CN107082754A - 一种具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物及其制备方法以及该肉桂酸衍生物在制备治疗糖尿病并发症及氧化应激所引起疾病的药物中的应用。该化合物的结构如式I所示。其制备方法包括：首先将取代苯甲醛与取代乙酸或其酸酐反应得到取代肉桂酸，再与N‑叔丁氧酰基保护的二胺类化合物反应，得N‑叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺。该化合物脱保护基叔丁氧酰基后，与天然或非天然的N‑酰基α‑氨基酸反应得到肉桂酸衍生物。本发明的化合物对醛糖还原酶具有优良抑制活性以及优良的抗氧化活性，能够应用于制备治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病视网膜病、糖尿病老年痴呆、神经末梢障碍等疾病以及由氧化应激所导致疾病的药物中。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物及其制备方法，以及该肉桂酸衍生物中制备治疗糖尿病并发症及氧化应激所引起疾病药物中的应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是由于机体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而引起的以高血糖和糖尿为主要特征的内分泌代谢综合征。2013年国际糖尿病协会(IDF)的统计数据显示，全球糖尿病患者人数约为3.82亿，预计到2035年这一数字将增至5.92亿人。我国是糖尿病患者人数最多的国家之一，20～79岁患者约为0.98亿，预计到2035年将增至1.43亿人。因此，糖尿病的药物治疗研究已成为世界药物研究领域的重点。
糖尿病患者长期处于高血糖状态容易诱发糖尿病并发症，主要有三大类：视网膜病变，如：青光眼、白内障等；周围神经病变，如：末梢神经炎，足部溃疡等；肾脏病变，如：肾微血管病变，严重时会导致肾衰竭、尿毒症等。此外也可能并发心脑血管病变，可能导致中风、心肌肥厚、充血性心力衰竭等。这些并发症都是机体长期高血糖导致的，高血糖损伤了血管壁及外周神经，大大增加了心血管疾病的风险。尽管糖尿病一直困扰着患者健康，但是真正威胁患者生命安全的却是由于体内持续高血糖所导致的一系列并发症。这些并发症的发生与醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)在高糖环境下被过分激活有关。
AR属于NADPH依赖性的醛酮还原酶超家族中的一员，是多元醇通路的关键限速酶，广泛存在于肾、肾上腺、睾丸、血管、胎盘、晶状体、视网膜、神经、心脏、脑、骨骼肌、肺及肝等组织中。在多元醇通路中，AR在辅酶NADPH作用下使得大量的葡萄糖转化成山梨醇，而相应地将山梨醇氧化成果糖的山梨醇脱氢酶并不受影响，山梨醇不能及时代谢而在体内蓄积，由于山梨醇的高极性使其不能轻易跨膜转运，这就导致了山梨醇局部蓄积而升高了膜内渗透压，其渗透压效应又会引发细胞膜及其组织损伤，导致糖尿病并发症。因此，抑制AR成为糖尿病并发症治疗的一条有效途径。世界范围内的医药科研工作者们经过不断地努力和探索，一大批治疗糖尿病并发症的药物已被研制出来。针对不同并发症，科学家们有针对性的研制出了控制和增加机体糖代谢、胰岛素受体敏感性、抑制糖基化终产物的形成及胰岛素抵抗、减少氧化应激等治疗药物，已经替代了早期单纯通过注射胰岛素达到降糖作用的治疗方案。随着科研水平的不断发展，研究者已经研制出了大批新型的抗糖尿病并发症药物，较之前的治疗效果有了较大提高，对患者病情的稳定和治疗起到了积极作用。目前，虽然有许多AR抑制剂被研发，但可供临床使用的、效果较好而不良反应又较小的醛糖还原酶抑制剂却很少。已上市的、化学合成的醛糖还原酶抑制剂有依帕司他(epalrestat)、阿司他丁(alrestatin)、泊那司他(ponalrestat)、索比尼尔(sorbinil)和托瑞司他(tolrestat)。其中阿司他和索比尼尔因毒副作用大，泊那司他因疗效不确切而被宣布停用；托瑞司他由于严重的肝脏毒性和引起死亡于1997年被宣布停用。只有依帕司他还在日本、印度及中国等少数国家使用。显然，开发疗效确切、安全的醛糖还原酶抑制剂存在迫切性。
许多疾病包括糖尿病及其并发症在内，都与氧化应激有关。具有抗氧化作用的化合物对这些疾病具有潜在的治疗前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的首要目的在于提供一种具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物。
本发明的另一目的在于提供上述的具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述的具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物在制备治疗糖代谢紊乱疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一方面，本发明提供了一种具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物，其结构如式I所示：
其中，X＝CN,H；Y＝NH,CH2,O,S；Z＝H,-；n＝2-6；标*处可以是R-或S-构型；R1、R2、R3分别为H、OH、OCH3中的任何一种；R4为甲基、异丙基、异丁基、苄基、对羟基苄基、苄氧甲基、苯乙基、4-氟苯乙基中的任何一种；R5为乙酰基、叔丁酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基中的任何一种。
优选地，该具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物选自下列化合物：
1.1. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3，4-二羟基肉桂酰丙二胺；
1.2. 3-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.3. 3-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.4. 3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.5. 3-N-(N-乙酰-L-苯丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.6. 3-N-(O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.7. 4-N-(N-乙酰-O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.8. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺；
1.9. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.10. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.11. 3-N-(N-新戊酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.12. 4-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.13. 4-N-(N-乙酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.14. 4-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.15. 4-N-(N-新戊酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.16. 3-N-(N-乙酰-L-丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.17. 3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.18. 3-N-(N-乙酰-D-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.19. 3-N-(N-乙酰-L-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.20. 3-N-(N-乙酰-D-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.21. 3-N-(N-乙酰-L-酪氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.22. 3-N-(L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.23. 3-N-(L-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.24. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4，5-三甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.25. 3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.26. 3-N-(N-乙酰-L-缬氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.27. 3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺。
另一方面，本发明提供了上述方案公开的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物的制备方法，其合成包含以下五个步骤：
(1)取代肉桂酸的制备：取取代苯甲醛溶于适量溶剂，加入取代乙酸或其酸酐1.0～5.0倍摩尔量，醋酸铵0.2～3.0倍摩尔量，注射器称取冰醋酸0.5-3.0倍摩尔量加入反应体系，反应瓶上接小型分水器、冷凝管、干燥管。于80～120℃油浴锅中搅拌回流反应8～18h。反应毕，降至室温，然后低温下静置，过滤，滤饼用二氯甲烷(DCM)洗涤三次，得黄色固体，为取代肉桂酸。
(2)N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺的制备：取取代肉桂酸溶于适量溶剂，加入1.0～3.0倍摩尔量的偶合试剂，-20～0℃下搅拌反应10～40min，随后加入1.0～3.0倍摩尔量的N-叔丁氧酰基保护的二胺和有机碱，-20～0℃下搅拌反应30～60min，升温至30～60℃，继续搅拌反应24～36h。反应结束，旋蒸除去溶剂，浓缩物用硅胶柱层析纯化，得N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺。
(3)取代肉桂单酰二胺：取N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺溶于适量溶剂，缓慢加入5～20倍摩尔量的4M盐酸溶液，0～40℃下搅拌反应3～6h。反应结束，旋蒸除去溶剂，冻干，得取代肉桂单酰二胺。
(4)N-酰化α-氨基酸的制备：取α-氨基酸溶于适量溶剂，加入1.0～5.0倍摩尔量的酰化试剂，50～100℃下搅拌反应4～9h，旋蒸除去溶剂，浓缩物用高效液相色谱分离纯化，得N-酰化α-氨基酸。
(5)新型肉桂酸衍生物的制备：取N-酰化α-氨基酸，溶于适量溶剂，加入1.0～3.0倍摩尔量的偶合试剂，-20～0℃下搅拌反应10～40min，得A液；另取取代肉桂单酰二胺溶于适量溶剂，加入3.0～5.0倍摩尔量有机碱，冷切至-30℃，搅拌下滴加A液，滴加完毕，保持该温度，搅拌1h。升至室温，继续反应20～40h。反应结束，旋蒸去除溶剂。浓缩物用硅胶柱层析纯化，得新型肉桂酸衍生物。
作为本发明的优选方案，本发明的制备方法中还包含如下附加技术特征的部分或者全部：
步骤1中所用的溶剂为甲苯或者苯。
步骤2中所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或体积比为10:1的二氯甲烷(DCM)/DMF。
步骤2中所用的缩合试剂可以是氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)中的一种与N-羟基苯骈三氮唑(HOBt)按1:1摩尔配比混合而成。
步骤2中所用的有机碱为三乙基胺和二异丙基乙胺(DIPEA)中的一种。
步骤3中所用的溶剂为甲醇、乙醇、DMF中的一种。
步骤4中所用的酰化试剂为酸酐或相应的酰氯。
步骤5中所用的溶剂同步骤2。
步骤5中所用的缩合试剂同步骤2。
作为说明本发明的制备方法的一个例证，对于上述具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物的制备方法，以Y＝NH，肉桂酸母核为α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸为例。首先是3,4-二羟基苯甲醛与氰基乙酸经克脑文格尔缩合反应，得到中间体原料α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸，然后再与N-叔丁氧酰基(Boc)保护的二胺类化合物反应，得N-Boc保护的α-氰基肉桂酰二胺。该化合物脱保护基Boc后，与N-酰基α-氨基酸(天然或非天然)反应得α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸衍生物。
本发明的新型肉桂酸衍生物的制备路线如下所示：
再一方面，本发明还提供上述具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物在制备治疗糖代谢紊乱疾病药物中的应用，尤其是在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。这些糖尿病并发症包括糖尿病视网膜病、糖尿病神经末梢障碍病、糖尿病老年痴呆症。
本发明利用以下实验证明上述的化合物对醛糖还原酶具有优良的抑制活性：以D,L-甘油醛为底物测定α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸衍生物(即本发明的化合物)对醛糖还原酶酶解活性的抑制率，以临床药物依帕司他(Epalrestat)作为阳性对照。结果表明，3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5N-D)对人源醛糖还原酶的抑制活性最好，IC50值为22.29±1.43nmol/L，强于依帕司他的水平(IC50＝41.13±1.47nmol/L)。
考察上述化合物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)所产生自由基的清除作用，发现CHR-5N-D表明出优良的抗氧化作用，其半数清除浓度EC50＝8.50±0.49μM，明显强于阳性对照药Trolox(EC50＝14.19±0.16μM)。
考察高糖环境下(0.4mmol/egg)待试药CHR-5N-D和阳性对照药依帕司他、抗氧化剂依达拉奉(edaravone)、文献(Zhang L,Li YF,Yuan S,et al.Scientific Reports,2016,6:24942.)报道的化合物5f等对鸡胚生存率、死亡率、神经管畸形率及鸡胚形态和体重的影响。结果表明，在500nM浓度下，经CHR-5N-D处理的鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率、体重分别为70.0％、30.0％、14.3％、220.6mg；经依帕司他处理的鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率、体重则分别为70.0％、30.0％、28.5.0％、223.2mg；经依达拉奉处理的鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率、体重则分别为70％、35％、21.4％、226.2mg；5f处理的鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率、体重则分别为65％、35％、30.7％、214.7mg，结果表明待试药CHR-5N-D的效果总体优于依帕司他、依达拉奉和5f。同时又发现了化合物对AR有专一性地抑制活性，发现对ALR2表现出显著地酶抑制活性，与阳性药体内活性相当，与体外活性结果一致；而对于其同工酶ALR1并没有表现出明显的抑制活性，因此目标化合物对AR的抑制是有高度选择性的。化合物通过抑制AR的活性，从而显著抑制葡萄糖代谢的多元醇途径，阻止该途径的代谢产物山梨醇的产生。其体内抗氧化实验也表明，该化合物能显著抑制胚胎体内氧化产物MDA的形成，同时ORAC水平显示具有良好的自由基清除能力。以上实验均有力地证明了化合物CHR-5N-D能对高糖诱导的鸡胚神经管畸形起到很好的保护作用，其次其体内酶抑制活性及体内抗氧化活性突出，与体外实验一致，同时还能显著提高调控蛋白Pax3的表达。
因此，上述的具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物可用于制备治疗糖代谢紊乱疾病的药物，尤其可用于制备治疗糖尿病并发症如糖尿病视网膜病、糖尿病老年痴呆、神经末梢障碍等疾病的药物；上述的具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物可用于制备治疗由氧化应激所引起的疾病，尤其糖尿病并发症。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的化合物对醛糖还原酶的抑制活性以及在制备治疗糖代谢紊乱疾病的药物、治疗糖尿病并发症药物以及治疗由氧化应激所引起疾病中的应用为首次报道。相比于其它现有技术，本发明的化合物制备工艺简单、疗效优于依帕司他。
附图说明
图1为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5N-D)的1H NMR图谱。
图2为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5N-D)的13C MRC。
图3为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5N-D)的HR-ESI-MS谱。
图4为所有化合物的抑制率-浓度柱状图。
图5 Trolox、CHR-5N-D、CHR-5P-D不同浓度的抑制率柱状图
图6为CHR-5N-D对高糖损伤鸡胚神经管发育的影响。
图7为化合物CHR-5N-D对EDD5高糖鸡胚模型体内脑组织糖含量、醛糖还原酶(AR)活性、醛还原酶(ALR1)活性及Sorbitol含量的影响。
图8为化合物CHR-5N-D对EDD5高糖鸡胚模型体内MDA含量ORAC水平影响。
图9为Western blotting实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：具有醛糖还原酶抑制活性的新型肉桂酸衍生物的制备
1.1.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3，4-二羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下五个步骤：
(1)化合物α-氰基-3,4-二羟基苯甲酸的合成：称取3,4-二羟基苯甲醛138mg(1.0mmol)于干燥的50mL圆底烧瓶中，加入氰基乙酸85mg(1.0mmol)，醋酸铵15.4mg(0.2mmol)，注射器称取冰醋酸48mg(0.8mmol)加入反应体系，再加入10mL甲苯作溶剂，反应瓶上接小型分水器、冷凝管、干燥管。于120℃油浴锅中搅拌回流反应18h。反应毕，降至室温，然后低温下静置，过滤，滤饼用二氯甲烷(DCM)洗涤三次，得黄色固体，收率93.2％。1HNMR(300MHz,CD3OD)δ:8.09(s,1H,＝CH-),7.64(1H,Ar-H),7.36(1H,Ar-H),6.88(d,J＝8.3Hz,1H,Ar-H)；ESI-MS(m/z):240.1[M-H]-。
(2)化合物3-N-叔丁氧酰基-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺的制备：在100mL圆底烧瓶中加入α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸2050.0mg(10.0mmol)，加入适量DCM/DMF＝10:1(V/V)搅拌溶解，烧瓶中加入已称好的EDC·HCl 1.15g(11.0mmol)，0℃搅拌反应10min，然后将已称好的HOBt 810.8mg(11.0mmol)加入反应烧瓶，0℃搅拌反应10min，充分活化游离羧基。待羧基充分活化后，注射器分别量取N-Boc-乙二胺0.9mL(11.0mmol)和DIPEA4.6mL(26.4mmol)依次注入反应烧瓶，0℃搅拌反应约30min后缓慢升至室温，继续反应24h。反应结束，除去溶剂，硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝40:1)分离纯化,得黄色固体,收率72.5％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.21(t,J＝5.4Hz,1H,-CO-NH-),7.93(s,1H,＝CH-),7.54(1H,Ar-H),7.28(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H,Ar-H),6.88(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),6.79(t,J＝5.1Hz,1H,-CO-NH-),3.21-3.17(m,2H,-CO-N-CH2-),2.97-2.93(m,2H,-CO-N-CH2-),1.65-1.53(m,2H,-CO-N-CH2-),1.37(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:161.59,155.63,150.69,150.60,145.71,125.19,123.37,117.20,116.10,115.94,100.73,77.54,40.34,40.07,39.79,39.51,39.23,38.95,38.67,37.52,37.41,29.37,28.26。
(3)化合物3-N-(α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰)丙二胺的制备：将3-N-叔丁氧酰基-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺1.08g(3.0mmol)用适量干燥的甲醇溶解，转移至50mL圆底烧瓶，缓慢滴加7.5mL的4mol/L HCl溶液(30mmol)，室温条件下搅拌反应4h。除去溶剂得浅黄色固体，收率95.0％。1H NMR(300MHz,D2O)δ:7.69(s,1H,＝CH-),7.35(s,1H,Ar-H),7.18(s,1H,Ar-H),6.88(s,1H,Ar-H),3.41(2H,-CO-N-CH2-),3.09(2H,-CO-N-CH2-),1.97(2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,D2O)δ:163.88,152.50,149.68,144.17,126.90,123.95,116.83,116.73,115.98,98.68,37.07,37.01,26.72:ESI-MS(m/z):262.1[M+H]+。
(4)N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酸的制备：称量纸称取N-Boc-O-苄基-D-丝氨酸300mg(1.0mmol)于50mL圆底烧瓶，加入适量重蒸DCM搅拌溶解，注射器取三氟醋酸(TFA)1mL加入反应瓶中，加入约0.05mL的三乙基硅烷，室温下反应反应3h。反应毕，减压蒸馏和冷冻干燥除去TFA，静置得白色晶体(纯度>97.0％)。
将上步所得白色晶体(约1mmol)溶于适量重蒸甲醇，注射器量取乙酸酐0.3mL(约3mmol)、DIEA 0.5mL(约3mmol)加入反应体系中，70℃回流反应7h。反应毕，减压除去反应液中的甲醇，冷冻干燥除去未反应的乙酸酐。经HPLC制备(流动相为甲醇:水＝50:50，含0.05％TFA，紫外波长254nm)得无色油状物，收率73.2％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.63(s,1H,-COOH),7.26(m,5H,Ar-H),7.04(d,J＝7.8Hz,1H,-CO-NH-),4.79-4.67(m,1H,-N-CH-),4.47(s,2H,Ar-CH2-O-),3.82-3.78(m,2H,-CH2-O-),2.01(s,3H,-CO-CH3)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ172.98,171.69,137.45,128.61,128.09,127.90,73.53,69.66,52.91,22.92.ESI-MS(m/z):236.7[M-H]-。
(5)化合物3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺的制备：称取N-乙酰-O-苄基-L-丝氨酸118.7mg(0.5mmol)于西林瓶，依次加入HOBt 101.5mg(0.75mmol)和EDC·HCl 144mg(0.75mmol)，3～10mL DCM/DMF(10:1，V/V)作为溶剂，搅拌反应10min，得A液。另称取2-N-(α-氰基-4-羟基肉桂酰)丙二胺127.2mg(0.55mmol)溶于3～10mL的DCM/DMF中，加入DIPEA 0.4mL(2.2mmol)，冷却至-30℃，搅拌下滴加A液，滴加完毕，保持该温度搅拌1h。随后升至室温，继续反应23h。反应结束，旋蒸去除溶剂。经HPLC制备(甲醇:水＝50:50，含0.1％甲酸，紫外波长254nm)得墨绿色油状物，收率58.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.24-8.18(m,1H,-CO-NH-),8-14-8.08(m,1H,-CO-NH-),8.05(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),7.92(s,1H,＝CH-),7.53(1H,Ar-H),7.35-7.25(m,6H,Ar-H),6.87(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),4.48(s,3H),3.56(d,J＝5.7Hz,2H,),3.20(d,J＝6.0Hz,2H,-CO-N-CH2-),3.14-3.05(m,2H,-CO-N-CH2-),1.87(s,3H),1.65-1.55(m,2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:169.70,169.42,161.66,150.97,150.64,145.78,138.16,128.22,127.50,127.44,125.31,123.22,117.26,116.04,115.96,100.50,72.01,69.90,52.78,48.62,36.22,28.99,22.56；ESI-MS(m/z):479.2[M-H]-；HR-ESI-MS(m/z):481.2113[M+H]+；calc for C19H23N4O4+H:481.2113；
上述数据证实该化合物为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5N-D)，结构如下所示。
1.2.3-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)3-N-叔丁氧酰基-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备：步骤同1.1的(2)。将α-氰基-3,4-二羟基肉桂酸2050.0mg(10.0mmol)改为α-氰基-4-羟基肉桂酸1890.4mg(10mmol)，得淡黄色固体，收率58.3％。1H NMR(300MHz,CD3COCD3)δ8.10(s,1H,＝CH-),7.90(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.74(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),7.63(t,J＝6.0Hz,1H,-CO-NH-),6.97(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.42-4.35(m,1H,-CO-CH-),3.73-3.50(m,2H),3.43-3.36(m,2H),3.28-3.19(m,2H),2.12-1.90(m,8H),1.69(p,J＝6.6Hz,2H,-CH2-)；13C NMR(75MHz,CD3COCD3)δ:173.58,171.11,163.04,162.79,151.98,134.17,124.85,118.07,117.32,102.29,61.42,49.00,38.05,36.86,30.88,30.62,30.53,30.44,30.37,30.11,29.85,29.60,29.34,25.65,22.82；ESI-MS(m/z):385.6[M+H]+,407.5[M+Na]+；HR-ESI-MS(m/z):385.1864[M+H]+；calc for C19H23N4O4+H:385.1864.Meltingpoint：110.8-112.3℃。
(2)3-N-(α-氰基-4-羟基肉桂酰)丙二胺的制备：步骤同1.1的(3)。投入上步所得的3-N-叔丁氧酰基-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺，得浅棕色固体1692.3mg,收率85.3％。1HNMR(300MHz,D2O)δ:7.62(s,1H,＝CH-),7.56(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),3.35(t,J＝6.6Hz,2H,-CH2-N-),3.04(t,J＝7.5Hz,2H,-CH2-N-),1.99-1.85(m,2H,-CH2-)；13C NMR(75MHz,D2O)δ:163.66,160.59,152.40,133.62,123.34,116.78,115.95,98.50,37.02,36.97,26.70.ESI-MS(m/z):346.2[M+H]+。
(3)N-乙酰-L-脯氨酸的制备：取L-脯氨酸115.1mg(1mmol)，加入适量溶剂甲醇溶解，注射器量取乙酸酐0.3mL(约3mmol)、DIEA0.5mL(约3mmol)加入反应体系中，70℃回流反应7h。反应毕，减压除去反应液中的甲醇，冷冻干燥除去未反应的乙酸酐。经HPLC制备(流动相为甲醇:水＝45:65，含0.05％甲酸，紫外波长214nm)得白色固体，收率84.2％。ESI-MS(m/z)：158.2[M+H]+。
(4)3-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备：步骤同1.1的(5)。将3-N-(α-氰基-3,4-二羟基肉桂酰)丙二胺143.6mg(0.55mmol)替换为3-N-(α-氰基-4-羟基肉桂酰)丙二胺134.9mg(0.55mmol)。经硅胶柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:1,DCM:甲醇＝10:1)分离得淡黄色固体，收率58.3％。1H NMR(300MHz,CD3COCD3)δ8.10(s,1H,＝CH-),7.90(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.74(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),7.63(t,J＝6.0Hz,1H,-CO-NH-),6.97(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.42-4.35(m,1H,-CO-CH-),3.73-3.50(m,2H),3.43-3.36(m,2H),3.28-3.19(m,2H),2.12-1.90(m,8H),1.69(p,J＝6.6Hz,2H,-CH2-)；13C NMR(75MHz,CD3COCD3)δ:173.58,171.11,163.04,162.79,151.98,134.17,124.85,118.07,117.32,102.29,61.42,49.00,38.05,36.86,30.88,30.62,30.53,30.44,30.37,30.11,29.85,29.60,29.34,25.65,22.82；ESI-MS(m/z):385.6[M+H]+,407.5[M+Na]+；HR-ESI-MS(m/z):385.1864[M+H]+；calc for C19H23N4O4+H:385.1864；Melting point:110.8-112.3℃。
上述数据证实该化合物为3-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰乙二胺(CHR-5A-L)，结构如下所示。
1.3.3-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤：
(1)步骤同1.2的(1)。
(2)步骤同1.2的(2)。
(3)步骤同1.2的(3)将酰化试剂乙酸酐替换成新戊酸酐1mL(5.0mmol)，HPLC制备(流动相为甲醇:水＝35:65，含0.1％甲酸；紫外波长214nm)得白色固体，收率：62.4％。1HNMR(300MHz,CD3OD)δ:4,43-4.39(m,1H,-CO-CH-),3.80(d,J＝1.4Hz,2H,-N-CH2-),2.24-1.82(m,4H),1.26(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:179.11,176.79,62.85,49.82,39.95,29.14,27.76,27.06；ESI-MS(m/z):198.4[M-H]-。
(4)步骤同1.2的(4)。将N-乙酰-L-脯氨酸115.1mg(1.0mmol)替换为N-新戊酰-L-脯氨酸199.1mg(1.0mmol)。经硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝40:1)分离得黄色油状粘稠物，收率53.6％。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ:8.11(s,1H,＝CH-),7.90(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.81(t,J＝6.0Hz,1H,-CO-NH-),7.55(t,J＝6.0Hz,1H,-CO-NH-),6.99(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.45(s,1H,-N-CH2-),3.78(t,J＝5.7Hz,2H),3.42(d,J＝6.3Hz,2H),3.27(d,J＝6.2Hz,2H),2.13-2.00(m,2H),1.89(dd,J＝10.8,5.4Hz,2H),1.76-1.66(m,2H,-CH2-),1.22(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:177.44,174.25,162.79,162.59,151.64,133.86,124.44,117.74,117.04,101.89,63.44,49.76,49.28,39.46,37.78,36.69,27.76.ESI-MS(m/z):425.7[M-H]-；HR-ESI-MS(m/z):427.2331[M+H]+；calcd for C19H23N4O4+H:427.2331.
以上数据证明该化合物为3-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5B-L)，结构如下：
1.4.3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)步骤同1.2的(1)。
(2)步骤同1.2的(2)。
(3)步骤同1.2的(3)将L-脯氨酸115.1mg(1.0mmol)替换成L-亮氨酸131.2(1.0mmol)。HPLC制备(流动相为甲醇:水＝35:65，含0.1％甲酸；紫外检测波长214nm)得白色固体，收率68.4％。ESI-MS(m/z):174.2[M-H]+。
(4)步骤同1.2的(4)。将N-乙酰-L-脯氨酸157.2mg(1.0mmol)替换为N-乙酰-L-亮氨酸173.1mg(1.0mmol)。经HPLC纯化(甲醇:水＝45:55，紫外波长214nm)得黄白色固体，收率64.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.26(t,J＝5.4Hz,1H,-CO-NH-),8.04(s,1H,＝CH-),7.99(t,J＝7.8Hz,2H,-CO-NH-×2),7.87(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),6.92(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),4.22(q,J＝7.5Hz,1H,-CO-CH-),3.25-3.17(m,2H,-N-CH2-),3.10-3.04(m,2H,-N-CH2-),1.84(s,3H,-CO-CH3),1.61-1.53(m,3H),1.42(t,J＝7.1Hz,2H,-CH2-),0.85(dd,J＝12.9,6.4Hz,6H,-CH3×2).13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.69,169.65,162.37,161.95,150.86,133.32,123.29,117.70,116.69,101.43,51.58,41.44,40.75,40.47,40.19,39.91,39.63,39.35,39.08,37.77,36.56,29.48,24.71,23.36,22.95,22.09.ESI-MS(m/z):399.8[M-H]-.HR-ESI-MS(m/z):401.2189[M+H]+；calc for C19H23N4O4+H:401.2189. Melting point：157.1-160.5℃。
以上数据证明该化合物为3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5F-L)，结构如下：
1.5.3-N-(N-乙酰-L-苯丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)步骤同1.2的(1)。
(2)步骤同1.2的(2)。
(3)步骤同1.2的(3)将L-脯氨酸115.1mg(1.0mmol)替换成L-苯丙氨酸165.1(1.0mmol)。HPLC制备(流动相为甲醇:水＝50:50，含0.1％甲酸；紫外检测波长214nm)得白色固体，收率72.4％。ESI-MS(m/z):208.2[M-H]+.
(4)步骤同1.2的(4)。将N-乙酰-L-脯氨酸157.2mg(1.0mmol)替换为N-乙酰-L-苯丙氨酸207.1mg(1.0mmol)。硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)分离，得黄色粉末状固体，收率63.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.23(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),8.16(d,J＝8.4Hz,1H,-CO-NH-),8.05-7.97(m,2H),7.88(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.29-7.14(m,5H,Ar-H),6.92(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.43-4.39(m,1H,-CO-CH-),3.16-2.71(m,6H),1.76(s,3H,-CO-CH3),1.55(p,J＝6.6Hz,2H,-CH2-)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:171.23,169.09,161.83,161.47,150.44,138.06,132.90,129.11,128.07,126.26,122.91,117.26,116.25,101.02,54.27,37.85,37.25,36.11,28.93,22.50；ESI-MS(m/z):433.9[M-H]-；HR-ESI-MS(m/z):435.2026[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:435.2026；Melting point：180.7-184.8℃.
以上数据证明该化合物为3-N-(N-乙酰-L-苯丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5H-L)，结构如下：
1.5.3-N-(O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)步骤同1.2的(1)。
(2)步骤同1.2的(2)。
(3)步骤同1.2的(4)氨基酸为N-BOC-O-苄基-L-丝氨酸，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:2)分离，得白色粉末状固体，收率61.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.24(t,J＝5.4Hz,1H,-CO-NH-),8.04(s,1H,＝CH-),8.00(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),7.88(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.34-7.25(m,5H,Ar-H),6.93(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),6.91-6.85(m,1H,),4.47(s,2H,Ar-CH2-O-),4.21-4.11(m,1H,-N-CH-),3.62-3.56(m,2H,-CH2-O-),3.25-3.17(m,2H,-CH2-N-CO-),3.15-3.06(m,2H,-CH2-N-CO-),1.66-1.55(m,2H,-CH2-),1.38(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:169.93,161.81,161.46,155.26,150.41,138.21,132.88,128.18,127.47,127.42,122.92,117.24,116.24,101.06,78.27,71.97,69.98,54.46,37.14,36.19,28.98,28.17。
(4)将上步所得化合物溶解于适量重蒸干燥DCM中，加入TFA 1.0mL,三乙基硅烷0.1mL,室温下搅拌反应2h,TLC监测反应完全。减压蒸馏除去溶剂，加入饱和碳酸氢钠溶液调pH至7～8，再加入DCM、饱和食盐水水洗两遍，浓缩有机相，得黄色油状液体。硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝15:1)分离，得黄色粉末状固体，收率62.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.26(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),8.08(t,J＝6.0Hz,1H,-CO-NH-),8.03(s,1H,＝CH-),7.87(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.37-7.23(m,5H,Ar-H),6.91(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.47(s,2H,Ar-CH2-O-),3.58-3.46(m,2H,-CH2-O-),3.41(t,J＝5.4Hz,1H,-N-CH-),3.26-3.17(m,2H,-CH2-N-CO-),3.16-3.06(m,2H,-CH2-N-CO-),1.61(p,J＝6.3Hz,2H,-CH2-)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ172.57,162.54,161.56,150.49,138.33,132.97,128.24,127.51,127.44,122.56,117.39,116.42,100.55,72.10,54.75,37.18,35.99,30.72,29.13；ESI-MS(m/z):423.5[M+H]+.HR-ESI-MS(m/z):423.2021[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:423.2021；
以上数据证明该化合物为3-N-(O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺(CHR-6J-L)，结构如下：
1.6.4-N-(N-乙酰-O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)步骤同1.2的(1)，得淡黄色固体，收率78.3％；ESI-MS(m/z):360.2[M+H]+。
(2)步骤同1.2的(2)。经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)分离得黄色固体,收率75.4％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.68(s,1H,Ar-OH),8.42(t,J＝5.7Hz,1H,-CO-NH-),8.11(s,1H,＝CH-),7.88(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H,Ar-H),3.22(q,J＝5.3Hz,2H,-N-CH2-),2.79(t,J＝8.4Hz,2H,-CH2-N-),1.62-1.49(m,4H,-CH2-CH2-)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:161.80,161.59,150.22,132.77,122.87,117.21,116.21,101.20,40.14,39.93,39.72,39.51,39.30,39.09,38.87,38.46,25.90,24.38；ESI-MS(m/z):260.3[M+H]+。
(3)步骤同1.1的(4)
(4)步骤同1.2的(4)经HPLC制备(甲醇:水＝55:45，含0.1％甲酸，紫外波长254nm)得黄色油状物，收率54.3％。1H NMR(300MHz,CD3COCD3)δ:8.12(s,1H,＝CH-),7.90(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H),7.64-7.56(m,2H,,-CO-NH-×2),7.38-7.12(m,5H,Ar-H),6.99(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),4.73-4.56(m,1H,-N-CH-),4.50(s,2H,Ar-CH2-O-),3.74-3.72(m,2H,-CH2-O-),3.37-3.33(m,2H,-CH2-N-CO-),3.28-3.24(m,2H,-CH2-N-CO-),1.97(s,3H,-CO-CH3),1.59-1.55(m,4H,-CH2-CH2-)；13C NMR(75MHz,CD3COCD3)δ:171.21,170.98,162.94,162.26,151.92,139.27,134.00,129.13,128.44,128.36,124.59,118.05,117.16,101.91,73.57,70.99,54.40,40.60,39.69,27.51,23.01；HR-ESI-MS(m/z):479.2311[M+H]+,calcfor C19H23N4O4+H:479.2311；
以上数据证明该化合物为4-N-(N-乙酰-O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺(CHR-5K-L)，结构如下：
1.7.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)3,4-二羟基肉桂酰丙二胺的制备：步骤同1.2的(1)。将α-氰基-4-羟基肉桂酸替换为咖啡酸。硅胶柱层析(氯仿:甲醇＝40:1)分离纯化得棕褐色油状物,收率73.4％。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.00(d,J＝5.1Hz,1H,-CO-NH-),7.30-7.16(m,1H,Ar-H),6.95(s,1H,Ar-H),6.81-6.77(m,3H),6.32(d,J＝15.6Hz,1H,＝CH-),3.19-3.09(m,2H,-CO-N-CH2-),2.94(d,J＝6.0Hz,2H,-CO-N-CH2-),1.61-1.47(m,2H,-C-CH2-C-),1.36(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:165.90,156.04,147.73,145.97,139.52,126.81,120.84,118.87,116.18,114.24,77.95,40.73,40.45,40.17,39.90,39.62,39.34,39.06,38.16,36.83,30.17,28.68；HR-ESI-MS(m/z):337.1758[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:337.1758。
(2)步骤同1.2的(2)过滤洗涤后得棕黄色固体，收率80.9％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:7.45(d,J＝15.6Hz,1H,＝CH-),7.06(s,1H,Ar-H),6.93(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H,Ar-H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),6.45(d,J＝15.6Hz,1H,＝CH-),3.43(t,J＝6.3Hz,2H,-CO-N-CH2-),3.00(t,J＝6.6Hz,2H,-CO-N-CH2-),2.01-1.87(m,2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,CD3OD)δ:170.29,149.18,146.84,143.35,128.10,122.66,117.42,116.63,115.18,38.43,37.37,28.83.ESI-MS(m/z):237.2[M+H]+；HR-ESI-MS(m/z):237.1234[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:237.1234。
(3)步骤同1.1的(4)。
(4)步骤同1.1的(5)经HPLC制备(甲醇:水＝50:50，含0.1％甲酸，紫外波长254nm)得黑色油状物，收率57.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.26-7.85(m,3H),7.42-7.20(m,6H,Ar-H),6.96(s,1H,Ar-H),6.80(2H,＝CH-),6.33(d,J＝14.8Hz,1H,＝CH-),4.48(s,3H),3.59-3.55(m,2H,-CH2-),3.15-3.11(m,4H,-CO-N-CH2-×2),1.88(s,3H,-COCH3),1.58(d,J＝2.4Hz,2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ:170.03,169.90,165.96,147.80,146.03,139.53,138.60,128.67,127.94,127.88,126.80,120.84,118.89,116.22,114.27,72.45,70.35,53.23,36.94,36.78,29.73,23.01；ESI-MS(m/z):454.3[M-H]-；HR-ESI-MS(m/z):456.2140[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:456.2140；
以上数据证明该化合物为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺(CHR-5P-D)，结构如下：
1.7.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-3,4-二甲氧基肉桂酰丙二胺的制备
包括以下四个步骤。
(1)步骤同1.1的(1)所用原料为3,4-二甲氧基苯甲醛，得到黄色固体，收率92.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.08(s,1H,＝CH-),7.70(s,1H,Ar-H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),7.11(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),3.84(s,3H,-OCH3),3.79(s,3H,-OCH3)；13CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ:164.00,152.20,151.06,148.66,125.28,124.97,118.30,112.39,111.77,104.79,55.77,55.46；HR-ESI-MS(m/z):234.0759[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:234.0759。
(2)步骤同1.1的(2)，经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)分离得黄色固体，收率75.8％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ:8.19(s,1H,＝CH-),7.69(s,1H,Ar-H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),6.92(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),3.93(d,J＝7.5Hz,6H,-OCH3×2),3.46(q,J＝6.3Hz,2H,-CO-N-CH2-),3.19(q,J＝5.4Hz,2H,-CO-N-CH2-),1.78-1.64(m,2H,-C-CH2-C-),1.43(s,9H,-CH3×3)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:161.56,156.73,153.24,152.60,149.32,127.26,125.04,117.72,111.52,111.12,100.93,79.63,56.27,56.14,37.28,30.29,28.56；HR-ESI-MS(m/z):390.2023[M+H]+,calc for C19H23N4O4+H:390.2023。
(3)步骤同1.1的(3)得黄色固体，收率83.5％。1H NMR(300MHz,D2O)δ7.50(s,1H,＝CH-),7.02(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H),6.77(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),3.78(s,3H,-OCH3),3.60(s,3H,-OCH3),3.38(t,J＝6.9Hz,2H,-CO-N-CH2-),3.06(t,J＝7.5Hz,2H,-CO-N-CH2-),2.01-1.88(m,2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,D2O)δ:163.11,152.39,152.17,147.59,128.37,123.90,116.63,110.97,110.17,98.43,55.63,55.00,37.06,26.77；ESI-MS(m/z):290.2[M+H]+。
(4)步骤同1.1的(4)。
(5)步骤同1.1的(5)经(DCM:石油醚＝2:1)重结晶得到黄色固体，收率52.0％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:8.18(s,1H,＝CH-),7.69(s,1H,-CO-NH-),7.45(d,J＝8.1Hz,1H,Ar-H),7.31(s,5H,Ar-H),7.01(d,J＝3.0Hz,2H,Ar-H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H,-CO-NH-),6.56(d,J＝4.2Hz,1H,-CO-NH-),4.65-4.48(m,3H),3.95(d,J＝4.5Hz,7H,-OCH3×2),3.63-3.54(m,1H),3.44-3.27(m,4H,-CO-N-CH2-×2),2.05(s,3H,-COCH3),1.71(d,J＝5.4Hz,2H,-C-CH2-C-)；13C NMR(75MHz,CDCl3)δ:170.75,170.58,161.67,153.37,152.75,149.41,137.58,128.70,128.21,128.10,127.23,125.04,117.80,111.70,111.19,100.84,73.69,69.82,56.29,56.17,53.12,37.06,36.24,29.64,23.42；HR-ESI-MS(m/z):509.2383[M+H]+,calc for C27H32N4O6+H:509.2383；Melting point：160.7-163.5℃.
以上数据证明该化合物为3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二甲氧基肉桂酰丙二胺(CHR-5R-D)，结构如下：
按照实施例1所述合成路线，并根据目标化合物的具体结构，在专业领域内进行合成路线的合理优化，共合成27个化合物，其结构、名称及物理性质列于表1-1。
表1-1 目标化合物的结构、名称及物理性质
-表示没有数据。
实施例2：实施例1所合成的化合物对醛糖还原酶酶的抑制活性
本实施例中，醛糖还原酶(AR)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、DL-甘油醛均购自Sigma公司；依帕司他(Epalrestat)购自东京化成工业株式会社。
实验步骤：酶反应体系在96孔板上进行，反应体系包括：PBS缓冲液(pH＝6.2)100μL，1.5mmol/L NADPH 20μL，100mmol/L DL-甘油醛20μL，不同浓度(Epalrestat或者受试样品)溶液20μL，AR稀释液20μL，蒸馏水20μL。实验设置空白照组、标准对照组、酶代谢组如表格2-1。
表2-1.分组及给药情况表
注：以上所有体积单位均为μL。
上述液体于37℃孵育5min后，除空白溶媒组外，每组加20μL AR启动反应，迅速将96孔板放入荧光酶标仪内，温度37℃，检测波长340nm，连续检测NADPH吸光度的变化情况，每30s检测一次，共检测30min。
根据实验测得的结果，分别求出空白组NADPH吸光度的下降值A0，酶活力组(未加样品)NADPH吸光度的下降值A1,Epalrestat组及受试样品组NADPH吸光度的下降值AEPS、A2。利用各组NADPH吸光度变化值求出其抑制率：
样品对AR抑制率/％＝[1-(A2-A0)/(A1-A0)]×100％。
根据酶反应实验结果，以样品终浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，依据动力学曲线求出不同样品的IC50。所有数据均用表示，数据统计由SPSS10.0软件处理，组间比较用t检验。求得阳性对照品Epalrestat的IC50为41.13±1.47。用以上方法求得目标终产物的IC50值，结果如表2-2所示：
表2-2.目标化合物的IC50值
从表2-2可以看出，化合物CHR-5N-D对醛糖还原酶的体外抑制活性最佳，明显强于阳性药依帕司他；化合物CHR-5A-D、CHR-5F-L、CHR-5F-D、CHR-5G-L、CHR-5G-L、CHR-5G-L、CHR-5G-D对醛糖还原酶的体外抑制活性与阳性药依帕司他的活性相当。
实施例3：实施例1所合成化合物的体外抗氧化活性
本实施例中，Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid)；1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)购自购自Sigma公司。
实验步骤：反应体系在96孔板上进行，将每种供试品溶液取40μL加入96孔板中，然后，每个孔中平行加入DPPH溶液160μL。同时设置对照组(40μL甲醇+160μL DPPH)，空白组(40μL供试品+160μL甲醇)。振摇1min，使其混合均匀，将96孔板置于避光条件下静置反应0.5h，迅速将板放入酶标仪中，检测波长517nm。测得最终吸光度(A)值，每个样品平行检测三次，取平均值。清除率的计算公式如下：
自由基清除率(％)＝A对照－(A样品－A空白)/A对照×100％
A对照为未加样品的对照组吸光度；
A样品为加入测试样品后反应液的吸光度；
A空白为空白组的吸光度。
所有数据均用表示，数据统计由SPSS10.0软件处理，组间比较用t检验。实验结果见表3-1。
表3-1.目标化合物在20μm浓度时对DPPH的抑制率
所有化合物的抑制率-浓度柱状图如图4所示。从表3-2及图4可以看出，除CHR-5N-D及CHR-5P-D外，其它化合物的体外抗氧化活性都弱于阳性对照品Trolox。
对于抑制活性突出的化合物和阳性对照，为方便比较其抑制活性，作出其20μM、10μM、2μM三个浓度的浓度-抑制率柱状图5所示：
通过对化合物的浓度对数与抑制率的线性回归分析得到Trolox、CHR-5N-D、CHR-5P-D的半数清除浓度，值即EC50值。
表3-2.化合物对应EC50值
从表3-2结果分析可见，化合物CHR-5N-D的抗氧化能力优良，明显强于阳性药Trolox；化合物CHR-5P-D的抗氧化能力与Trolox相当。
实施例4
化合物CHR-5N-D对高糖环境中鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率和体重的影响，以及对醛糖还原酶的抑制活性，对ALR1的抑制活性，自由基清除能力(ORAC水平)，对体内丙二醛(MDA)含量的影响，血糖调控能力，山梨醇产生的抑制能力以及对鸡胚发育调控蛋白Pax-3表达的影响等。
实验材料：新鲜受精鸡蛋购自华南农业大学。
实验步骤：新鲜受精鸡蛋保持孵育温度36-38℃，相对湿度65-75％。随机分为正常组(CON)、葡萄糖组(GLU)、CHR-5N-D低中高三个剂量组(DL、DM、DH)和epalrestat、edaravone、5f三个阳性对照组(EPS、EDA、5f)，每组20只。入孵的第0天气室开口，分别给予DL、DM、DH(20nM，100nM，500nM)和EPS、EDA、5f(500nM)。第1天除Control组外，其他组均给予D-葡萄糖(0.4M)。入孵的第5天取胚，记录体重、生存率、畸形率和体重，用体视显微镜拍摄胚胎形态。
实验结果见表4-1和图6。鸡胚死亡以没有心跳为标准判断。结果发现，高糖组的生存率降低，死亡率、总体畸形率和眼睛畸形率与正常组相比有明显的升高(p<0.01)。CHR-5N-D组则随着浓度的增加，生存率提高，死亡率、总体畸形率和体重均呈剂量依赖性下降，高浓度组效果较高糖组显著(p<0.01)。epalrestat、edaravone、5f等组别相比较于葡萄糖组，总体畸形率和体重均有明显的恢复(p<0.01)。将鸡胚用4％多聚甲醛固定后体式显微镜下拍照，如图6显示，高糖环境能够导致神经管畸形发生，而CHR-5N-D和epalrestat、edaravone、5f均对于胚胎眼发育畸形有明显的恢复作用。在500nM浓度下，CHR-5N-D对高糖环境下鸡胚发育的各项指标均优于阳性对照药epalrestat、edaravone、5f等。
表4-1 化合物5N-D对高糖环境中鸡胚生存率、死亡率、总体畸形率和体重的影响
(**P<0.01vs.Control.##P<0.01,#P<0.05vs.Glucose.)
为了更深层次研究化合物CHR-5N-D对高糖损伤鸡胚神经管畸形的保护作用，我们取EDD5的胚胎用体式显微镜观察整胚的形态并拍照记录，然后又采用石蜡包埋、HE染色及切片的方法观察胚胎神经管的发育状况。如图6所示，图6A是CON组的鸡胚，胚胎发育饱满，眼睛、脑泡、身体和尾部都发育正常。其胚胎的横切片图6A1显示，神经管闭合正常，脊索、神经节、神经管纤维组织等发育均衡。图6B是GLU组的胚胎，整个胚胎体型出现了畸形，脑泡发育迟缓，眼睛明显小于正常鸡胚，且尾部出现了不正常的弯曲。其胚胎的横切片图9B1显示，其神经管背侧面闭合失败，发生了严重的畸形，同时发现其神经管上皮细胞相对于正常鸡胚出现了无序的排列分布。此外，神经管的周边的附属结构诸如脊索，脊髓神经节等相比GLU组也呈现出明显的异常。图6C、6D、6E分别是EPS组、EDA组和5f组，这三组对鸡胚表现出明显的保护作用，神经管闭合明显，周围的附属结构也恢复良好，但并未完全恢复。图6F、6G、6H分别是CHR-5N-D的给药高剂量组CH、中剂量组CM、低剂量组CL，可以看出随着给药剂量的增加，神经管闭合逐渐完全，保护作用呈剂量依赖性。CH组神经管闭合完全，且效果明显好于阳性对照组结果，说明化合物CHR-5N-D在高浓度(500nM)时，能很好地保护鸡胚避免高糖环境的损伤，抑制其神经管畸形。
取第五胚龄日的鸡胚，采用相应的实验方法及试剂盒测定化合物CHR-5N-D的醛糖还原酶抑制活性，对ALR1的抑制活性，自由基清除能力(ORAC水平)，对体内丙二醛(MDA)含量的影响，血糖调控能力，山梨醇产生的抑制能力以及对鸡胚发育调控蛋白Pax-3表达的影响等。
实验结果如图7所示，化合物CHR-5N-D对AR抑制活性突出，高浓度组活性与Epalrestat相当，且强于5f(p＜0.01)，CHR-5N-D对ALR2的抑制率与给药浓度成正比，且活性突出是有效的AR抑制剂。但是CHR-5N-D对ALR2的同族酶ALR1无明显抑制作用，与阳性药和高糖组等无明显差异(P＞0.05)，说明化合物CHR-5N-D对ALR2是选择性抑制的，具有高度的专一性。
实验结果如图7所示，与CON组对比，高糖环境会显著增加胚胎组织中的Sorbitol含量，而目标化合物能显著抑制山梨醇的产生，因为CHR-5N-D有较强的AR抑制活性，从而抑制了多元醇途径，减少了Sorbitol的产生(P＜0.01)。实验结果与AR抑制活性一致，呈剂量依赖性。其活性与5f相当，且略强于Epalrestat。
实验结果如图8所示，CHR-5N-D能显著抑制MDA的产生(P＜0.01)，并且其活性呈剂量依赖性，CH组的抑制活性与5f和抗氧化剂依达拉奉(Edaravone)相当。同时ORAC水平实验也表明CHR-5N-D具有良好的自由基清除能力，且明显强于5F(P＜0.05)，与自由基清除剂Edaravone活性相当，其清除能力呈剂量依赖性递增。
Pax3负责调控胚胎发育过程中组织和器官的分化，其突变或者表达失调可能导致某些神经相关的出生缺陷和遗传综合征，如神经管畸形等。实验结果如图9所示，化合物CHR-5N-D能显著增强Pax3蛋白的表达，如图所示，与CON组对比，外源性添加高浓度葡萄糖减少了Pax3蛋白的表达水平(P＜0.01)，阳性药EPS、EDA、5f等都能明显恢复Pax3蛋白的表达(P＜0.01)，化合物CHR-5N-D也能较强地恢复Pax3蛋白的表达(P＜0.01)，且呈剂量依赖性，其活性明显强于阳性药EPS、EDA组(P＜0.01)，且与5f组相当(P＞0.05)。
化合物对AR抑制的专一性，发现对ALR2表现出显著的酶抑制活性，与阳性药体内活性相当，与体外活性结果一致，而对于其同工酶ALR1并没有表现出明显的抑制活性，因此目标化合物对AR的抑制是有高度选择性的。化合物通过抑制AR的活性，从而显著抑制葡萄糖代谢的多元醇途径，阻止该途径的代谢产物山梨醇的产生。其体内抗氧化实验也表明，该化合物能显著抑制胚胎体内氧化产物MDA的形成，同时ORAC水平显示具有良好的自由基清除能力。以上实验均有力地证明了化合物CHR-5N-D能对高糖诱导的鸡胚神经管畸形起到很好的保护作用，其次其体内酶抑制活性及体内抗氧化活性突出，与体外实验一致，同时还能显著提高调控蛋白Pax3的表达，化合物CHR-5N-D具有开发成ARIs的巨大潜力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物，其特征在于，结构如式I所示：
其中，X＝CN或H；Y＝NH,CH2,O,S；Z＝H,-；n＝2-6；标*处可以是R-或S-构型；R1、R2、R3分别为H、OH、OCH3中的任何一种；R4为甲基、异丙基、异丁基、苄基、对羟基苄基、苄氧甲基、苯乙基、4-氟苯乙基中的任何一种；R5为乙酰基、叔丁酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基中的任何一种。
2.如权利要求1所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物，其选自下列化合物：
1.1.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3，4-二羟基肉桂酰丙二胺；
1.2.3-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.3.3-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.4.3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.5.3-N-(N-乙酰-L-苯丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.6.3-N-(O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.7.4-N-(N-乙酰-O-苄基-L-丝氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.8.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-3,4-二羟基肉桂酰丙二胺；
1.9.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4-二甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.10.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.11.3-N-(N-新戊酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.12.4-N-(N-乙酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.13.4-N-(N-乙酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.14.4-N-(N-新戊酰-L-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.15.4-N-(N-新戊酰-D-脯氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丁二胺；
1.16.3-N-(N-乙酰-L-丙氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.17.3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.18.3-N-(N-乙酰-D-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.19.3-N-(N-乙酰-L-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.20.3-N-(N-乙酰-D-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.21.3-N-(N-乙酰-L-酪氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.22.3-N-(L-亮氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.23.3-N-(L-缬氨酰)-α-氰基-4-羟基肉桂酰丙二胺；
1.24.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-3,4，5-三甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.25.3-N-(N-乙酰-L-亮氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.26.3-N-(N-乙酰-L-缬氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺；
1.27.3-N-(N-乙酰-O-苄基-D-丝氨酰)-α-氰基-4-甲氧基肉桂酰丙二胺。
3.一种如权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物的制备方法，其特征在于，该肉桂酸衍生物的合成包含以下五个步骤：
(1)取代肉桂酸的制备：取取代苯甲醛溶于适量溶剂，加入取代乙酸或其酸酐1.0～5.0倍摩尔量，醋酸铵0.2～3.0倍摩尔量，注射器称取冰醋酸0.5-3.0倍摩尔量加入反应体系，反应瓶上接小型分水器、冷凝管、干燥管；于80～120℃油浴锅中搅拌回流反应8～18h；反应毕，降至室温，然后低温下静置，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤三次，得黄色固体，为取代肉桂酸；
(2)N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺的制备：取取代肉桂酸溶于适量溶剂，加入1.0～3.0倍摩尔量的偶合试剂，-20～0℃下搅拌反应10～40min，随后加入1.0～3.0倍摩尔量的N-叔丁氧酰基保护的二胺和有机碱，-20～0℃下搅拌反应30～60min，升温至30～60℃，继续搅拌反应24～36h；反应结束，旋蒸除去溶剂，浓缩物用硅胶柱层析纯化，得N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺；
(3)取代肉桂单酰二胺的制备：取N-叔丁氧酰基保护的取代肉桂酰二胺溶于适量溶剂，缓慢加入5～20倍摩尔量的4M盐酸溶液，0～40℃下搅拌反应3～6h；反应结束，旋蒸除去溶剂，冻干，得取代肉桂单酰二胺；
(4)N-酰化α-氨基酸的制备：取α-氨基酸溶于适量溶剂，加入1.0～5.0倍摩尔量的酰化试剂，50～100℃下搅拌反应4-9h，旋蒸除去溶剂，浓缩物用高效液相色谱分离纯化，得N-酰化α-氨基酸；
(5)肉桂酸衍生物的制备：取N-酰化α-氨基酸，溶于适量溶剂，加入1.0～3.0倍摩尔量的偶合试剂，-20～0℃下搅拌反应10～40min，得A液；另取取代肉桂单酰二胺溶于适量溶剂，加入3.0～5.0倍摩尔量有机碱，冷切至-30℃，搅拌下滴加A液，滴加完毕，保持该温度，搅拌1h；升至室温，继续反应20～40h。反应结束，旋蒸去除溶剂；浓缩物用硅胶柱层析纯化，得肉桂酸衍生物。
4.如权利要求2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所用的缩合试剂可以是氯甲酸乙酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N,N’-二异丙基碳二亚胺、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种与N-羟基苯骈三氮唑按1:1摩尔配比混合而成。
5.如权利要求2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤2中所用的溶剂为二甲基甲酰胺或体积比为10:1的二氯甲烷/二甲基甲酰胺；步骤2中所用的有机碱为三乙基胺和二异丙基乙胺中的一种；步骤2中所用的溶剂为二甲基甲酰胺、二氯甲烷或其混合溶剂；步骤1中所用的溶剂为甲苯、苯中的一种；步骤3中所用的溶剂为甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺中的一种；步骤4中所用的酰化试剂为酸酐或相应的酰氯；步骤5中所用的溶剂同步骤2；步骤5中所用的缩合试剂同步骤2。
6.权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物在制备治疗糖代谢紊乱疾病药物中的应用。
7.权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物在制备治疗糖尿病视网膜病药物中的应用。
8.权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物在制备治疗糖尿病神经末梢障碍病药物中的应用。
9.权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物在制备治疗糖尿病老年痴呆症药物中的应用。
10.权利要求1或2所述的具有醛糖还原酶抑制活性的肉桂酸衍生物在制备治疗由氧化应激所导致疾病药物中的应用。
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