KR101749971B1 - 라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량 분석 방법 - Google Patents

라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양시료에 함유된 인삼뿌리썩음병원균을 라디시콜(radicicol) 선택배지로 증식시켜 인삼뿌리썩음병원균의 DNA를 추출한 후, 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 인삼뿌리썩음병원균을 효과적으로 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 토양 내 미량 존재하는 인삼뿌리썩음병원균에 대해서 특이적이며 높은 민감도로 정량할 수 있어 효과적이다.

Description

라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량 분석 방법{Quantitative analysis method of Cylindrocarpon destructans in the soil using RT-PCR and radicicol selective medium}
본 발명은 라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양시료에 함유된 인삼뿌리썩음병원균을 라디시콜(radicicol) 선택배지로 증식시켜 인삼뿌리썩음병원균의 DNA를 추출한 후, 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 인삼뿌리썩음병원균을 효과적으로 정량하는 방법에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 다년생의 반음지성 숙근초(宿根草)로 오가피과에 속하며 생육적온은 20℃전후로 주로 북반구의 극동지방에 자생하거나 재배되며 우리나라의 주산지는 경기 북부지역과 풍산 및 금산 지방이다. 인삼의 주 약리성분은 사포닌으로서 자양강장, 면역증강, 피로회복, 중추신경계 조절, 항스트레스, 항당뇨, 항종양활성 등의 우수한 효능이 밝혀짐에 따라 그 소비가 증가추세에 있으며 특히 고려인삼의 우수함이 밝혀짐에 따라 그 소비 또한 꾸준히 늘어날 것으로 전망된다.
그러나, 인삼의 이러한 뛰어난 효능과 소비 욕구에도 불구하고 인삼은 다년생의 반 음지성 숙근초로서 반음지성식물이기 때문에 빛이 가장 중요한 생육제한요소이며, 높은 온도에서 생육이 저해되는 저온성 식물로서, 고온 및 고광도에 약한 식물이다. 또한 인삼은 상기 생육제한 요소 이외에 내병성이 약하고 효과적인 방제법이 적어 재배하기 어려운 식물로 평가되었다.
또한, 인삼의 식물체는 땅 밑에 뿌리와 뇌두(腦頭), 땅 위에는 줄기, 잎, 꽃(열매)으로 이루어져 있으며, 다년생이므로 매년 봄이 되면 땅속의 뿌리에서 새싹이 나오고 줄기는 매년 가을이 되면 고사한다. 인삼은 4 ~ 6년 동안 동일 포장에서 장기간 재배를 하여야 하고, 인삼을 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1 ~ 2년간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 연작방식 때문에 각종 병해에 의한 피해가 매우 크고 연작장해의 발생 가능성이 높은 식물이다.
인삼에서 연작장해를 일으키는 뿌리썩음병의 주요 병원균으로는 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 솔라니(Fusariumsolani), 라이조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네레아(Botryis cinerea), 파이토프소라 캑토룸(Phytophthora cactorum), 피시움(Pythium sp.), 알타나리아 파낙스(Alternaria panax)등 7종이 보고되어있으며, 이런 병원균들이 단독으로 또는 복합적으로 작용하기 때문에 발생하는 것으로 알려져 있다.
최근 농업기술원 연구결과에 따르면 4년근 이상 인삼의 결주 원인은 지역과 병해 종류 및 발생 정도의 차이는 있지만 뿌리썩음병 35%, 잿빛곰팡이병 32%, 점무늬병 등이 15%를 차지하고 있다. 특히 인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)은 토양에서 월동하면서 뿌리에 직접 병을 일으키기 때문에 인삼 식재 후 방제가 어렵고, 병에 의한 결주율 피해가 초작지 4년근 21.8%, 6년근 50%이상이며, 재작지 4년근에는 30 ~ 80%에 이르는 등 인삼생산에 있어 최대의 적으로 평가되고 있다.
인삼뿌리썩음병의 초기 증상은 잎가장자리가 붉게 변하거나 잎이 안쪽으로 오므라드는 증상을 보이다가 고사하며, 이와 같은 증상을 나타내는 뿌리는 끝 또는 중간 부분에 적갈색 또는 흑갈색 병반을 형성하며 모상근이 적갈색으로 변색되어 부패한다. 또한 인삼뿌리썩음병은 묘삼에서부터 6년생까지 모든 연생에서 발생하며 고년생으로 갈수록 발생이 많아지는 등, 국내 인삼 재배 농가에서 가장 큰 문제로 손꼽히고 있다.
국내 인삼뿌리썩음병의 주된 원인균인 뿌리썩음병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄스로서, 연작 장해의 전형적인 흑색의 병반조직으로부터 분리되고 병원성이 확인된 이래로, 균의 생리적 특성과 배양에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 한국 공개특허 10-2013-0098792(공개일자: 2013년09월05일)에는 인삼에 병을 유발하는 토양 병원성 곰팡이 4종을 진단할 수 있는 종(species) 및 속(genus) 특이 프라이머를 기재하고 있다. 그러나, 인삼뿌리썩음병원균 이외에 다른 병원균도 함께 검출되어 인삼뿌리썩음병원균 특이적인 프라이머가 아니므로 토양내 인삼 뿌리썩음병원균의 밀도를 효과적으로 검출할 수가 없었다.
토양내 병원균의 밀도를 검정하는 기술은 식물 병원균에 의한 토양병 발생 및 예찰을 위해 유용한 방법으로 일부 국가에서는 주요 작물의 토양병 연구가 상당히 진행되어 있는바, 우리나라도 이에 대응하기 위한 지속적 연구와 투자가 필요한 시점이다.
검체에 균을 정량하기 위한 방법 중 하나로. 파이토시퀀싱 방법을 사용할 수 있으나, 균주의 속까지 정확하게 판별하는 것이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 상기 방법은 식물체 등에 존재하는 균에 대해서 수행되는 것이 일반적이고, 토양 속에 존재하는 균을 정량하는 데에는 적합하지 않다. 특히, 토양내 미량 존재하는 병원균을 높은 정확도로 정량하는 방법에 대해서는 연구가 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 인삼뿌리썩음병원균만을 선택적으로 증식시키는 라디시콜 선택배지 및 토양내 미량의 인삼뿌리썩음병원균을 정량하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량분석용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 토양 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 수득한 DNA와 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머를 포함하는 혼합액으로 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 실시한 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하여 토양시료의 인삼뿌리썩음병원균을 정량하는 단계;를 포함하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 토양시료는 인삼을 재배하기 위한 토양인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, DNA를 분리하는 (a) 단계는 토양시료를 라디시콜 선택배지에 배양하는 단계가 추가적으로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 토양시료는 라디시콜 선택배지에서 36 내지 60 시간 배양하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 42 내지 54 시간 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 선택배지는 시판되는 라디시콜 또는 인삼뿌리썩음병원균의 쌀배양 추출물이 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 선택배지는 30 내지 70 ㎎/ℓ의 농도로 라디시콜이 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 서열번호 1 내지 18 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 둘 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하는 (c) 단계는 농도를 알고 있는 표준시료로 검량선을 작성하는 단계; 및 작성된 검량선으로부터 검출된 유전자 복제 수를 계산하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 토양내 인삼뿌리썩음병원균을 동정하기 위한 프라이머 세트; 라디시콜 선택배지; 및 중합효소연쇄반응을 위한 시약을 포함하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량분석용 키트를 포함한다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 중합효소연쇄반응을 위한 시약은 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 서열번호 1 내지 18 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 둘 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 일 수 있다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명의 "프라이머"는 복제하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장산물의 합성을 시작하도록 허용해야한다. 상기 프라이머의 바람직한 길이는 5 ~ 50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명의 "실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)”은 목표 DNA분자의 증폭과 양의 측정을 동시 실시하는 방법으로, DNA샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위하여, 실시간 중합효소연쇄반응은 검출과 양의 측정을 할 수 있는 방법이다. 계량은 절대적인 복제 수 또는 상대적인 양을 셀 수 있다.
본 발명의 “라디시콜(radicicol)"은 하기 화학식 1로 나타나는 화합물을 의미한다.
[화학식 1]
Figure 112015109565916-pat00001
본 발명의 “검량선”은 분석하고자 하는 물질의 '알고 있는 농도와 기기 반응간의 관계'에 대한 곡선을 의미한다. 검량선은 표준용액의 몇 개 농도수준에서 분석기기의 반응을 측정하기 위하여 작성하며, 이 때 분석하고자 하는 물질, 화합물질의 표준용액 및 작업장 시료는 같은 방식으로 분석기기에 반응을 한다는 가정을 둔다.
따라서 본 발명은 라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량분석 방법 및 라디시콜 선택배지, 프라이머 세트 및 중합효소연쇄반응을 위한 시약을 포함하는 정량분석 키트를 제공한다. 본 발명은 토양 내 미량 존재하는 인삼뿌리썩음병원균에 대해서 특이적이며 높은 민감도로 정량할 수 있어 효과적이다.
도 1은 본 발명의 전체 과정의 모식도이다. 라디시콜 선택배지를 사용하여 토양내 인삼뿌리썩음병원균 DNA를 안정적으로 추출하기 위한 토양 전처리 과정과 토양에서 인삼뿌리썩음병원균 DNA를 추출한 후 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 이용해 토양내 병원균의 밀도를 검정하는 방법이다.
도 2는 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 밀도 검정 또는 정량 분석을 위한 정량곡선이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 현재까지 토양 속에 존재하는 균을 정량하는 방법이 수립되어 있지 않으며, 더욱이, 토양내 미량으로 존재하는 인삼뿌리썩음병원균을 높은 정확도로 정량하는 방법에 대한 연구는 미비한 실정이다.
이에, 본 발명은 라디시콜 선택배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량분석 방법 및 라디시콜 선택배지, 프라이머 세트 및 중합효소연쇄반응을 위한 시약을 포함하는 정량분석 키트를 제공하여 상기 문제에 대한 해결책을 모색하였다.
이를 통해 토양 내 미량 존재하는 인삼뿌리썩음병원균에 대해서 특이적이며 높은 민감도로 정량할 수 있어 효과적이다.
따라서, 본 발명은 (a) 토양 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 수득한 DNA와 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머를 포함하는 혼합액으로 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 실시한 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하여 토양시료의 인삼뿌리썩음병원균을 정량하는 단계;를 포함하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 정량방법을 제공한다.
본 발명의 상기 토양 시료는 인삼, 바람직하게는 인삼 뿌리썩음병에 걸린 인삼 또는 그 주변의 토양으로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 시료는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 곰팡이를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 DNA를 분리하는 (a) 단계는 토양시료를 라디시콜 선택배지에 배양하는 단계가 추가적으로 포함되는 것일 수 있다.
상기 선택배지는 실린드로카폰 데스트럭탄스의 배양을 위해 사용될 수 있는 기본배지에 유효량의 라디시콜을 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 "기본배지"는 실린드로카폰 데스트럭탄스를 배양하는데 사용될 수 있는 것이라면, 그 종류에 아무런 제한이 없다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기본배지는 액체 또는 고체 배지일 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기본배지는 공지의 방법에 따라 제조된 MM (minimal medium), PDA (potato dextrose agar), CM (complete medium), CDA (czapek dox agar), PDB (potato dextrose broth) 또는 CMC (carboxylmethyl cellulose) 배지일 수 있으며, 가장 바람직하게는 MM (minimal medium)배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "유효량"이란 선택배지 내에 포함된 라디시콜이 시료 내에 포함된 실린드로카폰 데스트럭탄스 이외의 미생물에 대해 항균 및/또는 항진균 활성을 나타내는 첨가량을 의미하며, 배양조건, 배지 및 병원균의 종류 등에 따라 실린드로카폰 데스트럭탄스를 선택적으로 배양하기에 가장 적합한 양이 선택될 수 있다. 상기 선택배지의 라디시콜은 시판되는 라디시콜을 첨가하여 제조될 수도 있으나, 인삼뿌리썩음병원균의 쌀 배양 추출물을 첨가하여 제조될 수도 있다.
본 발명의 상기 선택배지는 30 내지 70 ㎎/ℓ의 농도로 라디시콜이 포함되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 내지 60 ㎎/ℓ의 농도로 라디시콜이 포함되는 것일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 45 내지 55 ㎎/ℓ의 농도로 라디시콜이 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 선택배지는 실린드로카폰 데스트럭탄스 이외의 미생물에 대해 항균 또는 항진균 활성을 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 토양시료는 라디시콜 선택배지에서 36 내지 60 시간 배양하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 42 내지 54 시간 배양하는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 토양시료를 0 시간, 24 시간, 48 시간, 60 시간 및 82 시간동안 배양한 후, 실린드로카폰 데스트럭탄스균을 정량하였다. 그러나 0 시간에서는 낮은 농도의 균은 검출이 되지 않는 문제점이 있었으며, 24 시간에서는 낮은 농도의 균은 검출이 되었으나, 균의 밀도간의 차이가 확연히 나타나지 않아, 정량이 정확하지 않다는 문제점이 있었다. 또한, 60 시간 이상 배양을 한 경우, 균의 밀도간의 차이가 확연히 나타나지 않는 문제점이 있었다. 이에, 본 발명의 토양시료는 36 내지 60 시간 배양하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 42 내지 54 시간 배양하는 것일 수 있다. 더더욱 바람직하게는 46 내지 50 시간 배양하는 것일 수 있다.
상기 선택배지는 실린드로카폰 데스트럭탄스 이외의 미생물, 바람직하게는 곰팡이, 더욱 바람직하게는 자낭균, 불완전 균류 및 난균류를 포함하는 곰팡이에 대하여 항균 또는 항진균 활성을 나타낸다. 상기 선택배지가 항진균 활성을 나타내는 병원성 곰팡이의 예로는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균 gDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이면 무엇이든 사용될 수 있으나, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 18 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 둘 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 일 수 있다.
프라이머명 염기서열 서열번호
Ccms105-AC51 forward tgggtgtggg tcggatctat ttct 1
Ccms105-AC51 reverse gtcgcgggaa aggaaaaaga aag 2
Ccms66-GCA51 forward atcgagacgg ggatgcgaca a 3
Ccms66-GCA51 reverse tttgcgctgt gcggactagg tt 4
Ccms57-1 forward aagcccacag gattgatg 5
Ccms57-1 reverse gactacttga ctccgtgatt 6
Ccms75-2 forward cagcgacaac agtttatttg a 7
Ccms75-2 reverse cttgaggact atgcgacc 8
ITS1 tccgtaggtg aacctgcgg 9
ITS4 tcctccgctt attgatatgc 10
Dest1 ttgttgcctc ggcggtgcct g 11
Dest4 ggtttaacgg cgtggccgcg ctgtt 12
Destruc2F gtgcctgytt cggcagc 13
Destruc2R ctgtttycca gtgcgaggtg tgc 14
CylF01 catgcgtgag attgtaagtt 15
CylR625 tgacccttgg cccagttgtt 16
CylF146 acgacgtgat tttgggacaa 17
CylR407 tcgttgaagt agacgctcat 18
본 발명의 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은 바람직하게는 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real time PCR)일 수 있다. "정량적 실시간 중합효소연쇄반응"이란 일반적으로 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한, PCR을 이용한 일련의 반응을 의미한다. 정량적 PCR에는 기준이 되는 표준시료를 사용하는 내부 표준법과, 증폭반응에 있어서 경쟁하는 분자를 사용하는 경쟁법이 포함된다. 또한, 각 서열의 분자 수를 정확하고 간편하게 결정하기 위해서 표준시료라고 불리는 기준이 되는 주형 DNA 서열을 이용한 PCR 방법을 사용하고, 반응 중 임의의 시점에서 반응의 진행상황, 즉 증폭의 정도를 확인한다. 따라서, 본 발명에서에서 "정량적 실시간 PCR"이란 증폭반응 개시 시의 주형 DNA 양을 정량하기 위한 PCR로서, 반응 중 임의의 시점에서 증폭대상의 분자에 대해 증폭을 확인할 수 있는 PCR을 의미한다. 정량을 위해서는 일반적으로 그와 같은 PCR과, 반응 개시 시의 주형 DNA 분자 수와 그 증폭의 지표가 되는 신호를 관련짓는 검량선(檢量線)이 조합된다. 이 검량선은 분자 수가 알려진 표준시료를 이용하여 제작할 수 있다.
본 발명의 상기 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하는 (c) 단계는 농도를 알고 있는 표준시료로 검량선을 작성하는 단계; 및 작성된 검량선으로부터 검출된 유전자 복제 수를 계산하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 토양내 인삼뿌리썩음병원균을 동정하기 위한 프라이머 세트; 라디시콜 선택배지; 및 중합효소연쇄반응을 위한 시약을 포함하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량분석용 키트를 포함한다.
본 발명에서의 용어, "키트"란, 시료 내에서 검출 또는 정량하고자 하는 미생물을 대표하는 유전자의 복제 수를 실시간 정량 PCR로 확인하여 표적 미생물의 절대 정량을 가능케 하는 도구를 의미한다. 본 발명에 따른 미생물의 절대 정량용 키트는, 실시간 정량 PCR의 검량성 작성을 위한 표준시료로서 검출 또는 정량하고자 하는 미생물을 대표하는 유전자에 특이적인 하나 이상의 프라이머 및/또는 프로브 부위를 포함하는 인위적 염기서열뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 1종이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물의 절대 정량용 키트는, 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 구체적으로, 실시간 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 인삼뿌리썩음병원균에 특이적인 프라이머, DNA 중합효소, 완충(buffer) 용액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 인삼뿌리썩음병원균 동정용 프라이머는 인삼뿌리썩음병원균 gDNA 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이면 무엇이든 사용될 수 있으나, 바람직하게는 시료 DNA에 포함된 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1 내지 18 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 둘 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트 일 수 있다.
본 발명의 실시예 6에 따르면, 여러가지 배지 조건으로 토양시료 내 인삼뿌리썩음균을 정량하였다. 그 결과, 라디시콜이 포함된 MM배지 이외의 다른 배지를 사용하게 되면 real time PCR 결과 SQ 값이 높게 나와 정량에 용이하지 않다. 따라서, 실제 인삼 농가 포장의 토양을 이용해 검사를 할 때 그 토양내에 많은 미생물들이 존재하기 때문에, 라디시콜 선택배지를 사용해 기타 다른 균들의 생장을 억제하려는 효과가 필요하며, 본 발명은 토양내 인삼뿌리썩음균을 정확하게 검출할 수 있는 라디시콜 선택배지를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
라디시콜 선택배지를 활용한 토양 전처리 과정
본 발명은 토양내에서 인삼뿌리썩음병원균(C. destructans)의 DNA를 안정적으로 추출하기 위한 방법으로 채집한 토양시료를 1mm 채로 불순물을 제거하였다. 불순물이 걸러진 토양 시료에서 5g을 채취해 라디시콜 50㎎/ℓ가 함유된 선택배지를 첨가한 후 20℃에서 48시간동안 진탕배양한다.
토양 시료 준비 및 토양 DNA 추출
라디시콜 선택배지에서 48시간동안 배양된 시료를 원심분리하여 상층액을 제거한 후 동결건조시켰다. 건조된 토양시료 0.3g과 일반적으로 사용되는 토양 DNA 추출 키트를 사용해 DNA를 추출하였다. 추출된 gDNA는 PCR 증폭 및 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)에 이용하였다.
실시간 유전자 분석기
인삼뿌리썩음병원균을 증폭할 수 있는 서열번호 1로 나타나는 정방향 프라이머(10pmol) 1 ㎕, 서열번호 2로 나타나는 역방향 프라이머(10pmol) 1 ㎕, 실시예 2에서 추출한 gDNA 2 ㎕, 멸균수 6 ㎕, SsoadvancedTMuniversalsybr? green supermix 10 ㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 이후 상기 혼합액 20 ㎕를 실시간 중합효소연쇄반응에 사용하였다.
구체적으로, PCR 반응은 혼합액 20 ㎕를 98℃에서 3분 동안 최초변성(predenaturation)시킨 다음 95℃에서 10초 변성(denature), 61℃에서 15초 결합(annealing), 72℃에서 30초 동안 확장(extension)하는 싸이클을 1 싸이클로 하여 40 싸이클을 반복한 후, melt curve를 작성하기 위한 과정을 진행하였다.
이후 상기 실시간 중합효소연쇄반응에서 수득한 결과는 제공되는 프로그램을 사용하여 프라이머의 다이머 형성(melt curve), 증폭된 유전부위 복제 수(SQ, starting quantity) 등을 확인하였다.
토양내 병원균 밀도검정을 위한 선택배지 최적배양기간 결정
도 1 또는 하기 표 2에서 확인되는 바와 같이, 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 밀도 검정을 위해 병원균의 포자를 농도별로 접종한 인공토양에 라디시콜 선택배지를 첨가해 배양한 후 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
먼저 라디시콜 선택배지에서 배양하지 않은 시료(0 day)에서는 병원균의 포자가 103이하에서는 실시간 유전자 분석 결과 검출되지 않았다. 실시간 중합효소연쇄반응 분석으로 토양내 인삼뿌리썩음병원균을 검출하기 위해서는 최소 하루이상 배양기간이 필요하며, 라디시콜 선택배지에 48시간 배양한 토양시료에서 병원균의 포자 농도별 PCR 단편의 증폭 수(SQ, starting quantity)가 가장 좋았다.
이로 인해, 종래의 인삼뿌리썩음병원균 정량분석은 토양내 병원균의 밀도가 적을(103이하) 시 안정적인 토양DNA가 확보되지 않아 실시간 유전자 분석기을 이용한 밀도검정이 적합하지 않은 것을 알 수 있었다. 본 발명에서 제시하는 라디시콜 선택배지를 이용한 토양 전처리 과정을 추가함으로써 문제점을 해결할 수 있다.
No. of spore
/0.3g soil		 SQ (starting quantity)
0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day
1 nd* 7.1E+01 3.3E+02 3.9E+03 3.2E+04 2.4E+05
10 nd 3.7E+02 2.4E+03 2.0E+04 2.6E+04 9.5E+05
102 nd 4.1E+03 2.0E+04 4.6E+05 8.9E+05 2.8E+06
103 1.8E+03 2.2E+04 3.0E+05 3.0E+05 1.2E+06 4.3E+06
104 1.7E+04 2.4E+05 9.1E+05 3.9E+06 1.5E+07 1.5E+07
105 3.4E+05 1.2E+06 4.8E+06 3.6E+06 7.6E+06 4.5E+06
*nd : not detected
실시간 유전자 분석기를 이용한 정량곡선
도 2에서 확인되는 바와 같이, 토양내 인삼뿌리썩음병원균의 밀도 검정을 위한 정량곡선을 제작하였다. 실시예 4와 표 3에서 결정된 라디시콜 선택배지를 활용한 토양시료 전처리(48시간 배양)를 통해 병원균 포자를 토양에 농도별로 접종한 인공토양을 이용해 실시간 유전자 분석을 수행하였다. 총 4회 반복을 통해 얻은 병원균 포자 농도별 SQ값을 가지고 통계분석을 실시하여 추세선(Y=160.74X1 .74, Y: SQ, X: 포자 수)을 확보하였다.
실시예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 라디시콜 선택배지를 활용한 토양 전처리 과정을 통해 실시간 중합효소연쇄반응을 위한 안정적인 토양시료 DNA를 확보할 수 있으며, 토양내 인삼뿌리썩음병원균 밀도검출에 적합한 식별방법을 제공하는 것을 확인할 수 있었다.
No. of spore
/0.3g soil		 SQ (starting quantity)
1st 2nd 3th 4th Avr* SD#
1 106.3 682.6 487.3 692.3 492.1 237.3
5 1381.4 3525.2 5102.0 4967.054 3743.9 1497.5
10 8557.6 55050.9 33392.8 45243.59 35561.2 17374.5
50 94540.6 158880.9 169082.8 156088.5 144648.2 29331.2
100 395793.8 451330.5 478322.9 694930.8 505094.5 113569.1
*Avr : average
#SD : standard deviation
여러가지 조건의 배지를 이용한 토양내 인삼뿌리썩음병원균 정량
각각 다른조건의 배지를 이용하여 농가 1 내지 3 토양에 존재하는 인삼뿌리썩음병원균을 정량하였다.
배지 조건은 각각 MM 배지, MM 배지에 라디시콜을 첨가한 배지, PDB 배지 및 CM 배지를 사용하였다. 배지의 조건만 달리한 후, 서열번호 1 및 2의 프라이머를 사용하여 같은 조건에서 real time PCR을 실시하였다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.
MM 배지를 사용한 실험군에서는 인삼뿌리썩음병원균이 충분히 자라지 못하여, PCR을 통해 검출되지 않았으나, MM배지에 라디시콜을 처리한 실험군에서는 인삼뿌리썩음균을 선택적으로 성장시키기 때문에, 비교적 정확한 정량이 가능하였다. 반면, PDB 배지 또는 CM 배지를 사용한 실험군에서는 인삼뿌리썩음균을 선택적으로 성장시키는 것이 아니라 토양내 모든 미생물들을 성장시키기 때문에, SQ(scarcing quantity) 값이 높게 측정되어 정확한 정량이 힘들었다.
No. of spore
/0.3g soil		 SQ (starting quantity)
MM MM+radicicol PDB CM
농가 1 nd* 1.5E+02 7.9E+02 9.8E+02
농가 2 nd 1.8E+02 3.7E+03 3.9E+04
농가 3 2.1E+01 1.3E+05 2.5E+05 4.6E+05
*nd : not detected
즉, 기타 다른 배지를 사용하게 되면 real time PCR 결과 값SQ가 높게 나와 정량에 용이하지 않다. 실제 인삼 농가 포장의 토양을 이용해 검사를 할 때 그 토양내에 많은 미생물들이 존재하기 때문에, 라디시콜 선택배지를 사용해 기타 다른 균들의 생장을 억제하려는 효과가 필요하다. 따라서, 본원 발명은 인삼뿌리썩음병원균을 선택적으로 성장시켜 정확하게 인삼뿌리썩음병원균을 정량할 수 있는 방법을 제공한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Quantitative analysis method of Cylindrocarpon destructans in the soil using RT-PCR and radicicol selective medium <130> 1042462 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms105-AC51 forward <400> 1 tgggtgtggg tcggatctat ttct 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms105-AC51 reverse <400> 2 gtcgcgggaa aggaaaaaga aag 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms66-GCA51 forward <400> 3 atcgagacgg ggatgcgaca a 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms66-GCA51 reverse <400> 4 tttgcgctgt gcggactagg tt 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms57-1 forward <400> 5 aagcccacag gattgatg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms57-1 reverse <400> 6 gactacttga ctccgtgatt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms75-2 forward <400> 7 cagcgacaac agtttatttg a 21 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ccms75-2 reverse <400> 8 cttgaggact atgcgacc 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS1 <400> 9 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 10 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest1 <400> 11 ttgttgcctc ggcggtgcct g 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dest4 <400> 12 ggtttaacgg cgtggccgcg ctgtt 25 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Destruc2F <400> 13 gtgcctgytt cggcagc 17 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Destruc2R <400> 14 ctgtttycca gtgcgaggtg tgc 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylF01 <400> 15 catgcgtgag attgtaagtt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylR625 <400> 16 tgacccttgg cccagttgtt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylF146 <400> 17 acgacgtgat tttgggacaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CylR407 <400> 18 tcgttgaagt agacgctcat 20

Claims (13)

  1. (a) 토양 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 수득한 DNA와 인삼뿌리썩음병원균 C. destructans 동정용 프라이머 세트를 포함하는 혼합액으로 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계에서 실시한 실시간 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하여 토양시료의 인삼뿌리썩음병원균 C. destructans을 정량하는 단계;를 포함하고,
    상기 DNA를 분리하는 (a) 단계는 토양시료를 라디시콜 선택배지에 배양하는 단계가 추가적으로 포함되며,
    상기 인삼뿌리썩음병원균 C. destructans 동정용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 토양시료는 인삼을 재배하기 위한 토양인 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 토양시료는 라디시콜 선택배지에서 36 내지 60 시간 배양하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 토양시료는 라디시콜 선택배지에서 42 내지 54 시간 배양하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 선택배지는 시판되는 라디시콜 또는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 쌀배양 추출물이 포함되는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량 방법.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 선택배지는 30 내지 70 ㎎/ℓ의 농도로 라디시콜이 포함되는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응의 결과를 분석하는 (c) 단계는 농도를 알고 있는 표준시료로 검량선을 작성하는 단계; 및 작성된 검량선으로부터 검출된 유전자 복제 수를 계산하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans의 정량방법.
  11. 토양내 인삼뿌리썩음병원균 C. destructans을 동정하기 위한 프라이머 세트; 라디시콜 선택배지; 및 중합효소연쇄반응을 위한 시약을 포함하고,
    상기 인삼뿌리썩음병원균 C. destructans 동정하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4로 구성되는 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 세트로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 정량분석용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응을 위한 시약은 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소 및 완충(buffer) 용액으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 토양내 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 검출용 키트.
  13. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Can. J. Plant Sci., Vol. 94, pp. 671-681 (2013.12.23.)*
Mycobiology, Vol. 38, No. 1, pp. 33-38 (2010.03.31.)*
Plant Pathol. J., Vol. 30, No. 4, pp. 432-436 (2014.12.15.)*
Plant Pathology, Vol. 56, pp. 508-516 (2007.)*

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