CN107025385B - 一种环状rna引物的设计方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种设计环状RNA引物的方法，目前针对环状RNA设计的背靠背引物并没有统一的规定，常用的方法需要在word文档上对序列做反复的拼接，且还要在primer premier 5软件上算连接点的位置，一方面容易在繁杂的过程中出错，出错又不容易发现，另一方面繁杂的设计过程增加时间负担。而本发明的设计方法简单有效，既节省设计时间，又容易学习不容易出错。

Description

一种环状RNA引物的设计方法

技术领域

本发明涉及一种设计方法，具体涉及一种环状RNA引物的设计方法。

背景技术

环状RNA(circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA，具有闭合环状结构，与线性RNA不同的是，circRNA没有3'或5'端，也没有多聚A尾等结构，有保守序列，结构稳定，目前的研究证实了环状RNA在转录后水平的调控起到重要作用。

由于circRNA和线性RNA具有相同的核苷酸序列，如果在PCR过程中利用传统的方法设计引物，则会把两者的序列都扩增出来。因此目前解决这个问题的方法就是RNA首尾连接处设计背靠背引物，即使上游引物和下游引物是呈背靠背反方向扩增(传统的引物是上游引物和下游引物的扩增方向呈面对面扩增)。但目前最常用的设计方法就是找出序列后，先在word文档打开，在序列5端和3端各找数百碱基的序列，然后3端的序列和5端序列连接后形成一段新的序列，计算出连接点所在的位点，再用primer premier 5软件设计，方法十分繁杂。所以申请人为解决这现状，发明一种更加简单容易的设计方法。

发明内容

目前环状RNA(circ-RNA)是医学研究的热门领域，但是circ-RNA的引物的具体设计方法并没有明确具体的报道，大多数的研究者的设计方法较为繁琐复杂。本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种设计环状RNA引物的方法，既满足环状RNA背靠背引物的特点，又简单容易操作。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种环状RNA引物的设计方法，所述设计方法包括以下步骤：

(1)在数据库中查找目的环状RNA的DNA序列；

(2)取两条查找到的DNA序列，将其中一条DNA序列的3’端与另一条DNA序列的5’端连接，形成一条新的DNA序列；

(3)在新的DNA序列上距离步骤(2)中3’端与5’端连接处300个碱基的区域内分别设计目的环状RNA的上游引物和下游引物，所述上游引物位于所述新的DNA序列上所述连接处的上游，所述下游引物位于所述新的DNA序列上所述连接处的下游；

(4)将步骤(3)中设计的上游引物和下游引物分别进行BLAST，如果该上游引物和下游引物均不能扩增线性RNA分子，则为最终设计的引物。

优选地，所述步骤(1)中数据库为circBASE数据库。

优选地，所述步骤(3)中设计的软件为primer premier 5。

优选地，所述步骤(3)中上、下游引物长度分别为18-23bp。

优选地，所述步骤(3)中上、下游引物的扩增长度为70-300bp。

优选地，所述步骤(3)中上、下游引物的GC比例分别为40％-60％。

优选地，所述步骤(1)中目的环状RNA为hsa_circ_0001727。

本发明提供了一种采用上述所述方法设计的引物。

优选地，所述引物包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种设计环状RNA引物的方法，目前针对环状RNA设计的背靠背引物并没有统一的规定，常用的方法需要在word文档上对序列做反复的拼接，且还要在primer premier 5软件上算连接点的位置，一方面容易在繁杂的过程中出错，出错又不容易发现，另一方面繁杂的设计过程增加时间负担。而本发明的设计方法简单有效，既节省设计时间，又容易学习不容易出错。

附图说明

图1为本发明实施例1中环状RNA的线性RNA示意图；

图2为本发明实施例1中环状RNA的示意图；

图3为本发明实施例1中两条相同的RNA序列连接形成新的RNA序列前的示意图；

图4为本发明实施例1中两条相同的RNA序列连接形成新的RNA序列后的示意图；

图5为本发明实施例1中设计环状RNA引物的流程图；

图6为本发明实施例1中分别以阴性对照组和实验组为模板采用ZKSCAN1(线性RNA)的引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和采用本发明设计的环状RNA引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增的结果；

图7为本发明实施例1中分别采用线性RNA的引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和本发明设计的环状RNA的引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)并以逆转录产物为模板做普通PCR的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、环状RNA引物设计原理：

如图1和2所示，若设计图一的背靠背引物时，由于PCR往两边扩增，并不能扩增出线性RNA的任何片段。但是对于环状RNA来说，此类背靠背引物相对来说，就是面对面的引物了，故而可以扩增出来上下游引物之间的cDNA片段，即可以扩增出首尾相接的那段序列。总结来说，背靠背引物是只能扩增环状RNA而不会扩增线性RNA的引物。故我们要设计的方法就是如何有效快捷地设计环状RNA的背靠背引物。

2、本发明环状RNA引物设计方案：

(1)以hsa_circ_0001727这个环状RNA为例，在circBASE找出环状RNA的DNA序列(由circBASE数据库可知该环状RNA的DNA序列含889个碱基)，序列如下(SEQ ID NO:1)：

GAATAGTAAAGAAACACATCATAAAACCTCCCAGGACATAAAGGTGAGCACAGACCCTGTTTGGATCAAGTCAGTTCCTGGAGCCTGAATGATGACTGCTGAATCACGGGAAGCCACGGGTCTGTCCCCACAGGCTGCACAGGAGAAGGATGGTATCGTAATAGTGAAGGTGGAAGAGGAAGATGAGGAAGACCACATGTGGGGGCAGGATTCCACCCTACAGGACACGCCTCCTCCAGACCCAGAGATATTCCGCCAACGCTTCAGGCGCTTCTGTTACCAGAACACTTTTGGGCCCCGAGAGGCTCTCAGTCGGCTGAAGGAACTTTGTCATCAGTGGCTGCGGCCAGAAATAAACACCAAGGAACAGATCCTGGAGCTTCTGGTGCTAGAGCAGTTTCTTTCCATCCTGCCCAAGGAGCTCCAGGTCTGGCTGCAGGAATACCGCCCCGATAGTGGAGAGGAGGCCGTGACCCTTCTAGAAGACTTGGAGCTTGATTTATCAGGACAACAGGTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAGGTCCCAGGTCAAGTTCATGGACCTGAGATGCTCGCAAGGGGGATGGTGCCTCTGGATCCAGTTCAGGAGTCCTCGAGCTTTGACCTTCATCACGAGGCCACCCAGTCCCACTTCAAACATTCGTCTCGGAAACCCCGCCTCTTACAGTCACGAG

(2)将两条相同的上述序列，3’和5’连接在一起，变成新的一条序列，如下所示(SEQ ID NO:2)：

GAATAGTAAAGAAACACATCATAAAACCTCCCAGGACATAAAGGTGAGCACAGACCCTGTTTGGATCAAGTCAGTTCCTGGAGCCTGAATGATGACTGCTGAATCACGGGAAGCCACGGGTCTGTCCCCACAGGCTGCACAGGAGAAGGATGGTATCGTAATAGTGAAGGTGGAAGAGGAAGATGAGGAAGACCACATGTGGGGGCAGGATTCCACCCTACAGGACACGCCTCCTCCAGACCCAGAGATATTCCGCCAACGCTTCAGGCGCTTCTGTTACCAGAACACTTTTGGGCCCCGAGAGGCTCTCAGTCGGCTGAAGGAACTTTGTCATCAGTGGCTGCGGCCAGAAATAAACACCAAGGAACAGATCCTGGAGCTTCTGGTGCTAGAGCAGTTTCTTTCCATCCTGCCCAAGGAGCTCCAGGTCTGGCTGCAGGAATACCGCCCCGATAGTGGAGAGGAGGCCGTGACCCTTCTAGAAGACTTGGAGCTTGATTTATCAGGACAACAGGTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAGGTCCCAGGTCAAGTTCATGGACCTGAGATGCTCGCAAGGGGGATGGTGCCTCTGGATCCAGTTCAGGAGTCCTCGAGCTTTGACCTTCATCACGAGGCCACCCAGTCCCACTTCAAACATTCGTCTCGGAAACCCCGCCTCTTACAGTCACGAGGAATAGTAAAGAAACACATCATAAAACCTCCCAGGACATAAAGGTGAGCACAGACCCTGTTTGGATCAAGTCAGTTCCTGGAGCCTGAATGATGACTGCTGAATCACGGGAAGCCACGGGTCTGTCCCCACAGGCTGCACAGGAGAAGGATGGTATCGTAATAGTGAAGGTGGAAGAGGAAGATGAGGAAGACCACATGTGGGGGCAGGATTCCACCCTACAGGACACGCCTCCTCCAGACCCAGAGATATTCCGCCAACGCTTCAGGCGCTTCTGTTACCAGAACACTTTTGGGCCCCGAGAGGCTCTCAGTCGGCTGAAGGAACTTTGTCATCAGTGGCTGCGGCCAGAAATAAACACCAAGGAACAGATCCTGGAGCTTCTGGTGCTAGAGCAGTTTCTTTCCATCCTGCCCAAGGAGCTCCAGGTCTGGCTGCAGGAATACCGCCCCGATAGTGGAGAGGAGGCCGTGACCCTTCTAGAAGACTTGGAGCTTGATTTATCAGGACAACAGGTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAGGTCCCAGGTCAAGTTCATGGACCTGAGATGCTCGCAAGGGGGATGGTGCCTCTGGATCCAGTTCAGGAGTCCTCGAGCTTTGACCTTCATCACGAGGCCACCCAGTCCCACTTCAAACATTCGTCTCGGAAACCCCGCCTCTTACAGTCACGAG

(3)用primer premier 5软件设计引物：把上述的新序列放入primer premier 5软件，设置条件为：上游引物位置：589-889(即n-300到n之间)；下游引物位置：889-1189(即n到n+300之间)；引物长度：18-23bp；扩增长度：70-300bp；GC比例40％-60％；根据上述条件搜索条件搜索出来的引物(扩增产物长度为234bp)：

上游引物(5’-3’)：AGTCCCACTTCAAACATTC(SEQ ID NO:3)；

下游引物(5’-3’)：TCTTCCTCTTCCACCTTC(SEQ ID NO:4)。

(4)引物BLAST：把上述引物用网页BLAST进行搜索，明确该引物不能扩增出线性RNA分子及其他RNA分子，则该引物为我们最终设计的引物。

(5)验证设计的引物能扩增环状RNA而不是线性RNA：

RNase R是一种只能消化线性RNA而不能消化环状RNA的试剂。因此该法设计的引物只要能检测出环状RNA能不被Rnase R消化这个事实，而且扩增出来条带大小与预期一致，则说明该引物确实是能扩增出环状RNA

实验方法：ZKSCAN1的扩增引物：上游引物为AATCTCAGTAGGGACAACAGG(SEQ ID NO:5)，下游引物为GCATGACAACTCCGAACA(SEQ ID NO:6)，扩增条带大小为134bp，取RNA总量为20ug的样品(其中包括ZKSCAN1(线性RNA)和hsa_circ_0001727(环状RNA))，平均分成两份(即每份有10ug RNA)，两份RNA均用DEPC水补充体积到17ul，再用2ul 10×Rnase R反应缓冲液补充至19ul。此后一份RNA样本用1ul水补充作为阴性对照组，另外一份样本用1ul 20×Rnase R溶液(广州吉赛生物有限公司购买)作为实验组，在37℃水浴锅加热15分钟，85℃加热5分钟。用上述两份处理后的标本做qRT-PCR实验，利用-△△t法算出实验组的特定的线性RNA及环状RNA的量较阴性对照组是否有变化。实验结果如图6所示，图6中左边的柱状图是分别以阴性对照组和实验组为模板采用ZKSCAN1(线性RNA)的引物(SEQ ID NO:5和SEQID NO:6)扩增的结果，从RNA表达量变化可以看出，线性RNA被Rnase R基本消化完全，图6中右边的柱状图是分别以阴性对照组和实验组为模板采用本发明设计的环状RNA引物(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增的结果，从RNA表达量变化可以看出，本发明设计的环状RNA引物能够扩增环状RNA hsa_circ_0001727并且只能扩增环状RNA hsa_circ_0001727，不能扩增线性RNA，因为如果本发明设计的环状RNA引物能够扩增线性RNA的话，以阴性对照组为模板采用本发明设计的环状RNA引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增的RNA表达量会大大高出实验组为模板采用本发明设计的环状RNA引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)扩增的RNA表达量(由于实验组的GAPDH会被消化，所以对照组和实验组均选用对照组的GADPH表达量作为内参)。

实验方法：阴性对照组和实验组如上图试验方法。用两份标本做逆转录，分别采用线性RNA的引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和本发明设计的环状RNA的引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)并以逆转录产物为模板做普通PCR(扩增方法根据不同公司的qPCR试剂盒而定)，扩增30个循环后取出扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示，观察结果：1、扩增条带的位置是否与设计引物时预期大小一致，如图7中右边两个泳道，has_circ_0001727的引物扩增约234bp，条带大小相符，说明引物设计可行；2、条带亮度：如图7中左边两个泳道，线性RNA对应的条带，用Rnase R处理后亮度会较弱，而环状RNA则亮度不变，说明本发明设计的引物确实是能扩增出环状RNA，并且不能扩增线性RNA。

3、本发明方法流程图如图5所示。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 龚畅、宋尔卫、梁格豪

<120> 一种环状RNA引物的设计方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2139

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

tggaaggagg caaaaccgga agaccttatg gattcaaaac ttagatgtgt gtttgaattg 60

ccagcagaga atgataaacc agtaagtata tttatagtta acaataattg aatgttgtaa 120

gctgatactt atttgcatac catttcctgc aaaaccaaga tttaagttgg caaattattt 180

tcctttatct gatgtctgaa gaaaaaaaat aagctgaagt cagcaaataa gtgggccttt 240

atgaaatcag cctttgaaaa actcacggaa agacaactga ttgacagtgt ttccccttga 300

aaagtgcagc ccgatggcca ttgagatgtc ataaatcctg aagagcttct gtggcctggc 360

aaaggtatag gttgctgtta aacagtgggt gagagtgaaa gagggaacaa tttgcccttt 420

atcatggtgg ttgatggacg tgtgggaagc tttcaagttc tcttgtttta caaagtgccc 480

tgtcagcctc cctacccctt ttaccctatc tacctcttca atcaaaggct gcttttagat 540

gaggatttct cagcctcaac actgttgata tttggggcaa atccttggtg gtggtggagg 600

ttgccctgtg tactgtaggg tgttttatta atagcagcat ccctggcttc tgccctcttg 660

atactggtag tacttcccag ttgtgacaac taaaaatgtc tccagatatt gccacatgtg 720

tcctggaggg caatatcaac ccccattgag agtgatccca ttccggtgtt gcctgtgggg 780

agaaggaagg agccccatcc tctaggctgt ccactgtgag cgctttacct ttcatgatcc 840

tcacttgtga ccagttgaag aaaggagact gtatctgaaa tgctaatttg gacttccctt 900

caacctagtc gaaaacattt taatttttat aaaaacacca aaactgtgaa agcatgcagc 960

atgtgaaact atcctagcca ttaatagctg gagttgggaa acagaagtac cctgaaatgt 1020

tgtgttaaca gtatctatgt tggtctgcgc gagtgctgtt gatttgtgtc aaaactacct 1080

gagattttat ttctgctgaa tcatttacca ctatcattac cctgtttctt taagtggata 1140

gtggtcattt tttccctctt cccagtgtac atcctgtcac aggaaggtca gtttggaagc 1200

tgtgaaagca gtattctggc ctcagctctg tgataggttg acttggtagc ctggggcctt 1260

gcttcacagg gcctactctt ctcatctgga aaatgatggg tagagctaga ttccaggcca 1320

atgatcgtca gttactcttt ccctgacaag ctgcgtgctt ccatgccctc cctccactga 1380

ctggctctca tcccctgtaa atctcaagag gggatcatag ctgaatcttg gcaggggaaa 1440

taaggggagt atgtaacttc ccaagattga aacattgcag acactgagtt tgtttcacct 1500

tcatcccagc ttccaaatgc taagttggta aagtaattcg ccctctgtct aatgctctcc 1560

caagcctcct aaccccacta aggcaatcct agggatgttc acatctttgt ggtgacagta 1620

atttgtggct aataattcct gagcttgcac aattacagta tgctgatttt tccgtggcag 1680

gaatttgata gtgcaatata cacagccctt tttctctttc tttgaagtat tagtctcagc 1740

cgaacttcat tatttgccct tatccataat ttctagggcc ctgttgcttt agattattaa 1800

gatatcagat aaagtaatcc atttttaaaa taaatgtgac attttacagt gtggatgaaa 1860

tgctaccacg tttggtgttt gctgagaact actttacttt gcataaaaaa gtccattatt 1920

acatggtcgg tgacacttag gctttcattt gtttttgaac agcatgatgt agaaataaat 1980

aaaattatat ccacaactgc atcaaagaca gaaacaccaa tagtgtctaa gtctctgagt 2040

tcttctttgg atgacaccga agttaagaag gttatggaag aatgtaagag gctgcaaggt 2100

gaagttcaga ggctacggga ggagaacaag cagttcaag 2139

<210> 2

<211> 4278

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggaaggagg caaaaccgga agaccttatg gattcaaaac ttagatgtgt gtttgaattg 60

ccagcagaga atgataaacc agtaagtata tttatagtta acaataattg aatgttgtaa 120

gctgatactt atttgcatac catttcctgc aaaaccaaga tttaagttgg caaattattt 180

tcctttatct gatgtctgaa gaaaaaaaat aagctgaagt cagcaaataa gtgggccttt 240

atgaaatcag cctttgaaaa actcacggaa agacaactga ttgacagtgt ttccccttga 300

aaagtgcagc ccgatggcca ttgagatgtc ataaatcctg aagagcttct gtggcctggc 360

aaaggtatag gttgctgtta aacagtgggt gagagtgaaa gagggaacaa tttgcccttt 420

atcatggtgg ttgatggacg tgtgggaagc tttcaagttc tcttgtttta caaagtgccc 480

tgtcagcctc cctacccctt ttaccctatc tacctcttca atcaaaggct gcttttagat 540

gaggatttct cagcctcaac actgttgata tttggggcaa atccttggtg gtggtggagg 600

ttgccctgtg tactgtaggg tgttttatta atagcagcat ccctggcttc tgccctcttg 660

atactggtag tacttcccag ttgtgacaac taaaaatgtc tccagatatt gccacatgtg 720

tcctggaggg caatatcaac ccccattgag agtgatccca ttccggtgtt gcctgtgggg 780

agaaggaagg agccccatcc tctaggctgt ccactgtgag cgctttacct ttcatgatcc 840

tcacttgtga ccagttgaag aaaggagact gtatctgaaa tgctaatttg gacttccctt 900

caacctagtc gaaaacattt taatttttat aaaaacacca aaactgtgaa agcatgcagc 960

atgtgaaact atcctagcca ttaatagctg gagttgggaa acagaagtac cctgaaatgt 1020

tgtgttaaca gtatctatgt tggtctgcgc gagtgctgtt gatttgtgtc aaaactacct 1080

gagattttat ttctgctgaa tcatttacca ctatcattac cctgtttctt taagtggata 1140

gtggtcattt tttccctctt cccagtgtac atcctgtcac aggaaggtca gtttggaagc 1200

tgtgaaagca gtattctggc ctcagctctg tgataggttg acttggtagc ctggggcctt 1260

gcttcacagg gcctactctt ctcatctgga aaatgatggg tagagctaga ttccaggcca 1320

atgatcgtca gttactcttt ccctgacaag ctgcgtgctt ccatgccctc cctccactga 1380

ctggctctca tcccctgtaa atctcaagag gggatcatag ctgaatcttg gcaggggaaa 1440

taaggggagt atgtaacttc ccaagattga aacattgcag acactgagtt tgtttcacct 1500

tcatcccagc ttccaaatgc taagttggta aagtaattcg ccctctgtct aatgctctcc 1560

caagcctcct aaccccacta aggcaatcct agggatgttc acatctttgt ggtgacagta 1620

atttgtggct aataattcct gagcttgcac aattacagta tgctgatttt tccgtggcag 1680

gaatttgata gtgcaatata cacagccctt tttctctttc tttgaagtat tagtctcagc 1740

cgaacttcat tatttgccct tatccataat ttctagggcc ctgttgcttt agattattaa 1800

gatatcagat aaagtaatcc atttttaaaa taaatgtgac attttacagt gtggatgaaa 1860

tgctaccacg tttggtgttt gctgagaact actttacttt gcataaaaaa gtccattatt 1920

acatggtcgg tgacacttag gctttcattt gtttttgaac agcatgatgt agaaataaat 1980

aaaattatat ccacaactgc atcaaagaca gaaacaccaa tagtgtctaa gtctctgagt 2040

tcttctttgg atgacaccga agttaagaag gttatggaag aatgtaagag gctgcaaggt 2100

gaagttcaga ggctacggga ggagaacaag cagttcaagt ggaaggaggc aaaaccggaa 2160

gaccttatgg attcaaaact tagatgtgtg tttgaattgc cagcagagaa tgataaacca 2220

gtaagtatat ttatagttaa caataattga atgttgtaag ctgatactta tttgcatacc 2280

atttcctgca aaaccaagat ttaagttggc aaattatttt cctttatctg atgtctgaag 2340

aaaaaaaata agctgaagtc agcaaataag tgggccttta tgaaatcagc ctttgaaaaa 2400

ctcacggaaa gacaactgat tgacagtgtt tccccttgaa aagtgcagcc cgatggccat 2460

tgagatgtca taaatcctga agagcttctg tggcctggca aaggtatagg ttgctgttaa 2520

acagtgggtg agagtgaaag agggaacaat ttgcccttta tcatggtggt tgatggacgt 2580

gtgggaagct ttcaagttct cttgttttac aaagtgccct gtcagcctcc ctaccccttt 2640

taccctatct acctcttcaa tcaaaggctg cttttagatg aggatttctc agcctcaaca 2700

ctgttgatat ttggggcaaa tccttggtgg tggtggaggt tgccctgtgt actgtagggt 2760

gttttattaa tagcagcatc cctggcttct gccctcttga tactggtagt acttcccagt 2820

tgtgacaact aaaaatgtct ccagatattg ccacatgtgt cctggagggc aatatcaacc 2880

cccattgaga gtgatcccat tccggtgttg cctgtgggga gaaggaagga gccccatcct 2940

ctaggctgtc cactgtgagc gctttacctt tcatgatcct cacttgtgac cagttgaaga 3000

aaggagactg tatctgaaat gctaatttgg acttcccttc aacctagtcg aaaacatttt 3060

aatttttata aaaacaccaa aactgtgaaa gcatgcagca tgtgaaacta tcctagccat 3120

taatagctgg agttgggaaa cagaagtacc ctgaaatgtt gtgttaacag tatctatgtt 3180

ggtctgcgcg agtgctgttg atttgtgtca aaactacctg agattttatt tctgctgaat 3240

catttaccac tatcattacc ctgtttcttt aagtggatag tggtcatttt ttccctcttc 3300

ccagtgtaca tcctgtcaca ggaaggtcag tttggaagct gtgaaagcag tattctggcc 3360

tcagctctgt gataggttga cttggtagcc tggggccttg cttcacaggg cctactcttc 3420

tcatctggaa aatgatgggt agagctagat tccaggccaa tgatcgtcag ttactctttc 3480

cctgacaagc tgcgtgcttc catgccctcc ctccactgac tggctctcat cccctgtaaa 3540

tctcaagagg ggatcatagc tgaatcttgg caggggaaat aaggggagta tgtaacttcc 3600

caagattgaa acattgcaga cactgagttt gtttcacctt catcccagct tccaaatgct 3660

aagttggtaa agtaattcgc cctctgtcta atgctctccc aagcctccta accccactaa 3720

ggcaatccta gggatgttca catctttgtg gtgacagtaa tttgtggcta ataattcctg 3780

agcttgcaca attacagtat gctgattttt ccgtggcagg aatttgatag tgcaatatac 3840

acagcccttt ttctctttct ttgaagtatt agtctcagcc gaacttcatt atttgccctt 3900

atccataatt tctagggccc tgttgcttta gattattaag atatcagata aagtaatcca 3960

tttttaaaat aaatgtgaca ttttacagtg tggatgaaat gctaccacgt ttggtgtttg 4020

ctgagaacta ctttactttg cataaaaaag tccattatta catggtcggt gacacttagg 4080

ctttcatttg tttttgaaca gcatgatgta gaaataaata aaattatatc cacaactgca 4140

tcaaagacag aaacaccaat agtgtctaag tctctgagtt cttctttgga tgacaccgaa 4200

gttaagaagg ttatggaaga atgtaagagg ctgcaaggtg aagttcagag gctacgggag 4260

gagaacaagc agttcaag 4278

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagttcagag gctacggg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgctggcaat tcaaacac 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatctcagta gggacaacag g 21

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcatgacaac tccgaaca 18

Claims (9)

1.一种环状RNA引物的设计方法，其特征在于，所述设计方法包括以下步骤：

(1)在数据库中查找目的环状RNA的DNA序列；

(2)取两条查找到的DNA序列，将其中一条DNA序列的3’端与另一条RNA序列的5’端连接，形成一条新的DNA序列；

(3)在新的DNA序列上距离步骤(2)中3’端与5’端连接处300个碱基的区域内分别设计目的环状RNA的上游引物和下游引物，所述上游引物位于所述新的DNA序列上所述连接处的上游，所述下游引物位于所述新的DNA序列上所述连接处的下游；

(4)将步骤(3)中设计的上游引物和下游引物分别进行BLAST，如果该上游引物和下游引物均不能扩增线性RNA分子，则为最终设计的引物。

2.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中数据库为circBASE数据库。

3.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的软件为primerpremier 5。

4.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中上、下游引物长度分别为18-23bp。

5.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中上、下游引物的扩增长度为70-300bp。

6.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(3)中上、下游引物的GC比例分别为40％-60％。

7.根据权利要求1所述的设计方法，其特征在于，所述步骤(1)中目的环状RNA为hsa_circ_0001727。

8.一种采用如权利要求1-7任一所述方法设计的引物。

9.根据权利要求8所述的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列。

Images