CN107099583A - 一种基于分子信标溶解曲线的可用于核酸扩增的快速、特异性检测方法 - Google Patents

一种基于分子信标溶解曲线的可用于核酸扩增的快速、特异性检测方法 Download PDF

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Abstract

快速、方便的一种基于分子信标溶解曲线的用于核酸扩增的快速、特异性检测方法，步骤为：(1).针对目的基因设计合成引物和分子信标；(2).提取待测物DNA；(3).将所述引物和分子信标加入核酸扩增体系，对所述待测物DNA作核酸扩增；其特征在于—(4).所述核酸扩增完成后设置分子信标溶解曲线，检测判断所述待测物。本发明适用于检测判断核酸反应终点产物。

Description

一种基于分子信标溶解曲线的可用于核酸扩增的快速、特异 性检测方法
技术领域
本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种可用于核酸扩增的快速、特异性检测方法。
背景技术
核酸聚合酶链式反应(PCR)是最为经典的体外核酸扩增技术，自Khorana(1971)提出至今，该技术已经越来越广泛地应用于医学诊断、食品安全检测等领域。近年来新兴的恒温扩增技术，如环介导恒温扩增技术(LAMP)，交叉引物恒温扩增技术(CPA)，重组酶扩增技术(RPA)，滚环扩增技术(RCA)等同样被广泛应用。随着核酸扩增技术的发展，探究更为特异、灵敏、快速的核酸扩增检测方法成为重中之重。
对于核酸扩增的检测方法，传统的凝胶电泳法采用的染料对人体有毒有害，操作步骤繁琐，开盖易造成气溶胶污染。实时荧光检测方法一般采用DNA双链荧光嵌入剂，如SYBR Green，Gel Red，SYTO 9等，实现了对核酸扩增的实时检测，并且避免了开盖操作造成的交叉污染，但该方法不具有检测特异性。为了实现对核酸扩增的特异性检测，有学者提出了采用分子探针，如水解探针(如Taqman探针)、杂交探针(如分子信标)、复合探针，在核酸扩增过程探针序列与模板进行互补配对，从而对核酸扩增进行实时、特异性的检测。但基于分子探针的检测方法，通常用于在核酸扩增过程中进行实时检测，而未见文献报道利用分子探针对核酸扩增终点产物进行检测。而对于核酸扩增终点产物的特异性检测，通常采用测序的手段，它成本高，周期长，而且需要专门的生物公司才能完成，不利于推广。
需要补充说明的是，对于采用荧光染料嵌入剂的实时荧光检测方法，溶解曲线常作为补充手段对其扩增产物进行特异性检测。但该方法需要仔细比对溶解曲线峰值(Tm)的位置，费时费力，对产物量较小的体系以及非特异性扩增明显的体系的检测难度更大。现有技术中采用分子信标的实时荧光检测方法，是在核酸扩增的同时进行检测，其检测受限于单批次性，尤其对于PCR扩增的检测，还需要被动集成精密的温控装置，不利于现场检测。由于传统基于分子信标的检测方法不能对已经扩增完成的产物进行检测，从而大大限制了其应用范围。因此，探究更为简便、快速、特异的核酸扩增检测方法是本领域技术人亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决上述现有技术对核酸扩增产物检测成本高、周期长、费时费力、特异性差，以及受限于单批次、需要配置高规格装置、不利于现场检测等问题，为此提供本发明的一种基于分子信标溶解曲线的可用于核酸扩增的快速、特异性检测方法。该方法快速、简便、特异性强，且能大大降低分子信标的设计要求。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案其步骤为：
(1).针对目的基因设计合成引物和分子信标；
(2).提取待测物DNA；
(3).将所述引物和分子信标加入核酸扩增体系，对所述待测物DNA作核酸扩增；
其特殊之处在于—
(4).所述核酸扩增完成后设置分子信标溶解曲线，检测判断所述待测物。
本发明步骤(3)中正、反向引物浓度比宜为1:(2～100)或(2～100):1，分子信标浓度不高于正、反向引物中高浓度引物浓度。
优选是正、反向引物浓度比为1:(4～10)或(4～10):1，分子信标的浓度不高于正、反向引物中高浓度引物浓度的1/2。
进一步，步骤(3)中分子信标浓度为正、反向引物中高浓度引物浓度的1/100至1/4。
再进一步，步骤(3)中分子信标浓度为正、反向引物中高浓度引物浓度的1/10至1/4。
也可以是步骤(3)中分子信标浓度为0.01μM～1μM。
优选是步骤(3)中分子信标浓度为0.01μM～0.1μM。
本发明步骤(4)中所述溶解曲线的升温速率为0.001℃/s～10℃/s，升温范围为10℃～95℃或分子信标的(Tm－40℃)～(Tm+40℃)。
优选是所述溶解曲线的升温速率为0.01℃/s～5℃/s，升温范围为20℃～80℃或分子信标的(Tm－20℃)～(Tm+20℃)。
更优选是所述溶解曲线的升温速率为0.02℃/s～2℃/s，升温范围为30℃～70℃或分子信标的(Tm－10℃)～(Tm+10℃)。
具体地：
本发明步骤(1)中所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:4所示，所述引物其碱序列为SEQ ID NO:2、3所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:1所示。
步骤(1)中所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:8所示，所述引物其碱序列为SEQ ID NO:6、7所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:5所示。
步骤(1)中所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:12所示，所述引物其碱序列为SEQ ID NO:10、11所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:9所示。
步骤(1)中所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:16所示，所述引物其碱序列为SEQ ID NO:14、15所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:13所示。
步骤(1)中所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:21所示，所述引物其碱序列为SEQ ID NO:18、19、20所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:17所示。
本发明步骤(1)、(2)时序无关。
本发明所述正、反向引物中高浓度引物浓度是指非对称扩增时正、反向引物中相对高浓度的引物的浓度。
下面说明分子信标溶解曲线的检测原理。
如图5所示，当模板DNA不存在时，在较低温度下，分子信标呈现稳定的发夹结构，此时分子信标两端标记的荧光基团和猝灭基团距离很近，分子信标呈猝灭状态。随着温度的逐渐升高，分子信标螺旋的茎部逐渐打开，分子信标呈现无规则卷曲状态，此时由于分子信标的荧光基团和猝灭基团远离，因此发出荧光。随着温度升高，荧光强度逐渐增强，直到分子信标茎部全部打开，荧光积累达到平稳期。
当模板DNA存在时，非对称扩增的单链DNA产物和双链DNA产物同时存在(如图1所示)。在较低温度下，一部分分子信标和单链DNA产物结合，形成DNA-分子信标复合物，发出荧光(如图2所示)，另一部分分子信标由于未和DNA结合，保持稳定的发夹结构，没有发出荧光。因此，对于相同的扩增体系，模板DNA存在时比模板DNA不存在时的荧光基底要高(如图6所示)。随着温度的升高，双链DNA产物解链，分子信标与解链的DNA结合形成DNA-分子信标复合物，结合的同时分子信标茎部打开，发出荧光(如图3所示)。因此，随着温度升高，荧光信号逐渐增强。当荧光积累到最高值后，随着温度继续升高，DNA-分子信标复合物变得不稳定，分子信标解离下来，恢复到原来的闭合构象，荧光积累减少(如图4所示)。当温度升高到分子信标的Tm值时，分子信标从DNA-分子信标复合物上解离下来一半，此时荧光减小的速度达到最快(如图7所示)。随着温度继续升高，分子信标又从闭合构象打开为无规则卷曲状态，荧光积累增多(如图5所示)。直到分子信标全部打开，荧光积累达到饱和。
以温度为横坐标，荧光值、荧光值导数为纵坐标作图，阳性样本在Tm值处出现峰值，对应的峰可称为阳性样本的特征峰，阴性样本不存在此特征峰(如图6、图7所示)。因此，根据有无特征峰即可明显区分阴性和阳性样本，而不用比较峰值的位置，大大简化了操作。
本发明是在核酸扩增过程完成后对终点产物作检测。与现有检测技术相比，本发明具有以下特点：
避免了传统凝胶电泳法步骤繁琐、对人体有毒害的缺陷；
避免了采用DNA双链荧光嵌入实时荧光检测不具有特异性的缺陷；
克服了包括分子信标的分子探针对核酸扩增过程实时检测受限于单批次性，设备要求高，不利于现场检测，应用范围窄的弊端；
避免了采用测序手段所致成本高、周期长、专业性要求高、不利于推广的缺陷；
分子信标设计简便——与核酸扩增实时检测分子信标设计相比，本发明中分子信标设计更为简单，对分子信标茎部的Tm值的要求大大降低。譬如在PCR扩增过程中，分子信标的Tm值无需以引物退火温度为参考；在恒温扩增过程中，分子信标的Tm值也无需以引物退火结合到模板的温度以及恒温扩增温度为参考，仅需保证分子信标的环部与模板互补配对，茎部Tm值不高于环部Tm值即可。其他设计条件仍遵照标准分子信标设计原则进行分子信标设计。
本发明不仅适用于PCR扩增，也适用于恒温扩增体系检测；操作过程无需开盖，避免了交叉污染；将扩增与检测分开，大大降低了对仪器精密温控与集成的要求；检测过程中无需对溶解曲线峰值位置进行比对即可完成终点产物是与否的判断，大大简化了操作；检测快速，特异性强，一般3分钟内可完成检测。
附图说明
图1表示非对称扩增产生的双链DNA模板(左)和单链DNA模板(右)；
图2表示DNA模板和分子信标结合形成的DNA-分子信标复合物；
图3表示随着温度的升高，双链DNA产物解链，分子信标与解链的DNA结合形成DNA-分子信标复合物，结合的同时分子信标茎部打开，分子信标发出荧光；
图4表示随着温度继续升高，DNA-分子信标复合物变得不稳定，分子信标解离下来，恢复到原来的闭合构象，分子信标荧光猝灭；
图5表示随着温度升高，分子信标从闭合构象打开为无规则卷曲状态，发出荧光；
图6为分子信标溶解曲线检测实际样本的荧光值-温度溶解曲线图；
图7为分子信标溶解曲线检测实际样本的荧光值导数-温度溶解曲线图；
图8表示实施例1对大豆叶片DNA的检测结果，阳性为转基因大豆，阴性为非转基因大豆；
图9表示实施例1对大豆种子DNA的检测结果，阳性为转基因大豆，阴性为非转基因大豆；
图10表示实施例2对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图11表示实施例3对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图12表示实施例4对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图13表示实施例5对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图14表示实施例6对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图15表示实施例7对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图16表示实施例8对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图17表示实施例9对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本；
图18表示实施例10对柑橘样本的检测结果，阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于转基因大豆检测。
首先，针对大豆的插入基因序列(GenBank:AB209952.1)，采用Primer primer 5.0软件进行PCR引物和分子信标探针设计，并采用IDT(http://sg.idtdna.com/calc/analyze)和blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对设计的引物和探针进行评估。再采用植物基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP305-02)分别对大豆叶片、大豆种子作DNA提取，操作完全按照试剂盒提供的步骤进行。然后，按照扩增试剂盒说明，配制PCR扩增反应液(又称为扩增体系)并分装到八连管中，盖上管盖。接着，将八连管放在PCR仪(Applied BiosystemsTMQ3PCR仪)上进行扩增反应。待扩增反应完成后，将样本温度逐渐升高并进行实时荧光采集，获得待测样本的分子信标溶解曲线，通过判断溶解曲线有无特征峰，对样本做出阳性/阴性判定。升温、实时荧光采集与荧光值导数—温度曲线记录在同一PCR仪(Applied BiosystemsTMQ3PCR仪)上进行。具体PCR扩增体系，PCR扩增程序，分子信标溶解曲线升温速率和升温范围如下：
扩增体系及程序：PCR反应在50μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶1.25U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTP各0.2mM，(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。PCR扩增程序为：40个循环，每个循环包括98℃反应10s，55℃反应30s和72℃反应1min。
溶解曲线：溶解曲线的温度从15℃升高到95℃，升温速率为0.02℃/s。
使用的分子信标序列：5’TexRd-CCT GCG GAA GTT CAT TTC ATT TGG GCA GG-Dab3’
使用的引物序列：F：5'CGCACAATCCCACTATCCTTC 3'
R：5'TCAGCTTGTCAGCGTGTCCTC 3'
扩增的模板序列：
CGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAAGCTGA(GenBank:AB209952.1)
使用的分子信标及引物浓度：分子信标工作浓度为0.03μM。引物工作浓度比例为1:5。具体而言，引物F(正向引物，下同)的工作浓度为0.08μM，引物R(反向引物，下同)的工作浓度为0.4μM。
图8、9分别表示分子信标溶解曲线对大豆叶片、大豆种子DNA的检测结果。阳性为转基因大豆，阴性为非转基因大豆。图中以及以下图10—18横坐标为温度，纵坐标为荧光值导数。
实施例2分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
首先，针对柑橘黄龙病基因序列(GenBank:GenBank:KY323722.1)，采用Primerprimer 5.0软件进行PCR引物和探针设计，并采用IDT(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)和blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对设计的引物和探针进行评估。再采用植物基因组DNA提取试剂盒(购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP305-02)对柑橘叶片作DNA提取，操作完全按照试剂盒提供的步骤进行。然后，按照扩增试剂盒说明，配制PCR扩增反应液(又称为扩增体系)并分装到八连管中，盖上八连管盖子。接着，将八连管放在PCR仪(Applied BiosystemsTMQ3PCR仪)上进行扩增反应。待扩增反应完成后，将样本温度逐渐升高并进行实时荧光采集，获得待测样本的分子信标溶解曲线，通过判断溶解曲线有无特征峰，对样本做出阳性/阴性判定。升温、实时荧光采集与荧光值导数—温度曲线记录在同一PCR仪(Applied BiosystemsTM Q3PCR仪)上进行。具体PCR扩增体系，PCR扩增程序，分子信标溶解曲线升温速率和升温范围如下：
扩增体系及程序：PCR反应在50μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶1.25U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTP各0.2mM，(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。PCR扩增程序为：40个循环，每个循环包括98℃反应10s，55℃反应30s和72℃反应1min。
溶解曲线：溶解曲线的温度从15℃升高到95℃，升温速率为0.02℃/s。
使用的分子信标序列：5’TexRd-GGA TAC GTG TCT CAG TCC CAG TGT ATC C-Dab3’
使用的引物序列：F：5’ATGGCTGGATCAGGGTTGC 3’
R：5’TGAGCCTGCGTTGGATTAGC 3’
扩增的模板序列：
TGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCAT(GenBank:KY323722.1)
使用的分子信标及引物浓度：分子信标工作浓度为0.03μM。引物工作浓度比例为1:5。引物F的工作浓度为0.08μM，引物R的工作浓度为0.4μM。
图10表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例3分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
此实施例中，分子信标的工作浓度为0.1μM。其他工作条件同实施例2。
图11表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例4分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
基本步骤同实施例2。具体PCR扩增体系，PCR扩增程序，分子信标溶解曲线升温速率和升温范围如下：
扩增体系及程序：PCR反应在50μL体积中进行，该体积中含有SpeedSTARTMHS聚合酶1.25U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTP各0.2mM，(购买自大连宝生物工程有限公司，货号RR070A)。PCR扩增程序为：40个循环，每个循环包括98℃反应10s，55℃反应30s和72℃反应1min。
溶解曲线：溶解曲线的温度从15℃升高到95℃，升温速率为0.02℃/s。
使用的分子信标序列：5’TexRd-GGA TAC GTG TCT CAG TCC CAG TGT ATC C-Dab3’
使用的引物序列：F：5’ATGGCTGGATCAGGGTTGC 3’
R：5’TGAGCCTGCGTTGGATTAGC 3’
扩增的模板序列：
TGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCAT(GenBank:KY323722.1)
使用的分子信标及引物浓度：分子信标工作浓度为0.03μM。引物工作浓度比例为1:5。引物F的工作浓度为0.08μM，引物R的工作浓度为0.4μM。
图12表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例5分子信标溶解曲线结合对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
此实施例中，正向引物和反向引物的工作浓度均为0.4μM，其他条件均同实施例4。
图13表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例6分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
扩增体系及程序：PCR反应在50μL体积中进行，该体积中含有Taq HS聚合酶1.25U，Tris-HCl 10mM，KCl 50mM，MgCl2 1.5mM，dNTP各0.2mM，(购买自大连宝生物工程有限公司，货号R007A)。引物和分子信标的浓度随具体实验变化。PCR扩增程序为：40个循环，每个循环包括98℃反应10s，55℃反应30s和72℃反应1min。
溶解曲线：溶解曲线的温度从15℃升高到95℃，升温速率为0.02℃/s。
使用的分子信标序列：5’TexRd-GGA TAC GTG TCT CAG TCC CAG TGT ATC C-Dab3’
使用的引物序列：F：5’ATGGCTGGATCAGGGTTGC 3’
R：5’TGAGCCTGCGTTGGATTAGC 3’
扩增的模板序列：
TGAGCCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCAT(GenBank:KY323722.1)
使用的分子信标及引物浓度：分子信标工作浓度为0.1μM。引物工作浓度比例为1:5。引物F的工作浓度为0.08μM，引物R的工作浓度为0.4μM。
图14表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例7分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为0.1℃/s，温度从30℃上升到70℃。其他工作条件均与实施例6相同。
图15表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘
实施例8分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为0.15℃/s，温度从30℃上升到70℃。其他工作条件均与实施例6相同。
图16表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例9分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为0.2℃/s，温度从30℃上升到80℃。其他工作条件均与实施例6相同。
图17表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例10分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为0.5℃/s，温度从15℃上升到95℃。其他工作条件均与实施例6相同。
图18表示分子信标溶解曲线对柑橘样本的检测结果。阳性为黄龙病柑橘样本，阴性为非黄龙病柑橘样本。
实施例11分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为1μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例12分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.5μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例13分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.4μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例14分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.05μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例15分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.01μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例16分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.005μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例17分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.001μM，其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例18分子信标溶解曲线结合非对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
基本步骤同实施例2。其中扩增反应也可以在热块上进行。
扩增体系及程序：NEAR恒温扩增反应在25μL体积中进行，反应体系中含有40mMTris-Cl(pH 8.8),2mM MgSO4,150mM KCl,10mM(NH4)2SO4,50mM NaCl,0.75U Nt.BstNBI和4.8U Bst 3.0DNA聚合酶,320μM dNTP,0.1μM引物BF,2.5μL DNA模板，切口引物1F，切口引物1R和分子信标的浓度随具体实验变化。NEAR恒温扩增反应条件为在56℃加热条件下孵育10分钟。
溶解曲线：溶解曲线的温度从15℃升高到95℃，升温速率为0.02℃/s。
使用的分子信标序列：
5’TexRd-GGA TAC GTG TCT CAG TCC CAG TGT ATC C-Dab 3’
使用的引物序列：NEAR-HLB-16s-BF(BF)：5’CCTGCGTTGGATTA 3’
NEAR-HLB-16s-1F(1F)：5’TATCATTTCAGAGTCACATACCAAGGCTACG 3’
NEAR-HLB-16s-1R(1R)：5’AGTGTCCGTCGAGTCCTATCCGTGTCTCAGTC 3’
扩增的模板序列：
ACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGG(GenBank:KY323722.1)
使用的分子信标及引物浓度：分子信标工作浓度为0.1μM。引物工作浓度比例为1:4。切口引物1R的工作浓度为0.1μM，切口引物1F的工作浓度为0.4μM。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例19分子信标溶解曲线结合对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，切口引物1F和切口引物1R的工作浓度均为0.4μM，其他工作条件均与实施例18相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例20分子信标溶解曲线结合非对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.03μM，其他工作条件均与实施例18相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例21分子信标溶解曲线结合非对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.01μM，其他工作条件均与实施例18相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例22分子信标溶解曲线结合非对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.005μM，其他工作条件均与实施例18相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例23分子信标溶解曲线结合非对称NEAR恒温扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为0.5μM，其他工作条件均与实施例18相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例24分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，分子信标的工作浓度为1μM，引物工作浓度比例为1:100。引物F的工作浓度为0.01μM，引物R的工作浓度为1μM。其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例25分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，引物工作浓度比例为1:10。引物F的工作浓度为0.04μM，引物R的工作浓度为0.4μM。其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例26分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为0.001℃/s。其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
实施例27分子信标溶解曲线结合非对称PCR扩增用于柑橘黄龙病的检测。
在此实施例中，溶解曲线的升温速率为5℃/s。其他工作条件均与实施例6相同。
分子信标溶解曲线对柑橘黄龙病样本的检测结果显示：柑橘黄龙病样本呈现阳性结果，非黄龙病样本呈现阴性结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种基于分子信标溶解曲线的可用于核酸扩增的快速、特异性检测方法
<130> 1
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgcggaag ttcatttcat ttgggcagg 29
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcacaatcc cactatcctt c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcagcttgtc agcgtgtcct c 21
<210> 4
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt 60
ggagaggaca cgctgacaag ctga 84
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggatacgtgt ctcagtccca gtgtatcc 28
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggctggat cagggttgc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgagcctgcg ttggattagc 20
<210> 8
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgagcctgcg ttggattagc tagttggtag ggtaagagcc taccaaggct acgatctata 60
gctggtctga gaggacgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 120
aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg atccagccat 170
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggatacgtgt ctcagtccca gtgtatcc 28
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggctggat cagggttgc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgagcctgcg ttggattagc 20
<210> 12
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgagcctgcg ttggattagc tagttggtag ggtaagagcc taccaaggct acgatctata 60
gctggtctga gaggacgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 120
aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg atccagccat 170
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggatacgtgt ctcagtccca gtgtatcc 28
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atggctggat cagggttgc 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgagcctgcg ttggattagc 20
<210> 16
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgagcctgcg ttggattagc tagttggtag ggtaagagcc taccaaggct acgatctata 60
gctggtctga gaggacgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 120
aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg atccagccat 170
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggatacgtgt ctcagtccca gtgtatcc 28
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cctgcgttgg atta 14
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tatcatttca gagtcacata ccaaggctac g 31
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
agtgtccgtc gagtcctatc cgtgtctcag tc 32
<210> 21
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
accaaggcta cgatctatag ctggtctgag aggacgatca gccacactgg gactgagaca 60
cgg 63

Claims (11)

1.一种基于分子信标溶解曲线的用于核酸扩增的快速、特异性检测方法，步骤为：
(1).针对目的基因设计合成引物和分子信标；
(2).提取待测物DNA；
(3).将所述引物和分子信标加入核酸扩增体系，对所述待测物DNA作核酸扩增；
其特征在于—
(4).所述核酸扩增完成后设置分子信标溶解曲线，检测判断所述待测物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中正、反向引物浓度比为1:(2～100)或(2～100):1，分子信标浓度不高于正、反向引物中高浓度引物浓度。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是正、反向引物浓度比为1:(4～10)或(4～10):1，分子信标的浓度不高于正、反向引物中高浓度引物浓度的1/2。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征是步骤(3)中分子信标浓度为正、反向引物中高浓度引物浓度的1/100至1/4。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是步骤(3)中分子信标浓度为正、反向引物中高浓度引物浓度的1/10至1/4。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中分子信标浓度为0.01μM～1μM。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(3)中分子信标浓度为0.01μM～0.1μM。
8.如权利要求1、2、3、6或7所述的方法，其特征是步骤(4)中所述溶解曲线的升温速率为0.001℃/s～10℃/s，升温范围为10℃～95℃或分子信标的(Tm－40℃)～(Tm+40℃)。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是所述溶解曲线的升温速率为0.01℃/s～5℃/s，升温范围为20℃～80℃或分子信标的(Tm－20℃)～(Tm+20℃)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征是所述溶解曲线的升温速率为0.02℃/s～2℃/s，升温范围为30℃～70℃或分子信标的(Tm－10℃)～(Tm+10℃)。
11.如权利要求1、2、3、6或7所述的方法，其特征是步骤(1)中所述目的基因、引物、分子信标其碱基序列为以下A、B、C、D、E组合之任何一种：
A组合：所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:4所示，所述引物其碱序列为SEQ IDNO:2、3所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:1所示；
B组合：所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:8所示，所述引物其碱序列为SEQ IDNO:6、7所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:5所示；
C组合：所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:12所示，所述引物其碱序列为SEQ IDNO:10、11所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:9所示；
D组合：所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:16所示，所述引物其碱序列为SEQ IDNO:14、15所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:13所示；
E组合：所述目的基因其碱基序列为SEQ ID NO:21所示，所述引物其碱序列为SEQ IDNO:18、19、20所示，所述分子信标其碱基序列为SEQ ID NO:17所示。
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