CN106999399A - 皮肤增白肽剂 - Google Patents

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C.康帕涅
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Abstract

本发明提供了可用作皮肤增白剂的新肽及其在美容或治疗应用中的用途。

Description

皮肤增白肽剂
发明领域
本发明涉及美容和医学领域，特别是皮肤病学领域。它提供了新的肽，其减少黑素细胞中黑色素的合成，因此可用作增白剂。
发明背景
色素沉着是由在皮肤、毛发和虹膜的色素上皮中最显著的黑色素的合成和分布引起的。因此，皮肤、毛发和眼睛的颜色主要取决于存在的色素的类型及其浓度。
黑色素是通过加成或缩合由酪氨酸形成的单体(真黑素)或酪氨酸和半胱氨酸(褐黑素)而在黑素体(即黑素细胞中包含的专门化的细胞内细胞器)中产生的大分子。合成黑色素或黑色素生成的机制特别复杂，并涉及各种酶，主要是酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白(酪氨酸酶相关蛋白-1或Tyrp-1)。
根据形态学标准，黑素体成熟可以分为四个阶段。阶段I对应于由膜界定的具有可变量的腔内膜的隔室。阶段II是具有特征性蛋白质样条纹的椭圆形结构。从阶段III，通过沿着条纹的电子致密沉积物检出黑色素。阶段IV是内部条纹不再可见的电子致密结构，对应于准备转移到角质形成细胞的成熟黑素体(Van Den Bossche等人，2006，Traffic，7,769-778; Raposo和Marks，Nat Rev Mol Cell Biol.Oct 2007; 8(10)：786-797)。
在生物发生过程中，通过转移在前黑素体中黑色素合成的关键酶获得阶段III和IV的黑素体(Raposo等人，2001，J.Cell Biol.152,809-824)。这种转移特别需要称为AP-1至AP-3的三种衔接蛋白(AP)复合物的参与，所述复合物是具有在运输小泡中募集酶的作用的异源四聚体。
虽然皮肤中的黑色素代表对UV辐射的适当保护，但是较深或过度着色的皮肤，例如色素沉着过度(例如黄褐斑或黑斑病)、雀斑(freckles，ephelides)、老年斑(着色斑)、太阳斑或脂溢性角化病，可导致严重的美容问题。这些色素斑可能由黑素细胞功能障碍诱导，或可能是由于事故，例如由于光敏化或损伤后瘢痕形成。太阳非常频繁地起重要作用，并且可以实现预防，特别是通过具有高光保护因素的常规防晒。
为了除去讨厌的色素斑，可使用各种可能性，例如激光、磨皮或其它电外科手术方法和包含脱色或增白物质的漂白霜剂。后一种选择具有的优点是，其显著更便宜并且对于患者更舒适。
增白分子作用于皮肤黑素细胞并干扰黑素生成的一个或多个阶段。已知的脱色物质特别是有氢醌及其衍生物、抗坏血酸及其衍生物、胎盘提取物、曲酸、烟酰胺、维生素C、噜忻喏(rucinol)、熊果苷、植物提取物(例如来自桑树(Morus alba)或余甘子(Phyllanthus emblica))、亚氨基酚类(WO 99/22707)、肉碱和醌的组合(DE 19806947)、氨基酚酰胺衍生物(FR 2772607)或苯并噻唑衍生物(WO 99/24035)。然而，这些物质存在各种缺点，例如低效率、制剂不稳定性、短保存期限、非特异性作用或毒性、刺激性或变应原性性质。
在过去几年中，出现了使用反义寡核苷酸或肽抑制剂以使皮肤增白的新方法。例如，设想了用调节酪氨酸酶表达的反义寡核苷酸(FR2804960)、抑制AP-2或AP-3复合物与酪氨酸酶之间相互作用的肽(WO 2009/010356)或直接抑制酪氨酸酶的肽(WO 2009/003034)来治疗色素沉着过度。
已知名为KIF13A的驱动蛋白能够与AP-1的亚基相互作用(Nakagawa等，Cell，2000，第103卷，569-581)，并且本发明人以前表明，可以利用抑制与驱动蛋白KIF13A相互作用的AP-1衔接子复合物的亚基表达的核酸来有效降低黑色素的合成(WO 2009/141541)。该核酸不仅能够破坏内体的黑素生成酶向前黑素体的转运，因此阻断这些细胞器的成熟，而且能够降低黑素生成酶的表达。因此，其构成有效的脱色剂。然而，当使用核酸作为皮肤病剂或美容剂时，稳定性、配制和施用途径仍然棘手。
因此，仍然需要新型皮肤增白剂，其能够破坏前黑素体中黑素生成酶的转运，因此具有高效力，而且具有良好的制剂性质。
发明简述
本发明的目的是提供新的皮肤增白肽剂，其是无毒的并且通过抑制AP-1衔接子复合物的亚基与驱动蛋白KIF13A之间的相互作用而对黑素生成具有特异性作用。
在第一方面，本发明涉及皮肤增白肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐，所述肽长度为3至15个氨基酸，并且包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的至少三个连续氨基酸的序列。
所述肽可以包含选自氨基酸序列EPL、PLN、LNN、NNL、NLQ、LQV、QVA、VAV、AVK和SEQID NO: 1至16的氨基酸序列。
优选地，肽具有3至11个氨基酸的长度，更优选3至7个氨基酸的长度。
所述肽可以由选自以下氨基酸序列的氨基酸序列组成：(i)氨基酸序列EPL、PLN、LNN、NNL、NLQ、LQV、QVA、VAV、AVK和SEQ ID NO: 1至16，和(ii)包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的6、7、8、9或10个连续氨基酸的任何序列。
特别地，所述肽可包含选自氨基酸序列AVK、VAVK (SEQ ID NO: 9)和QVAVK (SEQID NO: 16)的氨基酸序列，或由其组成。优选地，所述肽包含氨基酸序列QVAVK (SEQ IDNO: 16)，或由其组成。
在另一方面，本发明涉及编码根据本发明的肽的核酸、包含所述核酸的表达盒、包含所述核酸或所述表达盒的表达载体和包含所述核酸、表达盒或表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明涉及美容或药物组合物，其包含：根据本发明的肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐，以及生理学上可接受的载体和/或赋形剂。
在所述组合物中，肽可以包含在脂质体中。组合物可以进一步包含一种或几种其它活性物质。优选地，所述组合物适于通过局部途径施用。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的肽，其作为药物。
本发明还涉及根据本发明的肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐，其用于预防或治疗色素沉着过度。其还涉及治疗色素沉着过度的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效剂量的根据本发明的肽。本发明还涉及本发明的肽在制备用于治疗或预防色素沉着过度的药物中的用途。
特别地，色素沉着过度可以选自：黑斑病，例如特发性黑斑病(即与妊娠或口服避孕药的摄入均无关的黑斑病)或黄褐斑(也称为妊娠面斑)；光化性雀斑；来自痤疮的色素性后效应；由于光敏化引起的色素沉着；由于擦伤、烧伤、瘢痕、皮肤病和/或接触性变态反应引起的炎症后色素沉着；草地皮炎；由于毒藤(poison ivy)引起的色素沉着；雀斑；和痣，例如先天性巨痣、贝克痣(Becker nevus)或斯皮茨痣(Spitz nevus)。
在另一方面，本发明涉及根据本发明的肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐作为美容剂、特别是作为皮肤增白剂、脱色剂或增亮美容剂的用途。
本发明还涉及用于使人皮肤增白、脱色或增亮的美容方法，包括将本发明的美容组合物局部施用于人皮肤上。
附图说明
图1：在存在或不存在1μg所示的11种氨基酸肽(肽AI、QT、GN、EK、EL、WQ、NY、QF、LM、FF、LK和RI：分别为SEQ ID NO: 17、28、20、1、25、27、22、21、24、23、19和26)的情况下，在4℃、旋转条件下从HeLa细胞裂解物中免疫沉淀人AP-1复合物的γ-衔接蛋白亚基2小时。将免疫沉淀物加载在凝胶上用于蛋白质印迹分析，使用特异性抗人KIF13A揭示其配偶体。分子量单位为kDa。
图2：在存在或不存在1μg所示肽(肽SS-5、EK-11和QK-5：分别为SEQ ID NO: 28、1和16)的情况下，在4℃下、旋转条件下从黑素细胞(MNT1)的细胞裂解物中免疫沉淀人AP-1复合物的γ-衔接蛋白亚基2小时。将免疫沉淀物加载在凝胶上用于蛋白质印迹分析，使用特异性抗人KIF13A揭示其配偶体。EK-11和SS-5肽分别用作阳性和阴性对照。分子量单位为kDa。
图3：使用ImageJ对图2所示的免疫沉淀的KIF13A和AP-1条带的强度进行定量。将KIF13A强度除以其相应的AP-1强度并相对于对照(无肽孵育的裂解物，第一泳道)标准化。
图4：将MNT1黑素细胞与10 μM QK-5肽(SEQ ID NO: 16)或作为对照的H2O一起培养3天。如先前所述(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19; 187(2)：247-64)进行黑色素估计，并相对于对照标准化。QK-5肽孵育减少细胞内黑色素含量约40±0.02%。数据表示为平均值±标准偏差。*; p值(双尾)<0.05。
图5：将MNT1黑素细胞接种在玻璃盖玻片上，并与10 μM QK-5肽(SEQ ID NO: 16)或作为对照的H2O一起培养3天。将细胞固定在冷甲醇中，并使用兔抗人KIF13A和小鼠抗人γ-衔接蛋白作为一抗以及偶联Alexa-488或546的山羊抗兔或小鼠(Molecular Probes)进行共染色。将盖玻片安装在Dabco(Invitrogen)培养基中，并在Eclipse 80i Upright显微镜(Nikon)上获得图像并解卷积。图像是使用ImageJ软件获得的多达15个3D图像堆栈的最大强度z投影。通过定量重叠的KIF13A和AP-1像素的强度并通过将它们相对于对照标准化来进行分析。在黑素细胞上的QK-5肽孵育减少大约84±7%的KIF13A与AP-1的共定位。数据表示为平均值±标准偏差。***; p值(双尾)<0.001。
图6：将MNT1黑素细胞接种在玻璃盖玻片上，并与10 μM QK-5肽(SEQ ID NO: 16;底部图)或作为对照的H2O(上部图)一起培养3天。然后在室温下在DMEM中快速洗涤细胞，并在4℃下用2.5%戊二醛在0.1M二甲胂酸盐缓冲液中的混合物固定90分钟，在4℃下用1%OsO4/ 1.5%亚铁氰化钾后固定45分钟，在乙醇中脱水并包埋在Epon树脂中。在配备有KeenView相机(Soft Imaging System; SIS，Germany)的CM120电子显微镜(FEI公司，Eindoven)下观察超薄(60-70 nm)切片。与对照(上图)相比，与QK-5肽一起孵育的黑素细胞(下图)含有较少的黑色着色颗粒(黑素体)。比例尺：2 μm。
图7：基于其在如图6中处理的MNT1黑素细胞上的形态来定量黑素体阶段。阶段I和II对应于早期非着色黑素体，黑色素色素沉着在阶段III中开始，而阶段IV是完全成熟的和着色的黑素体。计数阶段并绘制为它们的总数的百分比。与对照相比，与QK-5肽一起孵育的黑素细胞减少了阶段IV黑素体的数目，并伴随地增加了较不成熟和着色的阶段III的数目。
图8：将MNT1黑素细胞与10 μM的EL-3或LN-3或作为对照的H2O一起培养3天。如先前所述(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19; 187(2)：247-64)进行黑色素估计，并相对于对照标准化。与对照相比，EL-3或LN-3肽孵育使细胞内黑色素含量降低约12%。
图9：将MNT1黑素细胞与10 μM QA-3肽或AK-3肽或作为对照的H2O一起培养3天。如先前所述(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19; 187(2)：247-64)进行黑色素估计，并相对于对照标准化。QA-3和AK-3肽孵育减少细胞内黑色素含量分别约22.8±7%和21.3±8%。数据表示为平均值±标准偏差。*; p值(双尾)<0.05。
图10：与30 μM的QA-3肽或AK-3肽一起孵育10天的3D人重建的着色表皮的黑色素定量。从其插入物中取出合成的表皮，并在100℃下在400μl的Solvable(Perkin Elmer)中溶解1小时。通过测量492nm处的光密度，对200μl进行黑色素定量。将黑色素定量相对于对照标准化。QA-3和AK-3肽减少约22.5±13%或21±10%的通过合成皮肤表皮产生的黑色素。数据表示为平均值±标准偏差。*; p值(双尾)<0.1。
发明详述
本发明人先前显示，AP-1衔接子复合物和驱动蛋白KIF13A对于合成皮肤黑素细胞中的黑色素是必需的(WO2009 / 141541)。两种蛋白质相互作用，并且这种相互作用对于维持着色表型是关键的。
如实验部分所示，他们设计并测试了AP-1复合物的β1-衔接蛋白亚基的小肽(3至11个氨基酸)干扰AP-1 / KIF13A相互作用的能力。他们开发了一种生化测定，其中将细胞裂解物与肽一起孵育。从细胞裂解物中免疫沉淀AP-1，将免疫沉淀物加载到凝胶上用于蛋白质印迹分析，其是通过揭示其配偶体KIF13A。使用该测定，他们观察到11个氨基酸的EK肽(SEQ ID NO: 1)及其片段、特别是5个氨基酸的肽QVAVK (SEQ ID NO: 16)有效地降低了在皮肤黑素细胞中的AP-1 / KIF13A相互作用。
这些结果通过以下来证实：(i)在活的皮肤黑素细胞上孵育这些肽和在孵育3天后测量色素的产生，(ii)免疫荧光，其显示在细胞上孵育肽后，AP-1与KIF13A的共定位减少，(iii)电子显微术，其显示完全成熟的着色黑素体的数目显著减少，和(iv)将这些肽在合成的3D人重建的着色表皮上孵育，其显示黑色素含量的显著降低和在超微结构水平没有观察到肽的细胞毒性效应。
因此，本发明人在此证实，所鉴定的肽能够阻断AP-1衔接子复合物和KIF13A之间的相互作用，以减少黑素细胞中黑色素的产生，并延迟表皮黑素细胞中完全成熟的着色黑素体的形成。令人惊讶的是，小至3个氨基酸的肽导致合成人皮肤表皮中细胞内黑色素含量减少约20%。
这种小肽的主要优点之一是它们可以跨细胞膜自由扩散，因此可以容易地用作用于皮肤病学和/或美容学目的的增白剂。
定义
如本文所用，术语“肽”、“寡肽”和“多肽”可互换使用，并且是指通过肽键连接的氨基酸链，而不管形成所述链的氨基酸的数目。肽可以包含来自任何天然存在的氨基酸和/或任何非天然存在的氨基酸的残基。在本文所述的肽序列中，氨基酸由根据以下命名法的单字母代码表示：C：半胱氨酸; D：天冬氨酸; E：谷氨酸; F：苯丙氨酸; G：甘氨酸; H：组氨酸; I：异亮氨酸; K：赖氨酸; L：亮氨酸; M：甲硫氨酸; N：天冬酰胺; P：脯氨酸; Q：谷氨酰胺;R：精氨酸; S：丝氨酸; T：苏氨酸; V：缬氨酸; W：色氨酸；和Y：酪氨酸。构成本发明的肽的氨基酸可以是L或D构型，优选L构型。根据本发明的肽可以包含一个或多个氨基酸，其是非常见的、合成的或化学修饰的氨基酸，特别是乙酰化氨基酸(例如N-乙酰基-L-丙氨酸)、酰胺化氨基酸(例如L-丙氨酸酰胺)、甲酰化氨基酸(例如N-甲酰基-L-甲硫氨酸)、羟基化氨基酸(例如羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸)、脂质缀合的氨基酸(例如N6-肉豆蔻酰-L-赖氨酸)、乙基化或甲基化的氨基酸(例如N-甲基-L-丙氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸)、磷酸化氨基酸(例如N6-磷酸-L-赖氨酸)或本领域技术人员已知的任何其它非常见的、合成的或化学修饰的氨基酸，例如鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸和环己基丙氨酸。
根据本发明的肽分子还可以包含促进分子穿透进入细胞的元件。特别地，该元件是促进分子的细胞穿透的肽(CPP：细胞穿透肽元件)。这些肽是本领域技术人员熟知的(例如，Vivès等，Biochimic＆Biophysica Acta，2008,1786,126-138)。例如但不限于，促进细胞穿透的肽可以选自Tat肽、触足肽或穿膜蛋白(penetratin)肽和富含精氨酸和/或赖氨酸的肽，特别是聚精氨酸。
本文中使用的术语“AP-1”是指在反式高尔基体和内吞网络中起作用的AP-1衔接子复合物。它不应该与同一名称的转录因子混淆，该转录因子由通过jun和fos家族成员的基因编码的蛋白质组成。AP-1衔接子复合物由4个亚基γ、β1、σ1和μ1组成。AP-1的γ、β1、σ1和μ1亚基的GeneID登录号分别为GeneID164、GeneID162、GeneID1174和GeneID8907。
术语“KIF13A”、“驱动蛋白样蛋白KIF13A”或“驱动蛋白KIF13A”是指一种正端定向的微管依赖性动力蛋白，其参与细胞内转运和调节各种过程，例如甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)转运到质膜、黑素体生物发生期间的内体分选、内体生物发生和胞质分裂再循环。人驱动蛋白Kif13A的GeneID登录号是GeneID63971。Uniprot登录号为Q9H1H9。
术语“黑色素(melanin/melanins/melanic pigments)”和“色素”在本文中可互换使用。它们包括可能在黑素体中合成的各种色素，包括真黑素或褐黑素。
如本文所用，术语“约”是指指定值的值±10%的范围。例如，“约20”包括20的±10%，或18至22。优选地，术语“约”是指指定值的值±5%的范围。
在第一方面，本发明涉及一种分离的皮肤增白肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐，所述皮肤增白肽具有3至15个氨基酸的长度并且包含EPLNNLQVAVK(SEQ ID NO: 1)肽的至少三个连续氨基酸的序列。
在实验部分中，本发明人显示，跨越EPLNNLQVAVK序列的几种3个氨基酸的肽能够有效地减少皮肤黑素细胞以及合成表皮的色素沉着。
因此，在一个实施方案中，所述肽包含以下序列，由其组成或基本上由其组成：
- EPLNNLQVAVK序列的三个连续氨基酸的序列，即选自氨基酸序列EPL、PLN、LNN、NNL、NLQ、LQV、QVA、VAV和AVK的氨基酸序列；
- EPLNNLQVAVK序列的四个连续氨基酸的序列，即选自氨基酸序列EPLN(SEQ ID NO:2)、PLNN(SEQ ID NO: 3)、LNNL(SEQ ID NO: 4)、NNLQ(SEQ ID NO: 5)、NLQV(SEQ ID NO:6)、LQVA(SEQ ID NO: 7)、QVAV(SEQ ID NO: 8)和VAVK (SEQ ID NO: 9)的氨基酸序列；或
- EPLNNLQVAVK序列的五个连续氨基酸的序列，即选自氨基酸序列EPLNN(SEQ ID NO:10)、PLNNL(SEQ ID NO: 11)、LNNLQ(SEQ ID NO: 12)、NNLQV(SEQ ID NO: 13)、NLQVA(SEQID NO: 14)、LQVAV(SEQ ID NO: 15)和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，所述肽包含含有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的6、7、8、9或10个连续氨基酸的任何序列，由其组成或基本上由其组成。在另一个实施方案中，肽包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
在一个具体的实施方案中，本发明的肽包含选自氨基酸序列EPL、PLN、LNN、QVA、VAV、AVK、LQVA(SEQ ID NO: 7)、QVAV(SEQ ID NO: 8)、VAVK (SEQ ID NO: 9)和QVAVK (SEQID NO: 16)的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。优选地，所述肽包含选自氨基酸序列EPL、LNN、QVA、AVK、VAVK (SEQ ID NO: 9)和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽包含选自氨基酸序列AVK、VAVK (SEQ IDNO: 9)和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。优选地，所述肽包含选自氨基酸序列AVK和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。更优选地，所述肽包含氨基酸序列QVAVK (SEQ ID NO: 16)、由其组成或基本上由其组成。
如本文所用，术语“基本上由...组成”是指允许至多两个置换或一个缺失或添加，即肽的氨基酸序列可以与特定序列具有一个或两个氨基酸差异。优选地，该术语是指肽具有与特定序列具有至少90%、更优选至少95%同一性的氨基酸序列。在优选的实施方案中，该术语是指肽的氨基酸序列与指定序列具有一个氨基酸差异(置换、缺失或插入)。
在一个优选的实施方案中，如上公开的本发明的肽表现出皮肤增白活性和/或干扰或抑制AP-1和KIF13A之间的相互作用。
当本发明的肽还包含额外的氨基酸残基时，这些残基可以添加到C-和/或N-末端。
本发明的肽具有3至15个氨基酸的长度。因此，肽可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸的长度。优选地，肽具有3至11个氨基酸的长度，更优选3至7个氨基酸的长度。
在一个具体的实施方案中，肽具有3至5个氨基酸的长度，优选具有5个氨基酸的长度。
为了通过提高肽对肽酶的抗性来增强肽的稳定性，可以将保护基添加到C-和/或N-末端而不改变肽的活性。例如，N末端的保护基可以是酰化或乙酰化，C末端的保护基可以是酰胺化或酯化。蛋白酶的作用也可以通过使用D构型的氨基酸，通过在C-和N-末端之间形成二硫桥、内酰胺环或键而环化肽来阻断。本发明的肽还可以包含替换“经典”CONH肽键并赋予对肽酶增强的抗性的假肽键，例如CHOH-CH2、NHCO、CH2-O、CH2CH2、CO-CH2、N-N、CH=CH、CH2NH和CH2-S。
本发明还包括如上所述的本发明的肽的功能衍生物。本文所用的术语“功能衍生物”是指模拟本发明的肽的化学结构并保留所述肽的功能性质的分子。例如，所述功能衍生物可以是逆肽(retropeptide)、逆反肽(retro-inverso peptide)、肽模拟物(如类肽或β-肽)或具有甲基化酰胺键的肽。设计肽类似物的方法是本领域众所周知的。
本发明还包括根据本发明的肽的生理学上可接受的盐。生理学上可接受的盐可以是例如：生理学上可接受的无机酸的盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的盐；生理学上可接受的有机酸的盐，例如乙酸、柠檬酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、抗坏血酸和酒石酸的盐；生理上可接受的无机碱的盐，例如钠、钾、钙、镁或铵的盐；或通常用于制药技术的含有可成盐氮的有机碱的盐。制备所述盐的方法是本领域技术人员公知的。
根据本发明的肽可以通过熟知的方法例如经典化学合成(在固相或均相液相中)或通过酶促合成(Kullmann W，1987，Enzymatic peptide synthesis，CRC Press，Florida)获得。它还可以通过包括下述步骤的方法获得：培养例如下文所述的宿主细胞，其包含编码所述肽的转基因并表达所述肽；并从所述宿主细胞或从分泌有所述肽的培养基中提取所述肽。本发明的肽还可以从天然蛋白质获得；即通过动物、植物或微生物来源的蛋白质的受控水解。水解可以对粗提取物或分离或纯化的蛋白质进行。因此，本发明的肽可以是天然或合成来源的。优选地，肽通过化学合成获得。
如本文所用，术语“皮肤增白”、“皮肤增亮”、“皮肤脱色”或“皮肤漂白”剂是指能够抑制或减少黑素细胞中黑色素合成并因此使皮肤增白的活性剂，即本发明的肽。该活性优选是由于AP-1和KIF13A之间的相互作用的干扰或抑制。
本发明的肽的皮肤增白活性可以通过评估肽对AP-1衔接子复合物和KIF13A之间的相互作用的影响而容易地确定。具体地，本领域技术人员可以进行如实验部分中公开的生化测定，即生化测定包括将细胞裂解物与本发明的肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐一起孵育，从细胞裂解物免疫沉淀AP -1，并通过此免疫沉淀物的蛋白质印迹分析揭示其配偶体KIF13A。可商购获得针对AP-1(特别是γ-衔接蛋白亚基)和KIF13A的单克隆或多克隆抗体(小鼠单克隆抗γ-衔接蛋白，Sigma Aldrich；兔多克隆抗KIF13A，BethylLaboratories，Inc.)。当本发明的肽能够破坏AP-1衔接子复合物和KIF13A之间的相互作用时，即当与无肽孵育的细胞裂解物相比，AP-1和KIF13A的共免疫沉淀显著降低时，本发明的肽显示出皮肤增白活性。
或者，可以通过免疫荧光观察在与或不与本发明的肽一起孵育的细胞中AP-1和KIF13A的细胞定位，来测定肽的皮肤增白活性。使用该测定，当与肽一起孵育的细胞中AP-1和KIF13A的细胞共定位与无肽孵育的细胞相比显著降低时，肽显示出皮肤增白活性。
肽的皮肤增白活性也可以通过电子显微镜检查观察在与或不与本发明的肽一起孵育的细胞中成熟的着色黑素体的数量来测定。使用该测定，当与肽一起孵育的细胞中成熟的着色黑素体的数量与无肽孵育的细胞相比显著减少时，肽显示出皮肤增白活性。
肽的皮肤增白活性可以进一步通过测量与肽一起孵育的黑素细胞(例如MNT-1细胞)的黑色素含量来确定。例如，该测定可以如下进行：在第1天，将105个MNT-1细胞接种在6孔板中;从第2天至第4天，在包含10μM肽的培养基中培养细胞;在第5天，通过在50mM Tris-HCl，pH 7.4，2mM EDTA，150mM NaCl，1mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂中超声处理破碎细胞。在4℃下以20,000g沉淀色素15分钟，在乙醇/乙醚(1:1)中漂洗一次，并在60℃下溶于2MNaOH / 20%二甲基亚砜中;黑色素含量测量为492nm处的光密度。使用该测定，当与本发明的肽一起孵育的细胞中的黑色素的量与无肽孵育的细胞的黑色素含量相比显著减少时，所述肽显示出皮肤增白活性。
如本文所用，术语“显著降低”是指用不与本发明的肽一起孵育的细胞获得的值(即用其中本发明的肽仅用稀释剂例如H2O代替的对照样品获得的值)的至少10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%降低。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽诱导与所述肽一起孵育的黑素细胞(例如MNT-1细胞)的黑色素含量减少至少20%，优选至少40%。
本发明还涉及编码根据本发明的肽的核酸。在本发明的精神中，“核酸”应理解为是指基于DNA或RNA的任何分子。这些可以是合成的或半合成的重组分子，可能扩增或克隆到载体中，化学修饰的，包含非天然碱基或修饰的核苷酸(包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的糖)。根据本发明的核酸可以是单链或双链的DNA和/或RNA的形式。根据优选的实施方案，核酸是通过本领域技术人员熟知的重组技术合成的分离的DNA分子。根据本发明的核酸可以从根据本发明的肽的序列推导，并且可以根据其中核酸将被转录的宿主细胞来改变密码子使用。这些步骤可以根据本领域技术人员熟知的方法进行，其中一些描述在参考手册Sambrook等人，(Sambrook J，Russell D(2001)Molecular cloning：alaboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor)。
本发明还涉及包含与其表达所需的序列可操作地连接的根据本发明的核酸的表达盒。特别地，核酸可以处在允许其在宿主细胞中表达的启动子的控制下。通常，表达盒由允许启始转录的启动子、根据本发明的核酸和转录终止子构成，或包含允许启始转录的启动子、根据本发明的核酸和转录终止子。术语“表达盒”表示包含可操作地连接的编码区和调节区的核酸构建体。表述“可操作地连接”表示元件以这样的方式组合，其使得编码序列(目的基因)的表达和/或编码的肽的靶向处在转录启动子和/或信号肽的控制下。
本发明还涉及包含根据本发明的核酸或表达盒的表达载体。所述表达载体可以用于转化宿主细胞并使得能够在所述细胞中表达本发明的核酸。载体可以是DNA或RNA，环状或非环状，单链或双链的。有利地，其选自质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒和人工染色体。有利地，表达载体包含允许表达根据本发明的核酸的调节元件。这些元件可以含有例如转录启动子、转录激活子、终止子序列、起始密码子和终止密码子。根据期望在其中表达的宿主细胞选择所述元件的方法是本领域技术人员公知的。载体还可以含有使其能够在宿主细胞中选择的元件，例如抗生素抗性基因或提供与宿主细胞基因组缺失的相应基因的互补物的选择性基因。这样的元件是本领域技术人员公知的并且在文献中广泛描述。
本发明涉及根据本发明的核酸、表达盒或表达载体转化或转染细胞的用途。宿主细胞可以以瞬时或稳定的方式转化/转染，并且核酸、盒或载体可以以附加体形式或染色体形式包含在细胞中。
本发明涉及包含根据本发明的核酸、盒或表达载体的宿主细胞。根据一个实施方案，宿主细胞是微生物，优选细菌或酵母。根据另一个实施方案，宿主细胞是动物细胞，例如哺乳动物细胞，例如COS或CHO细胞。在一个具体的实施方案中，所述细胞是非人的和非胚胎的。
本发明还涉及用于产生根据本发明的皮肤增白肽的方法，包括用根据本发明的核酸、表达盒或表达载体转化或转染细胞；培养转染/转化的细胞；并回收由所述细胞产生的肽。用于产生重组肽的方法是本领域技术人员公知的。
本发明还涉及用于产生根据本发明的肽的方法，包括将根据本发明的核酸、盒或表达载体插入体外表达系统(也称为无细胞的)，并回收由所述系统产生的肽。许多体外或无细胞表达系统是可商购的，并且所述系统的使用是本领域技术人员公知的。
另一方面，本发明涉及美容或药物组合物，其包含：本发明的皮肤增白肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐，和生理学上可接受的载体和/或赋形剂。
优选地，组合物的制剂适于局部施用，即组合物是局部组合物。
本文使用的术语“生理学上可接受的载体和/或赋形剂”是指优选适于局部施用到皮肤上，与本发明的肽和包含在组合物中的任何其它活性物质相容，并不会造成任何不良的安全或毒性问题的载体或赋形剂。载体或赋形剂可以是美容上或药学上可接受的，这取决于所需的性质概况。本发明的组合物可以包含约50%至约99.99%的载体和/或赋形剂，优选约80%至约99.9%，更优选约90%至约95%。
根据本发明的组合物可以以通常用于局部施用的任何盖仑制剂形式存在。特别地，组合物可以是固体、半固体或液体。其可以是例如白色或有色粉末、软膏、糊剂、乳膏、流体、乳液、化妆水、洗剂、浆液、水性或油性凝胶、水性水醇溶液或油性溶液、水包油或油包水或多重乳液、泡沫、面膜、水性贴或无水贴、油在聚合物相(例如纳米球和纳米胶囊)中的分散体的形式。
任选地，组合物可以以气雾剂的形式施用于皮肤。它还可以作为贴剂、笔、刷子和施用器提供，用于在面部或手部的斑点上局部施用。它可以用作护肤产品和/或化妆产品。
优选地，组合物包括水。更优选地，组合物为水包油、油包水或硅包水乳液的形式。
当本发明的组合物是乳液时，与组合物的总重量相比，油相的比例范围可以为5重量%至80重量%，优选5重量%至50重量%。以乳液形式用于组合物中的油、乳化剂和共乳化剂选自在相关领域中常规使用的那些。乳化剂和共乳化剂以相对于组合物的总重量为0.3重量%至30重量%、优选0.5重量%至20重量%范围的比例存在于组合物中。
合适的油的实例包括但不限于：矿物油，例如矿脂或石蜡油；植物来源的油，例如鳄梨、大豆或霍霍巴油；动物来源的油，如羊毛脂；合成油如苯甲酸烷基酯，和支链烃如聚丁烯、全氢化角鲨烯；硅油，例如环甲硅油、二甲硅油和苯基二甲硅油；和氟化油，例如全氟聚醚。也用作脂肪物质的有：脂肪醇，如鲸蜡醇；脂肪酸；或蜡，如巴西棕榈蜡、蜂蜡、聚乙烯蜡或地蜡。
合适的乳化剂和共乳化剂的实例包括但不限于脂肪酸和聚乙二醇的酯(例如PEG-20硬脂酸酯)和脂肪酸和甘油的酯(例如硬脂酸甘油酯)。
或者，在组合物中含有的本发明的肽可以包封在脂质体中。如本文所用，“脂质体”是指人工制造的且由磷脂层组成的小囊泡，其通过水性隔室彼此分离。它们具有非常接近细胞膜的结构，这使得它们能够与它们融合，同时释放它们含有的活性成分。合适的脂质体的实例包括但不限于多层脂质体或MLV(多层囊泡)、小单层脂质体或SUV(小单层囊泡)或大单层脂质体或LUV(大单层囊泡)或SECosomes(表面活性剂-乙醇-胆固醇-体)，如Geusens等人，2010(Advanced Functional Materials.2010. pp.4077-4090)中所述。脂质体也可以是其壁不由磷脂组成而是由非离子脂质组成的非离子脂质体。
组合物还可以包含其它添加剂，包括但不限于硅酮弹性体、表面活性剂、增稠剂、胶凝剂、保湿剂、促进经皮吸收的试剂、着色剂、防腐剂、光学改性剂、螯合剂(例如EDTA的盐)和/或香味剂。这样的添加剂和其它添加剂的实例见述于由Personal Care ProductsCouncil出版的International Cosmetic Ingredient Dictionary＆Handbook，第15版，2014。这些各种添加剂的量是在相关领域中常规使用的量。根据其性质，这些添加剂可以引入油相、水相、脂质囊泡和/或纳米颗粒中。
或者，本发明的组合物也可适于肠胃外给药，即组合物可以是可注射的组合物。本文所用的术语“可注射组合物”是指适合注射入人和/或动物的组合物，其中所述注射优选为皮内或皮下注射。这些组合物必须是无菌的、无热原的且在生理学上可接受的pH。合适的可注射制剂可以含有防腐剂，例如苯甲酸钠，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯等，并且在25摄氏度下可具有6.8-8.0的pH。优选通过缓冲液维持pH。合适的缓冲剂包括乙酸盐缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、TRIS缓冲液等。
组合物可包含一种或几种(例如2、3、4或5种)本发明的肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐。在一个优选的实施方案中，组合物包含至少一种包含氨基酸序列QVAVK(SEQ ID NO: 16)或由其组成的肽。
该组合物包含有效量的本发明的肽。本申请中使用的术语“有效量”是本发明的皮肤增白肽的量，其能够显著降低黑色素的合成。这种降低尤其可导致皮肤颜色的可见变化。该降低可以例如是未处理细胞中存在的黑色素量的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。例如，相对于组合物的总重量，有效量可以为0.001至20重量%，优选0.01至10重量%，更优选0.1至5重量%。
本发明的组合物可以进一步包含一种或几种另外的活性物质。
在一个实施方案中，本发明的肽与一种或几种其它皮肤增白剂混合。这样的增白剂的实例包括但不限于鞣花酸(Kamide等人，Nishinihon J Dermatol.1995; 57：136-142)、熊果苷(Sugai等人，Skin Res(Hifu)1992; 34：522- 529)、间苯二酚、噜忻喏(4-正丁基间苯二酚)(Katagiri等人J Cosmet Chem Jpn.2001; 35：42-49)、曲酸(Mishima等人，Skin Res(Hifu)1994; 36：134-150)、胎盘提取物(Itoh. Fragrance J. 1990：6, 67-71)、植物提取物(包括水仙(Narcissus tazetta)、桑树(Morus alba)、余甘子(Phyllanthus emblica)、长春花(Catharanthus roseus)、Fomes japonicus、灵芝(Ganoderma)、春黄菊(Chamomilla) (Kawashima等人，Nishinihon J Dermatol. 1999; 61：682-685)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra)提取物)、光甘草定、抗坏血酸及其衍生物(如L-抗坏血酸-2-磷酸、L-抗坏血酸-2-磷酸钠、L-抗坏血酸2-葡萄糖苷和L-抗坏血酸乙酯(Maeda等人J JpnCosmet Sci Soc.2003; 27：257-268; Kumano等人J.Nutr.Sci.Vitaminol.1998; 44：345-359; Kameyama等人J.Am.Acad.Dermatol.1996; 34：29-33; Miyai等人Nishinihon JDermatol. 1996; 58：439-443))、亚油酸(Shigeta等人，Biol.Pharm.Bull.2004; 27：591-594)、氨甲环酸(Mafune等人，Farumashia.2008; 44：437-442)、氨甲环酸十六烷基酯盐酸盐、4-甲氧基水杨酸钾、腺苷单磷酸二钠盐(Kawashima等人Jpn J Clin Dermatol.2008;62：250-257)、5,5'-二丙基-联苯-2,2'-二醇)(Magnolian®)(Takeda等人Nishinihon JDermatol.2006; 68：293-298)、4-(4-羟基苯基)-2-丁醇、半胱氨酸、4-硫代间苯二酚(EP0623341)、5-羟基-2-羟甲基-γ-吡啶酮、烟酰胺、亚氨基酚类(WO 99/22707)、肉碱和/或醌(DE 19806947)、氨基苯酚酰胺衍生物(FR 2772607)、苯并噻唑衍生物(WO 99/24035)、泛酸盐、甘草酸、氢醌β-葡萄糖苷和inulavosin (Pigment Cell Melanoma Res.2004 May; 27(3)：376-86)。
组合物还可以包含旨在增强所需效果的另外的活性物质，例如：有机或无机防晒剂；角质软化剂和/或剥脱剂，例如水杨酸、乙醇酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸；保湿剂；润肤剂；收敛剂；防腐剂；抗糖化和/或抗氧化剂，例如生育酚、硫代牛磺酸、次牛磺酸、氨基胍、焦磷酸硫胺、吡哆胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、吡哆醇、腺苷三磷酸；多元醇，如甘油、乙二醇或丙二醇；维生素，如维生素A、E、K；视黄酸、视黄醛、视黄醇；棕榈酸盐、丙酸盐或乙酸盐；透明质酸；抗炎剂；舒缓剂；和/或脱氧核糖核酸或核糖核酸。
本发明还涉及根据本发明的肽、其功能衍生物或生理学上可接受的盐作为美容剂、特别是作为皮肤增白美容剂的用途。
本发明还涉及用于增白人皮肤的美容方法，包括将本发明的美容组合物局部施用于人皮肤上。
优选地，每天施用本发明的美容组合物，更优选每天施用两次。
本发明还涉及用于增白人皮肤的美容方法，包括肠胃外给予本发明的美容组合物。优选地，所述组合物是皮内或皮下施用的。
在另一方面，本发明涉及作为药物的本发明的皮肤增白肽。
本发明还涉及用于预防或治疗色素沉着过度的本发明的肽或组合物。
本发明还涉及治疗色素沉着过度的方法，包括向有需要的受试者施用有效剂量的本发明的肽或组合物。本发明还涉及本发明的肽或组合物在制备用于治疗或预防色素沉着过度的药物中的用途。
优选地，待治疗的受试者是哺乳动物，更优选人。
色素沉着过度的特征在于黑色素的累积，并且常常导致不规则的色素沉着模式。特别地，本发明的肽或组合物可用于增白着色斑的皮肤，并因此使受试者的皮肤色素沉着均匀化。色素沉着过度可以选自：黑斑病，例如特发性黑斑病(即与妊娠或口服避孕药的摄入均无关的黑斑病)或黄褐斑(也称为妊娠面斑)；光化性雀斑(也称为衰老性着色斑、老年斑、太阳斑、老化斑或雀斑)；来自痤疮的色素性后效应；由于擦伤、烧伤、瘢痕引起的炎症后色素沉着；由于光敏化、皮肤病和/或接触性变态反应引起的色素沉着；草地皮炎；由于毒藤引起的色素沉着；雀斑；和痣，例如先天性巨痣、贝克痣或斯皮茨痣。
本发明的其它方面和优点将在以下实施例中描述，这些实施例应当被认为是说明性的而不是限制性的。
实施例
材料和方法
肽设计和制备
本发明人设计了跨越位于人AP-1的β1-衔接蛋白亚基的第813和890个氨基酸之间的区域的11、5或3个氨基酸的肽。
所有的肽由Proteogenix (Oberhausbergen，France)合成。冻干的肽根据制造商的建议在H2O或二甲基亚砜(DMSO)/H2O(1v/3v)中稀释。下表列出了肽序列。
肽名称 肽序列
AI-11 APLSPNQTVEI (SEQ ID NO: 17)
QT-11 QTVEISLPLST (SEQ ID NO: 18)
LK-11 LPLSTVGSVMK (SEQ ID NO: 19)
GN-11 GSVMKMEPLNN (SEQ ID NO: 20)
EK-11 EPLNNLQVAVK (SEQ ID NO: 1)
QF-11 QVAVKNNIDVF (SEQ ID NO: 21)
NY-11 NIDVFYFSTLY (SEQ ID NO: 22)
FF-11 FSTLYPLHILF (SEQ ID NO: 23)
LM-11 LHILFVEDGKM (SEQ ID NO: 24)
EL-11 EDGKMDRQMFL (SEQ ID NO: 25)
RI-11 RQMFLATWKDI (SEQ ID NO: 26)
WQ-11 WKDIPNENEAQ (SEQ ID NO: 27)
EN-5 EPLNN (SEQ ID NO: 10)
NV-5 NNLQV (SEQ ID NO: 13)
SS-5 STVGS (SEQ ID NO: 28)
QK-5 QVAVK (SEQ ID NO: 16)
EL-3 EPL
LN-3 LNN
QA-3 QVA
AK-3 AVK
细胞培养
将HeLa细胞维持在补充有10%FBS和抗生素的DMEM(Invitrogen)中。将MNT-1细胞维持在补充有10%AIM-V培养基、20%FCS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和抗生素的DMEM(Invitrogen)中。
蛋白质提取、免疫沉淀和蛋白质印迹分析
在冷PBS中洗涤80%汇合的细胞，并在冰上在裂解缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，0.1%Triton X-100,10mM EDTA，pH7.2，和蛋白酶抑制剂混合物，Roche)中裂解。将裂解物与1μg肽一起孵育过夜。首先使用蛋白G琼脂糖珠在4℃、旋转条件下预澄清裂解物1小时。收集上清液，并与具有1μg小鼠单克隆IgG2b抗CD9的蛋白G琼脂糖珠在4℃、旋转条件下一起孵育1小时。将预澄清的上清液与先前用1μg小鼠单克隆IgG2b抗γ-衔接蛋白包被的珠一起在4℃、旋转条件下孵育2小时。作为阴性对照，使用1μg小鼠单克隆IgG2b抗CD9免疫沉淀裂解物。
在冷裂解缓冲液中洗涤五次并在PBS中洗涤三次后，将与珠结合的免疫沉淀的蛋白质在具有还原剂的样品缓冲液中孵育，在95℃下煮沸10分钟，并通过SDS-PAGE使用Nupage(3-8%)Tris-乙酸盐凝胶(Invitrogen)分级分离。在硝酸纤维素膜(Millipore)上实现转移。用小鼠单克隆抗γ-衔接蛋白(Sigma-Aldrich)和兔多克隆抗KIF13A(BethylLaboratory，Inc.)探测膜。
免疫荧光
将在盖玻片上生长的MNT-1细胞在含有10μg肽的培养基中孵育3天。在PBS中漂洗盖玻片，在100%冷甲醇中固定30秒，随后在PBS和1mg / ml BSA中孵育。将固定的细胞在PBS中洗涤，在PBS和50mM甘氨酸中在RT淬灭10分钟，在封闭缓冲液中饱和，并在PBS，0.05%皂苷和1mg / ml BSA(孵育缓冲液，1B)中透化。将细胞与在IB中稀释的小鼠单克隆抗γ-衔接蛋白(Sigma-Aldrich)和兔多克隆抗KIF13A(Bethyl Laboratory，Inc.)一起孵育1小时，在IB中洗涤三次，并与相应的二抗(Alexa Fluor，Invitrogen)一起孵育30分钟。将细胞在1B中洗涤两次，在封闭缓冲液中洗涤一次。最后，将盖玻片安装在DABCO培养基中并在3D尼康显微镜下检查。
使用ImageJ软件进行共定位分析。首先，使用Colocalization Plugin生成合并图像。只有像素的覆盖强度超过单个通道的强度被认为是共定位像素。然后定义细胞内相同的区域并分析定量。
常规电子显微术
将在盖玻片上生长3天的对照和肽处理的MNT-1细胞用在pH 7.2的0.1M二甲砷酸盐缓冲液中的2.5%戊二醛固定，用补充有1.5%的亚铁氰化钾的1%OsO4后固定，在乙醇中脱水，并嵌入在epon中。用Ulltracut UCT超薄切片机(Leica)制备超薄切片，并在用乙酸双氧铀和柠檬酸铅复染色之后在CM120电子显微镜(FEI公司，Eindoven)下观察。
两个作者独立完成了基于形态和黑色素含量的黑色素体从I阶段到IV阶段的分级。下表列出了分析的标准。
阶段 标准
I 球形，无黑色素
II 椭圆形，平行丝
III 椭圆形，黑色素中等沉积
IV 椭圆形，黑色素强烈沉积
黑色素测定
对MNT-1细胞
在第1天，将105个细胞接种在6孔板中。从第2天到第4天，在含有1或10μg肽的培养基中培养细胞。每天更换培养基。在第5天，通过在50mM Tris-HCl，pH 7.4，2mM EDTA，150mMNaCl，1mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂中超声处理破碎细胞。在4℃下以20,000g沉淀色素15分钟，在乙醇/乙醚(1:1)中漂洗一次，并在60℃下溶解于2M NaOH / 20%二甲基亚砜中。黑色素含量作为在492nm的光密度测量。
对重建的表皮
在第10天接受光型VI的重建人表皮(Sterlab)，并从第11天至第21天用30μg肽补充的制造商的生长培养基孵育。按照推荐，每天更换培养基。在第21天，将表皮与插入物分离，通过在400μl的Solvable (PerkinElmer)中在98℃下孵育1小时来消化。黑色素含量作为在492nm的光密度测量。
结果
本发明人设计了旨在阻断AP-1复合物与驱动蛋白KIF13A的相互作用的小肽。已经表明，这种相互作用对于将黑素生成酶转运到黑素体是关键的，并且然后对于人皮肤黑素细胞的色素沉着是必需的(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19; 187(2)：247- 64)。本发明人在此显示，小至5或3个氨基酸(aa)的肽能够防止AP-1复合物与KIF13A之间的相互作用以及它们的细胞内共定位，导致皮肤黑素细胞的色素颗粒数目减少，和皮肤黑素细胞以及合成的人着色皮肤表皮的细胞内黑色素含量的减少。
EK-11肽减少KIF13A与AP-1复合物的相互作用
基于来自(Nakagawa等人，Cell，2000，vol.103,569-581)的之前的工作，预测小鼠AP-1复合物的β1-衔接蛋白亚基与小鼠KIF13A的结合结构域对应于位于第783和860个aa之间的77aa区域。本发明人鉴定了对应于77aa区域(第813-890)的人β1-衔接蛋白亚基的同源序列。使用这77aa人序列，本发明人设计了与相邻肽共享5个氨基酸的11个氨基酸的12种肽。本发明人测试了这些序列阻断人AP-1与人KIF13A的相互作用的能力。这些蛋白质被广泛表达，因此本发明人通过独立地将1μg的各12种肽与HeLa细胞裂解物(非着色细胞)一起孵育来进行第一次相互作用筛选。从裂解物中免疫沉淀AP-1复合物的γ亚基，并测试免疫沉淀物的KIF13A含量。本发明人显示，与对照或其他设计的肽相比，仅EK-11肽(SEQ ID NO: 1)与HeLa细胞裂解物的孵育能够显著减少AP-1与KIF13A的相互作用约52.6±7%(图1)。此外，本发明人还证实，EK-11肽减少皮肤黑素细胞MNT-1细胞裂解物中的AP-1 / KIF13A相互作用(57.5±8%)，与HeLa细胞中一样多(图2)。
QK-5肽减少KIF13A与AP-1复合物的相互作用
为了找到可用于工业目的的分子，本发明人设计了覆盖和包围EK-11肽的五肽，以找到能够防止AP-1 / KIF13A相互作用的更短的肽。本发明人显示，与对照或其它5aa肽例如SS-5肽(SEQ ID NO: 28)(图2)相比，对应于EK-11肽(SEQ ID NO: 1)的最后5个氨基酸的QK-5肽(SEQ ID NO: 16)降低了在黑素细胞细胞裂解物中AP-1与KIF13A(图2)相互作用的能力(56.1±6%;图3)。引人注意的是，倍数减少等同于通过EK-11肽孵育(参见上文)产生的倍数减少。总之，本发明人显示QK-5肽防止黑素细胞中AP-1与KIF13A的相互作用。
QK-5肽减少AP-1与KIF13A在皮肤黑素细胞中的共定位
本发明人测试了AP-1与KIF13A的相互作用的减少(图3)是否可以通过其在皮肤黑素细胞中的共定位的减少来反映。如上所述地将QK-5肽与皮肤黑素细胞一起孵育，并进行免疫荧光实验以定量AP-1与KIF13A在皮肤MNT-1黑素细胞中的共定位。本发明人显示，与对照相比，QK-5肽的孵育减少两种蛋白质之间的共定位约84±7%(图5; p <0.001)，这显示它们相互作用的物理破坏(图2)之后是它们的细胞内分布的空间隔离。
QK-5肽减少皮肤黑素细胞的黑色素产生
本发明人先前显示，AP-1 / KIF13A对是皮肤黑素细胞在细胞内产生黑色素所需要的(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19; 187(2)：247-64)。因此，本发明人测试了QK-5肽的孵育是否可以影响皮肤MNT-1黑素细胞的细胞内黑色素含量。将MNT1黑素细胞在含有10 μM QK-5肽的培养基中培养3天(每天更新孵育)，然后纯化细胞内黑色素和通过读取其在492nm的光密度来测量。与对照相比，QK-5肽的孵育使皮肤MNT-1黑素细胞的细胞内黑色素含量降低约40%(图4; p <0.05)。该结果表明QK-5肽自由扩散到细胞中，并且显示通过阻断KIF13A与AP-1的相互作用，QK-5因此减少了经处理的黑素细胞的黑色素产生。
QK-5肽减少完全成熟的色素颗粒的形成
在皮肤黑素细胞中，黑色素合成发生在膜结合的称为黑素体的细胞器中(Raposo和Marks，Nat Rev Mol Cell Biol.Opt 2007; 8(10)：786-797)。本发明人先前显示，AP-1 /KIF13A对是形成完全着色的黑素体所必需的(Delevoye等人，J Cell Biol.2009 Oct 19;187(2)：247-64)。然后本发明人测试了废除AP-1与KIF13A的相互作用和共定位(图2、3和5)的QK-5肽的孵育是否可能影响黑素体的成熟，并且因此减少色素沉着(图4)。如上所述地将QK-5肽与皮肤黑素细胞一起孵育，并进行电子显微镜处理(参见材料和方法)。基于它们的形态，黑素体以4个不同阶段存在，从早期非着色黑素体(阶段I和II)到早期成熟黑素体(阶段III，其中黑色素开始沉积到它们的腔中)，然后到完全成熟的黑素体(阶段IV，其中黑色素完全填充黑素体的腔)。与对照(图6，上图)相比，与QK-5肽一起孵育3天的MNT-1细胞(图6，下图)携带更少的黑色着色的颗粒(阶段IV黑素体)，显示完全着色的黑素体的成熟在QK-5处理的细胞中受到影响。本发明人定量了在H2O或QK-5处理的MNT1细胞中黑素体阶段的数目(表示为总数的%)。与对照相比，QK-5处理的黑素细胞增加其阶段III的数量，并且减少其阶段IV黑素体的数目，而不影响早期阶段(I和II)(图7)。该数据表明，当用QK-5肽处理细胞时，完全着色的阶段IV黑素体的成熟速率减慢，并解释了图4所示的色素沉着的减少。
三个氨基酸的QK衍生肽减少皮肤黑素细胞的色素沉着
为了找到较小的活性分子，本发明人设计了几种衍生自EK-11肽并因此来自两种五肽EN-5和QK-5的三肽，即EL-3(EPL)、LN-3 (LNN)、QA-3(QVA)和AK-3(AVK)肽，以测试其减少色素沉着的能力。本发明人显示，EL-3或LN-3的孵育适度地减少皮肤黑素细胞的黑色素产生(约12%)(图8)。此外，本发明人将衍生自QK-5肽的三肽(QA-3和AK-3)与皮肤MNT-1黑素细胞一起孵育。本发明人显示，QA-3和AK-3肽都使细胞内黑色素含量降低约20%(图9；分别为23%±7%和22%±8%；*，p <0.05)。此外，本发明人在30μM的各自三肽存在下保持人重建的着色表皮的培养。本发明人显示，与对照相比，QA-3和AK-3肽都减少了3D-人重建的着色表皮的色素沉着约20%(图10；分别为22.5±13%和21±10%; *，p <0.1)。该结果显示，衍生自QK-5和小至三个氨基酸的肽能够减少皮肤黑素细胞以及合成表皮的色素沉着。
结论
本文的发明人证明了衍生自EK-11肽的小至5或3个氨基酸(aa)的肽能够阻断AP-1复合物与驱动蛋白KIF13A的相互作用。这些肽不仅影响这些蛋白质的物理缔合，而且影响它们的空间细胞内共定位。因为AP-1和KIF13A对于维持黑素体的成熟和皮肤黑素细胞的色素沉着是关键的，所以本发明人显示这样的肽通过控制完全着色的黑素体的成熟速率而影响皮肤黑素细胞的色素沉着。本发明人还显示这些肽减少皮肤黑素细胞的色素沉着，并且重要的是，减少人重建的着色表皮的色素沉着。总之，本发明人显示，抑制AP-1与KIF13A的相互作用的小肽是调节人皮肤色素沉着的相关新工具，并且可用作新的增白活性分子。

Claims (20)

1. 下述肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐作为皮肤增白美容剂的用途：长度为3至15个氨基酸且包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的至少三个连续氨基酸的序列的肽。
2.权利要求1的用途，其中所述肽包含氨基酸序列AVK。
3. 权利要求2的用途，其中所述肽包含选自氨基酸序列AVK、VAVK (SEQ ID NO: 9)和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列。
4. 权利要求2的用途，其中所述肽由选自氨基酸序列AVK、VAVK (SEQ ID NO: 9)和QVAVK (SEQ ID NO: 16)的氨基酸序列组成。
5. 权利要求2的用途，其中所述肽包含氨基酸序列QVAVK (SEQ ID NO: 16)或由其组成。
6. 权利要求1的用途，其中所述肽包含选自氨基酸序列AVK、EPL、PLN、LNN、NNL、NLQ、LQV、QVA、VAV和SEQ ID NO: 1至16的氨基酸序列。
7. 权利要求1的用途，其中所述肽由选自以下的氨基酸序列组成：(i)氨基酸序列AVK、EPL、PLN、LNN、NNL、NLQ、LQV、QVA、VAV和SEQ ID NO: 1至16，和(ii)包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的6、7、8、9或10个连续氨基酸的任何序列。
8.权利要求1至7中任一项的用途，其中所述肽具有3至11个氨基酸的长度，优选3至7个氨基酸的长度。
9.权利要求1至8中任一项的用途，其中所述功能衍生物选自逆肽、逆反肽、肽模拟物和具有甲基化酰胺键的肽。
10.权利要求1至9中任一项定义的皮肤增白肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐，其用于预防或治疗色素沉着过度。
11.权利要求10的肽，其中所述色素沉着过度选自：黑斑病；光化性雀斑；来自痤疮的色素性后效应；由于光敏化引起的色素沉着；由于擦伤、烧伤、瘢痕、皮肤病和/或接触性变态反应引起的炎症后色素沉着；草地皮炎；由于毒藤引起的色素沉着；雀斑；和痣，例如先天性巨痣、贝克痣或斯皮茨痣。
12.一种美容或药物组合物，其包含：权利要求1至9中任一项所定义的皮肤增白肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐，以及生理学上可接受的载体和/或赋形剂。
13.权利要求12的组合物，其中所述组合物适于通过局部途径施用。
14.权利要求12或13的组合物，其中所述肽包含在脂质体中。
15.权利要求12或13的组合物，其中所述组合物为水包油、油包水或硅包水乳液的形式。
16.权利要求12至15中任一项的组合物，其还包含一种或几种另外的活性物质。
17.权利要求16的组合物，其中所述另外的活性物质选自：其它皮肤增白剂、有机或无机防晒剂、角质软化剂和/或剥脱剂、保湿剂、润肤剂、收敛剂、防腐剂、抗糖化和/或抗氧化剂、多元醇、维生素、视黄酸、视黄醛、视黄醇、棕榈酸盐、丙酸盐、乙酸盐、透明质酸、抗炎剂、舒缓剂和脱氧核糖核酸或核糖核酸，及其混合物。
18.一种用于增白人皮肤的美容方法，包括将权利要求12至17中任一项的美容组合物局部施用于人皮肤上。
19.权利要求1至9中任一项定义的皮肤增白肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐，其作为药物。
20.权利要求1至9中任一项定义的皮肤增白肽或者其功能衍生物或生理学上可接受的盐，其作为美容剂。
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