CN107098951A

CN107098951A - 降低黑色素含量的胜肽、方法及组合物

Info

Publication number: CN107098951A
Application number: CN201610506843.8A
Authority: CN
Inventors: 黄琇琴; 林炫
Original assignee: You Learn To Create Muscle Institute Ltd By Share Ltd
Current assignee: You Learn To Create Muscle Institute Ltd By Share Ltd
Priority date: 2016-02-23
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2036-06-30
Also published as: US9655834B1; CN107098951B; US9814663B2; US20170239163A1

Abstract

本发明公开了一种降低黑色素含量的胜肽、方法及组合物，所述的胜肽是一种用于在哺乳类个体中降低黑色素含量的单离的或合成的胜肽。该单离的或合成的胜肽是由SSASTTED(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列所组成。本发明亦提供用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成的方法及组合物。

Description

降低黑色素含量的胜肽、方法及组合物

技术领域

整体而言，本发明涉及一种于哺乳类个体中抑制黑色素生成或降低黑色素含量的胜肽，以及其方法及其组合物。

背景技术

人类色素沉着最显著的原因是由于皮肤及头发中黑色素的合成及分布。因此，在皮肤和头发的颜色主要取决于存在的色素种类及其浓度。

美国第6,579,848号专利是关于刺鼠讯号蛋白及胜肽以及其医药组合物及它们在抑制黑色素细胞的黑色素生成的方法上的用途。美国第8,669,238号专利揭示一种用于治疗过度色素沉着的方法，包括投予一组合物至患有过度色素沉着的个体，该组合物包含至少一种选自于由下列所组成的群组的抑制剂：驱动蛋白Kif13A抑制剂、AP-1连接物复合体次单元的抑制剂、以及AP-1连接物复合体次单元或AP-1连接物复合体与驱动蛋白Kif13A之间的交互作用的抑制剂。美国第8,455,023号专利是关于香桂(Cinnamomum subavenium)萃取物以及其通过抑制黑色素生成在美白美容中的用途。

发明内容

本发明发明人非预期地发现序列为SSASTTED(SEQ ID NO:1)的胜肽可有效地在哺乳类个体中抑制或降低黑色素生成。

因此，在一方面，本发明提供一种单离的或合成的胜肽，用于在哺乳类个体中抑黑色素生成或降低哺乳个体的黑色素细胞的黑色素含量。该单离的或合成的胜肽是由SEQ IDNO:1的氨基酸序列所组成。

另一方面，本发明提供一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成或降低哺乳个体的黑色素细胞的黑色素含量的方法，其包含对该个体或该黑色素细胞投予有效量的根据本发明的单离的或合成的胜肽。在本发明的较佳具体实施例中，该单离的或合成的胜肽是局部地投予至该个体。

又一方面，本发明提供一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成或降低哺乳个体的黑色素细胞的黑色素含量的组合物。该组合物包含有效量的单离的或合成的胜肽，其是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列所组成。根据本发明的特定具体实施例，该组合物可进一步包含一可接受的载体，且可调制为局部用制剂。

应理解的是，前述的一般性说明及以下的详细说明皆仅为例示性及解释性的，并不限制本发明。

附图说明

配合附图一起阅读将可更佳地理解前述的发明内容，以及下述的详细说明。为了说明本发明的目的，在图式中显示目前较佳的具体实施例。

在图式中：

图1显示在细胞中由本发明的胜肽所致的减少的黑色素生成。以10-50μg/ml的SEQID NO:1的胜肽(LF H-392-399)处理B16F10黑色素瘤细胞5天，并于第3天更换培养基。将细胞及培养基收集于试管中。已知曲酸对于酪胺酸酶活性的抑制效果，因此，在细胞试验中以其做为阴性对照组。已知IBMX可增进细胞内cAMP的含量，进而刺激黑色素生成，因此，在细胞试验中，以其做为阳性对照组。

图2A显示细胞中的黑色素含量。

图2B显示黑色素在培养基中的分泌情况。每次测量皆为三重复，数据以平均值±S.D.表示。相较于对照组，*p＜0.05。

图3显示由本发明胜肽所增加的酪氨酸酶活性。相较于对照组，*p＜0.05。

图4显示DOPA染色的结果。

具体实施方式

在一方面，本发明提供一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成或降低哺乳类个体的黑色素细胞的黑色素含量的单离的或合成的胜肽，该单离的或合成的胜肽是由SSASTTED(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列所组成。

另一方面，本发明提供一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成或降低哺乳类个体的黑色素细胞的黑色素含量的方法。该方法包含以下步骤：将该单离的或合成的SEQ IDNO:1的胜肽，可在该哺乳类个体中有效抑制黑色素生成的量，或以可有效降低该黑色素细胞的黑色素含量的量，投予至该哺乳类个体或该哺乳类个体的黑色素细胞。较佳地，该单离的或合成的胜肽是局部地投予。

又一方面，本发明提供一种组合物，其包含一有效量的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列所组成的单离的或合成的胜肽。本发明的组合物可用于抑制黑色素生成或降低哺乳类个体的黑色素细胞中的黑色素含量。该组合物可用于化妆品用途，例如，皮肤美白。

在本发明的特定具体实施例中，该组合物进一步包含一(生理上)可接受的载体。

在特定较佳具体实施例中，本发明的组合物是调制为局部用制剂。

除非另有定义，本文使用的所有技术及科学术语具有与本领域技术人员对于本发明所属领域的理解相同的含义。

用语「一」或「一个」在权利要求书及/或说明书中与术语「包括」一起使用时，其意思为「一个」，但其亦与「一或多个」、「至少一个」、以及「一或多于一个」的含义一致。

用语「胜肽」在本文中是以其常规含义而被使用，亦即为一种聚合物，其单体为氨基酸，并藉由酰胺键而互相连结在一起，另可选择地，其是指多肽(polypeptide)。当该氨基酸为α-氨基酸时，可使用L-光学异构物或D-光学异构物。此外，亦可包含非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯甘氨酸及高精氨酸。使用氨基酸的标准缩写。

本文中所使用的术语「载体」是指一般用于调制可增进稳定性、无菌性、递送性的药物或化妆品组合物的材料。当胜肽递送系统调制为一种溶液或悬浮液时，该递送系统是于一可接受载体中，较佳地为水性载体。可使用多种水性载体，例如，水、缓冲液、0.8％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。该组合物可含有如所需要而可接近生理条件的生理上可接受的辅助物质，例如pH调整及缓冲剂、溶液张力调节剂、润湿剂及其类似物，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨醇酐单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

术语「局部的」或「局部地」在本文中是以其常规含义而被使用，其是指可以在身体任何部位内或上的位置，包括但不限定于表皮、任何其他真皮、或任何其他身体组织。局部地投予或施予意指使该胜肽直接与组织接触，例如含有黑色素生成细胞的皮肤或膜。

本发明设计使用单离的或合成的SEQ ID NO:1所示的胜肽作为针对各种用途的活性成分。在一较佳具体实施例中，本发明的单离的或合成的胜肽是与一可接受的载体组合而形成一种可置放于皮肤上的局部用制剂。局部用制剂可包括软膏、乳液、糊剂、乳霜、凝胶、滴剂、塞剂、喷雾、液剂、洗发剂、护发剂、粉末及经皮贴片。根据需要，可使用增稠剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或黏合剂。较佳地，载体的功能为增加本发明胜肽的皮肤渗透性，并且在体内条件下应能将该胜肽递送至黑色素细胞。对于本领域技术人员而言，合适的载体为习知，且其包括但不限于水、二甲基亚砜、乙醇、脂质体、液体石蜡、石蜡、二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮、油酸、以及品牌的渗透增进剂。

通过以下实例进一步说明本发明，所述实例是以提供例示性的目的提供而非限制。

实例

实例1：SEQ ID NO:1所示的胜肽抑制小鼠黑色素瘤细胞的黑色素生成

1.材料与方法

1.1单离的或合成的SEQ ID NO:1所示的胜肽的制备

得自人类乳铁蛋白且具有SSASTTED(SEQ ID NO:1)(796.75Da)氨基酸序列的胜肽是由生工有限公司(MDBio,Inc.)(中国台湾，台北)所合成。以高效液相层析法(HPLC)及质谱仪确认该胜肽的纯度及组成。使10mg的胜肽粉末溶解并与1ml的双去离子水(ddH₂O)混合，而制得10mg/ml的SEQ ID NO:1所示的胜肽样本，将其储存于-20℃下备用。

1.2细胞培养

在37℃且含有5％CO₂的加湿空气下，将B16F10小鼠黑色素瘤细胞培养于无酚红而含10％胎牛血清及青霉素/链霉素(100IU/50g/mL)的DMEM中。

1.3黑色素含量检测

根据Lee et al.,J Invest Dermatol 124,405-411,2005的方法稍加修改以测定培养的B16F10细胞中的黑色素含量。简言之，将B16F10细胞种于6孔培养盘中(2×10⁴细胞/孔)，并培养过夜使细胞贴附。在培养箱中以各种测试样本处理5天后，进行清洗、经胰蛋白酶处理并在丸粒化(pelleting)前计数。在1M NaOH中煮沸1小时后，定量每个细胞中的黑色素，并在400nm下从针对合成真黑色素的校正曲线读取每个样本的黑色素含量，并由3个独立试验中，将其转换成黑色素pg/细胞的平均值±SE。

1.4酪胺酸酶测定

酪胺酸酶是黑色素生成路径的限速酶。其测定可提供针对黑色素生成的诱导程度的高特异性及灵敏性指标。根据Bellei et al.,J Biol Chem 285,7288-7299,2010的方法稍加修改以测定培养的B16F10细胞的酪氨酸酶酵素活性。简言之，将B16F10细胞种于6孔培养盘中(2×10⁴个细胞/孔)，并培养过夜使细胞贴附。在培养箱中以各种测试样本处理5天后，以PBS清洗细胞，之后使用胰蛋白酶收集细胞。达培养终点时，以含有1％TritonX-100的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)使细胞溶解。然后藉由冷冻及解冻将细胞打破，在10,000×g下离心10分钟使裂解液澄清。以裂解缓冲液进行蛋白质定量及调整蛋白质浓度后，将100μl的各裂解液(各含有相同量的蛋白质)等量分注于96孔盘中，然后将100μl的5mM L-DOPA添加至每孔中。在37℃下培养30分钟后，以分光亮度计测定在475nm下的吸光值。重复测定三次。

1.5DOPA染色

亦进行DOPA染色以测定酪胺酸酶的酵素活性。将B16F10细胞种于6孔培养皿中(2×10⁴细胞/孔)，并培养过夜使细胞贴附。在培养箱中以各种测试样本处理4天后，以PBS清洗细胞，再以2％多聚甲醛固定，并以PBS进一步清洗三次，在37℃下将细胞反应于0.1％DOPA(溶于0.1M的PBS中)中5小时，并以光学显微镜观察(Wang et al.,Exp Ther Med 6,967-972,2013)。

2.结果

2.1对黑色素生成的影响

以50μg/ml的SEQ ID NO:1所示的胜肽处理的B16F10细胞培养物，显示出较少的细胞色素沉着(图1)。

2.2对黑色素含量的影响

以10及50μg/ml的SEQ ID NO:1所示的胜肽处理B16F10细胞显示出显著地降低的黑色素合成量(图2A及图2B)。

2.3对于酪胺酸酶活性的效果

以10及50μg/ml的SEQ ID NO:1所示的胜肽处理B16F10细胞显示出显著地降低的酪胺酸酶活性(图3)，且细胞亦显示出较弱的DOPA染色(图4)。

本领域技术人员会理解在不脱离本发明的广义发明概念的情况下，可修改上述具体实施例。因此，可理解的是，本发明并不局限于所揭示的特定具体实施例，而旨在于涵盖由所附申请专利范围所定义的本发明精神及范围内的修饰。

Claims

1.一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成的单离的或合成的胜肽，其是由SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列所组成。

2.一种用于在人类个体中增白皮肤的方法，其包含对该个体投予有效量的如权利要求1所述的单离的或合成的胜肽，该有效量可在人类个体中或黑色素细胞中有效抑制黑色素生成。

3.如权利要求2所述的方法，其中黑色素的含量是通过如权利要求1的单离的或合成的胜肽抑制黑色素的生成而降低。

4.如权利要求2所述的方法，其中如权利要求1的单离的或合成的胜肽是局部地投予至该个体。

5.一种用于在哺乳类个体中抑制黑色素生成的组合物，其包含有效量的如权利要求1所述的单离的或合成的胜肽。

6.如权利要求5所述的组合物，其进一步包含一生理上可接受的载体。

7.如权利要求5所述的组合物，其是被调制为一局部用制剂。

8.如权利要求7所述的组合物，其中该局部用制剂包含软膏、乳液、乳霜、凝胶、滴剂、喷雾、液剂、洗发剂或护发剂。

9.如权利要求8所述的组合物，其中该局部用制剂为乳液或乳霜。

10.如权利要求8所述的组合物，其中该局部用制剂为凝胶。