CN107099591A - 水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物分子遗传育种学领域，具体公开了水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其应用。所述水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1，由如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增得到。利用Pi9InDel1标记引物，对不同遗传背景水稻亲本基因组DNA、及其与Pi9基因供体亲本的杂交后代基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定不同水稻亲本及杂交后代中是否含有Pi9功能基因，以及杂交育种选育后代中的Pi9基因是否纯合，并通过分子标记辅助选择育种技术培育含Pi9基因的抗稻瘟病水稻新种质或品种。

Description

水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其 应用

技术领域

本发明涉及农作物分子遗传育种学领域，具体地说，涉及水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其应用。

背景技术

抗稻瘟病基因Pi9是第一个被克隆的水稻广谱抗稻瘟病基因(Qu等2006，Genetics，172(3)：1901-1914)。Pi9基因对来自13个国家的43个稻瘟菌生理小种都表现高抗(Liu等2002，Mol.Genet.Genomics,267(4):472-480)。Pi9基因全长编码序列全长为8589bp(不含启动子)，由含2个内含子和3个外显子(Qu等2006)，如序列SEQ ID NO.1所示。Pi9基因的克隆为设计开发基因内部功能分子标记，并应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种培育抗病水稻新品种奠定了基础。

目前，已报道的Pi9基因的分子标记辅助育种方法主要为：一是利用Pi9基因连锁标记进行选择(倪大虎等2005，分子植物育种3:329-334；殷得所等2011，中国水稻科学25(1)：25-30)；二是利用Pi9基因内显性功能分子标记(文婷等2012，湖南农业大学学报38:262-266)；三是在Pi9基因区域内开发的SNP标记(张羽等2015，云南农业大学学报(自然科学版)，30(4)：528-534)；四是利用Pi9基因第二个外显子区域的CAPS标记方法(CN201510062377.4/CN104630364A)；五是利用启动子区域插入/缺失共显性分子标记方法(专利CN201310065310.7/CN103146695A)。

但尚未见Pi9基因第一个内含子区域共显性功能分子标记的报道。其中，连锁标记因与目的基因间存在距离，群体选择中容易因发生重组而影响目的基因的选择效率和准确性；CAPS标记尽管是共显性标记，但操作程序繁琐且成本较高；显性标记则不能有效区分杂合子/纯合子。因此，开发鉴定程序简单的共显性标记是利用Pi9基因进行分子标记辅助育种最有效的办法。此外，尽管已有一些共显性标记开发，但是对于不同遗传背景材料需要选择特异的共显性分子标记，因此还需开发大量适用于不同遗传背景水稻材料利用的共显性功能标记。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是开发一种新的水稻抗稻瘟病基因Pi9共显性功能分子标记，应用于水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种，快速培育广谱高抗稻瘟病水稻新品种。

本发明针对已克隆的Pi9基因第一个内含子，开发了一种新的水稻抗稻瘟病基因Pi9共显性功能分子标记Pi9InDel1，在分子标记辅助选择育种中准确鉴定目标个体的基因型，大大提高育种效率。

为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先利用Clustal W序列比对程序，对Pi9基因和NBS2-Pi2基因核苷酸序列进行比对，比对结果如图1所示。比对发现，Pi9基因与NBS2-Pi2基因序列比较，Pi9基因的核苷酸序列在第一个内含子内的473bp到747bp之间存在9个插入/缺失突变，导致Pi9基因在该区段比NBS2-Pi2基因缺少116bp的碱基序列，如图1所示。

所述抗稻瘟病基因Pi9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述NBS2-Pi2基因为Pi9基因的同源基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。Pi9与NBS2-Pi2基因在核苷酸序列上具有较高的同源性，Pi9基因编码区核苷酸序列共有8589个碱基，NBS2-Pi2基因编码区核苷酸序列有8748个碱基。

因此，本发明发现了水稻抗稻瘟病Pi9基因第一个内含子内的473bp～747bp碱基之间存在9个插入/缺失位点，导致Pi9基因与非Pi9功能基因间存在116bp碱基的插入/缺失变异。

进一步地，本发明根据Pi9与非Pi9功能基因473bp～747bp碱基之间的插入/缺失序列差异，设计了Pi9基因特异性的共显性分子标记Pi9InDel1，如图1所示。利用插入/缺失差异序列两端的保守序列作为所发明标记的正反向引物。其中，正向引物Pi9InDel1-F序列位于Pi9基因序列427bp至448bp间，如图1所示，共22个碱基；反向引物Pi9InDel1-R序列位于Pi9基因序列759bp至780bp间，如图1所示，共22个碱基。

图1为本发明方案中Pi9基因200bp～871bp核苷酸序列和NBS2-Pi2基因301bp～1088bp核苷酸序列比对图。其中，阴影标注部分为两个基因比对插入/缺失差异区域，黑色箭头标注下方的为Pi9InDel1标记正反向引物的起始和终止位置，其中Pi9InDel1-F所在箭头标注的为正向引物序列和位置，Pi9InDel1-R所在箭头标注的为反向向引物序列和位置。

该分子标记的正反向引物序列为：

正向引物Pi9InDel1-F序列：5’-ATCCACGAAACATCCACCATCC-3’，如SEQ ID NO.3；

反向引物Pi9InDel1-R序列：5’-TGAGCTAGCTCTTGCCTCCGAG-3’，如SEQ ID NO.4。

本发明进一步提供了所述分子标记在检测Pi9基因方面的应用，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测目标进行PCR扩增，若扩增后得到长度为354bp的片段，则待测目标含Pi9基因；若扩增后得到长度为470bp的片段，则待测目标不含Pi9基因。

本发明利用Pi9InDel1分子标记检测不同遗传背景水稻材料中是否含有Pi9基因。通过对不同水稻材料DNA进行PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳对DNA扩增产物片段进行检测，含Pi9基因的水稻材料应得到一条分子量大小与Pi9基因供体75-1-127一致的目的条带，扩增DNA片段长度为354bp，如图2样本1泳道检测条带所示；而不含Pi9基因的水稻材料PCR扩增DNA片段长度则为470bp，如图2样本2-19泳道检测条带所示。

本发明还提供了所述分子标记在选育杂交育种后代中Pi9基因纯合体方面的应用，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测目标进行PCR扩增，若扩增后仅得到长度为354bp的片段，则待测目标为含有Pi9基因的纯合子；若扩增后仅得到长度为470bp的片段，则待测目标为不含Pi9基因的纯合子；若扩增后得到长度为354bp和470bp的两个片段，则待测目标为含有Pi9基因的杂合子。

即本发明所述的Pi9InDel1分子标记不但可以对Pi9基因进行特异性的检测，判断不同遗传背景水稻亲本材料中是否含有Pi9基因，而且可利用其进行Pi9基因分子标记辅助选择改良水稻稻瘟病抗性，利用Pi9InDel1标记引物对杂交或回交后代进行快速PCR检测，判断Pi9基因是否导入杂交后代中，以及杂交后代中Pi9基因是否已是纯合状态。

进一步地，由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物组成的引物组合，以及含有所述引物组合的试剂或试剂盒、PCR反应体系及热循环参数也属于本发明的保护范围。

基于前述发明构思，本发明还提供了检测水稻抗稻瘟病Pi9基因的方法，以及选育杂交育种后代中Pi9基因纯合体的方法。

进一步地，本发明对前述PCR扩增的反应体系及反应条件进行了进一步优化。

优化后的PCR扩增反应体系如下：

优化后的PCR扩增反应条件为：94℃变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，扩增35个循环；72℃延伸5min。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明开发了一种水稻抗稻瘟病基因Pi9共显性功能分子标记及其应用。本发明发现Pi9基因第一个内含子内第473bp～747bp碱基间与其它非Pi9功能基因间存在116bp碱基的插入/缺失变异，根据该插入/缺失变异开发了Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及应用方法，具体步骤如下：利用Pi9InDel1标记引物，对不同遗传背景水稻亲本基因组DNA、及其与Pi9基因供体亲本的杂交后代基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定不同水稻亲本及杂交后代中是否含有Pi9功能基因，以及杂交育种选育后代中的Pi9基因是否纯合。本发明可准确鉴定不同遗传背景水稻亲本及杂交后代中是否含有Pi9基因以及该基因位点是否已经纯合，适用于Pi9功能基因的检测和利用分子标记辅助选择育种方法快速培育抗稻瘟病水稻新品种。

附图说明

图1为本发明Pi9与NBS2-Pi2基因序列比对图。

图2为本发明实施例1中Pi9InDel1标记多态性检测。

图3为本发明实施例2中Pi9InDel1标记对杂交种F1代的分子检测。

图4为本发明实施例3中Pi9InDel1标记检测回交自交群体中Pi9基因纯合子。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1利用Pi9InDel1标记检测不同遗传背景水稻亲本中是否含有Pi9基因

供试材料：Pi9基因供体材料75-1-127、18份不同遗传背景水稻亲本材料，包括谷梅4号、315B、金23B、II32B、丰源B、R288、湘晚籼11、湘晚籼13、R640、轮回422、黄华占、25H003、E32、R527、天龙香103、R747、明恢63、明恢86。

所需试剂：10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)、dNTPs、Pi9InDel1-F正向引物、Pi9InDel1-R反向引物、Taq DNA聚合酶、水稻基因组DNA模板、ddH2O。

实验程序：分别以供试水稻材料基因组DNA为模板，配置10μL PCR反应体系，然后进行PCR扩增，扩增产物用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果如图2所示。

图2为本发明实施例1中利用Pi9InDel1标记在不同遗传背景水稻亲本中检测Pi9基因及标记多态性分析PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA marker，左侧标注为对应DNA marker标记条带分子量大小；1为Pi9InDel1标记引物在Pi9基因供体品种75-1-127中扩增的DNA产物条带；2-19为Pi9InDel1标记引物在18个不同遗传背景的水稻亲本材料中扩增的DNA产物条带，分别为2:谷梅4号；3：315B；4：金23B；5：II32B；6：丰源B；7:R288；8:湘晚籼11；9:湘晚籼13；10:R640；11:轮回422；12:黄华占；13:25H003；14:E32；15:R527；16:天龙香103；17:R747；18:明恢63；19:明恢86。

其中，PCR反应体系配置为：

上述PCR扩增反应条件为：94℃变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，扩增35个循环后；72℃延伸5min。

实施例2利用Pi9InDel1标记检测杂交种F1代中Pi9目的基因

供试材料：Pi9基因供体材料75-1-127、4份不同遗传背景水稻亲本材料、75-1-127分别与4个不同遗传背景亲本杂交获得的4个F1代群体。

所需试剂：同实施例1。

实验程序：分别以各供试水稻材料基因组DNA为模板，配置10μLPCR反应体系，然后进行PCR扩增，扩增产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系配置和PCR反应条件同实施例1。实验结果如图3所示。

图3为本发明实施例2中利用Pi9InDel1标记检测杂交种F1代中，Pi9基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA marker标记，左侧标注为对应DNA marker条带分子量大小；1为Pi9InDel1标记引物在Pi9基因供体品种75-1-127中扩增的DNA产物条带；2、4、6和8为Pi9InDel1标记在4个遗传背景不同且不含Pi9基因的水稻亲本中扩增的DNA产物条带；3、5、7和9为Pi9InDel1标记引物在Pi9基因供体品种75-1-127与2、4、6、8四个亲本杂交种F1代中扩增的DNA产物条带。

实施例3利用Pi9InDel1标记检测回交自交育种群体中Pi9基因纯合状态

供试材料：Pi9基因供体材料75-1-127、1份遗传背景不同且不含Pi9基因的水稻亲本材料和7份该亲本材料与75-1-127杂交后的BC₆F₂代回交自交分离群体株系。

所需试剂：同实施例1。

实验程序：分别以各供试水稻材料基因组DNA为模板，配置10μL PCR反应体系，然后进行PCR扩增，扩增产物用浓度为1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系配置和PCR反应条件同实施例1。实验结果如图4所示。

图4为本发明实施例3中利用Pi9InDel1标记检测BC₆F₂代回交自交育种群体中，Pi9基因纯合状态的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNA marker，左侧标注为对应DNA marker条带分子量大小；1为Pi9InDel1标记引物在Pi9基因供体75-1-127中扩增的DNA产物条带；2为Pi9InDel1标记引物在1个遗传背景不同且不含Pi9基因的水稻亲本材料中扩增的DNA产物条带；3-10为Pi9InDel1标记引物在BC₆F₂回交自交分离群体不同株系中扩增的DNA产物条带，其中8为含有Pi9基因的纯合子，10为不含有Pi9基因的纯合子，其余为含有Pi9基因杂合子。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1及其应用

<130> KHP171111048.4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8589

<212> DNA

<213> Pi9

<400> 1

atggcggaga cggtgctgag catggcgagg tcgctggtgg gcagtgccat cagcaaggcc 60

gcctctgccg ctgccaatga gacgagcctc ctgctcggcg tcgagaagga catctggtac 120

gtactgcact gctctcgttt atcctagcaa gttcttaggc tcttaatctc gaaattgagg 180

aacaccatga aacactaaaa gagagctcga agactaggaa agaaaactag aagactaagc 240

tttgaaagtc ttctaaatcc aagcatctcg acattgatca tccttgtgca acatcatccc 300

ttcctattgc ttcaccagaa tcggtgtccc ttgtggagat ctctgtcgta gcgtcaaggg 360

gagaatccga gaagcagaac tagtccgcgc tgccttcgct acgccatctc cgccatagag 420

gatctcatcc acgaaacatc caccatccaa acgggaaact gttttaaaca ctcgggtgga 480

tattcacccg tttcttgcat gtcatctaaa tggttatgaa aaattttcaa aaaaaaaaca 540

tgataggtta atatataata tatcatctca caaatatgca agttcaaatt caacttttat 600

aagttgtaag tataacagga cgttcatctc acaaatatgc aagtttaaat ttaactttta 660

caagttgtaa gtgtaacagt acgtccatcg gatagattaa tatccatctc cccatccaaa 720

cccgttgttg caccatctgt cgaatccggc tgtggacgct cggaggcaag agctagctca 780

cccgtcccac acacacaccc aacgacgtca caagcgcctc cgaacaacgc caactgataa 840

cttggcagct cctacgtgcc gacgtcgcgg tacttgccgg cgctcctagc gcacgcaccg 900

tcgaaccaca ccgtcaccga ccaactaccc accgccgccg acttctgcct catctgccat 960

cgtcgcccta gcccaagtta tcatcgtggc aattgccgag gctcctaagt gtgccacggc 1020

cgaggcaaag ttctaactga atcagagtat cagacagcca ccaccgacgc tacttctgct 1080

tcatctgcca tcgccgtact agttcaagtt gtcgctgtgg caatcatggg ccctcctagc 1140

gtgccacaca accggacagc cacgacatcc cccatcactg ttgttattgc cgcgccctga 1200

cccctatcgt cgtcgctctt agcgcgtcgt cgagccgacc agccactgtc gtgcagatga 1260

aaaaaaaaca catattggcc tgagagatct gcttagttcc agtgcaggtc caacatgctg 1320

tgagatgcgg gcgtgccagt cagtttgatc ttgcaactga caagatatat aaatagcaga 1380

taaaacagcc tatcgactaa caagccgatg gagtaattcc agccgatagc cgatattagc 1440

cgatgccgat tctagccgat gtcgataggg ttttgaacta tcggctatat gtccaatgta 1500

ggtaatgata taaagacaat tggctgatga taataaaata taaaaatata atccaataga 1560

aaccaatcgg ctaataataa gtattgatcc gatagttaaa gcatacatcg gctaaaagtc 1620

cgatgtcata aaatccaatc gatttagata aacagtgaaa cctttgttgc aatcggctaa 1680

atccaacttg tatgtaatct tcgtaagccg atgaacgtcc agataactta tcggctagca 1740

cctcgataaa acactagcat gaacctatcg gcttaacaag atttatatta tcaacaacaa 1800

tctagtaggt cggacctaac cgatgcaaca cgtattagat atgataatct aatacttgat 1860

gagccaataa atctgtctaa tgtgatggat ataacaaatc tatttataaa agcattgcga 1920

ttgtagagat atatcggcta agacagaata tcagacctaa ctaaaccgat gcgtctctaa 1980

acacaatgca attaattaga gatataattg agatatcagc taggcaaata tatcaatcaa 2040

actagagcga tccaagagat cggagcaatg cagccttgaa caacaccaat gtagccgatg 2100

gattcaccag ggccgacgga acgtaggact taccccttcc ctgaagatcg ggctgaacca 2160

atgcagtccc acgtcaggtg ccaaattccg ccggttgata agtaaaacct tagaaaagag 2220

gatgacgatg cgccgagagt agtattgatc gagagataaa ttgcaatgac cctggatgta 2280

catatttgta cccatgggta gatattagtt cttgtaggac aagaaagaaa ctttcctaaa 2340

gataaaatga aaacataaag tctttattgg atactaaaca cactttccta aagataaaag 2400

gaaactaaac cctgcctaat taatagataa actgccatgt cgtatcctcc ttgaactcgg 2460

actcttttag ataagcttcc tttaactaat ctttacccga atccatcaag aatacaaatg 2520

ttggcattga tagttttcat cggtcaatta taggactttg aagccgatac tgactctaag 2580

ccgatgacta ctttgggctt accaaatttt gttgttaata tgtcgcgacc accatcaccg 2640

gccagccacc ctgatcattg ttgttgactc agcattcgcc aggctgagca gtccacatac 2700

atgccgccat ctccatggca gtgtcgttgc cgcccctttc tcctagagcc gccgcagcgc 2760

tcttcgacac acctactgca tcgtcgagca gtcgtgctac cacctcctcc atcgaccata 2820

gccgcctctt ctgctgcacc ggatccaccc acaccaacca ccagatacag tcaagccctc 2880

attcctggat cccatatcca tccatgccac tactgtgctg cccagtccaa ggaatggagc 2940

gaaggaggaa gccccgccgc tgccctcccg gcggccacat gcactccagt gccttgctcc 3000

gacggcagcg aggttggaaa atgggtggca gcggctaggg tttatctggg gagaaggaaa 3060

aggagaggga ggggggggga gggtccactt ccagcttaat tagcctagat cttattgaca 3120

aatcagttgc tgggtgcaca aacatgttat tttttttgca tgaccaatct tgaacactta 3180

ggtatgttag ttgagtggac actggtctat ctgaaacatc tcttcacatg gaggctgcga 3240

atgagttttc tttttgagag accaaagttt cgttgtatgt taagtgataa agccttggta 3300

agaaatgcta ccacaaacga actaataact ccaaacgtaa agtggaggaa cccgtatggg 3360

tgactcgagt ggcgacaaac tctagcacct ccacctcctt ggacgggctg cggcggtgct 3420

ttcggcatcc cagtcttctt ggaggcatca tctagaatta aggtcttgtt attgcttagc 3480

atgccttagg gcacgtccag tgtttagttc gactaaaact tccatgaaag ccaaacaaaa 3540

gttctgtttg accaccacag tgtaaaaatc gattgtggga cccatgcaaa aaaatcacaa 3600

tctcagctgc ctatgctctc ctcctggacc tgatagccgt gcacaacaaa tattttttta 3660

aactggatgt gttcggcttc tctttaaaga tcgttttttc ctctgacact taccaaccgg 3720

ctttcacagt gtggtcagtt cttttttttt ttacgcaaag tttgatttta gtcagacacg 3780

ggaggatctg ttaagcaggc ttggaaattt cggacccctc caatacaata ttattttagc 3840

caaaatttct aattttttaa tttttcatga attttggtaa tatttgttct aatttaacta 3900

aattttgttc aaaatttcgg tctatcagtg acctccgatc aaatcagtta aaccgagaaa 3960

ataaaccatg ctcttaagag agtttggtat ggttcaatat caaaacttat agtcttgcaa 4020

ttttttctac cctttatctt tttccctgac tatttagtat ggatcgttta aaaaaaagaa 4080

agcccattgg tgaccaaggg cttgtttgat tcaagaccat ccctagcctt accaaccttt 4140

tggcaatggc aaaaattggt tgttgccaaa aatattggca caaattggct aagcctatga 4200

ttggtttcta ccaaagttga attttggcat tcaatcaagc caaataattt ggcaataaca 4260

ttttcttatc tatggatata acatatggca aatattttgg cattaccatt ttctttttgc 4320

caaacatgtt attccttttg aatgaccaat cttgacacct tatgtatgtt agtagtggaa 4380

tcgacactat tctatctaaa acatctcttt acatagaggc cgctaataat ttttctttga 4440

gataaccaaa ttttccttac aagttaagca acaaagccca ttggtaagat atgctacgac 4500

aaatgaacta ataactccaa acgtaaagcg gaggatcccg catttcccac gtgggtgact 4560

cgagcggtga caaaccctag tacctccacc cccttgggtg ggttgtggtg gcactttcgg 4620

caccgtattt tccttggacg gatcatttag aaagtcctat tattgcctag tatgccttga 4680

cagtttaggc aacactcttg gatggtggtg tcctttgccc tggtgatcta gtagcccatg 4740

gatgtttagt tatttggaca tggtgttgga tggtgcgctc gtgggcctgt tgtaggtctg 4800

gtgccaacca gtcatgctta gaaatagccg gataggtgca cagtgctagt tctttacttg 4860

gtggtttgtg cagcgctatc gacatgtggt ggtgtgcttt ttctttgtcc ggataataat 4920

ctcatagggc tatactcttg ttattttgct gctatattat tatgataact tggtatggtt 4980

cgttttttct ttttttggaa aaacacctag ttgatcaagg gcttgtttgg ttcaagtgca 5040

ttcctaatct taccttttct tttttttttc aatggcaaga attgttcatt gcaaaaaaaa 5100

aaagagataa aaattggcta ggcttacgtt ttggttctta ccaaagttgt actttgagac 5160

caaatatatg gcaaaatttt ggcataacct tttttttttt tgcttggttg agcttggtac 5220

aaaccaatca gtcacaaaat agactgtcat gaatcacgcc tactaaattc ctttgaaccg 5280

aactagaata tatttgctct taaaagattt cttgatttca attggtacca tttactagta 5340

gaaacttaaa tttaaatttt aaaaacaaaa tcataatatt gttgttatgg aaattttagt 5400

cattttagta cttttgtaat atatgagttg ggttatactt gagatatcct aaattgcttt 5460

aagatgaaca attgctaggt atatcaaaga tgagctaaaa acaatgcagg cattccttag 5520

agctgctgaa gttatgaaaa agaaagatga actattaaag gtttgggcag agcaaatacg 5580

tgacctgtcg tatgacattg aagattccct tgatgaattt aaagtccata ttgaaagcca 5640

aaccctattt cgtcagttgg tgaaacttag agagcgccac cggatcgcta tccgtatcca 5700

caacctcaaa tcaagagttg aagaagtgag tagcaggaac acacgctaca atttagtcga 5760

gcctatttcc tccggcacag aggatgacat ggattcctat gcagaagaca ttcgcaatca 5820

atcagctcga aatgtggatg aagctgagct tgttgggttt tctgactcca agaaaaggct 5880

gcttgaaatg atcgatacca atgctaatga tggtccggcc aaggtaatct gtgttgttgg 5940

gatgggtggt ttaggcaaga cagctctttc gaggaagatc tttgaaagcg aagaagacat 6000

taggaagaac ttcccttgca ttgcttggat tacagtgtca caatcatttc acaggattga 6060

gctacttaaa gatatgatac gccaacttct tggccccagt tctctggatc aactcttgca 6120

agaattgcaa gggaaggtgg tggtgcaagt acatcatctt tctgagtacc tgatagaaga 6180

gctcaaggag aagaggtact ttgttattct agatgatcta tggattttac atgattggaa 6240

ttggataaat gaaattgcat ttcctaagaa caataagaag ggcagtcgaa tagtaataac 6300

cactcggaat gttgatctag cggagaagtg tgccacagcc tcactggtgt accaccttga 6360

tttcttgcag atgaacgatg ccataacatt gctactgaga aaaacaaata aaaatcatga 6420

agacatggaa tcaaataaaa atatgcaaaa gatggttgaa cgaattgtaa ataaatgtgg 6480

tcgtctacca ttagcaatac ttacaatagg agctgtgctt gcaactaaac atgtgtcaga 6540

atgggagaaa ttctatgaac aacttccttc agaactagaa ataaacccaa gcctggaagc 6600

tttgaggaga atggtgaccc taggttacaa ccacctacca tcccatctga aaccatgctt 6660

tttgtatcta agtatctttc ctgaggattt tgaaatcaaa aggaatcgtc tagtaggtag 6720

atggatagca gaagggtttg ttagaccaaa ggttgggatg acgactaagg atgtcggaga 6780

aagttacttt aatgagctaa tcaaccgaag tatgattcaa cgatcaagag tgggcatagc 6840

aggaaaaatt aagacttgtc gaatccatga tatcatccgt gatatcacag tttcaatctc 6900

gagacaggaa aattttgtat tattaccaat gggagatggc tctgatttag ttcaggaaaa 6960

cactcgccac atagcattcc atgggagtat gtcctgcaaa acaggattgg attggagcat 7020

tattcgatca ttagctattt ttggtgacag acccaagagt ctagcacatg cagtttgtct 7080

agatcaattg aggatgttac gggtcttgga tcttgaagat gtgacattct taatcactca 7140

aaaagatttc gaccgtattg cattgttgtg ccacttgaaa tacttgagta ttggatattc 7200

gtcatccata tattcacttc ccagatccat tggtaaacta cagggcctac aaactttgaa 7260

catgctgaga acatacattg cagcactacc aagtgagatc agtaaactcc aatgtctgca 7320

tactcttcgt tgtagtagaa agtttgttta tgacaacttt agtctaaacc acccaatgaa 7380

gtgcataact aacacaatat gcctgcctaa agtattcaca cctttagtta gtcgcgatga 7440

tcgtgcaaaa caaattgctg aattgcacat ggccaccaaa agttgctggt ctgaatcatt 7500

cggtgtgaag gtacccaaag gaataggtaa gttgcgagac ttgcaggttc tagagtatgt 7560

agatatcagg cggaccagta gtagagcaat caaagagctg gggcacttaa gcaagttgag 7620

gaaattaggt gtgataacaa aaggctcgac aaaggaaaaa tgtaagatac tttatgcagc 7680

cattgagaag ctctcttccc tccaatctct ctatgtgaat gctgcgttat tatcagatat 7740

tgaaacactt gagtgcctag attctatttc atctcctcct cccctactga ggacactcgg 7800

gttgaatgga agtcttgaag agatgcctaa ctggattgag cagctcactc acctgaagaa 7860

gatctactta ttgaggagca aactaaagga aggtaaaacc atgctgatac ttggggcatt 7920

gcccaacctc atggtccttt atctttattg gaatgcttac cttggggaga agctagtatt 7980

caaaacggga gcattcccaa atcttagaac acttcgtatt tacgaattgg atcagctaag 8040

agagatgaga tttgaggatg gcagctcacc cctgttggaa aagatagaaa tctcttgctg 8100

caggttggaa tcagggatta ttggtatcat tcaccttcca aggctcaagg agatttcact 8160

tgaatacaaa agtaaagtgg ctaggcttgg tcagctggag ggagaagtga acacacaccc 8220

aaatcgcccc gtgctgcgaa tggacagtga ccgaagggat cacgacctgg gggctgaagc 8280

cgaaggatct tctatagaag tgcaaacagc agatcctgtt cctgatgccg aaggatcagt 8340

cactgtagca gtggaagcaa cggatcccct tcccgagcag gagggagaga gctcgcagtc 8400

gcaggtgatc acgttgacga cgaacgatag gtcagtcact ccctacatgg cagcttaatt 8460

aacttgtttc taattctctt cttgttcagt attagccatc aggtgagggc gatgatttca 8520

actcactttt catctctctc gttttcttaa cctgacagcg aagagatagg cacagctcaa 8580

gctggctga 8589

<210> 2

<211> 8748

<212> DNA

<213> NBS2-Pi2

<400> 2

atggcggaga cggtgctgag catggcgagg tcgctggtgg gcagtgccat cagcaaggcc 60

gcctctgccg ctgccaatga gacgagcctc ctgctcggcg tcgagaagga catctggtac 120

gtactgcact gcgctctcgt ttatcctagc tcggttgtat cgacttccag cttaatcttt 180

ttaataatga ataaaaaccc ggacttgtta tccataagtg gatatacaca gtcaaaacac 240

gcgacaagtt cttaggctct taattaatct cgaaattgag gaacaccatg aaacactaaa 300

agagagctcg aagactagga aagaaaacta gaagactaag ctttgaaagt cttctaaatc 360

caagcatctc gacattgatc atccttgtgc aacatcaacc cttcctattg cttcaccaga 420

atcggcgtcc cttgtggaga tctctgttgt aacgtcaagg ggaaaatcgg agaagcagaa 480

ctagtccgcg ctgccttcgc tacgccatct ccgccttaga ggatctcatc cacgaaacat 540

ccaccatcca aacgggaaac agttttaaac actcgtggac gttcacccgt tcatctaaat 600

ggttatgaaa aattttcaaa aaaaataaca tgataggtta acatgtaata tatcatctta 660

taaatatgca agttcaaatt tgatttctac aagttgtaac aaaaataaca aattttactg 720

tgaatatacg taaactagtt aaagtttaat ttgttatttt tgttacaact tgtagaagtc 780

gaatttaaat ctgtatgttt gtgaaatgag atattacata ttaacctatc ttataatttt 840

ttttagaaat tttttagaat tatttaggtg gcatacaaga aacggatgga catccacaaa 900

gagattagta tccatctcca catccaaacc cgttgttgca ccatctgtcg aatctgtcga 960

atccggctgt ggacgctcgg aggcaagagc tagctcaccc gtcccacaca cacacccaac 1020

gacgtcacaa gcgcctccga acaacgccaa ctgataactt ggcagctcct acgtgccgac 1080

gtcgcggtac ttgccggcgc tcctagcgca tgcaccgtcg aaccacaccg tcaccgacca 1140

gctacccacc gccgccgact tctgcctcat ctgccatcgt cgccctagcc caagttatca 1200

tcgtggcaat tgccgaggct cctaagtgtg ccacggccga ggcaaagttc taactgaatc 1260

agacagccac caccgacact tctgcttcat ctgccatcgc cgtactagtt caagttgtcg 1320

ctgtggcaat cactgttgtt attgccgcgc cctgacccct atcgtcgtcg ctcttagcgc 1380

gtcgtcgagc cgaccagcca ctgtcgtgca gatgaaaaaa aaaaacacat tttggcctga 1440

gagatctgct tagttccatt gcaggtccaa catgctgtga gatgcgggcg tgccagtcag 1500

tttgatcttg caactgacaa gatatataaa cagcagataa aacagcctat cgactaacaa 1560

gccgatggag taattccagc cgatagccga tattagccga tgccgattct agccgatgtc 1620

gatagggttt tgaactatcg gctatatgtc caatgtaggc aatgatataa agacaattgg 1680

ctgatgataa taaaatataa aaatataatc caatagaaac caatcggcta ataataagta 1740

ttgatccgat agttaaagca tacatcggct aaaagtccga tgtcataaaa tccaatcgat 1800

ttagataaac agtgaaacct ttgttgcaat cggctaaatc caacttgtat gtaatcttcg 1860

taagccgatg aacgtccaga taacttatcg gctagcacct cgataaaaca ctagcatgaa 1920

cctatcggct taacaagatt tatattatca acaacaatct agtaggtcgg acctaaccga 1980

tgcaacacgt attagatatg ataatctaat actcgatgag ccaatagatc tgtctaatgt 2040

gatggatata acaaatctat ttataaaagc attgcgattg tagagatata tcggctaaga 2100

cagaatatca gacctaacta aaccgatgcg tctctaaaca caatgcaatt aattagagat 2160

ataattgaga tatcagctag gcaaatatat caaccaaact agagcgatcc aagagatcgg 2220

agcaatgcag ccttgaacaa caccaatgta gccgatggat tcaccagggt cgacggaatg 2280

taggacttac cccttccctg aagatcgggc tgaaccaatg cagtcccatg tcaggtgcca 2340

aattccgccg gttgataagt aaaacctcag aaaagaggat gacgatgcgc cgagagtagt 2400

attgatcgag agataaattg caatgaccct ggatgtacat atttgtaccc atgggtagat 2460

attagttctt gtaggacaag aaagaaactt tcctaaagat aaaatgaaaa cataaagttt 2520

ttattggata ctaaacacac tttcctaaag ataaaaggaa actaaaccct gcctaattaa 2580

tagataaact gccatgtcgt atcctccttg aactcgaact cttttagata agcttccttt 2640

aactaatctt tacccgaatc catcaagaat acaaatgttg gcattgatag ttttcatcgg 2700

tcaattctag gactttgaag ccgatactga ctctaagccg atgactactt tgggcttacc 2760

aaattttgtt gttaacatgt cgcgaccacc atcaccggcc agccaccctg atcattgttg 2820

ttgactcagc attcgccagg ctgagcagtc cacatacatg ccgccatctc catggcactg 2880

tcgttgccgc ccctttctcc tagagccgcc gcagcgctct tcgacacacc tactgcatcg 2940

tcgagcagtc gtgctaccac ctcctccatc gaccatagcc gcctcttctg ctgcaccgga 3000

tccacccaca ccaaccacca gatacagtca agccctcatt cccggatccc atatccatcc 3060

atgccactac tgtgctgccc agtccaagga atggagcgaa ggaggaagcc ccgccgctgc 3120

cctcccggcg gccacatgca ctccagtgcc ttgctccgac ggcagcgagg ttggaaaatg 3180

ggtggcagcg gctagggttt atctggggag aaggaaaagg agagggaggg ggggggggag 3240

ggtccacttc cagcttaatt agcctagatc ttattgacaa atcagttgct gggtgcacaa 3300

acatgttatt ttttttgcat gaccaatctt gaacacttag gtatgttagt tgagtggaca 3360

ctggtctatc tgaaacatct cttcacatgg aggctgcgaa tgagttttct ttttgagaga 3420

ccaaaggttc gttgtatgtt aagtgataaa gccttggtaa gaaatgctac cacaaacgaa 3480

ctaataactc caaacgtaaa gtggaggaac ccgtatgggt gactcgagtg gcgacaaact 3540

ctagcacctc cacctccttg gacgggctgc ggcggtgctt tcggcatccc agtcttcttg 3600

gaggcatcat ctagaattaa ggtcttgtta ttgcttagca tgccttaggg cacgtccagt 3660

gtttagttcg actaaaactt ccatgaaagc caaacaaaag ttctgtttga ccaccacagt 3720

gtaaaaatcg attgtgggac ccatgcaaaa aaaatcacaa tctcagctgc ctatgctctc 3780

ctcctggacc tgatagccgt gcacaacaaa tattttttta aactggatgt gttcggcttc 3840

tctttaaaga tcgttttttc ctctgacact taccaaccgg ctttcacagt gtggtcagtt 3900

cttttttttt ttacgcaaag tttgatttta gtcagacacg ggaggatctg ttaagcaggc 3960

ttggaaattt cggacccctc caatacaata ttattttagc caaaattttc taatttttta 4020

atttttcatg aattttggta atatttgttc taatttaact aaattttgtt caaaatttcg 4080

gtctatcagt gacctccgat caaatcagtt aaaccgagaa aataaaccat gctcttaaga 4140

gagtttggta tggttcaata tcaaaactta tagtcttgca attttttcta ccctttatct 4200

ttttccctga ctatttagta tggatcgttt aaaaaaaaga aagcccattg gtgaccaagg 4260

gcttgtttga ttcaagacca tccctagcct taccaacctt ttggcaatgg caaaaattgg 4320

ttgttgccaa aaatattggc acaaattggc taagcctatg attggtttct accaaagttg 4380

aattttggca ttcaatcaag ccaaataatt tggcaataac attttcttat ctatggatat 4440

aacatatggc aaatattttg gcattaccat tttctttttg ccaaacatgt tattcctttt 4500

gaatgaccaa tcttgacacc ttatgtatgt tagtagtgga atcgacacta ttctatctaa 4560

aacatctctt tacatagagg ccgctaataa tttttctttg agataaccaa attttcctta 4620

caagttaagc aacaaagccc attggtaaga tatgctacga caaatgaact aataactcca 4680

aacataaagc ggaggatccc gcatttccca cgtgggtgac tcgagcggtg acaaacccta 4740

gtacctccac ccccttgggt gggttgtggt ggcactttcg gcaccgtatt ttccttggac 4800

ggatcattta gaaagtccta ttattgccta gtatgccttg acagtttagg caacactctt 4860

ggatggtggt gtcctttgcc ctggtgatct agtagcccat ggatgtttag ttatttggac 4920

atggtgttgg atggtgcgct cgtgggcctg ttgtaggtct ggtgccaacc agtcatgctt 4980

agaaatagcc ggataggtgc acagtgctag ttctttactt ggtggtttgt gcagcgctat 5040

cgacatgtgg tggtgtgctt tttctttgtc cggataataa tctcataggg ctatactctt 5100

gttattttgc tgctatatta ttatgataac ttggtatggt tcgttttttc tttttttgga 5160

aaaacaccta gttgatcaag ggcttgtttg gttcaagtgc attcctaatc ttaccttttc 5220

tttttttttt caatggcaag aattgttcat tgcaaaaaaa aaagagataa aaattggcta 5280

ggcttacgtt ttggttctta ccaaagttgt actttgagac caaatatatg gcaaaatttt 5340

ggcataacct tttttttttt gcttggttga gcttggtaca aaccaatcag tcacaaaata 5400

gactgtcatg aatcacgcct actaaattcc tttgaaccga actagaatat atttgctctt 5460

aaaagatttc ttgatttcaa ttggtaccat ttactagtag aaacttaaat ttaaatttta 5520

aaaacaaaat cataatattg ttgttatgga aattttagtc attttagtaa ttttgtaata 5580

tatgagttgg gttatacttg agatatccta aattgcttta agatgaacaa ttgctaggta 5640

tatcaaagat gagctaaaaa caatgcaggc attccttaga gctgctgaag ttatgaaaaa 5700

gaaagatgaa ctattaaagg tttgggcaga gcaaatacgt gacctgtcgt atgacattga 5760

agattccctt gatgaattta aagtccatat tgaaagccaa accctatttc gtcagttggt 5820

gaaacttaga gagcgccacc ggatcgctat ccgtatccac aacctcaaat caagagttga 5880

agaagtgagt agcaggaaca cacgctacaa tttagtcgag cctatttcct ccggcacaga 5940

ggatgacatg gattcctatg cagaagacat tcgcaatcaa tcagctcgaa atgtggatga 6000

agctgagctt gttgggtttt ctgactccaa gaaaaggctg cttgaaatga tcgataccaa 6060

tgctaatgat ggtccggcca aggtaatctg tgttgttggg atgggtggtt taggcaagac 6120

agctctttcg aggaagatct ttgaaagcga agaagacatt aggaagaact tcccttgcaa 6180

tgcttggatt acagtgtcac aatcatttca caggattgag ctacttaaag atatgatacg 6240

ccaacttctt ggtcccagtt ctctggatca actcttgcat gaattgcaag ggaaggtggt 6300

ggtgcaagta catcatcttt ctgagtacct gatagaagag ctcaaggaga agaggtactt 6360

tgttgttcta gatgatctat ggattttaca tgattggaat tggataaatg aaattgcatt 6420

tcctaagaac aataagaagg gcagtcgaat agtaataacc actcggaatg ttgatctagc 6480

ggagaagtgt gccacagcct cactggtgta ccaccttgat ttcttgcaga tgaacgatgc 6540

catttcattg ctactgagaa aaacaaataa aaatcatgaa gacatggaat caaataaaaa 6600

tatgcaaaag atggttgaac gaattgtaaa taaatgtggt cgtctaccat tagcaatact 6660

tacaatagga gctgtgcttg caactaaaca ggtgtcagaa tgggagaaat tctatgaaca 6720

acttccttca gaactagaaa taaacccaag cctggaagct ttgaggagaa tggtgaccct 6780

aggttacaac cacctaccat cccatctgaa accatgcttt ttgtatctaa gtatctttcc 6840

tgaggatttt gaaatacaaa ggaatcgtct agtaggtaga tggatagcag aagggtttgt 6900

tagaccaaag gttgggatga cgactaagga tgtcggagaa agttacttta atgagctaat 6960

caaccgaagt atgattcaac gatcaagagt gggcacagca ggaaaaatta agacttgtcg 7020

aatccatgat atcatccgtg atatcacagt ttcaatctcg agacaggaaa attttgtatt 7080

attaccaatg ggagatggct ctgatttagt tcaggaaaac actcgccaca tagcattcca 7140

tgggagtatg tcctgcaaaa caggattgga ttggagcatt attcgatcat tagctatttt 7200

tggtgacaga cccaagagtc tagcacatgc agtttgtcca gatcaattga ggatgttacg 7260

ggtcttggat cttgaagatg tgacattctt aatcactcaa aaagatttcg accgtattgc 7320

attgttgtgc cacttgaaat acttgagtat tggatattcg tcatccatat attcacttcc 7380

cagatccatt ggtaaactac agggcctaca gactttgaac atgtcaagca catacattgc 7440

agcactacca agtgagatca gtaaactcca atgtctgcat actcttcgtt gtataagaga 7500

gcttgaattt gacaacttta gtctaaatca cccaatgaag tgcataacta acacaatatg 7560

cctgcctaaa gtattcacac ctttagttag tcgcgataat cgtgcaaaac aaattgctga 7620

atttcacatg gccaccaaaa gtttctggtc tgaatcattc ggtgtgaagg tacccaaagg 7680

aataggtaag ttgcgagact tacaggttct agagtatgta gatatcaggc ggaccagtag 7740

tagagcaatc aaagagctgg ggcagttaag caagttgagg aaattagctg tgataacaaa 7800

aggctcgaca aaggaaaaat gtaagatact ttatgcagcc attgagaagc tctcttccct 7860

ccaatctctc tatatgaatg ctgcgttatt atcagatatt gaaacacttg agtgcctaga 7920

ttctatttca tctcctcctc ccctactgag gacactcggg ttgaatggaa gtcttgaaga 7980

gatgcctaac tggattgagc agctcactca cctgaagaag ttcaacttat ggagtagtaa 8040

actaaaggaa ggtaaaaaca tgctgatact tggggcactg cccaacctca tgttcctttc 8100

tctttatcat aattcttatc ttggggagaa gctagtattc aaaacgggag cattcccaaa 8160

tcttagaaca cttgtgattt tcaatttgga tcagctaaga gagatcagat ttgaggacgg 8220

cagctcaccc cagttggaaa agatagaaat ctcttgctgc aggttggaat cagggattat 8280

tggtatcatt caccttccaa ggctcaagga gatttcactt gaatacaaaa gtaaagtggc 8340

taggcttggt cagctgaagg gagaagtgaa cacacaccca aatcgccccg tgctgcgaat 8400

ggacagtgac cgaagggatc acgacctggg ggctgaagcc gaaggatctt ctatagaagt 8460

gcaaacagca gatcctgttc ctgatgccca aggatcagtc actgtagcag tggaagcaac 8520

ggatcccctt cccgagcagg agggagagag ctcgcagtcg caggtgatca cgttgacgac 8580

gaatgatagg tcagtcactc cctacatggc agcttaatta acttgtttct aattctcttc 8640

ttgttcagta ttagccatca ggtgagggcg atgatttcaa ctcacttttc atctctctcg 8700

ttttcttaac ctgacagcga agagataggc acagctcaag ctggctga 8748

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atccacgaaa catccaccat cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagctagct cttgcctccg ag 22

Claims (9)

1.水稻抗稻瘟病Pi9基因的共显性功能分子标记Pi9InDel1，其特征在于，所述分子标记由如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增得到。

2.权利要求1所述的分子标记在检测Pi9基因方面的应用，其特征在于，利用SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测目标进行PCR扩增，若扩增后得到长度为354bp的片段，则待测目标含Pi9基因；若扩增后得到长度为470bp的片段，则待测目标不含Pi9基因。

3.权利要求1所述的分子标记在选育杂交育种后代中Pi9基因纯合体方面的应用，其特征在于，利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对待测目标进行PCR扩增，若扩增后仅得到长度为354bp的片段，则待测目标为含有Pi9基因的纯合子；若扩增后仅得到长度为470bp的片段，则待测目标为不含Pi9基因的纯合子；若扩增后得到长度为354bp和470bp的两个片段，则待测目标为含有Pi9基因的杂合子。

4.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物。

5.一种检测水稻抗稻瘟病Pi9基因的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的引物组合对待测目标进行PCR扩增，若扩增后得到长度为354bp的片段，则待测目标含Pi9基因；若扩增后得到长度为470bp的片段，则待测目标不含Pi9基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的扩增反应体系如下：

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述PCR的扩增反应条件为：94℃变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，扩增35个循环；72℃延伸5min。

8.一种选育杂交育种后代中Pi9基因纯合体的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的引物组合对待测目标进行PCR扩增，若扩增后仅得到长度为354bp的片段，则待测目标为含有Pi9基因的纯合子；若扩增后仅得到长度为470bp的片段，则待测目标为不含Pi9基因的纯合子；若扩增后得到长度为354bp和470bp的两个片段，则待测目标为含有Pi9基因的杂合子。

9.含有权利要求4所述引物组合的试剂或试剂盒。