CN107037117A - 一种幽门螺杆菌的快速鉴定及毒力分析方法 - Google Patents

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陈飞
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杨峰
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Abstract

本发明提供的幽门螺杆菌(H.pylori)的快速鉴定及毒力分析方法，包括以下步骤：(1)：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对H.pylori标准菌株、临床分离菌株进行特征性鉴定，得到数据；(2)：使用MALDI‑Biotyper和ClinProTools软件对所述的数据进行处理分析用于区分H.pylori菌株不同的毒力。以期作为一种快速、准确、高效及低成本的H.pylori鉴定和毒力的新型诊断方法，提高MALDI‑TOF MS确定H.pylori菌株的毒力的能力，为预测胃肠道疾病的发展以及指导临床采用合理的干预措施提供可靠依据。

Description

一种幽门螺杆菌的快速鉴定及毒力分析方法
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及幽门螺杆菌的快速鉴定及毒力分析方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种主要寄生在人体胃部的杆状革兰阴性菌，H.pylori感染是萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的重要危险因素。目前H.pylori鉴定和毒力检测有以下方法：1)生化鉴定；2)组织病理切片染色法；3)尿素呼气试验(Urea Breath Test,UBT)；4)快速尿素酶实验(Rapid ureasetest,RUT)；5)常规核酸分析法：包括测序、PCR、寡核苷酸探针杂交等。生化鉴定法耗时长，准确性低；组织病理切片染色法受H.pylori载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测；尿素呼气试验费用高、易受抑菌药物和抑酸药物的影响、敏感度低；快速尿素酶实验反应结果受到标本中H.pylori密度、环境温度以及反应较弱时缺乏明确客观的判断标准等影响，敏感性、特异性和准确性均较低；常规核酸分析法，通量小，成本较高，对操作者的要求比较高。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种快速、准确、高效及低成本的H.pylori的快速鉴定及毒力分析方法。
本发明提供的H.pylori的快速鉴定及毒力分析方法，包括以下步骤：
(1)：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对H.pylori标准菌株、临床分离菌株进行特征性鉴定，得到数据；
(2)：使用MALDI-Biotyper和ClinProTools软件对所述的数据进行处理分析用于区分H.pylori菌株不同的毒力。
同时，通过系统地比对和优化，确定了采用70％甲酸作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定前的预处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
其为一种快速、准确、高效及低成本的H.pylori鉴定和毒力的新型诊断方法，能够提高MALDI-TOF MS确定H.pylori菌株的毒力的能力，预测胃肠道疾病的发展以指导临床采用合理的干预措施，早期根治高危型的H.pylori感染，预防和治疗H.pylori感染相关疾病。
附图说明：
图1为本发明实施例在使用不同试剂处理菌种后后获得的图谱。
图2为本发明实施例37株临床H.pylori菌株和7株标准H.pylori菌株聚类分析图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
实施例
1 材料
1.1 样本来源
2016年1月至2016年7月在华东医院就诊的且需行胃镜检查的胃十二指肠疾病患者350例，其中男性185例，女性165例，平均年龄(50.3±13.8)岁。
1.2 对照菌株
对照菌株为一株经形态学和生化鉴定、并经16S rRNA测序确认的临床菌株。
1.3 材料与试剂
1.4 仪器与设备
其他：数据采集软件为德国布鲁克道尔顿公司的FlexControl；鉴定软件为德国布鲁克道尔顿公司的MALDI Biotyper软件,图谱分析软件为德国布鲁克道尔顿公司的FlexAnalysis软件。
1.5 主要试剂的配制
1.5.1 混合抗生素工作液：用电子天平称量5mg甲氧苄氨嘧啶(TMP)加入到50mL灭菌蒸馏水中，搅拌混匀并加入2滴乳酸，加热煮沸。降至室温后加入万古霉素100mg,两性霉素B 3.8mg，多粘菌素B 20mg，混合均匀之后将混合抗生素溶液用0.45μm针筒滤器进行过滤，分装至灭菌EP管中,4℃保存备用。
1.5.2 H.pylori选择性培养基
(1)用电子天平称量30.5g哥伦比亚血琼脂干粉，在1000mL锥形瓶内溶于780mL蒸馏水中，用玻棒搅拌均匀，盖上橡胶塞。
(2)121℃，高温高压蒸汽灭菌20分钟。
(3)待温度降至70℃左右，将培养基转移至已到达设定温度的水浴锅内(50～55℃)，平衡2小时左右备用。
(4)向温度已降至52.5℃的培养基中添加3.9mL混合抗生素工作液，然后用5mL移液器向锥形瓶内加入70mLl新鲜无菌脱纤维羊血，混合均匀后将其倒入无菌空平板中，高度约4mm。
(5)待平板冷却凝固后放入4℃环境下冷藏待用，2周内使用完毕。
1.5.3 冻存液：用电子天平称量布氏肉汤干粉2.8g，溶解于70mL蒸馏水中，用量筒量取甘油30mL添加其中,用玻棒搅拌均匀后置入灭菌锅内高压蒸汽灭菌20分钟；待冻存液冷却至室温，分装于无菌冻存管中，每管分装的量大约1mL，4℃条件下保存备用。
1.5.4 基质液配置：取适量基质溶解液加入到CHCA基质中，配置成CHCA过饱和溶液，常温下保存备用；基质溶解液：50％超纯水，47.5％乙腈，2.5％三氟乙酸(TFA)。
2 方法
2.1 H.pylori的分离培养
征得患者同意并签署知情同意书后，由华东医院消化内镜室医师经胃镜用活检钳于近胃幽门部、胃窦部或病变临近处采集患者胃活检组织样本，置保存液(0.9％生理盐水)中及时送检(4h内)。胃粘膜组织经全自动研磨仪(65Hz，60s)充分研磨形成组织匀浆后，取100μL密集均匀涂布在H.pylori选择培养基上。在6％O2、10％CO2的微需氧条件下，35℃培养5～7天。剩余的组织匀浆置于-80℃冰箱保存。
2.2 H.pylori的鉴定
挑取在H.pylori选择性平板上生长的疑似菌落(圆形，无色半透明呈露滴状，直径约0.5～1mm)进行革兰染色镜检，显微镜下呈革兰阴性弧形、螺旋形、S形、海鸥形或者是弯曲短杆状，氧化酶和触酶均阳性、脲酶强阳性，根据上述的特征，即可判断为H.pylori。传代后培养48～72h，用无菌棉拭子刮取足量平板上的菌落，置于冻存液中-80℃冻存。
2.3 H.pylori菌株的复苏
将-80℃冻存的菌株恢复至室温后，取100μL菌液接种于H.pylori选择性平板上均匀涂布，在6％O2、10％CO2的条件下，35℃培养3～5天。
2.4 细菌基因组总DNA抽提
(1)取适量平板上生长的H.pylori菌落转移至含有1mL无菌生理盐水的Ep管内，13000rpm离心60s，收集菌体沉淀；
(2)参照北京天根公司细菌DNA抽提试剂盒说明书中的步骤抽提细菌基因组总DNA；
(3)将提取好的H.pylori总DNA收集到离心管中；用NanoDrop分光光度计测量其浓度和纯度后放入-20℃保存备用，以进行后续的PCR反应。
2.5 H.pylori鉴定基因16S rRNA和毒力基因dupA的扩增与测序
引物序列16S rRNA(正向引物:TCTAACGAATAAGCACCGGC TA；反向引物:GTGCAGCACCTGTTTTCAAGG)，扩增长度为576bp；dupA(正向引物：AGCGACTCTTTTA GCTGAGATT；反向引物：GGACTTTCTATGATAA ATACGCAGT),扩增长度为1940bp。以H.pylori临床分离株总DNA为模板，用以上引物进行PCR扩增反应。总反应体系为25μL，模板DNA为1μL。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃预变性30s，52～60℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。然后将获得的PCR产物进行进行基因测序(上海桑尼生物科技公司)，测序结果与NCBI基因库进行比对，选择符合率＞99％的为鉴定结果。
2.6 检测前处理条件的优化
采用70％甲酸、甲酸和乙腈(1：1)、50％异丙醇(含有0.1％三氟乙酸)和ddH2O(阴性对照)，对临床菌株进行前处理(每个检测样本添加1μL的前处理试剂)，自然干燥后，进行质谱分析，比较上述不同试剂的细菌前处理能力，以选择H.pylori最佳的前处理方法。
2.7 H.pylori样本准备及MALDI-TOF MS分析
Microflex LT仪器参数设置为：线性阳离子模式，N2激光，λ＝355nm，脉冲持续时间：150ns，激光频率为200Hz，采集的质量范围为m/z＝2000-20,000Da，每张图谱采集200个shots。在进行检测前，用细菌实验标本品(BTS)进行外部校准，校准后的误差小于200ppm。然后用FlexAnalysis软件查看获得的图谱，评价图谱的质量。
临床分离菌株样品按照以下程序进行制备：用竹签挑取在哥伦比亚血琼脂上生长良好的H.pylori菌落，然后将其均匀涂布在靶板上，将1μL预处理试剂覆盖在样品上，在室温下完全干燥后，向靶板中加入1μLCHCA基质液并在常温下干燥。处理好的样品随后进行MALDI-TOF MS分析。每个样本做2个复孔，每个样本孔采集≥3张质谱图。FlexControl(Bruker Daltonics，Germany)软件用于获取质谱图。
2.8 细菌鉴定结果解读
MALDI Biotyper：使用Biotyper软件将获得的质谱图与参考图谱数据库进行比对，判断标准采用厂商的标准：分值≥2.000表示鉴定到种水平，分值为1.700～1.999表示鉴定到属水平，分值＜1.700表示未鉴定。
2.9 建立参考数据库
本发明MALDI Biotyper平台上建立了参考数据库用于临床H.pylori的鉴定:使用Biotyper 3.1软件对37株临床H.pylori分离株构建主图谱预测(Main spectralprojection,MSP)。MSP的构建基于平滑，基线减法，正常化，和峰值抓取处理后的原始图谱。每个菌株获得6张原始图谱用于构建一个MSP，共得到37个MSPs。将所有新建的MSP添加到Biotyper参考数据库中。软件参数为默认设置。
2.10 MALDI-TOF MS用于H.pylori毒力分析模型(dupA+/dupA-)的建立
MSP Dendrogram是一种在各种规模均能进行的通过创建一个集群功能树或树状图的分组方法。用44张MSPs(包括原始数据库中的7张MSPs和来自临床分离株的37张MSPs)建立MSP Dendrogram。基于MSP Dendrogram的结果，具有共同特征的菌株可以被分到同一个组。然后基于MSP Dendrogram的分组结果，使用ClinProTools建立毒力分类模型以区分dupA(+)/dupA(-)临床H.pylori分离株。ClinProTools软件主要操作设置如下：信噪比(S/N)的阈值设置为5，相对强度阈值为1.5％，用于区分的峰的个数设置为10。
结果
1.H.pylori的分离鉴定结果
为了构建新的参考数据库和毒力分析模型，从350例临床活检样本中共分离出68株H.pylori菌株，总的阳性分离率为19.4％。所有的H.pylori临床分离株均对其高度保守和稳定的基因16SrRNA进行测序确认。其中31株H.pylori菌株用于建立MALDI-TOF MS参考数据库和毒力类型(dupA+/dupA-)分析模型,其余37株用于评估参考数据库和毒力类型(dupA+/dupA-)分析模型的临床应用能力。
2.H.pylori毒力基因dupA鉴定
共有37株H.pylori菌株被添加到Biotyper原始数据库中并用于建立MSPDendrogram和ClinProTools毒力类型(dupA+/dupA-)分析模型，其中，24株为dupA阳性，13株为dupA阴性。所有菌株的遗传和临床背景见表1-1。
表1-1 临床H.pylori菌株的临床和基因背景
注：CAG：慢性萎缩性胃炎；N：非萎缩性胃炎；DU：十二指肠溃疡；GU：
胃溃疡；Hp：幽门螺杆菌。
3.细菌前处理条件的优化结果
MALDI Biotyper:1株已知遗传背景的临床H.pylori分离株被用于MALDI-TOF MS检测预处理条件的优化。图1显示了在使用不同试剂处理后获得的图谱：无处理、ddH2O、50％异丙醇(含有0.1％TFA)、70％甲酸和乙腈(1:1)和70％甲酸。与其他三种预处理试剂相比，70％甲酸处理后获得的图谱显示了最高的峰强度和最多的H.pylori特异性峰。此外，在16000Da后的位置依然可以观察到离子峰。因此，70％甲酸作为优化的预处理试剂用于H.pylori后续的MALDI-TOF MS检测。
注：MALDI-TOF分析前加入各种预处理试剂用于优化检测效率。图2显示了每种试剂处理后获得的图谱。70％甲酸处理后可以获得最佳的图谱。m/z：质荷比；MALDI基质：α-CHCA。
4.H.pylori菌株参考数据库和毒力类型(dupA+/dupA-)分析模型的建立
MALDI Biotyper参考数据库：37株临床H.pylori分离株被加入到原有数据库中，每株H.pylori菌株采集六张图谱，然后将其用于构建一个MSP，共获得37张MSPs加入到Biotyper数据库中。
MSP Dendrogram的建立：7株H.pylori标准菌株和37株临床H.pylori分离株构建了一张MSP Dendrogram。基于它们的亲缘性远近可以将这些菌株分成几个不同的组。原始Biotyper数据库中的7株标准菌株中有6株被分为一个单独的组，如图2所示。37株临床H.pylori分离株中的30株被分为2组：组1(10株)和组2(20株)，每个组可分为2个亚组：组1-1(G1-1)，组1-2(G1-2)，组2-1(G2-1)和组2-2(G2-2)。G1-2和G2-1中菌株导致十二指肠/胃溃疡的比例显著高于G1-1和G2-2(90％vs 10％)。相应地，G1-2和G2-1中的dupA(+)分离株的数目也显着高于G1-1和G2-2(85％vs 20％)。这种现象表明dupA(+)和dupA(-)菌株可能存在着不同的图谱模式，并且与不同的临床特征相关。G1-1和G2-2组dupA(-)菌株比例较大，患有十二指肠溃疡的概率小，临床危险性低；G1-2和G2-1组dupA(+)菌株比例较大，患有十二指肠溃疡的概率大，临床危险性高，需要根除治疗。
注：MSP Dendrogram由MALDI Biotyper 3.1软件使用默认设置生成。37株临床分离株中的30株可被分为4组。G1-1：第1-1组；G1-2：第1-2组；G2-1：第2-1组；G2-2：第2-2组。其余的7株临床H.pylori分离株和7株标准菌株参考图谱为“其他”组；HP：幽门螺杆菌。
ClinProTools毒力类型(dupA+/dupA-)分析模型的建立：除了MSP Dendrogram，ClinProTools(v.3.0.22；Bruker Daltonics)被进一步用于建立毒力分类模型以区分dupA(+)和dupA(-)临床H.pylori分离株。24株dupA(+)分离株和13株dupA(-)分离株用于创建分类模型。由遗传算法(Genetic Algorithm,GA)建立ClinProTools模型获得的用于分类dupA(+)和dupA(-)菌株的10个谱峰的质荷比(Mass to Charge Ratio,m/z)为:7767、8391、7286、6069、2789、6272、7668、13880、6554和14019。使用FlexAnalysis软件进一步确认发现，m/z＝8391、7286和7684为dupA(-)菌株的特异峰，m/z＝7767和14019为dupA(+)菌株的特异峰。ClinProTools所建立的遗传算法模型的识别能力(Recognition Capability，RC)为99.29％,交叉验证能力(Cross Validation,CV)为94.32％，表明了dupA(+)/dupA(-)临床H.pylori分离株可以被较好地区分。RC是指模型能正确分类用于建立模型的图谱的能力的一种度量。它通过检测用于相对于模型本身用于建立模型的每个图谱并将能正确分类的图谱数除以总数来计算。VC是模型可靠性的一种度量，并可用于预测其未来性能。它是通过将建立模型的图谱随机分成模型子集和测试子集来进行计算的。该过程重复多次以计算出一个归一化的交叉验证值。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
其为一种快速、准确、高效及低成本的H.pylori鉴定和毒力的新型诊断方法，能够提高MALDI-TOF MS确定H.pylori菌株的毒力的能力，预测胃肠道疾病的发展以指导临床采用合理的干预措施，早期根治高危型的H.pylori感染，预防和治疗H.pylori感染相关疾病。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (2)

1.一种幽门螺杆菌(H.pylori)的快速鉴定及毒力分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)：采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对H.pylori标准菌株、临床分离菌株进行特征性鉴定，得到数据；
(2)：使用MALDI-Biotyper和ClinProTools软件对所述的数据进行处理分析用于区分H.pylori菌株不同的毒力。
2.根据权利要求1所述的H.pylori的快速鉴定及毒力分析方法，其特征在于，通过系统的比对和优化，采用70％甲酸作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定前的预处理。
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