CN107115336A - 一种用于治疗缺血性脑中风的组合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包括原苏木素B和巴西苏木素的组合物及其在对抗脑缺血损伤中的应用。优选的，原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在80:20至20:80之间。本发明所述的组合物通过两种组分的协同作用，能够显着减少缺血再灌注所致的脑缺血面积，并降低脑缺血引起的神经功能评分。

Description

一种用于治疗缺血性脑中风的组合物及其制备方法和医药 用途

技术领域

本发明属于医药学技术领域，具体涉及一种新的治疗缺血性脑中风的组合物及其制备方法和医药用途。

背景技术

缺血性脑中风是由于中枢神经系统的某些区域，因血流灌注量下降而导致急性神经元坏死，进而对脑组织及整个神经功能产生不可逆伤害的一种严重的脑血管疾病。这种疾病如果救治不及时，可引起一些列与神经损伤相关的并发症，诸如：痴呆、失明、失语、手足无力、偏瘫等。目前，缺血性脑中风在老年人中具有发病率高、死亡率高、致残率高以及并发症多的特点。随着人们生活水平的提高和人口老龄化的加剧，缺血性脑中风已经成为了主要的致死性疾病，给患者和社会造成严重的负担。目前临床上对于缺血性脑中风的药物大多只能提供部分的保护作用，疗效并不显着，且伴随着不同程度的副作用。因此，开发具有治疗缺血性脑中风的新型药物具有十分重大的意义。

苏木(Sappan Lignum)为豆科植物苏木(Caecalpinia Sappan L.)的干燥心材，味甘、咸、微涩，气微无臭，性平，归心肝脾经，具有活血化瘀、消肿止痛的功效。中医上常用于治疗淤痛诸证，如跌打损伤、经闭痛经以及心腹疼痛等。

苏木的化学成分主要分为五大类，包括高异黄酮类、色原酮类、苏木素类、原苏木素类以及二苯类。其中，苏木素类和原苏木素类分别以巴西苏木素(又称巴西苏木红素，结构式如I所示)和原苏木素B(结构式如II所示)为代表性成分。

最早发现的苏木药理活性是其抗菌作用，随着研究的深入，苏木在多方面的药理作用被渐渐挖掘出来，但主要研究重点在抗肿瘤和免疫抑制作用方面，迄今已有多篇文献报道。苏木及其化学成分在其它方面，尤其是在神经系统方面的报道较少。

Zeng Kewu等曾报道苏木高异黄酮类成分中的脱氧苏木酮B能够通过拮抗神经炎症进而发挥神经保护作用(Zeng Kewu,et al.Deoxysappanone B,a homoisoflavone fromthe Chinese medicinal plant Caesalpinia sappan L.protects neurons frommicroglia-mediated inflammatory injuries via inhibition of IκB kinase(IKK)-NF-κB and p38/ERK MAPK pathways[J].Eur J Pharmacol.2015,748(5):18-29)。有文献报道，原苏木素B在细胞水平上可以保护神经细胞，并推测该作用可能是通过调控神经细胞内p53蛋白介导的线粒体凋亡信号通路实现的(Zeng KW,等,Protosappanin B protectsPC12 cells against oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death bymaintaining mitochondrial homeostasis via induction of ubiquitin-dependentp53 protein degradation.Eur J Pharmacol.2015Mar 15；751:13-23)。

申佳从体外和体内两个水平对巴西苏木红素对抗缺血损伤进行了评价，发现巴西苏木红素对缺糖缺氧损伤的Neuro-2细胞具有一定的保护作用，可以提高细胞的存活率并降低细胞乳酸脱氢酶的逸漏率；巴西苏木红素可以对抗大鼠脑缺血再灌注损伤，表现为脑缺血区域坏死体积的减少和神经行为学功能的恢复(申佳，巴西苏木红素对脑缺血再灌注损伤的作用及血管活性研究.博士学位论文.2007年10月)。李慧颖等报道巴西苏木红素对脑缺血具有明确的保护作用,并推测该保护作用可能与其强化神经元对乳酸的摄取利用有关(李慧颖,等.巴西苏木红素对小鼠脑缺血中能量代谢的影响[J].2010,35(18):2444-2448)。

但是，临床上缺血性脑中风的治疗需求仍然远未得到满足。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种新的组合物，该组合物通过组分之间的协同作用，能够有效地对抗缺血再灌注引起的脑损伤，为临床提供治疗缺血性脑中风的新选择。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种组合物，该组合物包含原苏木素B和巴西苏木素。

优选的，所述组合物由原苏木素B和巴西苏木素组成。

优选的，原苏木素B和巴西苏木素的质量比例在80:20至20:80之间，更优选在70:30到30:70之间，最优选为70:30。

本发明的另一个目的在于提供所述组合物的制备方法，包括如下步骤：将原苏木素B和巴西苏木素混合。

本发明还有一个目的在于提供所述组合物在制备药物和/或保健品中的用途。

优选的，本发明提供所述组合物在制备用于缺血性脑中风的药物和/或保健品中的用途。

还优选的，本发明提供所述组合物在制备预防和/或治疗由缺血性脑中风导致的急慢性并发症的药物和/或保健品中的用途。

所述由缺血性脑中风导致的急慢性并发症包括脑神经损伤、痴呆、失明、失语、手足无力、偏瘫、脑梗死和脑出血中的一种或多种。

此外，本发明还提供一种药物和/或保健品，包括所述组合物和药学上可以接受的辅料。

所述药学上可以接受的辅料，包括药学领域常规的溶剂(如水、乙醇、丙二醇、注射用油等)、稀释剂(如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等)、粘合剂(如水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等)、崩解剂(如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等)、润滑剂(如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等)、吸收促进剂(如表面活性剂、Azone(月桂氮卓酮)、EDTA、水杨酸、氨基酸乙胺衍生物、乙酰醋酸酯类、β-二羧酸酯、芳香族酸性化合物、脂肪族酸等)、防腐剂(如苯甲酸、羟丙丁酯、羟丙甲酯、苯酚、间甲酚等)、矫味剂(如蔗糖、甜菊素等)等。

上述药物和/或保健品，可以是口服制剂，也可以是非口服制剂。

所述口服制剂可以选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液中的一种或多种。

所述非口服制剂可以选自注射剂、膏剂、霜剂和栓剂中的一种或多种。

在用于治疗缺血性脑中风、或者预防和/或治疗由脑缺血导致的急慢性并发症时，本发明所述的药物和/或保健品的施用对象为人或哺乳动物。出于此目的，本发明所述药物和/或保健品的摄入的质量或给予的质量，以原苏木素B和巴西苏木素的总质量计，按照成人体重60～70kg计算，通常每人每天摄入100～800mg，更优选的每人每天摄入300～400mg。

药理试验发现，原苏木素B和巴西苏木素按照特定质量配比构成的组合物，能够有效对抗缺血再灌注引起的脑损伤，并改善由此引起的神经功能评分。此外，本发明所述的组合物对神经细胞缺血再灌注损伤和缺血诱导的血管内皮细胞损伤也有显着的保护作用，还能抑制神经细胞分泌炎症因子，从而可以预防和减轻脑缺血引起的多个并发症。更令人感兴趣的是，本发明的组合物的上述作用，均显着强于构成该组合物的两个单体——原苏木素B和巴西苏木素，说明两者之间存在协同作用。

附图说明

下面结合附图，对本发明做进一步的说明。

图1的照片示出的是实施例5中各组受试动物的脑切片，其中“sham”为假手术组，“MCAO”为模型组。

图2的柱状图示出的是实施例5中各组受试动物脑缺血面积百分比值，其中：1为模型组，2为原苏木素B组，3为组合物1组，4为组合物2组，5为组合物3组，6为组合物4组，7为组合物5组，8为巴西苏木素组。

图3的柱状图示出的是实施例6中各组受试动物的神经功能得分，其中：1为模型组，2为原苏木素B组，3为组合物1组，4为组合物2组，5为组合物3组，6为组合物4组，7为组合物5组，8为巴西苏木素组。

图4的柱状图示出的是实施例7中缺血缺糖/再灌注损伤条件下各试验组SHSY5Y神经细胞的存活率，其中：1为正常组，2为模型组，3为原苏木素B组，4为组合物1组，5为组合物2组，6为组合物3组，7为组合物4组，8为组合物5组，9为巴西苏木素组。

图5的柱状图示出的是实施例8中缺血诱导下各试验组的血管内皮细胞的存活率，其中：1为正常组，2为模型组，3为原苏木素B组，4为组合物1组，5为组合物2组，6为组合物3组，7为组合物4组，8为组合物5组，9为巴西苏木素组。

图6的柱状图示出的是实施例9中本发明的组合物对神经炎症反应的保护作用；其中，6(A)示出的是造模4h后测定的TNF-α的含量，6(B)示出的是造模8h后测定的IL-6的含量，6(C)示出的是造模24h后测定的IL-1β的含量；各图中，1为正常组，2为模型组，3为原苏木素B组，4为组合物1组，5为组合物2组，6为组合物3组，7为组合物4组，8为组合物5组，9为巴西苏木素组。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分原料、试剂购买情况如下：

苏木药材购自北京同仁堂科技发展股份有限公司，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯，购自北京化工厂。

实施例1原苏木素B和巴西苏木素的分离和鉴定

1.1制备分离：

苏木干燥心材(21㎏)，切成小细条，依次用8倍、6倍、6倍量95％乙醇回流提取3次，每次1h；提取液减压回收溶剂得95％乙醇提取物，待挥尽溶剂至无醇味后，混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别回收溶剂后得石油醚萃取物60g，乙酸乙酯萃取物1400g，正丁醇萃取物360g。

取乙酸乙酯萃取物800g，经硅胶(100～200目)柱色谱，氯仿-甲醇＝30:1、20:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，TLC比对合并后得到Fr.A-Fr.N共14个流份。流份Fr.G经硅胶(200～300目)柱色谱，氯仿-甲醇(30:1、20:1、10:1)梯度洗脱，得Fr.G-A至Fr.G-D共4个流份。流份Fr.G-C经MCI Gel柱色谱，不同百分比的甲醇-水(50％，70％，100％)梯度洗脱，合并含有巴西苏木素的流分，经重结晶后得巴西苏木素(20mg)。

流份Fr.L经硅胶(200～300目)柱色谱，氯仿-甲醇(10:1)等度洗脱，得到Fr.L-A至L-F共6个流份。流分Fr.L-E经硅胶柱色谱，氯仿-丙酮(1:1)等度洗脱，得化合物原苏木素B(90mg)。

1.2结构鉴定：

巴西苏木素，红色无定形粉末，硫酸乙醇显红色。

[α]86.6°(c 0.31,MeOH)。

ESI-MS：m/z 285[M-H]^-。分子式为C₁₆H₁₄O₅。

¹H-NMR(500MHz,in CH₃OH-d₄)δ:2.77and 3.02(each 1H,each d,J＝16.0Hz,H-9),3.69and 3.93(each 1H,each d,J＝11.0Hz,H-2),3.96(1H,s,H-4),6.29(1H,d,J＝2.5Hz,H-8),6.47(1H,dd,J＝2.5,8.5Hz,H-6),6.60(1H,s,H-5′),6.71(1H,s,H-2′),7.18(1H,d,J＝8.5Hz,H-5)。

¹³C-NMR(125MHz,in CH₃OH-d₄)δ:43.1(C-9),51.2(C-4),71.0(C-3),78.2(C-2),104.4(C-8),110.1(C-6),112.6(C-5′),113.0(C-2′),115.7(C-4a),131.5(C-1′),132.4(C-5),137.6(C-6′),145.5(C-4′),145.8(C-3′),155.9(C-8a),158.0(C-7)。

以上波谱数据与文献报道一致，因此鉴定化合物为巴西苏木素，结构式如下所示：

原苏木素B：白色针晶(甲醇-水)，硫酸乙醇显黄褐色。

ESI-MS:m/z 303[M-H]^-，分子式为C₁₆H₁₆O₆。

¹H-NMR(500MHz,in CH₃OH-d₄)δ:2.50(1H,d,J＝13.5Hz,8-H_e),2.57(1H,d,J＝13.5Hz,8-H_a),3.47(1H,d,J＝11.5Hz,13-H₁),3.55(1H,d,J＝11.5Hz,13-H₂),3.86(1H,d,J＝12.0Hz,6-H_a),4.15(1H,d,J＝12.0Hz,6-H_e),6.44(1H,d,J＝2.5Hz,4-H),6.52(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,2-H),6.71(1H,s,12-H),6.73(1H,s,9-H),6.98(1H,d,J＝8.5Hz,1-H)。

¹³C-NMR(125MHz,CH₃OH-d₄)δ:40.0(C-8),68.5(C-13),73.0(C-7),76.6(C-6),108.2(C-4),111.5(C-2),117.6(C-12),120.0(C-9),124.1(C-1a),127.5(C-8a),132.6(C-12a),133.3(C-1),145.0(C-10,11),159.1(C-3),159.4(C-4a)。

以上波谱数据与文献报道一致，经与对照品共薄层，R_f完全一致，因此鉴定化合物为原苏木素B，结构式如下所示：

实施例2-4一种组合物

按照表1所示的质量，分别精确称取一定量的原苏木素B与巴西苏木素固体粉末，然后将二者混合，于玛瑙研磨钵里充分研磨使之混合均匀，即得目标组合物，置于4℃密封避光保存，待用。

表1实施例2-4的组合物的组成

对比例1-2一种组合物

按照表2所示的质量，分别精确称取一定量的原苏木素B与巴西苏木素固体粉末，然后将二者混合，于玛瑙研磨钵里充分研磨使之混合均匀，即得目标组合物，置于4℃密封避光保存，待用。

表2实施例1-2的组合物的组成

实施例5本发明组合物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

5.1受试动物：SD大鼠，雄性，8周龄。维通利华实验动物公司提供。各组动物饲养条件相同，环境温度(23±2)℃，相对湿度50％～60％，自由进食和饮水。

5.2受试药物：

1)原苏木素B

2)组合物1：对比例1制备的组合物(原苏木素B：巴西苏木素＝90:10)

3)组合物2：实施例2制备的组合物(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)

4)组合物3：实施例3制备的组合物(原苏木素B：巴西苏木素＝50:50)

5)组合物4：实施例4制备的组合物(原苏木素B：巴西苏木素＝30:70)

6)组合物5：对比例2制备的组合物(原苏木素B：巴西苏木素＝10:90)

7)巴西苏木素

以上各受试药物用0.5％CMCNa配制成2.5mg/mL的溶液，给药剂量均为25mg/kg。

5.3动物分组及处理：

SD大鼠72只，适应性喂养1周后，每组8只，随机分为9组：sham组((假手术组，仅切开外表皮但不进行动脉结扎)、MCAO组(模型组)、原苏木素B组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4、组合物5和巴西苏木素组。除假手术组外，各组动物均行下述手术：

SD大鼠分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA并剪断，CCA用丝线打活结暂时阻断，用动脉夹夹闭ICA后，于ECA剪开切口，插入尼龙线，致使大脑中动脉阻塞缺血。同时，各组大鼠按3mL/kg体积推注相应的受试药物(模型组仅给于等体积0.5％的CMCNa溶液)。1.5h后抽出尼龙线，放开CCA丝线，实现再灌注。缺血24小时麻醉动物，安乐死后断头取出大脑，平均切成8个脑片，置TTC染液中37℃避光温孵约15min，缺血区呈白色，非缺血区呈玫瑰红色。扫描各组脑缺血面积后计算脑相对缺血面积数值，并进行统计分析。

同时安乐死假手术组动物，按照手术组相同的处理制备脑切片，置TTC染液中37℃避光温孵约15min。

各组脑切片的照片见图1。

5.4试验结果

图1的照片(灰度)示出，假手术组的大鼠脑切片均为深色，无缺血区。MCAO组的脑切片中出现明显的白色缺血区，其它给药组与MCAO比较，白色缺血区减少，尤其是组合物2、3和4组最为明显。

各组大鼠的脑相对缺血面积(％)，见表2和图2。

表2各组大鼠脑相对缺血面积

注：*表示与MCAO组比较有显着性差异(P<0.05)；**表示与MCAO组比较有极显着性差异(P<0.01)；1表示与原苏木素B组比较有显着性差异(P<0.05)；2表示与巴西苏木素组比较有显着性差异(P<0.05)；3表示与原苏木素B组比较有极显着性差异(P<0.01)；4表示与巴西苏木素组比较有极显着性差异(P<0.05)。

表2和图2示出：

1)与MACO比较，原苏木素B、巴西苏木素及两者不同质量配比的组合物，脑缺血面积均显着或极显着地减少(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素单独或组合都能对抗脑缺血再灌注损伤。

2)与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，组合物1组和组合物5组大鼠脑缺血面积有所减少，但是没有显着性差异(P＞0.05)；组合物2-4组的大鼠脑缺血面积均显着或极显着地减少(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在70:30～30:70之间时，两者之间才存在协同关系，能够显着改善脑缺血再灌注引起的脑损伤效果。且组合物2(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)抗脑缺血再灌注损伤的作用最强，是本发明最优选的组合物。

实施例6本发明组合物对大鼠脑缺血再灌注引起的神经功能的改善作用

6.1受试动物：同实施例5

6.2受试药物：同实施例5

6.3动物分组及处理：

SD大鼠64只，适应性喂养1周后，每组8只，随机分为8组：MCAO组(模型组)、原苏木素B组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组和巴西苏木素组。各组动物均行下述手术：

SD大鼠分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA)，结扎ECA并剪断，CCA用丝线打活结暂时阻断，用动脉夹夹闭ICA后，于ECA剪开切口，插入尼龙线，致使大脑中动脉阻塞缺血。同时，大鼠按3mL/kg体积推注受试药物。1.5h后抽出尼龙线，放开CCA丝线，实现再灌注。

缺血24小时检测各组大鼠神经功能评分。

longa 5分制评分标准为：

无神经损伤症状，0分；

不能完全伸展左侧前爪，1分；

向非缺血侧转圈，2分；

行走时向非缺血侧倾倒，3分；

不能自发行走，意识昏迷，4分。

6.4试验结果

各组大鼠的神经功能评分，见表3和图3。

表3各组大鼠脑神经功能评分

注：*表示与MCAO组比较有显着性差异(P<0.05)；**表示与MCAO组比较有极显着性差异(P<0.01)；1表示与原苏木素B组比较有显着性差异(P<0.05)；2表示与巴西苏木素组比较有显着性差异(P<0.05)；3表示与原苏木素B组比较有极显着性差异(P<0.01)；4表示与巴西苏木素组比较有极显着性差异(P<0.01)。

表3的数据和图3示出：

1)与MACO(模型)组比较，原苏木素B、巴西苏木素及两者不同质量配比的组合物，大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分均显着或极显着地降低(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素单独或组合能够有效地改善脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损伤。

2)与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，两者不同质量配比构成的组合物中，组合物1和组合物5大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分有所降低，但是没有显着性差异(P＞0.05)；组合物2、3和4组大鼠的神经功能评分均显着或极显着地降低(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在70:30～30:70之间时，两者之间才存在协同关系，能够显着改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能损伤效果优于单用原苏木素B或巴西苏木素；且组合物2(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)作用最强，是本发明最优选的组合物。

实施例7本发明组合物对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用

7.1受试细胞：SHSY5Y神经细胞，购自中国医学科学院细胞中心。

7.2受试药物：

与实施例5相同；各受试药物用PBS缓冲液配制成50mg/mL的溶液。

7.3试验步骤：

SHSY5Y神经细胞用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/L青霉素，100μg/L链霉素)进行传代培养，每3天传代1次。SHSY5Y神经细胞接种后建立缺氧缺糖/再灌注损伤模型，模型建立方法参照前期文献(Liao LX,et al.TDB protects vascular endothelialcells against oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced injury bytargeting miR-34a to increase Bcl-2expression[J].Sci Rep.2016Nov 25(6):37959.)；分为8个组：模型组、原苏木素B组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组和巴西苏木素组，OGD/R组加入等体积的PBS缓冲液，其它各组分别加入各受试药物溶液(50μg/mL)加以干预。药物处理细胞24h后弃去上清液，加MTT(0.5mg/mL)染色液100μL，温箱孵育2h；弃上清，加入DMSO(400μL)，酶标仪检测吸亮度值(A570nm)。同时测定正常传代的SHSY5Y神经细胞的吸亮度值(A570nm)，以正常细胞的吸亮度值为基准，计算各组细胞存活率。同时设立正常组为空白对照。

所有数据用平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism5统计学软件进行t检验和单因素方差分析，P<0.05认为有统计学意义。

7.4试验结果

各组的SHSY5Y神经细胞存活率，见表4和图4。

表4各组SHSY5Y神经细胞存活率

注：^##表示与正常组比较有极显着性差异(P<0.01)；**表示与模型组比较有极显着性差异(P<0.01)；1表示与原苏木素B组比较有显着性差异(P<0.05)；2表示与巴西苏木素组比较有显着性差异(P<0.05)；3表示与原苏木素B组比较有极显着性差异(P<0.01)；4表示与巴西苏木素组比较有极显着性差异(P<0.05)。

表4的数据和图4均示出：

1)与正常组比较，缺氧缺糖/再灌注模型组的SHSY5Y神经细胞存活率极显着降低(P＜0.01)，说明造模成功，缺氧缺糖/再灌注后能够明显引起神经细胞损伤。

2)与模型组比较，原苏木素B、巴西苏木素及两者不同配比的组合物干预后，神经细胞的存活率均极显着地提高(P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素单独或组合具有显着的神经细胞保护作用。

3)与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，两者不同配比构成的组合物干预后，组合物1组和组合物5组的神经细胞存活率有所提高，但是没有显着性差异(P＞0.05)；组合物2、3和4组的神经细胞存活率均显着或极显着地提高(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在70:30～30:70之间时，两者之间才存在协同关系，能够显着保护神经细胞对抗缺血缺氧的损伤；且组合物2(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)对神经细胞的保护作用最强，是本发明最优选的组合物。

实施例8本发明的组合物对模拟缺血诱导的血管内皮细胞损伤的改善作用

8.1受试细胞：HUVEC血管内皮细胞，购自中国医学科学院细胞中心。

8.2受试药物：

与实施例5相同；各受试药物用PBS缓冲液配制成50mg/mL的溶液。

8.3试验步骤：

HUVEC血管内皮细胞用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/L青霉素，100μg/L链霉素)进行传代培养，每3天传代1次。HUVEC血管内皮细胞接种后建立缺氧缺糖/再灌注损伤模型，模型建立方法参照前期文献(Liao LX,et al.TDB protects vascularendothelial cells against oxygen-glucose deprivation/reperfusion-inducedinjury by targeting miR-34a to increase Bcl-2expression[J].Sci Rep.2016Nov 25(6):37959.)。分为8个组：模型组、原苏木素B组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组和巴西苏木素组，模型组加入等体积PBS缓冲液，其它各组分别加入各受试药物溶液(50μg/mL)加以干预。药物处理细胞24h后弃去上清液，加MTT(0.5mg/mL)染色液100μL，温箱孵育2h；弃上清，加入DMSO(400μL)，酶标仪检测吸亮度值(A570nm)。同时测定正常传代的HUVEC血管内皮细胞的吸亮度值(A570nm)，以正常细胞的吸亮度值为基准，计算各组细胞存活率。同时设立正常组作为空白对照。

所有数据用平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism5统计学软件进行t检验和单因素方差分析，P<0.05认为有统计学意义。

8.4试验结果

各组的血管内皮细胞存活率，见表5和图5。

表5各组HUVEC血管内皮细胞存活率

注：^##表示与正常组比较有极显着性差异(P<0.01)；*表示与模型组比较有显着性差异(P<0.05)；**表示与模型组比较有极显着性差异(P<0.01)；1表示与原苏木素B组比较有显着性差异(P<0.05)；2表示与巴西苏木素组比较有显着性差异(P<0.05)；3表示与原苏木素B组比较有极显着性差异(P<0.01)；4表示与巴西苏木素组比较有极显着性差异(P<0.01)。

表5的数据和图5均示出：

1)与正常组比较，缺氧缺糖/再灌注模型组的HUVEC血管内皮细胞存活率极显着降低(P＜0.01)，说明造模成功，缺氧缺糖/再灌注后能够明显引起HUVEC血管内皮细胞损伤。

2)与模型组比较，原苏木素B、巴西苏木素及两者不同质量配比的组合物干预后，HUVEC血管内皮细胞的存活率均显着或极显着地提高(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素单独或组合能够保护缺氧缺糖/再灌注所致血管内皮细胞的损伤。

3)与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，两者不同质量配比构成的组合物干预后，组合物1组和组合物5组的HUVEC血管内皮细胞的存活率基本不变，没有显着性差异(P＞0.05)；组合物2、3和4组的神经细胞存活率均显着或极显着地提高(P＜0.05或P＜0.01)。说明原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在70:30～30:70之间时，两者之间才存在协同关系，能够显着保护HUVEC血管内皮细胞；且组合物2(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)对HUVEC血管内皮细胞的保护作用最强，是本发明最优选的组合物。

实施例9本发明的组合物对神经炎症反应的保护作用

9.1受试细胞：BV-2小鼠胶质细胞，购自中国医学科学院细胞中心。

9.2受试药物：

与实施例5相同；各受试药物用PBS缓冲液配制成50mg/mL的溶液。

9.3试验步骤：

BV-2小鼠胶质细胞用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/L青霉素，100μg/L链霉素)进行传代培养，每天传代1次。

接种BV-2小鼠小胶质细胞后用1μg/mL细菌脂多糖(LPS)造模刺激，分为8个组：模型组、原苏木素B组、组合物1组、组合物2组、组合物3组、组合物4组、组合物5组和巴西苏木素组，模型组加入等体积的PBS缓冲液，其它各组分别加入各受试药物溶液(50μg/mL)加以干预。造模4h，8h和24h后分别收集细胞上清液，用酶联免疫分析法(ELISA)检测炎症因子TNF-α(4h)，IL-6(8h)和IL-1β(24h)的含量。同时设立正常组作为空白对照。

9.4试验结果

各组的炎症因子含量，见表6和图6。

表6各组炎症因子含量测定结果

注：^##表示与正常组比较，有极显着性差异(P<0.01)；*表示与模型组比较，有显着性差异(P<0.05)；**表示与模型组比较，有极显着性差异(P<0.01)；1表示与原苏木素B组比较，有显着性差异(P<0.05)；2表示与巴西苏木素组比较，有显着性差异(P<0.05)。

表5的数据和图5均示出：

1)与正常组比较，模型组LPS刺激后的BV-2小鼠脑胶质细胞培养上清液中的炎症因子(TNF-α，IL-6和IL-1β)含量都极显着升高(P＜0.01)，说明造模成功，LPS刺激能够明显引起BV-2小鼠脑胶质细胞分泌炎症因子。

2)与模型组比较，原苏木素B、巴西苏木素及组合物1、4和5干预4h后，BV-2小鼠脑胶质细胞培养上清液的炎症因子TNF-α含量变化不明显；组合物3能够降低TNF-α的含量，但是没有统计学差异(P＞0.05)；组合物2能够显着降低TNF-α的含量(P＜0.05)。与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，组合物1、4和5组的TNF-α水平基本不变；组合物3组的TNF-α水平有所下降，但是统计学差异(P＞0.05)；组合物2组的TNF-α含量显着降低(P＜0.05)。

3)与模型组比较，原苏木素B、巴西苏木素及两者不同配比的组合物干预8h后，BV-2小鼠脑胶质细胞培养上清液的炎症因子IL-6含量均显着或极显着地降低(P＜0.05或P＜0.01)。与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，组合物1、4和5组的IL-6水平基本不变；组合物2组的IL-6含量显着降低(P＜0.05)。

4)与模型组比较，原苏木素B、巴西苏木素及组合物1、3、4和5干预24h后，BV-2小鼠脑胶质细胞培养上清液的炎症因子IL-1β含量变化不明显；仅组合物2能够显着降低IL-1β的含量(P＜0.05)。与原苏木素B、巴西苏木素单独应用比较，组合物1、3、4和5组的IL-1β水平有所降低，但是没有统计学差异(P＞0.05)；仅组合物2组IL-1β含量显着降低(P＜0.05)。

上述实验结果说明：上述组合物对TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌抑制强度存在一定的差异，但是各组合物均能够显着抑制炎症因子IL-6的分泌；组合物2(原苏木素B：巴西苏木素＝70:30)对各炎症因子的分泌均有显着的抑制作用，是本发明最优选的组合物。

总之，本发明提供了一种新的能够有效对抗缺血再灌注引起的脑损伤的组合物——原苏木素B和巴西苏木素的质量配比在80:20到20:80之间；两者优选的质量配比在70:30到30:70之间，其中最优选的是原苏木素B：巴西苏木素＝70:30。

Claims (10)

1.一种组合物，该组合物包含原苏木素B和巴西苏木素；

优选的，所述组合物由原苏木素B和巴西苏木素组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，原苏木素B和巴西苏木素的质量比例在80:20至20:80之间；

优选的，原苏木素B和巴西苏木素的质量比例在70:30到30:70之间。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，原苏木素B和巴西苏木素的质量比例为70:30。

4.权利要求1至3中任一项组合物的制备方法，包括如下步骤：将原苏木素B和巴西苏木素混合。

5.权利要求1至3中任一项组合物在制备药品和/或保健品中的用途。

6.权利要求1至3中任一项组合物在制备用于缺血性脑中风的药品和/或保健品中的用途。

7.权利要求1至3中任一项组合物在制备用于预防和/或治疗由缺血性脑中风导致的急慢性并发症的药物和/或保健品中的用途。

8.根据权利要求7所述用途，其特征在于，所述由缺血性脑中风导致的急慢性并发症包括脑神经损伤、痴呆、失明、失语、手足无力、偏瘫、脑梗死和脑出血中的一种或多种。

9.一种药物和/或保健品，包括权利要求1至3中任一项所述的组合物和药学上可以接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的药物和/或保健品，其特征在于，可以是口服制剂，也可以是非口服制剂；

优选的，所述口服制剂可以选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液中的一种或多种；

还优选的，所述非口服制剂可以选自注射剂、膏剂、霜剂和栓剂中的一种或多种。