACCCCTTAATCCTAAAAAATGTTGAGGAAAAAAAGTTAAATTAACACCAATAAATATTAAAAAAAATTGAATTTTTAATCATTTTTGATTTATTGATAAACCAAACATTATAGGAAATCAATAAATAAATCTCCCAAAAATTGCAAACACAGCTCCTATCGATAAAACATAATGAAAATGAGCAACTACATAATAAGTATCATGTAAAATAATATCAATTGAAGAATTTGATAAAATAATACCAGTTAAACCTCCAACAGTAAATAAAAAAATAAAACCTAATAACCATAAATTAGTAACATTAAATTTAATTTTTATTCCATTTATTGATGCAAGTCATCTAAAAATTTTAATTCCTGTTGGAATTGCAATAATTATAGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCGAGTATCCACATCCATCCCTACTGTAAATATATGATGAGCCCAAACAATAAATCCTAACAACCCAATAGAAATTATTGCATAAATTATACCTATTGATCCAAATACTTCTTTTTTTATACTTTCATTACAAATTATATGAGAAATTAAACCAAACCCTGGTAAAATTAAAATATAAACTTCAGGATGACCAAAAAATCAAAATAAATGTTGATATAAAATTGGATCACCACCACCAGAAGGATCAAAAAAAGAAGTATTTAAATTACGATCAAATAATAGTATGGTAATAGCACCAGCTAAAACAGGTAAAGACAATAATAATAAAATAGCAGTTAATAATATTGCCCAAGAAAATAAAGAAATACTTTCAATTTTATAAATTTTTATATTTAAAATTGTACAAATAAAATTAATTGAACCTATAATTGAAGATAAACCAGCAATATGTAAAGAAAAAATAGATAAATCTACTGAAGGACCACTATGTGATAAATTTAAAGATAATGGAGGATAAACAGTTCAACCTGTCCCAGTACCAATTCCAATAAATATACTAGATATTAATAATATTAAACTTGGAGGTAAAAGTCAAAATCTTATATTATTTATTCGAGGAAAAGCTATATCTACTGAACCTAATATTAAAGGAATTAAGTAATTCCCAAACCCTCCTATTATTACAGGTATAACAAAAAAAAAAATTATAGTAAAAGCATGACTAGTAACAATAAAATTATAAATTTGATCATTACCAATTAATGAACCAAAATTCCCTAATTCTAAACAAAAAATTAATCTTATTGATAACCCTAAAATTCCTGCTCATATTCCAAAAATAAAATATAAAATTCCAATATATTTATGATTTGTAGAAAATAATCATAATTTCATAATTTTTATGTAGTTTAAAAT。
根据以上获得的我国辽宁支系和山东支系两个日光蜂遗传支系COI基因全长序列，采用Primer5软件设计引物，共设计8对引物，通过筛选，最终确定发现如下的引物扩增效果最好、灵敏度最高。
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’(SEQ ID NO:1)；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’(SEQ ID NO:2)。
图3中自左而右的第2、3、8条带是正义引物RGF-COI1-F和反义引物RGF-COI1-R扩增的，而其它引物并未扩增出条带。
实施例2PCR扩增技术检测日光蜂、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜
(1)在城阳区苹果园中采集日光蜂成虫、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜各5头；
(2)裂解液的配制
准备好200ml以上容量的试剂瓶，洗干净后用于实验
首先需要配备0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.4)
1)0.1mol/L Tris：1.211gTris用于100ml蒸馏水
2)0.1mol/LHCl：0.862mL(常用工业盐酸浓度为12M)溶于100mL蒸馏水
3)50mL0.1mol/L Tris碱溶液与17.2mL0.1mol/LHCl混合，加水定容至100mL，即成0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.4)(配好后灭菌)
在0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.4)中加入以下试剂
全部加好后置于4℃冰箱过夜，用于提取时再按比例加入Proteinase K8mg(按浓度换算成80μg/ml)，配置完成。(蛋白酶K工作浓度为20mg/ml,配制提取液1ml加4ul)。
(3)基因组DNA的提取
分别将单头日光蜂成虫、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜放入0.2mL离心管中，加入10μL裂解液，用10μL的封口枪头把日光蜂研磨匀浆后，然后再加入40μL裂解液。置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，分别制得日光蜂成虫、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜基因组DNA溶液，储存在-20℃以下；
(4)以步骤(3)制得的日光蜂基因组DNA为模板，利用如下的引物对被日光蜂寄生的苹果绵蚜的DNA进行梯度PCR，目的为了获得最适合的退火温度；
引物序列如下：
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’；
(5)对步骤(4)获得的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，获得电泳图谱，目的条带的大小为750bp左右，找出最亮的条带所对应的温度为56.1℃，此温度为退火温度。
(6)日光蜂COI基因的PCR检测
分别以日光蜂成虫、苹果绵蚜及被日光蜂寄生的苹果绵蚜基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为13μl
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq Buffer(缓冲液)1.3μl，10mM dNTP 1.04μl，ddH20 7.94μl；
引物序列如下：
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’；
PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，退火温度设置为56.1℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
(7)用2％琼脂糖凝胶电泳对制得的PCR扩增产物进行电泳检测，在凝胶成像仪中摄影拍照，获得电泳图谱，如图1所示。
图1中1-5是日光蜂成虫，6-10是未被日光蜂寄生的苹果绵蚜，11-15是被日光蜂寄生的苹果绵蚜，M为2000bp DNA Marker，自上而下DNA条带依次是2000、1500、1000、750、500、250、100bp；图中表明日光蜂成虫及被日光蜂寄生的苹果绵蚜均检测到一条750bp左右的DNA条带，而未被日光蜂寄生的苹果绵蚜没有检测到该条带，说明该PCR扩增技术能够区分被日光蜂寄生的苹果绵蚜，从而检测日光蜂对苹果绵蚜的寄生率以及日光蜂的产卵量。
实施例3检测田间苹果绵蚜被日光蜂寄生的寄生率
(1)2016年5月20日田间采集一根带有苹果绵蚜的苹果枝条(部分已被日光蜂寄生)，带回室内用镊子轻轻取下所有苹果绵蚜，共计13头；
(2)将采集的苹果绵蚜单头放入0.2mL离心管中，加入10μL裂解液，用10μL的封口枪头把日光蜂研磨匀浆后，然后再加入40μL裂解液。置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，储存在-20℃以下；
(3)以步骤(2)制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的目的基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为13μl：
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq Buffer(缓冲液)1.3μl，10mM dNTP 1.04μl，ddH20 7.94μl；
引物序列如下：
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’；
PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
(4)将如上获得的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，如图2所示，观察其是否有目的条带，被日光蜂寄生的苹果绵蚜有750bp左右DNA条带出现，未被寄生的苹果绵蚜没有50bp左右DNA条带出现。
图2中1-14是被日光蜂寄生的苹果绵蚜，M为2000bp DNA Marker，自上而下DNA条带依次是2000、1500、1000、750、500、250、100bp；图2表明，13个苹果绵蚜中共有3个DNA样品检测到600-700bp的DNA条带，说明3头苹果绵蚜被日光蜂寄生了，日光蜂的寄生率为3/13*100％＝23.08％
实施例4日光蜂产卵量检测
(1)取新羽化的日光蜂，雌雄交配后，把雌蜂接种在装有100头苹果绵蚜的0.1立方米的玻璃容器中，置于25℃的培养箱中，每天更换新鲜的苹果绵蚜，换下被寄生的苹果绵蚜，直至雌蜂死亡，新换下的被寄生苹果绵蚜放在另外25℃的培养箱中继续发育3天，然后把所有被寄生的苹果绵蚜收集在一起，总数量为500头，备用；；
(2)将采集的苹果绵蚜单头放入0.2mL离心管中，加入10μL裂解液，用10μL的封口枪头把日光蜂研磨匀浆后，然后再加入40μL裂解液。置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，储存在-20℃以下；
(3)以步骤(2)制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的目的基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为13μl：
基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq Buffer(缓冲液)1.3μl，10mM dNTP 1.04μl，ddH20 7.94μl；
引物序列如下：
正义引物RGF-COI1-F：5’-AGTTGCAGAAGTAAAATAAGCTCG-3’；
反义引物RGF-COI1-R：5’-ACCTGTAATAATAGGAGGGTTTGGG-3’；
PCR扩增条件如下：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
(4)将如上获得的PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其是否有目的条带，有日光蜂卵的苹果绵蚜会检测到750bp左右的DNA条带，没有日光蜂卵的的苹果绵蚜检测不到750bp左右的DNA条带(电泳图谱未列出)。
500个苹果绵蚜中共有65个DNA样品检测到600-700bp的DNA条带，说明65个苹果绵蚜内有日光蜂的卵，该日光蜂的产卵量为65粒。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛农业大学
<120> 一种检测日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 1
<400> 1
agttgcagaa gtaaaataag ctcg 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
acctgtaata ataggagggt ttggg 25

Claims (7)

1.一种引物对，其特征在于，所述的引物对包括正义引物和反义引物，其中正义引物的序列为SEQ ID NO:1；反义引物的序列为SEQ ID NO:2。
2.权利要求1所述的引物对在检测苹果绵蚜是否被日光蜂寄生以及日光蜂的产卵量中的应用。
3.一种日光蜂对苹果绵蚜寄生率及产卵量的检测方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的引物对进行检测。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)田间采集被日光蜂寄生的苹果绵蚜，记录采取的苹果绵蚜的数量为A；
2)取新羽化的日光蜂，雌雄交配后，把1对雌雄蜂接种在装有足够数量苹果绵蚜的大型玻璃容器中，置于25℃的培养箱中，每天更换新鲜的苹果绵蚜，换下被寄生的苹果绵蚜，直至雌蜂死亡；换下的被寄生苹果绵蚜放在另外25℃的培养箱中继续发育3天，然后把所有被寄生的苹果绵蚜收集在一起，记录总数量为B；
3)配制裂解液
准备好200ml以上容量的试剂瓶，洗干净后用于配制100mL 0.05mol/L、pH8.4的Tris-HCl，各物质的比例如下：
a)Tris：0.6055％
b)盐酸：0.06493％
加水定容至100mL，灭菌后，再按比例加入以下4种试剂：
全部加好后置于4℃冰箱过夜，用于提取时再按比例加入Proteinase K 8，配置完成；
4)提取日光蜂DNA及(1)和(2)中苹果绵蚜DNA；
5)对步骤4)获得的日光蜂寄生的苹果绵蚜DNA(1)、(2)为模板，利用权利要求1所述的引物对在56.1℃的退火温度进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
6)对步骤5)获得的PCR产物(1)、(2)进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像仪中摄影拍照，获得电泳图谱；根据PCR产物(1)出现750bp左右条带数目C，PCR产物(2)出现750bp左右条带数目D，计算得到日光蜂对苹果绵蚜寄生率为C/A*100％；日光蜂产卵量为D；
7)测定苹果园中日光蜂对苹果绵蚜的寄生率时，直接从果园中采集带有苹果绵蚜的枝条，收集苹果绵蚜，记录数量，然后重复(3)-(6)步骤，即获得日光蜂对苹果绵蚜的寄生率。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中每对雌雄蜂提供带有100头苹果绵蚜的苹果枝条，放在0.1立方米的大型玻璃容器中。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(5)中PCR扩增的扩增体系为13μl；其中，基因组DNA溶液2μl，20μM引物0.26μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq Buffer1.3μl，10mM dNTP 1.04μl，ddH20 7.94μl。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，56.1℃退火45秒，72℃延伸1分钟，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
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