CN107043819B

CN107043819B - 基于psbA-trnH序列分析结合重要表型性状选择的白及杂种优势预测方法及其应用

Info

Publication number: CN107043819B
Application number: CN201710250402.0A
Authority: CN
Inventors: 梁泉; 董文汉; 尹元萍; 张雅琼; 王明君; 黄莉; 杨生超; 张慧; 何潘敏
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2017-04-17
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2037-04-17
Also published as: CN107043819A

Abstract

本发明为一种基于psbA‑trnH序列分析结合重要表型形状选择的高效率白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)杂种优势预测方法及应用，属于生物技术育种领域，该方法在地缘来源和重要表型性状划分亲本群体的基础上，利用psbA‑trnH序列分析双亲的遗传距离，结合重要表型性状组配，经人工去雄授粉产生杂种F1代蒴果，再经组培快繁或种子直播育苗，快速产生大量杂种F1代种苗应用于生产。本发明的方法利用psbA‑trnH序列分析技术为白及提供了简易有效的杂种优势预测方法，并利用组培快繁技术或种子直播育苗固定杂种优势，迅速获得数量巨大的F1代杂种株系。

Description

基于psbA-trnH序列分析结合重要表型性状选择的白及杂种优势预测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型性状选择的白及杂种优势预测方法及其应用。

背景技术

利用杂种优势是提高作物产量和改进作物品质的重要途径。目前，在水稻、玉米等大田作物上取得了巨大的成功。在蔬菜、果树、林木等植物上，以及在家畜、家禽、鱼类等动物上都把利用杂种优势作为提高产量、改善品质、增强抗性的重要手段。

快速而准确地预测Fl杂种优势有助于选育强优势的杂交组合。杂种优势预测主要是指探寻杂种双亲的遗传差异与杂种子一代 F1优势大小的相关性。目前，杂种优势的遗传机理及预测方法尚未完全探明。杂种优势的大小，往往取决于双亲性状间的相对差异和相互补充。一般而言，亲缘关系，生态类型和生理特性上差异越大的，双亲间相对性状的优缺点能彼此互补的，其杂种优势越强，双亲的纯合程度越高，越能获得整齐一致的杂种优势。

分子标记遗传距离已广泛应用于作物杂种优势类群的鉴定。预测杂种优势主要有地理差异、群体遗传学、生理生化、分子标记等方法。这些预测方法科学，但多数方法的实用性和准确性较差。配合力是预测杂种优势的主要方法之一，但需要耗费大量的时间、人力、物力。遗传距离作为一种对生物遗传差异的定量描述，其客观性已初步得到植物育种分类实践的检验和承认。目前，广泛应用于杂种优势研究的分子标记有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等（付航等，2016；陆静姣等，2014；黄永相等，2013；杨蛟等，2010；应雯，2009；蔡健和兰伟，2005；袁力行和傅骏华，2000）。但分子标记遗传距离预测白及的杂种优势尚未见相关报道。

植物DNA条形码技术是一种新的生物身份识别系统，能够实现对物种的快速自动鉴定和遗传多态性分析。陈士林等（2011）通过筛选多个DNA条形码，建立了以ITS2 为核心、psbAtrnH为补充序列的植物类药材DNA 条形码鉴定体系。

白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)是我国重要的中药材之一，作为药用已有上千年的历史。但由于传统的获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，导致野生资源日益减少和种质资源的匮乏。目前，白及已被《中国植物红皮书-稀有濒危植物》第1册收录，同时也被写入了《濒危野生动植物国际贸易公约》（CITEs）保护种类。随着白芨野生资源量的骤减、市场需求量的增加，大力推广人工栽培种植显得越来越重要。

国以农为先，农以种为先，优良品种是中药材产业链的起点。目前，白及等中药材基本上采用系统育种方法选育新品种，其产量和质量难尽人意。杂交育种周期长，杂交后代分离大且分离出的优良单株极少，选育出各种优良性状相聚合的品种极为艰难。杂种优势利用已普遍应用在大田作物上，但在中药材上仍然罕见。白及人工授粉方便、容易，蒴果种子量很大，目前白及利用种子进行组培快繁和种子大田直播育苗技术日趋成熟。随着以白及为原料的新产品开发和新用途的研究，白及的市场需求也日益增大，应用杂种优势恰逢其时。

发明内容

为解决背景技术中存在的问题，本发明公开了一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型性状选择为白及提供了简易有效的杂种优势预测方法。

其技术方案为：

一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型形状选择的白及杂种优势预测方法，包括以下步骤：

（1）按照原生境来源划分白及种质资源材料；

（2）根据3年生白及种质资源假鳞茎直径、假鳞茎指状分枝的长/宽比、假鳞茎厚度、倒数第一和第二片叶片之间的夹角、倒数第二叶叶片中部宽度重要表型性状划分类别；

（3）从白及种质资源材料叶片中分离提取DNA；

（4）以DNA为模板，psbA-trnH分子标记为引物，通过PCR扩增出特异片段；

（5）凝胶电泳检测并回收PCR扩增产物并双向测序，峰图经专业软件拼接后去除引物及低质量区，获得相应DNA条形码序列；

（6）DNA条形码序列在ncbigenbank数据库上与公布的标准序列进行比对，确定其基原植物是否符合白及的标准；

（7）采用MEGA计算序列间的遗传距离，采用罗杰斯距离（RD）或改良的罗杰斯距离（MRD）来确定相关种质的亲缘关系；

（8）以亲缘关系的远近为基本指标，结合上述重要表型性状确定双亲；

（9）以重要表型性状突出的亲本为母本，经人工去雄授粉，得到杂种F1代蒴果；

（10）成熟的杂种蒴果采收，经组培快繁或者进行种子直播育苗得到F1代杂种种苗。

psbA-trnH分子标记引物上、下游序列分别为5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC3'，

5'- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 3'。

一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型形状选择的白及杂种优势预测方法在白及生产上的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的方法无需通过了解双亲所携带基因来预测杂种子一代F1的性状，利用psbA-trnH序列分析技术为白及提供了简易有效的杂种优势预测方法，并利用组培快繁技术或种子直播育苗固定杂种优势，迅速获得数量巨大的F1代杂种株系。该方法既可以确定种质材料是否符合白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)基原植物，避免种间混杂，又减少大量的人工测配及田间配合力鉴定时间，大大加快了白及杂种优势利用的进程。

附图说明

图1为基于psbA-trnH序列的白及属植物系统发育树；

图2 为基于psbA-trnH序列的白及居群系统发育树；

图3为扩增反应程序最终选定的参数；

其中，皖白及1号（AH(1)）、贵州白及（GZ(1)）、贵州野生小白及（GZ(2)）、湖北白及（HB(1)）、湖北黄花白及（HB(2) ）、湖南白及（HN(1)）、良宝大白及1号（LB(1)）、浙江白及（ZJ(1)）、陕西黄花白及（SX(1)）、镇沅野生小白及（ZY(1) ）、标尺表示遗传距离。

具体实施方式

我们采集安徽、湖北、湖南、贵州、云南、重庆等不同来源地36份居群样本，通过表型比较和4个候选DNA条形码（rbcL，matK，psbA-trnH，ITS2）的扩增效率、种内/种间遗传变异以及barcoding gap，确定psbAtrnH为白及属通用条形码，得出一套成熟的技术方法，并应用于白及种内杂种优势类群鉴定。

本发明的基于psbA-trnH序列分析结合重要表型性状选择的白及杂种优势预测方法，包括：

（1）居群来源分类：按照原生境来源，如湖北、湖南省张家界、重庆市铜梁县、云南省蒙自市等，划分白及不同居群（品种）。

（2）亲本类别分类：测定上述白及不同居群（品种）材料的重要表型性状，并按照下述标准将亲本材料划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3个类别（以3年生植株为准）：

①假鳞茎个数

Ⅰ类≥20个、15个≤Ⅱ类≤19个、Ⅲ＜15个；

②假鳞茎直径：

Ⅰ类≥35mm、25 mm≤Ⅱ类＜35mm、Ⅲ＜25mm；

③假鳞茎指状分枝的长/宽比：

Ⅰ类≤1.5、1.5＜Ⅱ类≤1.8、Ⅲ类＞1.8；

④假鳞茎厚度：

Ⅰ类≥20mm、15mm≤Ⅱ类＜20 mm、Ⅲ类＜15mm；

⑤倒数第一、第二片叶片的夹角

Ⅰ类≤40°、40°＜Ⅱ类≤55°、Ⅲ类＞55°；

⑥倒数第二叶叶片中部宽度

Ⅰ类≥60mm、40mm≤Ⅱ类＜60 mm、Ⅲ类＜40mm。

上述指标中，其权重依次是假鳞茎个数＞假鳞茎直径＞假鳞茎指状分枝的长/宽比＞假鳞茎厚度＞倒第一、直叶片的夹角＞倒数第二叶叶片中部宽度。

（3）采用CTAB法或商品试剂盒从白及种质资源材料中分离提取叶片总DNA。

（4）选择psbA-trnH引物并合成，将引物稀释为50µM，置于-20℃冰箱保存。

（5）PCR扩增特异区段，采用20 µl的PCR反应体系，组成如下：

10×PCR Buffer（含Mg²⁺） 2.0 µl

dNTP（10 mmol/L） 0.3 µl

上、下游引物（50µmol/L）各 0.06 µl

Taq酶（5U/µl） 0.2 µl

模板DNA 1 µl （约20 ng）

补双蒸水至20 µl

混匀后，置于PCR仪上进行扩增，扩增反应程序最终选定的参数如图3所示。

（6）采用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR扩增产物，双向测序，双向测序后的一个一个的基因片段，用相关软件直接进行序列连接。或者先将逆向测定序列转换为它的反向互补序列，再和正向序列进行比较，找到两者的重叠序列，剔除反向互补序列中的重叠部分，将其余的连接带正向序列之后即可得到拼接序列。常用的序列拼接软件包括Unix平台的 Phrap、Cap3，Windows平台的 Sequencher、CodonCode Alingner、Genious和 DNA Star等。

（7）得到的DNA条形码序列，在ncbigenbank数据库上与公布的标准序列进行比对，可以确定种质资源材料其基原是否与其基原植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)相符，避免因种间杂交导致后代成为伪品白及。

（8）采用MEGA计算序列间的遗传距离，采用罗杰斯距离（RD）或改良的罗杰斯距离（MRD）（Rogers，1972；Goodman & Stuber，1983）来确定相关种质的亲缘关系。

（9）以亲缘关系最远的两个居群（或品种）为基本材料，结合上述重要表型性状假鳞茎直径、假鳞茎指状分枝的长/宽比、假鳞茎厚度、倒数第一与第二叶片的夹角、倒数第二叶叶片中部宽度，依据这些性状的权重最终确定双亲。

（10）一般以重要表型性状突出的亲本为母本，相应的另一方为父本，母本经人工去雄后授粉，得到杂种F1代蒴果。

（11）蒴果荚色变黄褐色且面积超过种荚的2/3以上时，采收杂种蒴果，经组培快繁或者进行种子直播育苗，能方便地固定杂种优势，其F1代杂种种苗供生产应用。

（12）白及蒴果种子量很大，对种荚数量的需求不多，且人工去雄授粉方便、容易，可以每年在种圃进行杂交获得杂种蒴果，也可以把优良杂种一代的植株组织或体细胞进行离体培养，其F1代种苗供生产使用，以代替年年杂交制种方法。

按照上述方法，我们选择了皖白及1号（AH）、贵州白及（GZ）、湖北白及（HB）、湖南白及（HN）、浙江白及（ZJ）、良宝大白及1号（LB）等6个品种（居群），其中：皖白及1号（AH）和良宝大白及1号（紫花，LB）为省级鉴定（登记）品种，其余4个分别为贵州、湖北、湖南、浙江等地白及居群的株系。同时，引入2个小白及和1个黄花白及居群作为对照。将6个白及品种（居群）两两杂交，获得共计21个不同组合的 F1代杂种蒴果，经组培快繁育苗，再将6个白及品种（居群）亲本材料及其F1代杂种材料按照随机区组设计，3次重复种植于田间，F1代杂种移栽3年后，观察和测定假鳞茎个数、假鳞茎直径、假鳞茎指状分枝的长/宽比、假鳞茎厚度、倒数第一和第二片叶片之间的夹角、倒数第二叶叶片中部宽度等重要表型性状。与此同时，提取6个白及品种（居群）、2个小白及居群、1个黄花白及居群的叶片DNA，利用psbA-trnH序列分析比较亲本材料之间的亲缘关系，根据分子标记遗传距离并结合重要表型性状选择预测白及杂种优势。结果发现：

（1）利用psbA-trnH序列分析可以明确区分白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.)、小白及(Bletilla formosana(Hayata)Schltr.)和黄花白及(Bletillaochracea Schltr.)3个种，其中白及的6个品种（居群）单独为一大类，小白及和黄花白及为另一大类（附图1）。由此可见，基于psbA-trnH序列分析可以很好的将亲缘关系较远的白及属不同种很好的区分开来，也可以将亲缘关系较近的种内品种（居群）区分，这样可以避免种间杂交，造成后代种源混乱的现象。

（2）白及的6个品种（居群）之间，其遗传距离不尽相同，大体上可以分为2个大类，其中：良宝大白及1号、皖白及1号、湖北居群为第一大类，浙江居群、贵州居群和湖南居群则为第二大类。良宝大白及1号与皖白及1号、湖南居群与贵州居群的亲缘关系最接近（附图2）。

（3）白及存在明显的杂种优势，21个组合6个性状的中亲优势（MPH）平均值分别为：假鳞茎个数27.6%、假鳞茎直径21.5%、假鳞茎指状分枝的长/宽比16.9%、假鳞茎厚度15.6%、倒数第一和第二片叶片之间的夹角26.6%、倒数第二叶叶片中部宽度6.8%。其中：假鳞茎个数、假鳞茎直径、倒数第一和第二片叶片之间的夹角、假鳞茎厚度绝大多数组合杂种优势为正优势，而假鳞茎指状分枝的长/宽比和倒数第二叶叶片中部宽度的多数组合为负优势。

（4）21个组合6个性状的超亲优势（BPH）平均值分别为：假鳞茎个数12.4%、假鳞茎直径9.5%、假鳞茎指状分枝的长/宽比6.7%、假鳞茎厚度5.6%、倒数第一和第二片叶片之间的夹角14.5%、倒数第二叶叶片中部宽度2.7%。其中：假鳞茎个数、假鳞茎直径、倒数第一和第二片叶片之间的夹角、假鳞茎厚度绝大多数组合杂种优势为正优势，而假鳞茎指状分枝的长/宽比和倒数第二叶叶片中部宽度的多数组合为负优势。

（5）通过对psbA-trnH序列分析遗传距离与特殊配合力相关分析、遗传距离与杂种F1代表现及杂种优势的相关性分析发现：亲本遗传距离与假鳞茎个数、假鳞茎直径、假鳞茎指状分枝的长/宽比、假鳞茎厚度等的杂种表现显著相关；与倒数第一和第二片叶片之间的夹角、倒数第二叶叶片中部宽度的相关性未达到显著水平；特殊配合力与产量中亲优势（r1=0.4653）、亲本遗传距离（r2=0.4786）之间相关性达显著水平，说明亲本遗传距离的大小能够反映特殊配合力。

（6）我们以遗传距离和重要表型性状的分类为标准进行亲本选择，按照附图2中的遗传距离，以及假鳞茎个数、假鳞茎直径、假鳞茎指状分枝的长/宽比、假鳞茎厚度、倒数第一和第二片叶片之间的夹角、倒数第二叶叶片中部宽度等重要性状的分类方法，选择单株进行杂交组配，良宝大白及1号×浙江居群、良宝大白及1号×湖南居群、皖白及1号×贵州居群等3对组合杂种F1代产量中亲优势分别为28.6%、30.5%和27.8%。

5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC3'，

5'- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 3'

Claims

1.一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型形状选择的白及杂种优势预测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）按照原生境来源划分白及种质资源材料；

（3）从白及种质资源材料叶片中分离提取DNA；

2.根据权利权利要求1所述的一种基于psbA-trnH序列分析结合重要表型形状选择的白及杂种优势预测方法，其特征在于，所述psbA-trnH分子标记引物的上、下游序列分别为

5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC3'，

5'- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC 3'。

3.一种如权利要求1所述的基于psbA-trnH序列分析的白及杂种优势预测方法在白及生产上的应用。